Плазмідний експресуючий вектор ркns4 – 110dеlта, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е.coli гібридного злитного білка pns4delta вірусу гепатиту с

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної Інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка pNS4A вірусу гепатиту С і в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до вірусу гепатиту С в сироватках крові пацієнтів. Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Luslo,, Construction of a new family of high efflclenty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. //EMBO Journel. vol 3, N 6, p. 1429-1434). Ці вектори походять від crolacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію, яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е.соlі элитного білка pNS4A вірусу гепатиту С. Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмідної ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка pNS4 вірусу гепатиту С. Для цього була створена рекомбінантна плазмида pKNS4-110A, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК; фрагмент гену Сrо, розміром 51 п. о., фрагмент Lad, розміром 114 п. о., фрагмент Lac Z, розміром 1050 п. о. і фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку NS4 вірусу гепатиту С, розміром 1218 п. о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll. Pop 2136. Рекомбінантні клони Е. coll нарощували і тестували методом імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримували антитіла до неструктурных білків вірусу гепатиту С. Плазмида pKNS4-110Δ кодує гібридний білок молекулярною масою 45,6 кД. (403 амінокислоти). Штам - продуцент гібридного біка (ITG-111) одержували трансформацією клітин Е. coll Рор-2136 плазмидою pKNS4-110A (див. креслення). Клітини — продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти і мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібрідного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll iTG-111 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штампа гібрідний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликози-лювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою pKNS4-110D.