Плазмідний експресуючий вектор ртрр-15, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli злитного білка оболонки trepanema pallidum

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної Інженерії І може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка оболонки Trepanema Pallldum І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до Trepanema Pallldum в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К. Stanley and Paul Lusio., Construction! of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel, vol 3, N 6, p. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. coll элитного білка Trepanema Pallldum. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка Trepanema Palildum. Для цього була створена рекомбінантна плазмида рТрр-15, яка містить наступні ІнсерційнІ фрагменти ДНК: фрагмент гену Сго, розміром 51 п.о., фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент Lac Z, розміром 1050 п.о. 1 фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку Trepanema pallldum розміром 3504 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll. Peкомбінантні клони Е. соlі нарощували і тестували методом Імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків Trepanema pallldun. Плазмида рТрр-15 кодує гібридний білок молекулярною масою 132,2 кД. (1167 амінокислот). Штам - продуцент гібрідного білка (ITG-515) одержували трансформацією клітин Е. coll Pop 2136 плазмидою рТрр-15(див. креслення). Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42 °С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють Інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійний І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-515 при температурі 32-42 °С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою рТрр-15. Hind HI