Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протибруцельозних антитіл в сироватках крові людини або великої рогатої худоби (врх)

Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протибруцельозних антитіл у сироватках крові людини або великої рогатої худоби (ВРХ), в складі якої як кон'югативи використовують антивидові антитіла (анти IgM + IgG людини або анти-ВРХ), мічені ферментом, яка відрізняється тим, що включає імуносорбент з нанесеними антигенами очищених культур штамів Brucella abortus 1119 та Brucella mehtensis Винахід належить до імунохімії, медицини, ветеринарної медицини та може бути використаний для імунологічних досліджень, для діагностики інфікованості збудниками бруцельозу людей або великої рогатої худоби Відомий тест для виявлення зараженості бруцельозом базується на реакції зв'язування комплементу (РЗК) [1,2] В основу винаходу поставлена задача створити імуноферментну тест-систему на основі антигенів, виділених з очищених культур штамів збудників бруцельозу - Brucella abortus 1119 та Brucella mehtensis Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів В складі кон'югатив використовуються антивидові антитіла (анти IgM+IgG людини або ВРХ), мічені ферментом Ферментативну реакцію визначають за допомогою розчину субстрату з хромогеном За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток Приклад 1 Визначення антитіл проти антигенів збудників бруцельозу в сироватці крові людини В кожну лунку стрипів планшету вносять по 80мкл розчину для розведення сироваток і по 20мкл зразків досліджуваних сироваток, залишив ши вільними 5 лунок першого ряду (контрольні лунки) В три лунки вносять по 20мкл негативного контролю (К+ - негативна на бруцельоз сироватка крові людини), а в дві ІНШІ - по20мкл позитивного контролю (К~ - позитивна бруцельозна сироватка крові людини) Накривають стрипи клейкою плівкою або кришкою та шкубують при температурі 37°С бОхв Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів В лунки стрипів вносять по ЮОмкл розчину антивидового кон'югату -анти lgM+lgG-людини, міченого пероксидазою, та шкубують при 37°С у термостаті 45хв Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по ЮОмкл розчину проявника (субстрату з хромогеном) та шкубують при 18-22°С у темряві 10-25ХВ Зупиняють кольорову реакцію, додаючи до всіх проб по 50мкл стоп-реагенту Не більше як через 1хв після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) 00 00 48811 в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра Значення ОГ зразка прямо пропорційне КІЛЬКОСТІ антитіл у сироватці Приклад 2 Визначення антитіл проти антигенів збудників бруцельозу в сироватці крові ВРХ проводили аналогічно прикладові 1, але як антивидовий кон'югат застосовували мічений пероксидазою хрону анти-lgM+lgG-BPX кон'югат, за позитивний контроль (К+) правила позитивна на бруцельоз сироватка крові ВРХ, а за негативний контроль (К~) - негативна на бруцельоз сироватка крові ВРХ Приклад 3 Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові (20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток) Усі сироватки досліджували у чотирьох повторностях кожною тест-системою за описаною методикою З 20 позитивних сироваток наявність антитіл проти збудника бруцельозу показали 20, що становить 100% чутливості 3 100 негативних сироваток у пропонованій тест-системі виявилися справді не гативними 95 (специфічність - 95%) В РЗК, яку порівнювали з пропонованою тест-системою, з 20 достеменно позитивних сироваток 4 визначено як негативні (титр < 1 50) Чутливість РЗК становила 80% 3 100 негативних сироваток в РЗК виявилися справді негативними 92 зразка (специфічність 92%) Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти антигенів збудника бруцельозу у сироватках людей або ВРХ Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність Використана література 1 Кайтмазова Е И , Чернышева М И Лабораторная диагностика бруцеллеза - В кн Бруцеллез (ред П А Вершилова) - М «Медицина», 198-241 2 MacMillan А Р , Stack J Bovine brucellosis In Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Office International des Epizootics, Pans, 2000, 4th Edition, 328-345 3 AT Михайлов, В Н Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" М "Наука", 1981 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71