Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протилейкозних антитіл у сироватках крові та в молоці великої рогатої худоби (врх)

Тест-система для визначення протилейкозних антитіл у сироватках крові та в молоці великої рогатої худоби, де в складі імуносорбенту використовують білки-антигени збудника лейкозу, а як кон'югати - антивидові антитіла, мічені ферментом, яка відрізняється тим, що включає імуносорбент з нанесеними рекомбінантними антигенами або виділеними та очищеними з культури FLK, що продукує вірус лейкозу великої рогатої худоби, у складі кон'югатів використовують моноклональні антитіла, мічені пероксидазою, що забезпечує виявлення антилейкозних антитіл у досліджуваних зразках, як у сироватках, так і в молоці В основу винаходу покладено завдання створити імуноферментну тест-систему на основі рекомбінантних білків-антигенів вірусу лейкозу ВРХ або антигенів, виділених та очищених з культури FLK, що продукує цей вірус Антигени сорбують на поверхні полістиролових планшетів В складі кон'югатів використовують моноклональні антивидові антитіла (анти-ВРХ), мічені пероксидазою Ферментативну реакцію визначають за допомогою розчину проявника, який містить субстрат та хромоген За одну постановку (2 години) можна проаналізувати 88 сироваток Приклад 1 Визначення антитіл проти антигенів збудника лейкозу в сироватці крові ВРХ В кожну лунку стрипів планшету вносять по 80мкл розчину для розведення сироваток і по 20мкл зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (контрольні лунки) В три лунки вносять по 20мкл негативного контролю (КГ-негативна на лейкоз сироватка крові ВРХ), а в дві ІНШІ - по 20мкл позитивного контролю (К+-позитивна лейкозна сироватка крові ВРХ) Накривають стрипи клейкою плівкою або кришкою та шкубують при температурі 37°С протягом 00 со Ю (О 60 хв Після закінчення інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальноі піпетки та промивають лунки чотири рази розчином для промивання планшетів В лунки стрипів вносять по ЮОмкл розчину антивидового кон'югату - анти ВРХ, міченого пероксидазою, та шкубують при 37°С у термостаті протягом 45 хв Після закінчення інкубації промивають лунки шість разів і вносять туди по ЮОмкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та шкубують при 18-22°С у темряві 10-25 хв Зупиняють кольорову реакцію, додаючи до всіх проб по 50мкл стоп-реагенту Не більше як через 1 хв після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра Значення ОГ зразка прямо пропорційне КІЛЬКОСТІ антитіл у сироватці Приклад 2 Визначення антитіл проти антигенів збудника лейкозу в молоці ВРХ Молоко знежирюють центрифугуванням при 3000об/мин протягом ЗОхв Знежирене молоко використовують в аналізі аналогічно прикладу 1 Приклад 3 Визначення чутливості та специфі Комп'ютерна верстка А Крулевський 61538 чності пропонованої тест-системи Використовуючи названі тест-системи, досліджували сироватки крові по (20 достеменно позитивних та 100 достеменно негативних сироваток) Усі сироватки досліджували у чотирьох повторностях кожною тест-системою за описаною методикою 3 20 позитивних сироваток показали наявність антитіл проти збудника лейкозу 20, що становить 100% чутливості 3 100 негативних сироваток виявилися справді негативними 98 (специфічність - 98%) у пропонованій тест-системі В порівнюваній РІДА з 20 достеменно позитивних сироваток 4 були негативними (титр < 1 50) Чутливість РІДА становила 80% Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл проти антигенів збудника лейкозу у сироватках ВРХ Тест-система проста й надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність Використана література 1 М Н Lucas Enzootic bovine leukosis In the "OIE Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines", France, Pans, 1996, 276-280 2 AT Михайлов, ВН Симирский "Методы иммунохимического анализа в биологии развития" М "Наука", 1981 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119