Спосіб отримання простагландинів із медичних пиявок

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов, и может быть использовано в гематологии, биотехнологии, медицинской промышленности, ветеринарии. Известен способ получения стабильного аналога простациклина бактериальной природы, взятый нами в качестве прототипа [1]. Он включает забор крови из медицинской пиявки, инкубирование ее в питательной среде, пересев выросших колоний бактерий, собирание клеток, разрушение ультразвуком суспензированных в дистиллированной воде клеток, диализ надосадочной жидкости. Но данный способ имеет следующие недостатки: он трудоемок, требует много времени на осуществление, конечный продукт неоднороден. В основу изобретения поставлена задача создания способа получения простагландинов из медицинских пиявок, в котором обеспечивается сокращение времен получения, снижение трудоемкости способа и получение простагландинов в гомогенном состоянии. Поставленная задача достигается тем, что водный раствор гомогената или порошка лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной бане не менее 3 минут, центрифугир уют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают ее до сухого остатка. Пример 1. Готовят водный экстракт Пиявита (лиофилизированного порошка медицинских пиявок); 100мг порошка суспензируют 30мин при 37°C, центрифугируют при 2000об/мин в течение 20мин (или фильтруют через бумажный или ватномарлевый фильтр). Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 10мин. В остывший до комнатной температуры раствор вносят трипсин и химотрипсин в конечной концентрации 10мг/мл при pH 8,0 и оставляют на 10 часов (ферментативный гидролиз). По окончании инкубации экстрагируют этилацетатом в течение 20 минут при постоянном встряхивании, собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка. Для тестирования активности сухого остатка суспензируют его в H2O дист. при pH 8,0 - 8,5, центрифугир уют и анализируют надосадочную жидкость. Конечный продукт не содержит полипептидных цепей и аминокислот (отрицательный спектрофотометрический и нингидриновый тесты). Содержит простагландины в количестве 25,0 наннограмм/мл и блокируют агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ, на 100%. Пример 2. Берут 20 медицинских пиявок, измельчают в гомогенизаторе, экстрагируют дист. H2O и центрифугир уют. Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 5 минут. В охлажденный до комнатной температуры раствор вносят едкий натр (NaOH) до конечной концентрации 2Н, инкубируют в течение 12 часов (щелочной гидролиз). В раствор вносят двукратный объем хлороформа и экстрагируют 20 минут при постоянном встряхивании. Собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка. Сухой остаток растворили в 0,5М фосфа тном буфере, pH 7,5. Конечный продукт не содержит полипептидных цепей и аминокислот (отрицательные спектрофотометрические и нингидриновый тесты), содержит простагландины, в количестве 23,0нанногр/мл и блокирует агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ, на 100%. При прогревании надосадочной жидкости в кипящей водяной бане менее 3 минут получают конечный продукт с низким содержанием простагландинов. Это объясняется тем, что большая часть простагландинов находится в связанном состоянии с белками дистабилазного комплекса, обеспечивая им термостабильность и защиту от гидролитического действия трипсина и химотрипсина. Таким образом, большая часть простагландинов остается в водной фракции после экстрагирования этилацетатом, поскольку связаны они с неуспевшими денатурироваться за такое время кипячения белками дистабилазного комплекса. Методы тестирования содержания и активности простагландинов, выделенных из медицинских пиявок. 1. Количественный метод: используют набор реактивов для радиоиммунологиче-ского анализа 6-кето-простагландин 12. 2. Качественный метод: ингибирование агрегации тромбоцитов, Готовят плазму крови (теплокровных животных) богатую тромбоцитами [2, 3], для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 10 минут при 500об/мин. Собирают плазму богатую тромбоцитами. Далее цитратную кровь центрифугир уют в течение 15 минут при 2000об/мин, собирают плазму, лишенную тромбоцитов, которую используют в качестве фоновой крови при спектрофотометрическом определении агрегации тромбоцитов при длине волны 600нм по методу Борна [4]. Предлагаемый способ достаточно прост и позволяет получить простагландины в чистом виде.