Плазмідний експресуючий вектор ртрр-17, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli злитного білка trepanema pallidum

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка Trepanema Pallidum І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до Trepanema Pallidum в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Kelt К Stanley and Paul Luslo., Construction of a new family of high effeclenty bacterial expression vectors: identification of cDNA clones for human liver proteins. // EMBO Journel vol 3, N6, pp. 1429-1434). ЦІ вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. сої! элитного білка Trepanema Pallidum. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка Trepanema Pallidum. Для цього була створена рекомбіиатна плазмида рТрр-17, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Сrо, розміром 51 П.О., фрагмент Lac 1, розміром 114 п.о., фрагмент Lac Ζ, розміром 1050 п.о. І фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку Treponema pallidum розміром 3537 п.о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. соlі. Рекомбінатні клони Е. соlі нарощували і тестували методом Імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які .утримували антитіла до структурних білків Trepanema pallidum. Плазмида рТрр-17 кодує гібридний білок мо-лекулярною масою 132,7 кД. (1178 амінокислот). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-517) одержували трансформацією клітин Е. coll Pop 2136 плазмидою рТрр-17 (креслення). Клітини-продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють Інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-517 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації ре-комбінантного штама гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомінантною плазмидою рТрр-17.