Спосіб одержання аlрhа-галактозидази

Способ получения а-галактозидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей соевую муку, моносахарид, сульфат аммония, мочеви ну, фосфат калия однозамещенный, сульфат магния, хлорид кальция, дрожжевой экстракт и воду, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что и с п о л ь з у ю т штамм м и к р о о р г а н и з м а Cladosporlum cladosporloides (Fres.) de Vrles 1603 q при следующем соотношении компонентов вышеупомянутой питательной среды,г/л: соевая мука 20,0-40,0 моносахарид 3,0-7,0 сульфат аммония 2,0-3,0 мочевина 0,25-0,55 фосфат калия однозамещенный сульфат магния 1,5-3,5 хлорид кальция 0,4-0,8 дрожжевой экстракт 2,5-5,5 вода остальное С > О Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения внеклеточной а-галактозидазы при помощи микробиологического синтеза. Наиболее близким к данному изобретению по технической сущности является способ получения а -галактозидазы с использованием в качестве продуцента микромицета Cephalosporlum acremonium 237, который культивируется глубинным методом при температуре 26-28°С в течение 48 час на полусинтетической питательной среде следующего состава, г/л воды: соевая мука , глюкоза сульфат аммония , мочевина сульфат магния . хлорид кальция фосфат калия однозамещн. дрожжевой экстракт рН среды 2,5 0,15 1,4 0,3 0,3 0,3 2,0 0,05 5,5 О-Галактозидазная активность в конце ферментации достигала 1,15 Е/мл культураль,ной жидкости. ел ю 10512 Недостатком указанного способа является сравнительно низкая продуктивность используемого штамма вследствие чего выход целевого продукта невысок. Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения сс-галэктозидэзы с высоким выходом. Поставленная задача решается тем, что согласно изобретению предусматривается культивирование продуцирующего фермент микроорганизма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, глубинным методом в условиях аэрации, а в качестве продуцирующего микроорганизма впервые используется представитель рода Cladosporlum, а именно штамм Clodosporlum ciadosporloides (Fres.) de Vries 16038. Предлагаемый штамм выделен нами в 1986 г. методом серийных разведений из искусственной ассоциации микроорганизмов, создаваемой для выращивания шампиньонов в условиях тепличного хозяйства фирмы "Лето" (г.Ленинград). Мутагенному воздействию штамм не подвергался. Культурально-морфологические признаки- штамм С ciadosporloides 16038отличается хорошим спороношением на следующих агаризованных средах: сусло-агаре, картофельно-глюкозном агаре, среде Чапека, Сабуро, Ролена-Тома. На сусло-агаре колонии широко распростертые, бархатистые, оливково-коричневые, обратная сторона черного цвета. Конидисносцы хорошо выражены 300-350 мкм длиной. 3-5 мкм шириной, бледно-оливковые, гладкие, с возрастом слегка шероховатые, образуют многочисленные ветвящиеся конидиальные цепочки Базальные конидии с 1-2 перегородками или одноклеточные размером 2-3 х 30 мкм, вначале гладкие, с возрастом слегка мелкобородавчатые. Конидии в длинных ветвящихся цепочках - одноклеточные, эллиптические, овальные или почти шаровидные, гладкие, бледио-оливковые, размером 2-4 х 3-7 мкм. Иа среде Чапека воздушный мицелий слабо развит, колонии порошистые или слабо войлочные. Мицелий состоит из узких неокрашенпых гиф шириной 2-4 мкм и темноокрашенных гиф шириной 4-10 мкм. Конидиеносцы образуются терминально или латерально из растущих гиф, длиной 25-350 мкм и шириной 2-55 мкм, гладкие или слегка шероховатые, нерегулярно септированные,темноокрашенные с Солее или менее одинаковым диаметром из протяжении всей длины с одной или двумя короткими промежуточными септами. Конидиальные головки от 50 до 100 мкм в диаметре, конидиальные цепочки тер 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 минальные на конидиеносцах или латеральные, возникающие из прорастающих веточек. Конидии гладкие или слегка шероховатые двух типов: одноклеточные, размером в среднем 2-8x2-4 мкм, овальные, лимоновидные, эллиптические, слегка суженные с одного или двух концов; второй тип конидий - двух-, трех клеточные, цилиндрические, базальные, с двумя-тремя перегородками, размером 12-14 х 4-6 мкм. На картофельной среде колонии бархатистые, слабо развитые, зеленовато-коричневого цвета, обратная сторона оливково-черного цвета. Конидиеносцы достигают размера 350 мкм длиной и 26 мкм шириной, конидии эллиптической или лимоновидной формы, в основном гладкие, редко шиповатые, коричнево-оливкового цвета. Конидии двух видов: одноклеточно 3-7 х 2-4 мкм и базальные размером 3-25 х 3-6 мкм в основном шероховатые, удлиненной, цилиндрической или эллиптической формы. Линейный рост колоний на агаризованных средах: на сусло-агаре на 5-ый день 3,8 см, на 10-ый д е н ь - 5 5 см; накартофельно-глюкозной среде на 5-ый день - 2,4 см. на 10-ый-4,2 см; на среде Чапека-на 5-ый день -3,6см, на 10-ый день - 4 , 6 см. Из источников углерода усваивают глюкозу, галактозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, крахмал, сорбит, дульцит и др. Хорошо растет на нитратных, аммонийных и органических источниках азота. Штамм растет в широких пределах рН от 3,5 до 8,5, при температуре 26-28°С, хранится на косяках с сусло-агаром, периодичность пересевов - один раз в 3-4 месяца. Культура C.cladosporloldes 16038 не патогенна, а культуральная жидкость, полученная при г л у б и н н о м культивировании штамма, не токсична. Штамм хранится в Коллекции музея культур промышленных микроорганизмов институтз "ВНИИ генетика" под номером F-581. Штамм C.cladosporloldes 16038 синтезирует внеклеточную ее -галактозидазу при выращивании глубинным методом при скорости вращения мешалки 220 об/мин и температуре 26-28°С на среде следующего состава, г/л воды; соевая мука 20-40 лактоза 3-7 сульфат аммония 2-3 мочевина 0,25-0,55 фосфат калия однозам. 3,0-7,0 сульфат магния 1,5-3,5 хлорид кальция 0,4-0,8 дрожжевой автолизат 2,5-5,5 Для приготовления среды используют дистиллированную воду, рН доводят до 5,3 10512 Активность инвертазы определяли ана5,5, среду разливают по 100 мл в 0,5 л качалогичным образом, используя в качестве лочные колбы и стерилизуют при 0,5 атм в субстрата 0,06 М раствор сахарозы. Количетечение 30 мин. После охлаждения среду ство инвертного сахара определяли по метозасевают кусочками (0,5x0,5 см) вегетативного мицелия и выращивают инокулюм в 5 ду Шомоди-Нельсона. За единицу активности принято то количество ферментечение 72 часов на качалке в указанных та, в результате действия которого отщеплявыше условиях. Полученным инокулюмом в ется 1 мкмоль глюкозы в минуту. количестве 3 об.% засевают ферментационные колбы со средой того же состава и проВ таблице приведены сравнительные дуцент культивируют глубинным методом в 10 данные по биосинтезу а-галактозидазы затечение 120-144 час до достижения максиявляемым штаммов и прототипом при глумальной а -галактозидазной активности в бинном культивировании в оптимальных для культуральной жидкости (см.рис.) каждого из них условиях. Как'видно из таблицы, а-галактозидазПосле окончания ферментации мицелий 15 ная активность заявляемого штамма, учитываемая по гидролизу п-НФГ, в 4,5 раза удаляли путем фильтрования и о фильтрате выше, чем у прототипа. В культуральной определяли а-галактозидазную активжидкости C.cladosporloldes 16038 не обнаность, используя синтетические (п-нитроферужена инвертазная активность, примеси нил-а-Д-галактопиранозид) и естественные (мелибиоза, рафиноза) субстраты. 20 которой ухудшают качество препаратов агалактозидазы. Установлено также, что агалактозидаза зая-вляемого штамма При определении а:-галактозидазной способна гидролизовать а-галактозидные активности с использованием в качестве связи в естественных субстратах - олигосасубстрата п-нитрофенил-а-Д-галактопиранозида (п-НФГ) к0,1 мл культуральиой жид- 25 харидахмелибиозеирафинозе, чтоуказывакости соответствующего разведения ет на перспективность применения данного добавляют 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера фермента в пищевой промышленности с рН 4,6, 0,1 мл 0,01 М раствора п-НФГ, смесь целью улучшения качества соевых продукинкубируют 10 мин при 37°С и останавливатов и уселичения выхода сахара в свеклосают реакцию добавлением 2 мл 1 М раствора 30 харном производстве. углекислого натрия. Оптическую плотность Пример 1. раствора определяют при длине волны 400 Готовится питательная среда следующеим и по калибровочной кривой находят кого состава, г/л: личество отщепившегося п-нитрофенола. За 10,0 Соевая мука единицу активности а-галэктозидэзы при- 35 1.0 Лактоза нято то количество фермента, которое от1.5 Сульфат аммония . щепляет 1 мкмоль п-нитрофенола в минуту. -0,1 Мочевина Определение а-галактозидазной активФосфат калия однозамещенности с использованием в качестве субстра1.0 ный тов мелибиозы и рафимозы осуществляли 0,5 Сульфат магния следующим образом: к 1 мл культуральной 0,2 Хлорид кальция жидкости добавляли 0,5 мл 0,06 М раствора 1.0 Дрожжевой автолизат мелибиоэы (или рафинозы) и 0,5 мл 0,1 М 1000 мл Дистиллированная вода фосфатного буфера рН 5,2, смесь инкубироКислотность среды должна находиться в вали 2 часа при температуре 40°С, реакцию 45 пределах 5,3-5,5, готовая среда разливается останавливали путем прогревания пробы в по 100 мл в качалочные колбы емкостью 0,5 л кипящей водяной бане в течение 5 мин, заи стерилизуется при 0,5 атм в течение 30 тем добавляли к охлажденной пробе по 1 мл мин. Для получения посевного материала 1,8% раствора гидроксида бария и 2% расколбы засеваются в асептических условиях твора сульфата цинка для осаждения белка. 50 кусочками вегетативного мицелия (0,5 х 0,5 Полученную смесь центрифугировали и в см) и культура выращивается притемператунадосадочной жидкости определяли содерре 26-28°С на качалке со скоростью вращежание глюкозы глюкозооксидазным метоиия 220 об/мин. Затем 3-х суточным дом, а содержание галактозы - по методу посевным материалом в количестве 3 о6.% Шомоди-Нельсона, За единицу активности 55 засеваются ферментационные колбы со срефермента принято то его количество, котодой того же состава, продолжительность вырое отщепляет 1 мкмоль глюкозы (субстрат ращивания культуры - 120 часов, мелибиоза) или 1 мкмоль галактозы (суба-гэлактозидазнап активность в конце ферстрат рафиноза) ээ 1 минуту. ментации составляет 2,4 Е/мл культураль 8 10512 ной жидкости. Инвертазная активность отсутствует. . - . -.- • ..-..' Пример 2, Все, как в примере 1, за исключением того, что для культивирования штамма C.cladosporioides 16038 используется питательная среда следующего состава, г/л: Соевая мука 20,0 Лактоза . 3,0 Сульфат аммония . 2,0 Мочевина 0,25 Фосфат калия однозамещенный 3,0 Сульфат магния . 1,5 Хлорид кальция 0,4 Дрожжевой автолизат 2,5 Дистиллированная вода 1000 мл а-Галактозидазная активность культуры, выращенной в течение 144 час составляла 3,5 Е/мл культуральной ж и д к о с т и , инвертазная активность отсутствовала. Пример 3. Все, как в примере 1, за исключением того, что для культивирования штамма С. cladosporloldes 16038 используется питательная среда следующего состава, г/л: 10 15 20 25 Соевая мука . . , ! : , 30,0 Лактоза '•' 5,0' Сульфат аммония ... ...2,5 \ 30 ; Мочевина . 0,4 Фосфат калия однозамещенный 5,0 Сульфат магния . 2,5 Хлорид кальция • .. 0,6 35 Дрожжевой автолизат ' 4,0 Дистиллированная вода 1000 мл а-Галактозидазная активность после 144 час культивирования штамма составля40 Название штамма па 5,2 Е/мл культуральной жидкости, инвертазная активность отсутствовала. Пример 4. Все, как в примере 1, эз исключением того, что ДЛИ культивирования штамма C.cladosporioides 16038 используется питательная среда следующего состава, г/л: Соевая мука 40,0 Лактоза 7,0 Сульфат аммония 3,0 Мочевина 0,55 Фосфат калия однозамещенный . 7,0 Сульфат магния . 3,5 Хлорид кальция 0,8 Дрожжевой автолизат 5,5 Дистиллированная вода 1000 мл а-Галактозидазная активность в культу-, ральной жидкости продуцента в конце ферментации составляла 4,5 Е/мл, инвертазная -отсутствовала. • . П р и м е р 5. Все, как в примере 1, за исключением того, что для культивирования штамма С. cladosporloides 16038 используется питательная среда следующего состава, г/л; Соевая мука 50,0 Лактоза 9,0 Сульфат аммония 3,5 Мочевина 0,7 . Фосфат калия однозамещенный 9,0 : Сульфат магния . 4,5 Хлорид кальция 1,0 Дрожжевой автолизат. 7,0 cr-Галактозидазная активность о конце ферментации составляла 3,8 Е/мл культурзльной жидкости, инвертазная активность отсутствовала. а-галактозидазнэя активность, Е/мл п-НФГ Рафиноза Мелибиоза Инвертазная активность, Е/мл Заявляемый штаммCladosporium cladosporloldes 16038 5,2 2,23 1,3 . 0 ПрототипCephalosporlum acremonlum 237 1,15 0 10512 Е/мл 5,0 ' О ?Л 48 72 % і 20 144 168 час Рис» ьигалактозвдаэная активность штамма о. е '16038 в динамике» Упорядник В.Смирнов Замовлення 4018 Техрод М.Моргентал Коректор1 М.Свмборсыьв" Тираж Підписне Державне латентне відомство УкраТни, 254655, ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне тооариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101