Спосіб виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі із ракових наростів

Винахід відноситься до області виявлення структурних елементів патогенних мікроорганізмів із рослин, зокрема виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі із ракових наростів уражених рослин і може бути використаним при вивченні цього патогену. Відома суміш для виділення зооспорангіїв збудника раку картоплі із ракових наростів (прототип), яка характеризується тим, що із сухих розтертих ракових наростів шляхом перемішування їх із сумішшю чотирихлористого вуглецю і етилового ефіру з наступним відстоюванням і фільтруванням суспензії виділяють спочатку з осаду легкі домішки сумішшю з питомою вагою 1,09, а потім - зооспорангії - за допомогою суміші з питомою вагою 1,30 [1]. Недолік цього винаходу полягає в тому, що при його використанні одержують зооспорангії з домішками інших видів мікроорганізмів, зокрема мікроорганізмів з роду Synchytrium [2], що заважає проведенню точних аналізів, особливо при імунологічних та біохімічних дослідженнях. При цьому цей винахід дуже трудомісткий і потребує великих затрат реактивів. Мета - розробити спосіб виділення зооспорангіїв з ракових наростів в чистій культурі без домішок інших мікроорганізмів і більш економний по матеріальних і трудо вих затратах. Мета досягається за рахунок зміни технології підготовки ракових наростів, зокрема у період висушування свіжих ракових наростів створюють сприятливі умови для процесу перегнивання їх. В результаті цього зооспорангії звільняються від оточуючих клітин і, у зв'язку з цим значно полегшується процес їх виділення, а також за рахунок застосування сумішей чотирихлористого вуглецю і етилового ефір у з питомою вагою 1,18 та 1,23 для очистки зооспорангіїв від інших мікроорганізмів. Приклад конкретного виконання У період цвітіння або при зборі урожаю картоплі знімають ракові нарости з хворих рослин, подрібнюють їх на шматочки величиною 1-4 см 3 і розстеляють на плівку шаром у 3-5 см товщиною. Сушку ведуть повільно у тіні для того, щоб одночасно із висиханням у наростах проходив процес перегнивання. Під час сушки нарости періодично перемішують, щоб на них не виникало мокрого слизу. Нарости висушують до сухого стан у і в сухому місці зберігають до їх використання. Для виділення зооспорангіїв відбирають наважку сухих ракових наростів від 20 до 200 г - в залежності від потреб у чистій культурі гриба. Відібрану наважку розтирають у фарфоровій ступці і просіюють через сито з отворами 0,25 мм. З одержаного порошку виділяють зооспорангії у витяжній шафі. Для цього порошок ще подрібнюють до утворення максимальної кількості вільних зооспорангіїв у ньому шляхом 5-10-хвилинної гомогенізації його в етиловому ефірі при співвідношенні 1 об'єм порошку на 1,5-2 об'єми рідини з наступним висушуванням утвореного гомогенату. Сухим гомогенатом наповнюють п'яту частину циліндра, розмір якого підбирають в залежності від кількості гомогенату. Об'єм порошку в циліндрі заливають 3-4 об'ємами суміші чотирихлористого вуглецю і етилового ефіру (співвідношення 1:1,4) з питомою вагою 1,09. Суспензію розмішують скляною паличкою, циліндр закривають ваткою і залишають для відстоювання на 30 хвилин. Після утворення осаду надосадову рідину, в якій містяться легкі домішки гомогенату обережно зливають і фільтрують через фільтрувальний папір, а із осаду таким же способом виділяють легкі домішки ще 2-3 рази до просвітління надосадової рідини. Час відстоювання при кожному наступному виділенні легких домішок скорочують на 5 хвилин. При цьому відфільтровану від легких домішок суміш доводять етиловим ефіром до питомої ваги 1,09 і використовують повторно. Після виділення з осаду легких домішок виділяють зооспорангії. Осад заливають трьома об'ємами суміші чотирихлористого вуглецю і етилового ефіру (співвідношення 2:1) з питомою вагою 1,30. Суспензію старанно перемішують скляною паличкою, циліндр закривають ваткою і залишають для відстоювання на 20 хвилин. Після відстоювання надосадову рідину, в якій містяться зооспорангії, фільтрують на фільтрувальному папері, де зооспорангії залишаються, а відпрацьовану рідину доводять до питомої ваги 1,30 і використовують повторно. Виділення зооспорангіїв з осаду повторюють ще 2-3 рази до просвітлення надосадової рідини. Одержані на фільтрі зооспорангії висушують і переносять в циліндр на 50-100 мл. Сюди заливають суміш чотирихлористого вуглецю й етилового ефіру з питомою вагою 1,18 (співвідношення 1,13:1) у такій кількості, яка перевищує за об'ємом об'єм зооспорангіїв у 15-20 разів. Суспензію перемішують, циліндр закривають і залишають для відстоювання на 10 хвилин. Надосадову рідину зливають і фільтрують на фільтрувальному папері. Цю процедуру повторюють ще 2-3 рази до просвітлення надосадової рідини, а потім з цього осаду виділяють зооспорангії гриба. При виділенні зооспорангіїв об'єм осаду перемішують з 15-20 об'ємами суміші чотирихлористого вуглецю й етилового ефіру з питомою вагою 1,23 (співвідношення 1,38:1). Циліндр закривають і залишають на 5 хвилин для відстоювання. Утворену надосадову рідину заливають в ділильну лійку. Процедуру виділення зооспорангіїв з осаду повторюють ще 1-2 рази - доки в надосадовій рідині не зникне коричневе забарвлення, яке залежить від наявності в ній патогена. Ділильну лійку із зооспорангіями щільно закривають і залишають на 20 хвилин до утворення на поверхні рідини шару зооспорангіїв коричневого кольору. Після цього з лійки рідину випускають, а зооспорангії залишають, які за допомогою етилового ефіру переносять у чашку Петрі, де їх і висушують. Сухі зооспорангії переносять у флакон і зберігають при температурі 0-5°С до початку дослідів. Запропонований спосіб дозволяє швидко виділяти зооспорангії гриба в чистій культурі без домішок інших мікроорганізмів, що є необхідною умовою для проведення точних аналізів при всебічному вивченні патогена. Література. 1. Голик И.В. Состав для выделения зооспорангиев Synchytrium endobioticum (Sshilb.) Perc. из раковых наростов картофеля. А.c. СССР № 254944,1969. 2. Karling I.S. Synch ytrium, New York and London, 1964. - P.470.