Плазмідний експресуючий вектор ркns4-110, маючий послідовність днк, відповідаючу за експресію в бактеріях е. coli гібридного злитного білка pns4 вірусу гепатиту с

Винахід відноситься до розділу молекулярної біології, генної Інженерії і може бути використаний при біотехнологічному синтезі білка pNS4 вірусу гепатиту С І в медицині, для конструювання тест-систем, придатних для виявлення антитіл до вірусу гепатиту С в сироватках крові пацієнтів, Прототипами винаходу є сімейство бактеріальних експресійних векторів типу рЕХ1-3 (Keith К Stanley and Paul Luslo., Construction of a new family of high efflcienty bacterial expression vectors: Identification of cDNA clones for human liver proteins. //EMBO Journel vol 3, N 6, p. 1429-1434). ЦІ вектори походять від croiacZ злитних плазмид, які експресують велику кількість злитних білків під контролем Рr промотору фагу лямбда. В основу винаходу покладене завдання створити генно-інженерну конструкцію. яка забезпечить мікробіологічний синтез в Е. соlі элитного білка pNS4 вірусу гепатиту С Суть винаходу полягає в одержанні модифікованої послідовності плазмІдноТ ДНК, відповідаючої за синтез элитного білка pNS4 вірусу гепатиту С. Для цього була створена рекомбінантна плазмида pKNS4-110, яка містить наступні інсерційні фрагменти ДНК: фрагмент гену Сго, розміром 51 п. о., фрагмент Lad, розміром 114 п. о., фрагмент Lac Z, розміром 1050 п. о. I фрагмент ДНК, відповідаючий послідовностям білку NS4 вірусу гепатиту С, розміром 3402 п. о. Одержаною модифікованою плазмідою трансформували клітини Е. coll. Pop 2136, РекомбІнантнІ клони Е. coll нарощували і тестували методом Імуноблотінгу, використовуючи сироватки крові людини, які утримувапи антитіла до неструктурних білків вірусу гепатиту С. Плазмида pKNS4-110 кодує гібридний білок молекулярною масою 128 кД. (1131 амінокислота). Штам - продуцент гібридного білка (ITG-110) одержували трансформацією клітин Е. соlі Рор-2136 плазмидою pKNS4-110 (див. креслення). Клітини - продуценти ростуть добре на простих поживних середовищах при температурах 32-42°С. При рості на м'ясопептонному поживному агарі формують гладкі, круглі, плоскі, сірі, блискучі колонії з рівними краями. При рості на рідких поживних' середовищах утворюють інтенсивну муть. Джерелом вуглеводів для клітин є вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Клітини не споживають ацетат, аданіт, лактозу, ксилозу. Джерелом азоту являються пептон, амінокислоти І мінеральні солі в амонійній І нітратній формах. Клітини ростуть при рН 6,0-8,0. Синтез гібридного білка відбувається при вирощуванні культури Е. Coll ITG-110 при температурі 32-42°С. В оптимальних умовах ферментації рекомбінантного штама гібридний білок нагромаджується усередині клітин в нерозчиненій формі у вигляді тілець включення І по кількості складає до 10% всього білка клітин. Гликозилювання білка відсутнє. Клітини рекомбінантного штаму виявляють стійкість до ампіциліну, обумовлену рекомбінантною плазмидою pKNS4-110.