Спосіб диференційованого визначення джерел та вмісту супероксиданіонрадикалу у тканинах тварин

Винахід відноситься до галузі біології, медицини і сільського господарства та може бути використаний для з'ясування походження, концентрації і співвідношення супероксиданіонрадикалів у тканинах тварин. У світі відомі способи визначення супероксиданіонрадикалів, продукованих нейтрофілами крові, що базуються на біохемолюмінісценції та не характеризуються великою специфічністю [4]. Існує також спосіб, в основі якого лежить перетворення нітросинього тетразолію (НСТ) у гранули ди формазану, при цьому розрахунок виражають в середньому цитохімічному коефіцієнті, або формазанпозитивних гранулах [2]. Точність і інформативність при цьому є низькою. Цей недолік був дещо усунений спектрофотометричним методом[5], який можна використати тільки для дослідження нейтрофілів, але отриманий результат виражають у відносних одиницях екстинкції [6]. Отже, викладені способи мають слідуючі недоліки: вони - невисоко-специфічні, отримані результати виражаються в відносних одиницях, призначені тільки для дослідження крові та не дають змоги встановити джерела продукування супероксиданіонрадикалів. Найближчим аналогом до винайденого є спосіб [1], що дозволяє визначити спектрофотометрично НСТтестом продукцію супероксиду в гомогенаті тканин з стимуляцією відновленим нікотинаденіндинуклеотидфосфа том (НАДФ·Н) та бактеріальними ліпосахаридами. Недоліком цього прототипу є отримання даних про кількість супероксиданіонрадикалу знову в відносних одиницях екстинкції, що значно ускладнює вивчення шляхів продукування цих радикалів, особливо мітохондріальних. Поставлена мета досягається за рахунок визначення вмісту супероксиданіонрадикалів у зразках тканин тварин, при цьому з'являється можливість диференційованого аналізу шляхів їх продукування з слідуючи джерел: внутрішньоклітинних - електронно-транспортних ланцюгів окислення мембран мітохондрій (відновленим нікотинаденіндинуклеотидом (НАД·Н) - цитохромоксидаза) і гладенької ендоплазматичної сітки (НАД·Н-цито хром Р-450) та позаклітинних на мембранах фагоцитів (Н АД·Н - оксидаза, ксантиноксидаза). Пропонований спосіб визначення відрізняється від прототипу слідуючими ознаками: - з'являється можливість аналізувати концентрації супероксиданіон-радикалу фагоцитарного електроннотранспортного ланцюга, з врахуванням загального фону не стимульованої продукції супероксиду; - додавання стимуляторів перед інкубацією та введення НСТ дає змогу уникнути його відновлення воднем від проміжних перевідновлених ділянок ланцюгів; - оптимальною концентрацією гомогенату органів, часом інкубації, компонентами реакційної суміші та кількості розчинника; - для вимірювання продукції супероксиданіонрадикалу використано більш доступний і дешевший їх індуктор від фагоцитів тканин - пірогенал або зимозан; - вираження розрахунку кількості супероксиду проводиться в чітко визначених величинах системи СІ. Патентний пошук показав, що жоден з аналогів не має таких широких та комплексних можливостей визначення вмісту та походження супероксиданіонрадикалів від мітохондріального електронно-транспортного ланцюга при інкубації за допомогою стимуляції - НАД·Н, мікросомального електронно-транспортного ланцюга та NO-синтетази - НАД·Н, фагоцитарного електронно-транспортного ланцюга і ксантиноксидази - пірогеналом або зимозаном. Таким чином, використання винайденого способу, що заявляється, відкриває можливість отримання даних про вміст і співвідношення супероксиданіонрадикалу мітохондріального, мікросомального та особливо фагоцитарного походження, дасть змогу визначати індуктори вільнорадикильного окислення в тканинах тварин на різних етапах розвитку, відкриє шлях для пізнання і з'ясування причин апоптозу клітин. Джерела інформації: 1. Коган А.Х., Грачев С.В., Елисеева С.В.,Быевич С.Н. Свойство вуглекислого газа ингибировать генерацію супероксидного анионрадикала клетками и его биологическое значение// Вопросы медицинской химии. - 1997. - №1. -С.193-200. 2. Лабораторные исследования в клинике. Спавочник// Под ред. В.В.Меньшова. - М.: Медицина, 1987. 368с. 3. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гисто химия ферментов. Лабараторные методы. М.: Мир, 1982. - 270с. 4. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. -Казань.-Магариф, 1993, - 192с. 5. Объем и методы генотоксической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ. Ленинград, 1989. - 90с. 6. Metcalf J.A., Gallin J.I., Nauseef W.M., Root R.K. Laboratory manual of neutrofhil function, N.-Y.: Raven Press, 1986. - 192p.