Спосіб виділення днк мікобактерій з зразків фекалій та тканин великої рогатої худоби

Спосіб виділення ДНК мікобактерій з зразків фекалій та тканин великої рогатої худоби, що включає відділення та накопичення ДНК, який відрізняється тим, що тварину пперімунізують термічно шактивованими штамами мікобактерій для одержання політональних антитіл, а суспензію знезаражених фекалій або тканин великої рогатої худоби з цими антитілами обмежують магнітними гранулами, які розташовані в магнітному полі, після чого імунологічні комплекси знезаражують Винахід відноситься до ветеринарної мікробіологи, імунологи та бютехнологп, а саме до способу виділення ДНК мікобактерій Mycobactenum bovis, Mycobactenum tuberculosis та Mycobactenum avium subsp paratuberculosis В основі способу виділення ДНК мікобактерій лежить ізолювання та накопичення специфічної ДНК мікобактерій у КІЛЬКОСТІ, достатньої для и детекцм в полімеразно-ланцюговій реакції в зразках фекалій та тканин від великої рогатої худоби (ВРХ) В полімеразноланцюговій реакції використовують виявлення специфічного фрагменту ДНК збудника інфекцій в біологічних пробах Існує декілька способів виділення ДНК мікобактерій Існує спосіб, запропонований Miller J, Jenny A, Rhyan J et al (Detection of Mycobactenum bovis in formalin-fixed, parafm-embedded tissues of cattle and elk by PCR amplification of an IS6110 sequence specific for Mycobactenum tuberculosis complex organisms J Vet Diagn Invest 1997, 9 244-249) для виділення ДНК мікобактерій з тканин, попередньо фіксованих формаліном та оброблених парафіном Спосіб виконується таким чином Зрізи тканини по 5мкм розміщують у центріфужній пробірці з додаванням 200мкл стерильної води, яка містить 0,5% Tween 20, потім центрифугують при 16000 х g на протящу 1 хвилини Пробірку розміщують у термостаті при 100°С на протязі 10 хвилин, після чого проводять заморожування у рідкому азоті Цикл нагрівання заморожування повторюють ще один раз, і пробірку знову кип'ятять протягом 10 хвилин, після чого центрифугують при 3000 х g протягом 20 хвилин Надосадову рідину переміщують в іншу пробірку, зберігають при температурі -20°С і використовують у ПЛР аліквоту 5мкл Недоліком способу є те, що він є недостатньо чутливим, призводить до значної деградації ДНК, що не дозволяє проводити подальші дослідження виділеної ДНК, не дозволяє накопичити достатню концентрацію ДНК мікобактерій для подальшого проведення ПЛР-аналізу Існує «Способ выделения ДНК микобактерий» (Россия, патент №2119954, от 27 12 1996, ВНИИЗЖ, кл C12N15/10, Грибанов и др) Цей спосіб можливо використовувати в молекулярній біологи для селективного виділення дволанцюгової ДНК, одноланцюгової ДНК або РНК Це рішення може бути прототипом Спосіб виконується відділенням та накопиченням ДНК Нуклеїнову кислоту сорбують на аеросилі при необхідній концентрації хаотропного агенту шляхом додавання до проби аеросилу, суміш інкубують, осаджують центрифугуванням, промивають Здійснюють елюювання ДНК В присутності високих концентрацій хаотропних агентів сорбують дволанцюгову ДНК, а при низьких - РНК і одноланцюгову ДНК Недоліком його є те, що він є трудомісткий, вимагає значних матеріальних затрат, результат, о> (О 61779 отриманий за допомогою цього методу є недостатньо чітким, що ускладнює скрінінг В основу винаходу, що передбачається, поставлено завдання розробити спосіб виділення ДНК мікобактерій виділенням та накопиченням ДНК, шляхом пперімунізацм тварини термічно шактивованими штамами мікобактерій для одержання політональних антитіл при цьому суспензія з незаражених фекалій або тканин ВРХ для розподілу клітин мікобактерій з цими антитілами обмежуються магнітними гранулами, які розташовані в магнітному полі, після чого імунологічні комплекси знезаражують, щоб забезпечити спосіб виділення ДНК мікобактерій зразків фекалій та тканин ВРХ Спосіб виконується таким чином Суть імунологічного дослідження полягає в одержанні політональних антитіл тварини шляхом пперімунізацм різними термічно шактививованими штамами мікобактерій, що використовують для виготовлення овечого імуноглобуліну G Суспензію фекалій покривають розчином імуноглобулінів G, змішуючи зі зразками фекалій, знезаражують, шкубують, і потім, для розподілу клітин мікобактерій, обмежують магнітними гранулами, розташованими в сильному магнітному полі Верхній шар видаляють, а ресуспендовані гранули, на яких розміщені імунологічні комплекси з високою концентрацією збудників туберкульозу та мікобактерюзів, знезаражують до інкубації Ця суспензія є збагаченою збудниками Таким чином цей спосіб дозволяє сконцентрувати та виділити збудників із проб фекалій та тканин - обережно відбирали надосадову рідину (до 1мл) і ресуспендували гранули в обсязі, що залишився, - використовували 0,5мл для введення в MGIT-пробірку Приклад 2 - Зг фекалій змішували з Юмл стерильного РВ+0,05т % Tween і добре перемішували на вортексі, - центрифугували при 350д на протязі Зхв , - готували пробірки з 20мкл гранул і додавали 1,4мл надосадової рідини, - шкубували змішані зразки (DYNAL) на протязі ЗОхв при кімнатній температурі, - розділяли гранули і суспензію концентратором магнітнних часток (DYNAL) на протязі Юхв, акуратно видаляли залишки рідини аспірацією, - ресуспендували гранули в суміші 0,75мл PBS+0,05% Т\л/ееп+0,75мл MYCOPREP (BD) у вортексі на протязі ЗОсек , - обережно збовтували 20 хв , - розділяли гранули і суспензію концентратором магнітних часток (DYNEL), акуратно видаляли залишки рідини аспірацією, - ресуспендували гранули в суміші 1 мл PBS+0 05% Tween (pH 6,8), - використовували 0,5мл для введення в MGIT-пробірку Приклад З - брали 5г промитої тканини, зрізаної стерильним лезом у Falcon-пробірки, - гомогенізували зі стерильним морським Приклад 1 - готували розчин гексадецилпіридіум хлориду 0,95% у ВНІ (9 5м НРС+18 5м ВНІ+ЮООмл дистильованої води), - брали Змл фекалій+ЗОмл НРС-суспензм (у Falcon-пробірці) і ретельно перемішували на вортексі, - дали фекаліям осісти (10-20хв ), - брали 20мл надосадової рідини і потім струшувати ЗОхв, - шкубували з вечора при кімнатній температурі, - центрифіугували при ЮООд ЗОхв , - додавали 5мл MYCOPREP і перемішували у вортексі ЗОсек, - обережно збовтували 20хв , - додали 20мл фосфатної буферної солі, - центрифугували при 3500 х g 20хв при +8°С, - обережно витягали надосадову рідину на 12мм вище гранул, - ресуспендували гранули з 1мл РВС (розчин фосфатного буфера), - використовували 0,5мл для введення в MGIT-пробірку Спосіб є високочутливим і специфічним Чутливість способу складає від 2 до 100 клітин в досліджуваному зразку Комп'ютерна верстка Н Лисенко ПІСКОМ, Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119