Плазмідний експресуючий вектор ртрр-47, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е.coli злитного білка trepanema pallidum

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка Trepanema Pallldum і в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до Trepanema Pallldum в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бак- . теріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Lusio., Construction of a new family of high effeclenty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel, vol 3, N 6, p. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плаз-мид, які єкспресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е.coll элитного білка оболонки Trepanema Pallldum. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка Trepanema Pallidum. ' Для цього була створена рекомбінантна плазмида рТрр-47, яка містить наступні ІнсерційнІ фрагменти ДНК: фрагмент гену Сго, розміром 51 п.о., фрагмент Lad, розміром 114 п.о., фрагмент Lac Ζ, розміром 1050 п.о. І фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку Trepanema розміром 4377 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coif, штам Рор-2136. Рекомбінантні клони Е. соlі нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до структурних білків Trepanema pallldum. Плазмида рТрр-47 кодує гібридний білок молекулярною масою 164 кД (1458 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-547) одержували трансформацією клітин Е. coli Pop 2136 плазмидою рТрр-47 (див. креслення). Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-547 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення і по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою рТрр-47.