Поліпептид, що містить укорочену послідовність вірусу гепатиту с, ізольований епітоп, реагент для імуноаналізу на вірус гепатиту с (варіанти), спосіб виявлення наявності антитіл (варіанти)

1. Полипептид, содержащий усеченную последовательность вируса гепатита С, отличающийся тем, что указанная усеченная последовательность вируса гепатита С включает одиночный эпитоп, содержащий октамер вируса гепатита С, причем октамер выбран из группы, состоящей из GRTWAQPG, LINTNGSW, FDQGWGPI, NNTRPPLG, VVPQSEQV, AAARVTAI, VESENKVV, а указанная усеченная последовательность вируса гепатита С имеет максимальную длину, равную приблизительно 25 аминокислотам. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что усеченная последовательность вируса гепатита С имеет максимальную длину, равную приблизительно 20 аминокислотам. 3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что усеченная последовательность вируса гепатита С имеет максимальную длину, равную приблизительно 10 аминокислотам. 4. Полипептид, содержащий усеченную последовательность вируса гепатита С, отличающийся тем, что указанная усеченная последовательность вируса гепатита С состоит из эпитопа, содержащего октамер вируса гепатита С, причем октамер выбран из группы, состоящей из PKARRPEG, GRTWAQPG, LINTNGSW, FDQGWGPI, NNTRPPLG, VVPQSEQV, AAARVTAI, VESENKVV, EAQALPVW. 5. Изолированный эпитоп, содержащий октамер вируса гепатита С, отличающийся тем, что указанный октамер выбран из группы, состоящей из PKARRPEG, GRTWAQPG, LINTNGSW, FDQGWGPI, NNTRPPLG, VVPQSEQV, АААR VTAI, VESENKVV, EAQALPVW. 6. Реагент для иммуноанализа на вирус гепатита С, содержащий эпитоп, отличающийся тем, что он содержит эпитоп по п. 5. 7. Реагент для иммуноанализа на вирус гепатита С, содержащий полипептид, отличающийся тем, что он содержит полипептид по п. 1. 8. Реагент для иммуноанализа на вирус гепатита С, содержащий полипептид, отличающийся тем, что он содержит полипептид по п. 2. 9. Реагент для иммуноанализа на вирус гепатита С, содержащий полипептид, отличающийся тем, что он содержит полипептид по п. 3. 10. Реагент для иммуноанализа на вирус гепатита С, содержащий полипептид, отличающийся тем, что он содержит полипептид по п. 4. 11. Способ обнаружения наличия антител, иммунореактивных к белкам вируса гепатита С в пробе, отличающийся тем, что указанный метод включает контактирование иммобилизованного реагента для иммуноанализа по п. 6 с указанной пробой и определение антител, связанных с указанным реагентом. 12. Способ обнаружения наличия антител, иммунореактивных к белкам вируса гепатита С в пробе, отличающийся тем, что указанный метод включает контактирование иммобилизованного реагента для иммуноанализа по п. 7 с указанной пробой и определение антител, связанных с указанным реагентом. 13. Способ обнаружения наличия антител, иммунореактивных к белкам вируса гепатита С в пробе, отличающийся тем, что указанный метод включает контактирование иммобилизованного реагента для иммуноанализа по п. 8 с указанной пробой и определение антител, связанных с указанным реагентом. 14. Способ обнаружения наличия антител, иммунореактивных к белкам вируса гепатита С в пробе, отличающийся тем, что указанный метод включает контактирование иммобилизованного реагента для иммуноанализа по п. 9 с указанной пробой и определение антител, связанных с указанным реагентом. 15. Способ обнаружения наличия антител, иммунореактивных к белкам вируса гепатита С в пробе, отличающийся тем, что указанный метод вклю (19) (21) 93004481 (22) 24.06.1992 (24) 15.08.2001 (31) 722489 (32) 24.06.1991 (33) US (86) PCT/US92/05388, 24.06.1992 (46) 15.08.2001, Бюл. № 7, 2001 р. (72) Чін Девід Вай, US, Раттер Вільям, US (73) ЧІРОН КОРПОРЕЙШН, US (56) 1. EP, A, 0419182 (AKIRA OYA ET AL.) 27, 1991. 2. Peptide Chemistry, October 1990, Y. Shimonishi; Protein Research Foundation, Osaka (JP), E. Munekata et al.: “Epitope-mapping of hepatitus C virus constituting protein”, pages 211– 214. C2 (54) ПОЛІПЕПТИД, ЩО МІСТИТЬ УКОРОЧЕНУ ПОСЛІДОВНІСТЬ ВІРУСУ ГЕПАТИТУ С, ІЗОЛЬОВАНИЙ ЕПІТОП, РЕАГЕНТ ДЛЯ ІМУНОАНАЛІЗУ НА ВІРУС ГЕПАТИТУ С (ВАРІАНТИ), СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ НАЯВНОСТІ АНТИТІЛ (ВАРІАНТИ) 40572 чает контактирование иммобилизованного реагента для иммуноанализа по п. 10 с указанной пробой и определение антител, связанных с указанным реагентом. ____________________ Настоящее изобрете ние относится к веществам и способам предотвраще ния распространения инфекции вируса гепатита С (HCV). В частности, изобретение относится к полипепти дам, используе мым в качестве иммунологических реагентов для выявления, предуп реждения и лечения инфекций HCV. Вирус гепати та С был впервые идентифи цирован и описан Hougton et al. в качестве причины гепатита, отличного от гепатита А и гепати та В (NANBH). Это приве ло к выявлению ряда основных и специфи ческих полипептидов, применяемых в качестве иммунологических реагентов (cм., например, Houghton et al., EPO Pub. No. 318, 216; Houghton et al., EPO Pub. No. 388, 232; Choo et al., Science (1989) 244:359 – 362; Houghton et al., Hepatology (1991) 14:381 – 388; Kuo et al., Science (1989) 244:362 – 364). В указанных публикациях приведен известный уровень техники с углубленным рассмотрением проблем HCV в целом, в также вопросов изготовления и использования полипептидных иммунологических реагентов HCV. Поэтому для краткости указанные публикации в данном описании используются, в частности, в качестве ссылок. Другие исследователи использовали и развили работу Houghton et al. (cм., например, Highfield et al., UK Pat. App. 2, 239, 245 (The Wellcome Foundation Ltd.); Wang, EPO Pub. No. 442, 394 (United Biomedical Inc.); Leung et al., EPO Pub. No. 445, 423 (Abbott Laboratories); Habits et al., EPO Pub. No. 451, 891 (Akzo N.V.); Reyes et al., PCT Pub. No. WO 91/15516 (Genelabs Inc.); Maki et al., EPO Pub. No. 468, 657 (Tonen Corp.); Kamada et al., EPO Pub. No. 469 348 (Shionogy Seiyaku K.K.). Важным шагом вперед в медицинской практике является создание чувствительных специфических мето дов скрининга и идентифи кации носителей HCV и крови или составляющих крови, содержащи х HCV. Ге патиты, наблюдаемые после переливания крови (РТН) имеют место приблизительно у 10% пациентов, подвергнутых этой операции, при этом HCV отмечался при более чем 90% таких случаев. Основной проблемой для данной болезни является часто встречающее ся развитие хронического разруше ния печени (25– 55%). Лечение пациентов, также как и предотвращение передачи HCV кровью или составляющи ми крови или при близком личном контакте, требуют надежных диагностических и прогностических средств таких, например, как полипептиды HCV для обнаружения анти тел, связанных с HCV. Такие полипептиды также используются в качестве вакцин и иммунотерапевтических агентов для предотвраще ния и/или лечения болезни. исследования клинического курса болезни и эпидемиологии HCV у населения. Изобретение относится к характе ристикам новых эпи топов HCV. Особенность этих эпитопов позволяет изго тавливать полипептидные препараты, которые иммунологически взаимодействуют с анти телами, связанными с HCV и/или вырабатывают антитела к HCV in vivo. Та кие полипептидные препараты используются в качестве эталонов или реагентов в диагностических тестах и /или в качестве компонентов вакцин. Антите ла, включая, например, как поликлональные, так и моноклональные, направленные против эпитопов HCV, содержащи хся внутри этих по липептидных последовательностей, также являются полезными реагентами, например, для диагностических тестов, в качестве те рапевтических средств, для скрининга анти вирусных агентов и для выделения или выделения/очистки полипептидов или частиц HCV. В наиболее широком смысле настоящее изобретение направлено на создание полипептидов, содержащи х эпито пы HCV с новыми характеристи ками, приведенными в настоящем описании, способов изготовления таких полипепти дов (например, рекомбинантных и синтети ческих способов), способов применения указанных полипептидов (например, в диагности ке, в терапии, в вакцинах), и изделий, композиций или рецептов, направленных на такое применение (например, полипептиды, связанные с иммунопробой или другим носителем, фармацевтическими композициями для перорального или инъекционного введения). Аналогичным образом, антитела (поликлональные, моноклональные или их эквиваленты такие, как связующие участки, одноцепочечные белки, связывающие антигены, и т.д. (к эпитопам HCV, рассмотренным в данном описании, также включаются в объем настоящего изобретения, как и способы создания таких антител, способы их использования (например, в диагностике, в терапии, вакцинах), а также изделия, композиции и рецепты, направленные на такое применение (например, антитела, связанные с иммунопробой или другим носителем, фармацевтическими композициями для перорального или инъекционного введения). Другие аспекты изобретения относятся к наборам для анализа образцов на наличие антигенов HCV, содержащим вышеуказанные антите ла в подхо дящем контейнере. Еще одни аспекты изобрете ния относятся к наборам для анализа образцов на наличие антител, подавляющи х антигены HCV, со держащим полипептид, описанный выше, в соответствующем контейнере. К другим аспектам изобретения относятся: способ изготовления полипепти да, содержащего вновь описанные эпитопы HCV, включающий инкубирование клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим векто ром, содержащим последовательность, кодирующую полипептид, со держащий эпитопы HCV, при условиях, позволяющих Поскольку HCV является относительно новым агентом, имеется насущная необхо димость в выявлении дополнительных иммунологи ческих реагентов, что позволит проводить дальнейшие 2 40572 экспрессировать указанный полипептид; и полипептид, содержащий та кой эпитоп HCV, изготовленный этим способом. В изобретение также включены иммуноанализы. К ним относятся иммуноанализ для обнаружения антигена HCV, включающий инкубирование образца, в котором предполагается наличие антигена HCV с анти телом, как это описано выше, при условиях, позволяющих образовать комплекс антиген-антите ло, и для обнаружения комплекса антиген-антите ло, содержащего анти тело. Иммуноанализ для выявления анти тел к HCV, включающий инкубирование образца, в котором предполагается наличие антител к HCV с полипептидом, как это описано выше, при условиях, позволяющи х создать комплекс антитело-антиген; и для обнаружения комплекса антитело-антиген, содержащего полипептид. В изобретение, кроме того, включены вакцины для лечения инфекции HCV, содержащие иммуногенный пептид, включающий вы шеописанный эпитоп HCV. Еще одним аспектом изобрете ния является способ создания антител к HCV, включающий введение пациенту вы деленного иммуногенного полипепти да, содержащего эпитон HCV, рассмотренного в данном описании, в количестве, достаточном для осуществления иммунной реакции. Вышеуказанные аспекты настояще го изобрете ния реализуются за счет вновь созданных эпито пов HCV в соответствии с формулой где aa означает аминокислоту; x и y соответствуют целым числам, причем y-x ³ 6; aax–aay указывают на часть аминокислотной последовательности, приведенной на рис. 1, и х вы бирается из группы, содержащей 35 (где y меньше 45), 80 (где y меньше 90), 95 (где y меньше 110), 99 (где y меньше 120), 100 (где y меньше 150), 190 (где y меньше 210), 500 (где y меньше 550), 600 (где y меньше 625), 1260 (где y меньше 1280), 1569 (где y меньше 1931), 1570 (где y меньше 1590), 1694 (где y меньше 1735), 1949 (где y меньше 2124), 1950 (где y меньше 1985), 2000 (где y меньше 2050), 2005 (где y меньше 2025), 2054 (где y меньше 2223), 2250 (где y меньше 2330), 2287 (где y меньше 2385), 2290 (где y меньше 2310), 2345 (где y меньше 2375), 2348 (где y меньше 2464), 2445 (где y меньше 2475), 2470 (где y меньше 2490), 2605 (где y меньше 2620), 2780 (где y меньше 2830), 2796 (где y меньше 2886), 2800 (где y меньше 2850), и 2885 (где y меньше 2905). В разных вариантах вы полнения изобретения в каждой из вышеприведенных формул разность x–y может быть меньше или равна 10, 20, 30, 40 или 50. На фиг 1. представлен полипротеин изолята прототипа HCV – HCVI. На фиг. 2 показана составная последовательность кДНК для HCVI. На фиг. 3 показана обобщающая типичная нуклеотидная последовательность человеческого изолята 23, варианты последовательности показаны ниже строки вышеуказанной последовательности. Также показаны аминокислоты, закодированные в обобщающей типичной последовательности. На фиг. 4 показана обобщающая типичная нуклеотидная последовательность человеческого изолята 27, варианты последовательности показаны ниже строки вышеуказанной последовательности. Также показаны аминокислоты, закодированные в обобщающей типичной последовательности. На фиг. 5 показаны совмещен ные нуклеотидные последовательности челове ческих изолятов 23 и 27 и HCVI. Гомологичные последовательности обозначены символом (*). Него мологичные последовательности отпечатаны мелким шрифтом. На фиг. 6 показаны совмещенные аминокислотные последовательности челове ческих изолятов 23 и 27 и HCVI. Гомологичные последовательности обозначены символом (*). Него мологичные последовательности отпечатаны мелким шрифтом. На фиг. 7 показано сравнение составных совмещенных нуклеотидных последовательностей изолятов Thorn, ECI, HCT No. 18 и HCVI. На фиг. 8 показано сравнение нуклеотидных последовательностей ECI0 и составной последовательности HCVI; последовательность ECI0 расположена по линии выше линии точек, последовательность HCVI на линии ниже линии точек. На фиг. 9 показано сравнение аминокислотных последовательностей 117– 308 (относительно HCVI), закодированных на участках "EnvL" обобщающих ти пичных последовательностей че лове aax–aay, в которой aa означает аминокислоту; x и y соответствуют целым числам, причем y– x ³ 6; aax–aay указывают на часть аминокислотной последовательности, приведенной на фиг. 1; и x вы бирается из группы, содержащей 23–34, 36, 66–79, 81–94, 96–98, 101–103, 186–189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297–299, 321, 347, 357, 413, 414, 432, 465–471, 480–484, 501, 502, 521, 540–549, 579, 594–599, 601–613, 641, 662–665, 685, 705, 706, 729, 782–789, 801, 851–855, 893, 916, 928, 946, 952–954, 1026, 1072, 1109, 1112– 1117, 1218, 240, 1280–1285, 1322, 1338, 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532–1535, 1560, 1561, 1566–1568, 1571–1577, 1601–1607, 1615–1620, 1655, 1695, 1710–1712, 1728, 1729, 1758–1762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 1908– 1913, 1925, 1940–1948, 1951, 1966–1969, 1999, 2001–2004, 2006–2014, 2024, 2048–2053, 2055– 2057, 2071, 2088–2093, 2108, 2122–2148, 2165, 2187, 2226–2232, 2244–2249, 2267, 2281–2286, 2288, 2289, 2345–2327, 2346, 2347, 2349, 2382, 2401, 2417–2422, 2439–2444, 2446–2456, 2469, 2471–2476, 2495, 2533, 2534, 2573–2578, 2602– 2604, 2606–2612, 2632–2638, 2660, 2676–2679, 2688–2693, 2707, 2721, 2757–2762, 2779, 2794, 2795, 2797–2799, 2801, 2802, 2817–2843, 2863– 2867, 2878–2874, 2886–2895. Вышеуказанные цели достигаются также за счет использования эпито пов HCV в соответствии с фор мулой aax–aay, 3 40572 ческих изолятов НСТ No. 18, JH 23, JH 27, Thorne, ECI и HCVI. На фиг. 10 показано сравнение аминокислотных последовательностей 330–360 (относительно HCVI), закодированных на участках "EnvR" обобщающих ти пичных последовательностей человеческих изолятов НСТ No. 18, JH 23, JH 27, Thorne, ECI и HCVI. І. Определения Термин "вирус гепати та С" или "HCV" относится ко вновь выявленным разновидностям вирусов, патогенные штаммы которых являются причиной NANBH и ослабленных штаммов или дефектных интерфе рирующи х частиц, выделенных из них. См. публикации, приведенные в разделе "Предпосылки создания изобретения". Геном HCV образуется из РНК. Известно, что вирусы, содержащие РНК, имеют относительно высокую степень спонтанной мутации, т.е., по известным данным, порядка 10-3...10-4 на внедренный нуклеотид (Fields & Knipe (1986)). Таким образом, поскольку гетерогенность и текучесть генотипа являются присущи ми вирусам РНК, имеется множество штаммов/изолятов, которые могут быть вирулентными или авирулентными внутри разновидности HCV. Информация о распространении, идентифи кации, выявлении и выделении штаммов или излятов вирусов HCV достаточно хорошо представлена в литературе. Кроме того, настоящее описание позволяет осуществлять диагностику и изготавливать вакцины для различных штаммов/изолятов, а также композиции и способы, применяемые в операциях скрининга для антивирусных агентов при фармакологическом использовании, например, агентов, которые подавляют репликацию HCV. В данном описании приводится информация о нескольких различных штаммах/изолятах HCV, в частности о штамме или изоляте CDC/HCVI (также называемом HCVI). Информация, полученная от одного штамма или изолята, такая, как частично геномная или аминокислотная последовательность, является достаточной, чтобы позволить специалистам в данной области, используя стандартные методы, вы делить новые штаммы/изоляты и идентифицировать, являются ли эти новые штаммы/изоляты HCV. Например, ниже описаны несколько различных штаммов/изолятов. Указанные штаммы, которые были получены из ряда человеческих сывороток (и из различных географических районов), были выделены, используя информацию из геномной последовательности HCVI. Данные, приведенные в данном описании, показывают, что HCV может состоять в дальнем родстве с flavi viridae. Семейство Flavi virus содержит большое число вирусов, кото рые являются небольшими патоге нами человека, содеpжащими оболочку. Морфология и состав частиц Flavivirus известны и рассмотрены в Бринтоне (1986). В общем случае, в морфологическом отношении Flavivirus содержат центральный нуклеокапсид, окруженный липидным двойным слоем. Вироспоры имеют сферическую форму с диаметром 40...50 нм. Их ядра имеют диаметр 25...30 нм. Вдоль внешней поверхности оболочки вироспоры располагаются выступы длиной 5...10 нм с оконечными выпуклостями с диаметром около 2 нм. Типичны ми представите лями семейства являются вирус желтой лихо радки, вирус За падного Нила, вирус тропической лихо радки. Они обладают геномами плюс РНК (приблизительно 11000 нуклеотидов), что несколько превышает это количество у HCV и кодируют предшественника полипротеина, содержащего около 3500 аминокислот. От полипептида указанного предшественника отщепляются отдельные вирусные белки. Установлены геномная структура и нуклеотидная последовательность геномной РНК HCV. По-видимому, ге ном представляет собой однонитевую РНК, со держащую приблизительно 10000 нуклеотидов. Указанный геном является положительно скрученным и имеет непрерывную трансляционную открытую счи тывающую рамку (ОСР), которая кодирует полипротеин, содержащий около 3000 аминокислот. В ОСР структур ный белок (и), по-видимому, кодируется приблизительно в первой четверти N-терминального участка, при этом большая часть полипротеина ответственна за неструктур ные белки. При сравнении с известными вирусными последовательностями небольшие, но достаточно заметные гомологии наблюдались у неструктур ных белков семейства flavi virus и у пестивирусов (которые в настоящее время также считаются относящимися к семейству Fla vivirus). Исходя из условных аминокислот, закодированных в нуклеотидной последовательности HCVI, и других данных, возможными белковыми доменами закодированного полипротеина HCV, а также ориенти ровочными границами являются: Условный домен С (нуклеокапсидный белок) Е1 (белок оболочки вириона) Е2/NS1 (оболочка?) NS2 (неизвестная функция) NS3 (протеаза?) NS4 (неизвестная функция) NS5 (полимераза) Ориентировочная граница (номера аминокислот) 1– 191 192– 383 384– 800 800– 1050 1050– 1650 1650– 2100 2100– 3011 (конец) Указанные области, однако, являются гипотетическими. Например, граница между Е1–NS2 возможно лежит на участке 750–810, а граница между NS3–NS4 нахо дится приблизительно на участке 1640–1650. Имеются также данные о том, что версия С 191 аа является предшественником, который затем превращается (например, до приблизительно 170 аа по длине) в зрелый продукт, и что каждый из белков NS2, NS4 и NS5 в дальнейшем превращаются в два зрелых белка. Ожидается, что различные штаммы, изоляты или подтипы HCV содержат вариации у аминокислоты и нуклеиновых кислот по сравнению с HCVI. Ожидают, что многие изоляты проявляют большую го мологию (т.е. бо лее 40%) в полной аминокислотной последовательности по сравнению с HCVI. Однако можно также обнаружить, что имеются другие менее гомологичные изоляты HCV. И х можно было бы определить как HCV сог 4 40572 ласно различным крите риям, таким, например, как ОСР, нахо дящаяся в диапазоне от приблизительно 9000 нуклеотидов до приблизительно 12000 нуклеотидов, кодирующая полипротеин, аналогичный по размеру HCVI, закодированный полипротеин, аналогичный по гидрофобному или/и антигенному характеру HC VI, и наличие колинеарных пептидных последовательностей, которые сохраняются с HCVI. Кроме того, ге ном должен представлять собой плюс РНК. HCV кодирует, по крайней мере, один эпитоп, кото рый может быть иммунологически идентифи цирован с эпитопом в полипротеине HCVI. Указанный эпитоп является специфи ческим для HCV по сравнению с ранее упомянутыми Flaviviruses. Специфичность указанного эпитопа может быть определена по его иммунологической реактивности с антителами HCV и по отсутствию иммунологической реактивности с антителами известных разновидностей Flavi virus. Специалистам в данной области известны способы определения иммунологической реактивности, например, с помощью радиоиммунной пробы, пробы ELISA, гемагглютинации. В данном описании приводится ряд примеров подхо дящи х способов для проведения анализов. С другой стороны, для оценки понятия "специфичность" может использоваться сравнение последова тельности эпито па HCV с ранее известными последова тельностями членов семейства Flavi virus. Помимо вышеизложенного, для идентификации штамм/изолята в качестве HCV пригодны как в отдельности, так и в комбинации следующие параметры гомологии нуклеиновой кислоты и гомологии аминокислоты. Поскольку штаммы и изоляты HCV являются эволюционно связанными, ожидается, что полная гомология геномов на нуклеотидном уровне может быть равной около 10% или более, возможно будет равной около 40% или более, возможно будет составлять около 60% или более и с еще большей возможностью составлять 80% или более; и, кроме того, будут соответствующие смежные последовательности, по крайней мере, 13 нуклеоти дов. Необхо димо отметить, что внутри генома HCV имеются неустойчивые и гипернеустойчивые области; таким образом, ожидается, что го мология на этих участках будет значительно меньше, чем гомология у полного генома. Соответствие между условной геномной последовательностью штамма HCV и, например, последовательность кДНК CDC/HCVI может быть определено способами, известными специалистам. Например, оно может определяться путем непосредственного сравнения информации, имеющейся в последовательности полинуклеоти да условного HCV, и информации, имеющей ся в последовательности кДНК HCV, рассматриваемой в данном описании. Кроме того, оно может быть определено, например, путем гибридизации полинуклеотидов в условиях, при которых фор мируются стабильные дуплексы между го мологичными участками (например, дуплексы, которые могли бы использоваться до гидролитического расщепления S1), с последующим гидролитическим расщеплением однонитевой специфической нуклеазой (ами) и дальнейшим определением размера расщепленных фрагментов. Из-за эволюционного соотноше ния штаммов или изолятов HCV возможные штаммы или изоляты HCV могут быть иденти фицированы за счет их гомологии на полипептидном уровне. В общем случае ожидается, что штаммы или изоляты HCV обладают, по крайней мере, приблизительно 10% гомологичности, бо лее, чем приблизительно 40% гомологичности, возможно, более, чем приблизительно 70% гомологичности и с еще большей вероятностью, более, чем приблизительно 80% гомологичности, а некото рые штаммы или изоляты могут обладать гомологичностью, превышающей приблизительно 90% на полипептидном уровне. Специалистам в данной области известны способы определения гомологии аминокислотных последовательностей. Например, можно непосредственно определить аминокислотную последовательность и сравнить ее с последовательностями, приведенными в данном описании. С другой стороны, можно определить нуклеотидную последовательность геномного вещества условного HCV (обычно через промежуточную кДНК), определить аминокислотную последовательность, закодированную в ней, и сравнить соответствующие области. В смысле, используемом в данном описании, выражение “полинуклеотид”, "вы деленный из" обозначенной последовательности, относится к нуклеотидной последовательности, которая составлена из последовательности, содержащей, по меньшей мере, приблизительно 6 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 8 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 10–12 нуклеоти дов и еще более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 15–20 нуклеотидов, соответствующи х участку обозначенной нуклеотидной последовательности. Термин "соответствующий" означает гомологичность или комплементарность относительно обозначенной последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность участка, из кото рого выделяется полинуклеотид, была гомологичной или комплементарной последовательности, которая специфична для генома HCV. Вопрос о том, является ли последовательность специфичной относительно генома HCV может быть решен, используя способы, известные специалистам в данной области. Например, последовательность можно сравнить с последовательностями, находящимися в банках данных (на дату приорите та), например, в генобанке с тем, что бы определить, присутствует ли эта последовательность в неинфицированном хозяине или други х организмах. Последовательность можно также сравнить с известными (на дату приоритета) последовательностями других вирусных агентов, включая агенты, кото рые, как известно, вызывают гепатит, например, HAV, HBV и HDV, и с членами семейства Flavi viridae. Соответствие или несоответствие выделенной последовательности др угим последовательностям можно определить путем гибридизации при соответствующих обязательных условиях. Специалистам известны способы гибридизации для определения соответствия последовательности нуклеиновых кислот. См., например, Maniatis et al. (1982). Кроме того, несоответствие дуплексных нуклеоти дов, об 5 40572 разованных при гибридизации, может быть определено известными способами, включая, например, гидролитическое расщепление с помощью нуклеазы, например, S1, которая подвергает гидролитическому расщеплению однонитевые участки в дуплексных полинуклеотидах. Участки, из которых могут быть "выделены" типовые последовательности ДНК, включают, но не ограничиваются этим, например, участки, кодирующие специфические эпитопы, также как и нетранскрибированные и/или нетрансляционные участки. Выделенный полинуклеотид извлекается из показанной нуклеотидной последовательности необязательно физическими мето дами, но может быть сформирован любым способом, включая, например, химический синтез, или репликацию ДНК, или обратную транскрипцию, или транскрипцию. Кроме того, комбинации участков, соответствующи х участкам обозначенных последовательностей, могут быть модифи цированы известными специалистам способами, чтобы быть совместимыми с предполагаемым использованием. Аналогичным образом, полипептидная или аминокислотная последовательность, "выделенная из" обозначенной аминокислотной последовательности или последовательности н уклеиновой кислоты, относится к полипепти ду, аминокислотная последовательность кото рого идентична последовательности полипептида, закодированного в последовательности, или ее части, причем эта часть содержит, по меньшей мере, 3–5 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 8– 10 аминокислот, еще более предпочти тельно, по меньшей мере, 11–15 аминокислот или кото рая иммунологически идентична полипептиду, закодированному в последовательности. Указанная терминология включает также полипептид, экспрессированный из обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты. Рекомбинантный или выделенный полипептид необязательно транслируется из обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты; он может быть образован любым способом, включая, например, химический синтез, или экспрессию рекомбинантной экспрессирующей системы, или выделение из HCV, включая мути рованную HCV. Рекомбинантный или выделенный полипептид может включать в себя один или более аналогов аминокислот или неприродных аминокислот в своей последовательности. Способы введения аналогов аминокислот в последовательность известны специалистам. Он может также включать одну или более меток, которые известны специалистам в данной области. Термин "рекомбинантный полинуклеотид", используемый в данном описании, означает полинуклеотид ге номного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который благодаря своему происхождению или манипуляции с ним: 1) не связан со всем полинуклеотидом или его частью, с которым он связан в природе, 2) связан с полинуклеотидом, отличным от того, с которым он связан в природе, или 3) не встречается в природе. Термин "полинуклеотид", используемый в настоящем описании, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо к рибонук леоти дам, либо к дезоксирибонуклеотидам. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин охватывает двух- и однонитевые ДНК и РНК. Он также включает известные типы модификаций, например, метки, которые известны специалистам, мети лирование, "насадки", замещение одного или более встречающи хся в природе нуклеотидов аналогом, внутринуклеотидные модифи кации такие, например, как модифи кации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфо триэфи ры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфо ротиоаты, фосфо родитиоаты и т.д.), модифи кации, содержащие дополнительные составляющие такие, например, как белки (включая, например, нуклеазы, токсины, анти тела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модифи кации, содержащие интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хе латные соединения (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модифи кации, содержащие алкилаты, модифи кации с модифи цированными связями (например, альфа-аномерические нуклеиновые кислоты и т.д.), а также немодифи цированные формы полинуклеотида. Термин "очищен ный" полипептид относится к полипепти ду, находяще муся в состоянии, при котором он, в основном, свободен от других полипептидов, т.е. в композиции, которая содержит указанный полипептид в количестве как минимум приблизительно 50% по весу (отношение требуемого полипепти да к общей массе полипепти да в композиции), предпочтительно как минимум около 70%, еще более предпочти тельно как минимум около 90% требуе мого полипептида без учета небелковых ве ществ в композиции. Способы очистки вирусных полипепти дов известны специалистам. Аналогичным образом терминологи чески определяются очищен ные антите ла. "Рекомбинантные клетки-хозяева", "клеткихо зяева", "клетки", "линии клеток", "культуры клеток" и другие аналогичные термины, обозначающие микроорга низмы или линии клеток высших эукариотов, культи вируемых в виде одноклеточных форм, относятся к клеткам, которые могут или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантного вектора или другой транспортной ДНК, и включают потомство первоначальной клетки, которая была подвергнута трансфекции. Ясно, что потомство единичной родительской клетки необязательно может быть полностью идентично по морфологии или по геномному комплементу или комплементу полной ДНК первоначальному родителю благодаря естественной, случайной или преднамеренной мута ции. "Репликон" – это любой генети ческий элемент, например, плазмида, хромосома, вирус, космид и т.д., который ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации внутри клетки, т.е. способен к репликации под собственным контролем. "Вектор" – это репликон, к которому присоединяется другой полинуклеотидный сегмент, чтобы вызвать репликацию и/или экспрессию указанного присоединенного сегмента. 6 40572 Термин "регулярная последовательность" относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необхо димы для осуществления экспрессии кодирующи х последовательностей, с которыми они лигируются. Природа таких регулярных последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина; в прокариота х та кие регулярные последовательности обычно включают промотер, участок для связыва ния рибосомы и терминаторы; в эукариотах такие регулярные последовательности обычно включают промотеры, терминаторы и, в некоторых случаях, энхан соры. Предполагается, что тер мин "регулярные последовательности" вк лючает как минимум все компоненты, наличие кото рых необхо димо для экспрессии, и может включать также дополнительные компоненты, наличие которых является предпочтительным, например, лидерные последовательности. Термин "операбельно связанный" означает сопоставление, когда описанные компоненты нахо дятся в соотношении, позволяющем им функционировать предполагаемым для них образом. Регулярная последовательность, "операбельно связанная" с кодирующей последовательностью, лигируется таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совмести мых с регулярными последовательностями. Термин "открытая считывающая рамка" (ОСР) означает участок полинуклеотидной последовательности, который кодирует полипептид; этот участок может представлять собой часть кодирующей последовательности или всю кодирующую последовательность. Термин "кодирующая последовательность" означает полинуклеотидную последовательность, которая транскрибируется в мДНК и/или транслируется в полипептид, когда она находится под управлением соответствующи х регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются трансляционным кодирующим кодоном на 5'-конце и трансляционным терминирующим кодоном на 3'-конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничиваясь этим, мРНК, кДНК и рекомбинантные полинуклеотидные последовательности. Термин "иммунологически определимый с/как" относится к наличию эпитопа(ов) и полипептида(ов), которые также присутствуют в обозначенном полипептиде(ах), обычно в белках HCV. Иммунологическая идентичность может быть определена путем связывания антител и/или конкуренции в связывании; эти способы известны средне подготовленным специалистам в данной области. В смысле, используемом в данном описании, термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп может содержать 3 или более аминокислот, которые определяют участок для связывания антитела. Обычно эпитоп содержит, по крайней мере, 5 аминокислот, а иногда – по крайней мере, 8 аминокислот. Специалистам известны способы картирования эпитопов. Полипептид является "иммунологически реактивным" с антителом, когда он связан с антителом благодаря узнаванию антите ла специфичес кого эпитопа, содержаще гося внутри полипептида. Иммунологическая реактивность может быть определена путем связывания антитела, более конкретно – за счет кинетики связывания анти тела и/или путем конкурирования в связывании, используя в качестве конкурента(ов) известный полипептид(ы), содержащий эпитоп, против которого направлено антитело. Способы определения того, является ли полипептид иммунологически реактивным с антителом, известны специалистам в данной области. В смысле, используемом в данном описании, термин "антитело" относится к полипептиду или группе полипептидов, которые содержат по меньшей мере один участок для связывания антитела. "Участок для связывания антитела" или "связывающий домен" формируется из укладки доменов молекулы (молекул) антитела для образования трехмерных связывающи х пространств с внутренней поверхностной конфи гурацией и распределением заряда, комплиментарным к свойствам эпито па антигена, что обеспечивает иммунологическую реакцию с антигеном. Участок для связывания антитела может быть сформирован из тяжелого и/или легкого цепочечного домена (VH и VL соответственно), которые образуют гипернеустойчивые петли, способствующие связыванию антигена. Термин "антитело" включает, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, хи мерные антите ла, видоизмененные антитела, белки Fab и однодоменные антитела. В смысле, используемом в данном описании, "однодоменное антитело" (dAb) означает антитело, содержащее VH-домен, который иммунологически взаимодействуе т с обозначенным антигеном. Однодоменное антитело не содержит VL домен, но может содержать другие антиген-связывающие домены, которые, как известно существуют в антителах, например, каппа- и лямбда-домены. Способы формирования dAb известны специалистам (cм., например, Ward et al. (1989)). Ан титела могут со держать также VH и VL домены, а также другие антиген-связывающие домены. Примеры таких ти пов антител и способы их получения известны специалистам (см., например, патент США № 4816467, на который в данном описании делается ссылка). Например, "антите ла позвоночных" относятся к антителам, которые являются тетрамерами или их объединением, содержащи ми легкие и тяжелые цепочки, которые обычно агреги руются в "У" конфи гурацию и которые могут или не могут иметь ковалентные связи между цепочками. В антите лах позвоночных аминокислотные последовательности все х це почек соответствующе го антите ла являются гомологичными цепочками, находящимися в одном антителе, сформированном лимфо цитом, который создает это антитело in situ или in vitro (например, в гибридомах). Ан титела позвоночных обычно включают нативные антитела, например, очищенные поликлональные антите ла и моноклональные антитела. Примеры способов получения таких антител описаны ниже. Термин "гибридные антитела" относится к анти телам, в кото рых одна пара тяжелой и легкой цепочек гомологична такой паре в первом антителе, в то вре мя как другая пара тяжелой и легкой 7 40572 цепочек гомологична такой паре в другом отличном антителе. Обычно каждая из указанных двух пар связывает различные эпитопы, особенно на различных антигенах. Это приводит к появлению свойства "двухвалентности", т.е. способности к связыванию двух антигенов одновременно. Такие гибриды могут быть получены, используя хи меровые цепочки, как это описано ниже. Термин "химеровые антитела" относится к анти телам, в которых тяжелые и/или легкие цепочки представляют собой гибридные белки. Обычно постоянный домен цепочек образуется из одного конкретного вида и/или класса, а вариабельные домены происхо дят от различных видов и/или класса. Термин относится также к любому анти телу, в котором либо каждая, либо обе, тяжелая и легкая цепочки, составляют комбинации последовательностей, имитирующих последовательности в анти телах различного происхождения, незави симо от того, происхо дят ли они от различных классов или от различного вида первоосновы, и независимо от того, нахо дится или нет на переменной/постоянной границе точка слияния. Таким образом, становится возможным получать антитела, в которых ни постоянный, ни вариабельный участок не имитирует из вестные последовательности антител. При этом возможно конструировать анти тела, в которых вариабельный участок имеет более высокое специфическое родство для конкретного анти гена, или в которых постоянный участок может проявлять более высокое связывание комплимента, или обеспечивать другие улучше ния свойств, которыми обладает конкретный постоянный участок. Другим примером являются "видоизмененные антите ла", относящиеся к антите лам, в которых встречающаяся в природе аминокислотная последовательность в антите ле позвоночных изменилась. Используя технологию рекомбинантной ДНК, антитела могут быть реконструированы для получения требуемых характеристик. Имеется много возможных вариантов, расположенных в диапазоне от изменения одной или более аминокислот до полной реконструкции участка, например, постоянного участка. Изменения на постоянном участке, в общем случае, направлены на получение желательных ха рактеристик клеточного процесса, например, изменения в связывании комплемента, взаимодействии с мембранами и в других функциях эффекто ра. Изменения на вариабельном участке могут осуществляться для изменения характе ристик связыва ния антигена. Антитело может быть также сконструи ровано с целью облегчения специфи ческой доставки молекулы или вещества к специфической клетке или участку ткани. Требуемые изменения могут быть выполнены способами, известными в молекулярной биологии, например, рекомбинантными методами, сайтспецифическим мутагенезом и т.д. В определение антител включены также "Fab"-фрагменты антител. Участок "Fab" относится к тем участкам тяжелых и легких цепочек, которые в основном эквивалентны или аналогичны последовательностям, содержащим участок ветви, тяжелой и легкой цепочек и которые, как было показано, проявляют иммунологическое связывание с оговоренным антигеном, но в которых отсутствует участок эффектора Fc. "Fab" включает агрегаты, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепочки (обычно известной как Fab), а также тетрамеры, содержащие 2H и 2L цепочки (известные как F(ab)2, которые способны выборочно взаимодействовать с обозначенным антигеном или семейством анти генов. Антитела "Fab" могут быть разделены на подвиды, аналогичные описанным выше, т.е. "позвоночных", "гибридные Fab", "химерные" и "измененные Fab". Способы получения фрагментов антител известны специалистам и включают, например, протеолиз и синтез с помощью методов рекомбинации. В термин "анти тела" включены также одноцепочечные антиген-связывающие (SCA) белки, например, типа, описанного в статье Schlom, J., изданной 15 июня 1992 г. в жур нале Gancer Research (также как и в статьях, приведенных в данном описании). Термин "иммуногенетический полипептид" в смысле, используемом в данном описании, относится к полипептиду, который проявляет клеточную и/или гуморальную иммунную реакцию, независимо от того, является ли он самостоятельным или связан с носителем в присутствии или при отсутствии адьюванта. Термин "полипептид" относится к полимеру аминокислот вне зависимости от спе цифи ческой длины продукта; таким образом, в понятие "полипептиды" включены пептиды, олигопептиды и белки. Указанный термин, кроме того, не относится или исключает постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилацин, ацетилоцин и т.п. Термин включает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, искусственные аминокислоты и т.д.), полипепти ды с замещенными связями, а также другие модифи кации природного или искусственного происхождения, известные специалистам. Термин "трансфор мация" в смысле, используемом в данном описании, относится к введению экзогенного полинуклеотида в клетку-хо зяин, независимо от способа, используемого для вве дения, например, прямого поглоще ния, трансдукции, f-скрещи вания или электропорации. Экзогенный полинуклеотид может сохраняться в качестве неинтегрированного вектора, например, для плазмиды, или, наоборот, может быть интегрирован в ге номхо зяин. Термин "лечение" в смысле, используемом в данном описании, относится к профи лактике и терапии. Термин "индивидуум" в смысле, используемом в данном описании, относится к позвоночным, в частности, к млекопитающим, но не ограничен животными (например, собаками, кошками, крупным рогатым скотом, козами, свиньями, овцами, мышами, крысами, кроликами, морскими свинками Еще одним примером являются "одновалентные антитела", которые представляют собой агрегаты, состоящие из димера тяжелая цепочка /легкая цепочка, связанного с Fc (т.е. постоянным) участком второй тяжелой цепочки. Этот тип антитела устраняет антигенную модуляцию. См., например, Glennie et al. (1982). 8 40572 и т.д.), примата ми, включая обезьян, шимпанзе, бабуинов и людьми. "Смысловая нить" нуклеиновой кислоты содержит последовательность, имеющую последовательность, гомологичную последовательности мРНК. "Ан тисмысловая нить" содержит последовательность, которая комплементарна последовательности "смысловой нити". В смысле, используемом в данном описании, термин "плюс геном" вируса относится к геному, независимо РНК или ДНК, который является однонитевым и кодирует вирусный полипептид(ы). Примерами плюс РНК-вирусов являются Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridae, Picornaviridae, Caliciviridae. В них включены также Flaviviridae, которые ранее классифи цировались как Togaviridae (см. Fields & Knipe (1986)). В смысле, используемом в данном описании, термин "компонент тела, содержащий антитело" относится к компоненту тела индивидуума, который является источником рассматриваемых антител. Компоненты тела, содержащие антитела, известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются этим, например, плазму, сыворотку, спинальную жидкость, лимфатическую жидкость, внешние участки кожи, дыхательные, кишечные, мочеполовые тракты, сле зы, слюну, молоко, белые кровяные клетки и миеломы. В смысле, используемом в данном описании, термин "биологический образец" относится к образцам тканей или жидкости, выделенной из организма индивидуума, включая, но не ограничиваясь нижеперечисленным, плазму, сыворотку, спинальную жидкость, лимфати ческую жидкость, внешние участки кожи, дыхательные, кишечные, мочеполовые тракты, слезы, молоко, красные кровяные клетки, опухо ли, органы, а также образцы компонентов клеточной культуры in vitro (включая, но не ограничиваясь этим, кондиционированную среду, полученную в результате роста клеток в питательной среде клеточной культуры, вирусоинфи цированные клетки, рекомбинантные клетки и компоненты клетки). ІІ. Описание изобретения Настоящее изобретение предусматривает применение, если не оговорено иначе, обычных способов молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Та кие способы полностью раскрыты в литературе (См., например, Maniatis, Fitsch & Sambrook, "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning, Volumes I and II" (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed, 1984); “Nucleic Acid Hybridisation" (B.D. Hames & S.J. “Higgins eds. 1984); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney ed. 1986); "Immobilized Cells And EnZymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); the series, "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells" (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth Enzymol Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., Mayer and Walker, eds. (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Мolecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, (1987) "Protein Purification:Principles and Practice", Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.); and "Handbook of Experimental Immunology", Volumes I– IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986). Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые в данном описании выше и ниже, используются в качестве ссылок. ІІ. A. Усеченные полипептиды HCV. Применение веществ и способов, заявляемых в соответствии с настоящим изобретением, становится возможным за счет идентификации ниже описанных новых эпито пов HCV. Данные об этих эпитопах (или антигенных участках) позволяют конструировать полипептиды, содержащие усе ченные последовательности HCV, которые могут быть использованы в качестве иммунологических реагентов. Усеченные аминокислотные последовательности HCV, кодирующие, по меньшей мере, один вирусный эпитоп, являются полезными иммунологическими реагентами. Например, полипептиды, содержащие такие усеченные последовательности, могут использоваться в качестве реагентов при иммуноанализе. Указанные полипептиды входят также в возможную подгруппу антигенов для использования в композициях противосыворотковой продукции или вакцин. В то время как эти усе ченные последовательности могут изготавливаться различными способами обработки нативного вирусного белка, в общем случае, предпочтение отдается синте тическим или рекомбинантным полипептидам, содержащим последовательность НСV. Полипептиды, содержащие указанные усеченные последовательности HCV, могут быть составлены только из последовательностей HCV (один или более эпитопов, соприкасающихся или несоприкасающихся) или последовательностей HCV и гетерогенных последовательностей в синтезированном белке. Полезные гетерогенные последовательности включают последовательности, которые обеспечивают секрецию из рекомбинантного хо зяина, уси ливают иммунологическую реактивность эпитопа(ов) HCV или способствуют связыванию полипептида с носите лем имунной пробы или носителем вакцины (см., например, Заявку ЕПВ № 116201; Патент США № 4722840; Заявку ЕПВ № 259149; Патент США № 4629783, сущность которых приведена в данном описании). Размер полипептидов, содержащи х усе ченные последовательности HCV, может изменяться в ши роких пределах, причем минимальный размер последовательности должен быть достаточным для обеспечения эпито па HCV, а максимальный размер не является критичным. Для удобства, максимальный размер обычно не намного больше, чем размер, требуе мый для получения желательных эпитопов HCV и функции(й) гетерогенной последовательности, если она имеется. Обычно, длина усе ченной аминокислотной последовательности HCV нахо дится в диапазоне от 5 (или 8) до приблизительно 100 аминокислот. Более типично, однако, когда последовательность HCV имеет максимально приблизительно 50 (или 40) аминокислот, иногда же этот максимум составляет приблизительно 20, 25 или 30 аминокислот. Обычно считается целесообразным выбирать последовательности HCV, 9 40572 состоящие, по меньшей мере, из 8, 10, 12 или 15 аминокислот. Примерами усеченных аминокислотных последовательностей HCV (октамеров), которые используются в настоящем изобретении, являются ниже приведенные последовательности. Ясно, что эти пепти ды необязательно точно отображают один эпитоп. Неиммуногенные участки последовательности могут быть определены с использованием обычных способов и удалены из описанных последовательностей. Более того, дополнительные усеченные аминокислотные последовательности HCV, которые содержат эпитоп или являются иммуногенными, могут быть идентифицированы, как это приведено в данном описании. Полипептидные продук ты, содержащие усеченные аминокислотные последовательности HCV, описанные ниже, могут быть получены в виде неслившихся пептидов или объединенных в больший полипептид и могут нахо дить применение в случаях, приведенных в данном описании. Преимущественно, усеченные последовательности из E1 и/или Е2 доменов применяются в вакцинах и терапевтических препарата х. В то вре мя как любой из доменов может использоваться в некоторых диагностических целях, C, NS3, NS4 и NS5 являются предпочтительными, а комбинации Сэпито пов с эпитопами из одного или более доменов NS3, NS4 или NS5 являются особо предпочтительными. ІІ. В. Получение полипептидов. Наличие последова тельностей ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности HCV, позволяют конструи ровать экспрессирующие векторы, кодирующие антигенноактивные участки полипептида (см., например, рис. 2). Эти антигенноактивные участки могут быть выделены из оболочковых антигенов, или из нуклеоидных антигенов, или из анти генов, в структуру которых не входят полинуклеотид – связывающие белки, полинуклеотидная полимераза(ы) и другие вирусные белки, необходимые для репликации и/или сборки вирусной частицы. Фрагменты, кодирующие желательные полипептиды, выделяются, например, из клонов вирусной кДНК обычным рестрикционным гидролизом или синтетическими способами, и лигируются в векторы, которые могут, например, содержать участки сливающихся последовательностей, та ких как b-Галактозидаза или супероксидная дисмутаза (СОД), предпочти тельно СОД. Способы и векторы, используемые для получения полипепти дов, содержащи х сливающие ся последовательности СОД, описаны в патенте ЕПВ с номером публикации 0196056, опубликованной 01.10.86. Векторы, кодирующие гибридные полипептиды СОД и полипептиды HCV, т.е. N ANB5-1-1, NANB81 , и CIOO–3, которые кодируются в композите кДНК HCV, описаны в разделах IV.B.1, IV.B.2 и IV.B.4 соответственно. Любой необхо димый участок кДНК HCV, содержащий открытую считывающую рамку (или ее синтетический вариант), может быть использован для экспрессии рекомбинантного полипепти да, например, такого как зрелый или гибридный белок. С другой стороны, полипептид, содержащий эпито пы HCV, может быть получен с помощью химического синтеза, используя стандартные спосо бы, основанные на аминокислотной последовательности, показанной на рисун ках и приведенной в примерах. ДНК, кодирующая требуе мый полипептид в гибридной или в негибридной форме, и содержащая или не содержащая сигнальную последовательность для обеспечения секреции, может быть лигирована в экспрессирующие векторы, подхо дящие для любого удобного хо зяина. Как эукариотическая, так и прокариотическая системы хозяевов используются в настоящее время для формирования рекомбинантных полипептидов, при этом линии клеток-хозяев приводятся к заявке ЕПВ с номером публикации 318216. Затем полипептид выделяется из лизированных клеток или из культуральной среды и очищается до сте пени, необходимой для предполагаемого его использования. Очистка осуществляется известными специалистам способами, например, диффе ренциальной экстракцией, соляным фракционированием, хроматографией на ионообменных смолах, хроматографией по сродству, центрифугированием и подобными способами (cм., например, Cпособы в ферментологии для различных методов очистки белков). Указанные полипептиды могут использоваться в качестве средств диагностики, а полипептиды, вызывающие нейтрализацию антител, могут вхо дить в рецептуру вакцин. Ан титела к указанным полипептидам могут быть также использованы в качестве диагностических средств или для целей иммуноте рапии. Кроме того, как это оговаривается ниже, антитела к этим полипептидам используются, например, для выделения и идентифи кации частиц HCV. Полипептиды HCV могут быть также выделены из вирионов HCV и усе чены (если они не были усечены до этого). Вирионы могут вы ращи ваться в инфицированных клетках HCV в тканевой культуре или в инфицированном хозяине. ІІ.C. Получение антигенных полипепти дов и связывание с носителем Ан тигенный участок полипептида обычно имеет относительно небольшой размер, в типовом случае его длина составляет от 8 до 10 аминокислот или менее. Указанный участок может характеризоваться фрагментами с длиной, равной 5 аминокислотам. Эти сегменты могут соответствовать участкам антигена HCV. Соответственно, используя кДНК HCV в качестве основы, кодирующие короткие сегменты полипептидов HCV кДНК могут быть рекомбинантно экспрессированы либо в виде гибридных белков, либо в виде выделенных полипептидов. Кроме того, короткие аминокислотные последовательности можно удобно получить химическим синтезом. В случае, если синтезированный полипептид сформирован правильно для обеспечения правильного эпитопа, но является слишком малым, что бы быть иммуногенным, полипептид может быть связан с подхо дящим носителем. Специалистам известен ряд способов для получения такой связи, включая образование дисульфидных связей, используя N-суксинимидил-3/2-пиридилтио/пропионит/SPDP/ и суксинимидил 4-/N-малеимидо-метил/циклогексан-1-карбоксилат /SMCC/, полученный фирмой Pierce Company, Rockford, Illinois (если в пептиде отсутствует суль 10 40572 фидрильная группа, она может быть обеспечена за счет добавления цистеинового остатка). Указанные реагенты образуют ди сульфидную связь между со бой и цистеиновыми остатками пептида на одном белке и амидную связь через эпсилонаминогруп пу на лизине, или другую свободную аминогруп пу в другом. Известен целый ряд таких дисульфид/амид-образующи х агентов. См., например, Immun Rev /1982/62:185. Другие бифункционально связывающие агенты образуют скорее тиоэфи ровую, чем дисульфидную связь. Многие из этих тиоэфир-образующих агентов коммерчески доступны и включают хи мически активные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2-йодуксусной кислоты, 4-/N-малеимидо-метил/циклогексан-1-карбоксиловой кислоты и т.п. Карбоксильные группы могут быть активированы путем связывания их с сукцинимидом или 1гидроксил-2-нитро-4-сульфо новой кислотой, солью натрия. Дополнительные способы связывания анти генов используют систему ротавирус/"связывающий пептид", описанную в Патенте ЕПВ № 259149. Вышеприведенный список не является исчерпывающим и модифи кации названных соединений несомненно могут быть использованы. Мо жет быть использован любой носитель, который самостоятельно не вызывает образование вредных антител к хозяину. Подхо дящи ми носителями обычно являются большие, медленно трансфор мируемые при обмене веществ макромолекулы, например, белки, полисахариды, такие как Сефа роза, агароза, целлюлоза, целлюлозные шарики и тому подобное; полимерные аминокислоты, например, полиглута миновая кислота, полилизин и тому подобное; аминокислотные сополимеры; и пассивные вирусные частицы, см., например, раздел II.D. Особенно применимыми белковыми субстрата ми являются сывороточные альбумины, гемоцианин блюдечка крылатки, молекулы иммуноглобулина, тироглобулин, овалбумин, столбнячный токсоид и другие белки, хорошо известные специалистам в этой области. частицы в S.Cerevisiae (P. Valenzuela et al. (1982)) также как, например, и в клетках млекопитающих (P. Valenzuela еt al. (1984)). Показано, что образование таких частиц уси ливает иммуногенность мономерной субъединицы. Конструкции могут также включать иммунодоминантный эпитоп HBSAg, содержащий 55 аминокислот предповерхностного (пре-S) участка. Neurath et al. (1984). Конструкции пре-S-HBSAg частицы, экспрессируе мой в дрожжах, описаны в заявке ЕПВ 174444, опубликованной 19 марта 1986 г.; гибриды, включающие гетерологичные вирусные последовательности для экспрессии дрожжей, описаны в заявке ЕПВ 175261, опубликованной 26 марта 1966 г. Эти конструкции могут также быть экспрессированы в клетках млекопитающих, например, в клетках яичника китайского хо мяка (СНО), используя вектор SV40-дигидрофолатредуктазы (Michelle et al. (1984)). Кроме того, участки частицеобразующего белка, кодирующе го последовательность, могут быть замеще ны кодонами, кодирующи ми эпитоп HCV. При таком замещении участки, которые не требуются для содействия агрегации единиц с целью формирования иммуногенных частиц в дрожжах или у млекопитающих, могут быть уда лены, исключая, таким образом, дополнительные антигенные участки HBV из конкурентной борьбы с эпито пами HCV. ІІ.E. Получение вакцин. Вакцины могут быть получены из одного или более иммуногенных полипептидов, выделенных из HCV. Эти полипептиды могут быть экспрессированы в различных клетках-хозяевах (например, в клетках бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающи х), или, с др угой стороны, могут быть выделены из вирусных препаратов или изготовлены синте тическим путем. Одно- или поливалентные вакцины против HC V могут содержать один или более эпитопов из одного или более структур ных белков. Указанные вакцины могут содержать, например, рекомбинантные полипептиды HCV и/или полипептиды, выделенные из вирионов. В частности, считается, что вакцины содержат один или более следующих белков HCV или анти генов субъединиц, выделенных из Е1, Е2, С, NS2, NS3, NS4 и NS5. Особенно предпочти тельны вакцины, содержащие Е1 и/или Е2 или их субъединицы. В дополнение к вышеизложенному представляется возможным получать живые вакцины ослабленных микроорганизмов, которые экспрессируют один или более рекомбинантных полипептидов HCV. Специалистам известны подхо дящие ослабленные микроорганизмы, включающие, например, вирусы (например, вирус коровьей оспы (смю Brown et al. (1986)), а также бактерии. Специалистам в данной области известны способы приготовления вакцин, которые содержат иммуногенный полипептид(ы) в качестве активных ингредиентов. Обычно такие вакцины приготавливаются для проведения инъекций либо в виде жидкого раствора, либо в ви де суспензий; вакцины также могут приготавливаться в твердой форме, пригодной для изготовления растворов или суспензии перед инъецированием. Препарат может также быть эмульгирован или заключен в белковую оболочку в ли посомах. Активные иммуноген ІІ.D. По лучение гибридных иммуногенов, содержащи х эпито пы HCV. Иммуноген ность эпитопов HCV может быть также уси лена за счет приго товления их в организмах млекопитающи х или дрожжевы х систе мах, сли ты х или собранных с части цеобразующи ми белками такими, например, как белки, свя занные с по верхностным антиге ном гепати та В. См., например, патен т США 4722840. Конструк ции, в кото рых эпи топ HCV свя зан непосредствен но с части цеобразующим белком, кодирующим последова тель ности, про дуцируют гибриды, кото рые являются иммуногенными по отноше нию к эпито пу HC V. Кро ме того , все по лученные векто ры включают эпи то пы, ха рактерные для HВV и имеющие различные степени иммуногенности та кие, например, как пре-S-пептид. Та ким образом, части цы, сконструи рованные из части цеобразующе го белка, вк лючающего последова тельности HC V, я вляются иммуногенными по отноше нию к HC V и НBV. Было показано, что поверхностный анти ген гепатита (HBSAg) фор мируется и собирается в 11 40572 ные ингредиенты часто смеши вают с наполнителями, кото рые являются фармакологически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. В качестве подходящих наполнителей могут выступать, например, вода, соляной раствор, декстроза, глицерин, этанол или подобные им, а также их комбинации. Кроме того, при необхо димости, вакцина может содержать небольшое количество вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульги рующие агенты, рН-буферные агенты и/или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцины. Примерами эффективных адъювантов являются, но не ограничиваются нижеперечисленным: гидроксид алюминия, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP) N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, известное как нор-MDP, Nацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835А, известный как МТР-РЕ) и RIBI, со держащий три ингредиента, экстрагированных из бактерий, монофосфориллипида А, димиколата трегалозы и скелета клеточной оболочки (MPL+TDM+CWS) в двухпроцентной эмульсии жидкого тритерпена/твина 80. Эффективность адъюванта может определяться путем измерения количества антител, направленных против иммуногенного полипепти да, содержащего анти генную последовательность HCV, образующи хся при введении указанного полипептида в вакцины, которые также содержали различные адъюванты. Обычно вакцины вводятся парентерально, путем инъекции, например, подкожно или внутримышечно. Дополнительными рецептурами, являющи мися подхо дящи ми для других способов введения, могут быть суп позитории и в некоторых случаях оральные рецептуры. Для суппозиториев в качестве связывающи х ве ществ и носителей обычно могут использоваться, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащи х активный ингредиент в количестве, нахо дящемся в диапазоне от 0,5 до 10%, предпочтительно 1%– 2%. Оральные рецептуры включают та кие обычно применяемые наполнители как, например, фармацевтические виды манниты, лактозу, крахмал, стеарат магния, кристаллозу, целлюлозу, карбонат магния и т.п. Указанные композиции представляют собой растворы, суспензии, таблетки, пилюли, капсулы, порошки и содержат от 10 до 90% активного ингредиента, предпочти тельно 25%– 70%. Белки могут быть вве дены в вакцину в ви де нейтральных или соляных форм. Фармацевтически приемлемыми солями являются соли с кислотными добавками (образованные со свободными аминогруп пами пептида) и соли, которые образуются неорганическими кислотами, например, хло ристоводородной или фосфорной кислотами, или такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, малеиновая и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными груп пами, могут быть также выделены из неорганических оснований, таких как, например, гидроокись натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических основа ний, как изопропила мин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п. ІІ.F. До зирование и введение вакцин. Вакцины вводятся способом, совместимым с рецептурой дозировки, в количестве, обеспечивающим профи лактическую и/или терапевтическую эффективность препарата. Подлежащее введению количество вакцины, которое обычно находится в диапазоне от 5 до 250 мкг антигенов на дозу, зависит от пациента, способности иммунной системы субъекта к синтезу ан тител и сте пени необхо димой защиты от инфекции. Точное количество активного ингредиента, требуе мого для введения, зависит от оценки практикующе го врача и может определяться индивидуально для каждого субъекта. Вакцина может вводиться по схеме, предусматривающей применение единичной дозы, или, что более предпочтительно, многократных доз. Схема, предусматривающая применение многократных доз, представляет собой схему, при которой первичный курс вакцинации предусматривает введение 1–10 отдельных доз с последующим введением других доз в более поздние промежутки времени, что необходимо для поддержания и/или усиления иммунной реакции через, например 1–4 месяца – введение второй дозы, и, при необхо димости, вве дение последующей дозы (доз) через несколько месяцев. С хема приема будет также, по крайней мере отчасти, определяться потребностями пациента и зависит от оценки практикующего врача. Кроме того, вакцина, содержащая иммуногенный анти ген(ы), может вво диться совместно с другими иммунорегуляторными агентами, например, иммуноглобулинами. ІІ.G. Приготовление антител к эпитопам HCV. Иммуногенные полипептиды, описанные в данной заявке, используются для продуцирования анти тел, как поликлональных, так и моноклональных. При необхо димости продуцирования поликлональных антител отобранные млекопитающие (например, мыши, кролики, козы, лошади и т.д.) иммунизируются иммуногенным полипептидом, несущим эпитоп(ы) HCV. Сыворотка от иммунизированного животного со бирается и обрабатывается в соответствии с известными процедурами. Если сыворотка, содержащая поликлональные антитела к эпитопам HCV, включает антитела к другим анти генам, поликлональные антите ла могут быть очищены с помощью иммуноаффин ной хроматографии. Технология продуцирования и обработки поликлональной антисыворотки известна специалистам в данной области, см. например, Mayer и Walker (1987). С другой стороны, поликлональные анти тела могут быть выделены из млекопитающи х, которые предварительно были инфицированы HCV. Мо ноклональные антитела к эпитопам HCV могут быть также легко получены специалистами в данной области. Общая методология продуцирования моноклональных антител с помощью гибридом хорошо известна. Линии неумирающи х клеток, продуцирующи х ан титела, могут быть созданы путем слияния клеток, а также другими способами, например, прямой трансформацией В-лим 12 40572 фо цитов с онкогенными ДНК или трансфекцией с вирусом Эпштейна-Барра (cм., например, M. Schreier et al. (1980); Hammerling et al. (1981); Kennet (1980) см. также Патенты США № 4341761; 4399121; 4427783; 4444887; 4466917; 4472500; 4491632 и 4493890). Группы созданных моноклональных антител к эпитопам HCV могут быть скринированы по различным свойствам; т.е. по изотипу, сродству к эпитопу и т.д. Ан титела, как моноклональные, так и поликлональные, которые направлены против эпи топов HCV, главным образом используются в диагностике, а антите ла, которые являются нейтрализующими, могут использоваться в пассивной терапии. Мо ноклональные анти тела, в частности, могут быть использованы для выращивания проти воидиоти пических анти тел. Противоидиоти пические антите ла представляют собой иммуноглобулины, кото рые несут "внутренний образ" анти гена инфекционного агента, от которого создается защи та. (cм., например, Nisonoff, A., et al. (1981) и Dreesman et al. (1985)). Специалистам в данной области известны способы выращивания противоидиотипических антител. (cм., например, Grzych (1985), MacNamara et al (1984) и Vytdehaag et al. (1985)). Указанные противоидиотипические антитела могут быть также использованы для лечения, вакцинации и/или диагности ки NANBH, а также для разъяснения иммуногенных участков антигенов HCV. ІІ.H. Иммунологический анализ и диагностические наборы. Как полипептиды, так и антитела, созданные согласно настоящему изобретению, используются в иммунологических анализах для определения наличия антител HCV или наличия вирусов и/или полипептидов HCV (или эпито пов), например, в биологических пробах. С хе ма проведения иммунологических анализов имеет множество ва риантов, из которых многие известны специалистам, в данной области. Для проведения иммунологического анализа используется по меньшей мере один вирусный эпитоп, вы деленный из HCV. В одном из вариантов для иммунологи ческого анализа используется комбинация вирусных эпитопов, вы деленных из HCV. Указанные эпитопы могут вы деляться из одних и тех же или из различных ви русных полипептидов и могут нахо диться в отдельных рекомбинантных или природных полипептидах, или находиться вместе в одних и те х же рекомбинантных полипептидах. В иммунологическом анализе может использоваться, например, моноклональное антитело к вирусному эпитопу(ам), комбинация моноклональных антител к эпитопам одного ви русного антигена, моноклональные антитела к эпитопам различных вирусных антигенов, поликлональные антитела к одному и тому же вирусному антигену или поликлональные антите ла к различным вирусным антигенам. Схе ма проведения иммуноанализа может быть выбрана на основе конкуренции, или прямой реакции, или иметь промежуточный характер. Указанная схема может также предусматривать использование твердых носителей или использование иммунопреципитации. Большинство ва риантов анализа включают использование меченых антител или полипептидов; метки могут представлять собой, например, окрашенные молекулы, быть фер ментативными, флуо ресцентными, хемилюминесцентными или радиоактивными. Также известны анализы, при которых сигналы от пробы усиливаются; примерами таких анализов являются анализы, использующие биотин и авидин, а также ферменто меченые и промежуточные иммунологические анализы, такие как анализы ELISA (описанные ниже). Обычно иммунологический анализ для антитела(тел) к HCV включает отбор и приготовление испытуе мой пробы, предполагаемой на наличие анти тел, например, биологической пробы, затем инкубирование ее с анти генным (т.е. эпитоп-содержащим) полипептидом(ами) HCV в условиях, которые позво ляют образовать комплекс антигенанти тело, а затем обнаружение факта образования таких комплексов. Требуемые условия инкубирования хорошо известны специалистам в данной области. Иммунологический анализ может иметь, без ограничений, гетерогенный или гомогенный ха рактер, и быть стандартного или конкурентного типа. При гетерогенном ха рактере анализа полипептид обычно связан с твердым носите лем, для облегчения отделения пробы от полипептида после инкубирования. Примерами твердых носителей для возможного использования являются нитроцеллюлоза (например, в форме мембраны или ячейки микротитра), хлорид поливинила (например, в фор ме пластин или ячеек микротитра), латекс полистирола (например, в форме гранул или пластин микротитра), поливинилидин флуо рид (известный как Иммулон), диазотированная бумага, нейлоновые мембраны, активированные гранулы и гранулы белка А. Например, пластины микротитра Dynatech Immulon 1 или Immulon 2 или 0,25дюймовые (6,3 мм) полистироловые гранулы (прецизионный пластиковый шарик) могут использоваться в анализе, имеющем гете рогенный характер. Твердый носитель, содержащий антигенный полипептид, обычно промывается после отделения его от исследуе мого образца и перед выявлением связанных анти тел. Специалистам известны как стандартные, так и конкурентные типы анализа. При проведении анализа гомогенного типа исследуе мый образец инкубируется с антиге ном в растворе. Например, это может осуществляться в условиях, при которых любые образованные комплексы "антиген-антитело" будут выпадать в осадок. Специалистам в данной области известны как стандартные, так и конкурентные типы таких анализов. При анализе стандартного ти па количество анти тел HCV, образующих комплекс "антитело-антиген" регистрируется непосредственно. Это может быть достигнуто путем определения того, связаны ли меченые антитела к ксеногенам (например, к генам человека), распознающие эпитоп на анти телах к HCV, благодаря образованию комплекса. При анализе конкурентного типа количество анти тел HCV в пробе устанавливается путем регистрации эффекта конкуренции на связывание известного количества меченого антите ла (или другого конкурирующе го лиганда) в комплексе. Комплексы, образованные конкурирующими анти телами к HCV (или, в случае анализа конку 13 40572 рентного типа, количество конкурирующи х антител), обнаруживаются с помощью любого из ряда известных способов в зависимости от типа анализа. Например, немеченые антитела HCV в комплексе могут быть обнаружены с использованием конъюгата антиксеногенного иммуноглобулина, скомплексированного с меткой (например, ферментной меткой). При иммунологическом анализе, в котором полипептиды HCV являются аналита ми, исследуемая проба, обычно биологическая проба, инкубируется с антите лами к HCV при условиях, позволяющих образовывать комплексы антиген-антитело. При этом могут использоваться различные типы анализа. Например, может использоваться анализ промежуточного ти па ("сандвич-анализ"), при котором антитело, связанное с твердым носителем, инкубируется с исследуе мой пробой, промывается, инкубируется со вто рым, меченым антителом до получения аналита, после чего носитель промывается вновь. Аналит выявляется путем определения того, является ли второе антитело связанным с носителем. При анализе конкурентного типа, который может быть либо гетерогенным, либо гомогенным, исследуе мая проба обычно инкубируется с антителом, при этом меченый конкурирующий антиген инкубируется также, либо последовательно, либо одновременно. Такие и другие типы анализа хо рошо известны специалистам в данной области. Эффективные системы выявления инфекции HCV могут включать груп пы эпитопов, как это было описано выше. Эпитомы в группе могут быть встроены в один или множество полипептидов. Анализ для различных эпитопов может проводиться последовательно или одновременно. Ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) может использоваться для измерения концентраций либо антигенов, либо антител. Этот метод зависит от конъюгации фермента либо к антигену, ли бо к антителу и используют активность связанного фермента в качестве количественной метки. Для оценивания антитела известный антиген фиксируется в твердой фазе (например, на микропластине или в пластмассовой чаше), инкубируется с исследуе мыми разбавленными растворами сыворотки, промывается, инкубируется с антииммуноглобулином, меченым ферментом, и промывается вновь. Ферменты, подхо дящие для маркирования, известны специалистам и включают, например, пероксидазу хре на обыкновенного. Активность фермента, связанного с твердой фа зой измеряется путем добавления специального субстрата и определения структуры продукта или утилизации субстрата колориметрическим способом. Активность связанного фер мента напрямую зависит от количества связанных антител. Для оценки антигена специфи ческое антитело фиксируется на твердой фазе, добавляется исследуе мое вещество, содержащее антиген, после инкубирования твердая фаза промывается и в нее добавляется второе ферментномеченое анти тело. После промывания добавляется субстрат и активность фермента оценивается колориметрическим способом и соотносится с концентрацией анти генов. Набор, подхо дящий для иммунодиагности ки и содержащий соответствующие меченые реагенты, формируется путем упаковки соответствующи х веществ, включая полипепти ды, созданные в соответствии с настоящим изобретением, содержащие эпитопы HCV или антитела к эпитопам HCV, в подхо дящие контейнеры, вместе с остальными реагентами и веществами, необхо димыми для проведения анализа, а также с соответствующим набором инструкций по проведению анализа. ІІІ. Общие методы. Общие методы, используе мые в практике реализации настояще го изобрете ния, можно найти, например, в источниках, приведенных в данном описании, в частности, в п убликациях ЕПВ № 318216 и 388232, а также в библиографии, прилагаемой к данному описанию. IV. Примеры. Приведенные ниже примеры, касающиеся настояще го изобретения, носят только иллюстративный характер и не ограничивают объем заявляемого изобрете ния. В свете данного описания многочисленные варианты выполнения изобретения в объеме пунктов формулы изобретения являются очевидными для среднеподготовленных специалистов в данной области. IV. A. Картирование эпитопа генома HCV. Следующий пример является результатом эксперимента по картирова нию эпитопа, который проводился на последовательности полипротеина HCVI, показанной на фиг. 1. Как показано на рис. 3–11, среди изолятов HCV имеются гетерогенности, указывающие на то, что эти аминокислотные замеще ния могут быть сделаны в октамерах, описанных ниже. Кроме замеще ний аминокислотами из соответствующего участка в других изолятах HCV, замеще ния синтетическими аналогами конкретных аминокислот или консервативные замещения, основанные на заряде и т.д. (особенно, если замеще ние не разрушает связь анти тела) находятся в пределах объема настояще го изобретения. IV. A.1. Синтез перекрывающих пепти дов. Полиэтиленовые булавки, размещенные в блоке, представляющем собой матрицу 8 х 12 (Coselco Mimetopes, Victoria, Australia) готовились путем помещения их в ванну (20% в объемном отноше нии пиперидина в диметилформамиде (DMF)) в те чение 30 минут при комнатной температуре. Булавки были уда лены из ванны, промыты в течение 5 минут в DMF, затем 4 раза промыты в метаноле (2 минуты на каждую промывку). Затем булавки были подвергнуты воздушной сушке в течение, по меньшей мере, 10 минут и окончательно промыты в DMF. 1-Гидроксибензотриазол (HOBt, 367 мг) растворяли в DMF (80 мл) для использования при сцеплении Fmoc-защищенных аминокислот: Fmoc-L-Ala-OPfp, Fmoc-L-Cys(Trt)-OPfp, Fmoc-L-Asp(O-tBu)-OPfp, Fmoc-L-Glu(O-tBu)-OPfp, Fmoc-LPhe-OPfp, Fmoc-Gly-OPfp, Fmoc-L-His(Boc)-OPfp, Fmoc-L-Ile-OPfp, Fmoc-L-Lys(Boc)-OPfp, Fmoc-L-Leu-OPfp, Fmoc-L-Met-OPfp, Fmoc-L-Asn-POfp, Fmoc-L-Pro-OPfp, Fmoc-L-Gln-OPfp, Fmoc-L-Arg(Mtr)-OPfp, Fmoc-LSer(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Thr(t-Bu)-ODhbt, Fmoc-L-Val-OPfp, and Fmoc-L-Tyr-OPfp. 14 40572 Защи щенные аминокислоты размещали в ячейках планше та для титрирования с HOBt, а блок булавок помеща ли над планшетом, при этом булавки опускались в ячейки. Затем указанную сборку закупоривали в пластиковый мешок и оставляли для осуществления реакции при 25оС в течение 8 часов с целью сцепления первых аминокислот с булавками. Затем блок удаляли, а булавки промывали DMF(2 минуты), MeOH (4 x 2 минуты) и основа промывали DMF с целью очистки и снятия защи ты со связанных аминокислот. Процедуру повторяли для каждой дополнительной связанной аминокислоты до те х пор, пока не были приготовлены все октамеры. Затем свободные N-концы ацети лировали для компенсации свободного амида, поскольку большинство эпитопов не нахо дятся на N-концах и поэтому не имеют связанного положительного заряда. Аце тилирование осуществляли путем наполнения ячеек планше та для титрования DMF (уксусный ангидрид/триэтиламин/5:2:1 в объемном отноше нии), и позволяя булавкам взаимодействовать с содержимым ячеек в течение 90 мин при 20оС. Затем булавки промыва ли DMF (2 мин) и MeOH (4 x 2 мин) и подвергали воздушной сушке в течение, по меньшей мере, 10 минут. Защи щающие гр уппы боковой цепи удаляли путем обработки булавок составом из трифлуороуксусной кислоты (фенол/дитиоэтана/95:2,5:2,5, в объемном отношении) в полипропиленовых мешочках в те чение 4 часов при комнатной температуре. Затем булавки промывали в дихлорметане (2 х 2 мин), 5% диизопропилэтиламин/дихлорметане (2 х 5 мин), дихлорметане (5 мин) и подвергали воздушной сушке в течение, по меньшей мере, 10 мин. Затем булавки промывали в воде (2 мин), MeOH (18 часов), сушили in vacuo, и хра нили в герметизированных пластиковых мешочках над силикагелем. IV.A.2. Ана лиз пептидов. Октамеронесущие булавки, приготовленные по описанной выше методике, вначале обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин в измельченном буфере (1% додецилсульфа та натрия, 0,1% 2-меркаптоэтанола, 0,1 М NaH2PO4) при 60оС. Затем булавки несколько раз погружали в воду (60оС), подвергали выпариванию MeOH (2 мин) и воздушной сушке. Далее булавки подвергали предварительному покрытию в течение 1 часа при 25оС в ячейках микротитра, содержащих 200 мкл блокирующе го буфера (1% овалбумина, 1% BSA, 0,1% Твина и 0,05% NaN3 в PBS) при перемешивании. Затем булавки погружали в ячейки микротитра, содержащи х 175 мкл антисыворотки, полученной от пациентов, продиагностированных как носителей HCV, и подвергали инкубированию при 4оС в течение всей ночи. Булавки анализировали относительно антисыворотки от трех разных пациентов. Проба РАА 3663-("А") показала сильную реакцию на вестерн-блоты HCV, конкурентный анализ ELISA HCV, анализ ELISA HCV к клону С100–3 (при разбавлении 1:1000) и реакции RIBA > 4 + к С100, 5–1–1 и С33с (С22 не проводился). Название антиген/клон приводится в Заявках ЕПВ №№ 318216 и 388232, а также в источниках, касающи хся иммуноанализов HCV, имеющихся в Ortho Diagnostics Systems, Inc. Бычью плазму разбавляли в блокирующем буфе ре в соотношении 1:500. Проба РАА 33028 ("В") показала сильную реакцию к вестерн-блотам HCV, конкурентному анализу ELISA, анализу ELISA HC V к клону С100-3 (в растворе 1:500) и реакции RIBA > 4 + к С100, 5– 1– 1, С33С и С22. Поликлональную сыворотку частично очища ли путем переноса ее через колонку белка А и использовали в блокирующем буфере при разбавлении 1:200. Проба РАА 32931 ("С") показала умеренную реакцию к вестерн-блотам HCV (3+), конкурентному анализу ELISA HC V к клону С100-3 (в растворе 1:64) и реакции RIBA 3 + и 4 + к С100 и 5–1–1 соответственно (С33с и С22 не делались). Поликлональную анти сыворотку частично очища ли путем переноса ее через колонку белка А и использовали в блокирующем буфе ре при разбавлении 1:500. Булавки промывали в PBS/Твин 20 /4 х 10 мин/ при комнатной температуре, затем инкубировали в ячейках микротитра, содержащи х козлиную анти сыворотку к иммуноглобулину человека, меченую пероксидазой хрена /HRP//175 мкл, в блокирующем буфе ре без NaN3 при разбавлении 1:2000/ в течение 1 часа при 25оС с перемешиванием. Человеческая антисыворотка является специфической для легких и тя желых це почек человеческого иммуноглобулина и вступает в реакцию с гр уппами IgG и Ig M. Затем булавки снова промывали в PBS/Твин 20 /4 х 10 мин/ при комнатной температуре. Раствор субстрата готовили путем растворения NaH2PO4 (1 M, 200 мл) и лимонной кислоты (1М, 160 мл) в 2 л дистиллированной воды, дово дя рН до 4.0. Для получения полного раство ра непосредственно перед его использованием к 100 мл буфера добавляли ацино-ди-3-этилбензтиазодинсуль фонат (ABTS, 50 мг) и перекись водорода (0,3 мкл/мл). Раствор субстрата (150 мкл) добавляли в каждую ячейку планше та микротитра, в ячейки погружали булавки и инкубирова ли их в темноте при 25оС. После появления окраски реакции приостанавливали путем уда ления булавок и спектральную поглощательную способность растворов определяли при 405 нм. Перечисленные ниже октамеры были иммунореактивными с антисывороткой к HCV. Пептиды, участвующие в реакции со всеми тремя антисыворотками, включены в реестр в качестве эпитопов, тогда как пептиды, участвующие в реакции только с одной или двумя антисыво ротками, причисляются к слабым эпитопам (обозначаются "~"). Особенно сильные эпитопы обозначаются чаще буквами, чем числами (например, ЕрАА). 15 40572 16 40572 801 17 LALPQRAY ~ 40572 18 40572 19 40572 20 40572 21 40572 22 40572 IV.B. Ди ффе ренциальный анализ. Следующий анализ прово дили для разделения ранних антигенов от поздних антигенов. Более быстро могут быть выявлены и использованы для диагностики инфекции HCV антитела к ранним антигенам. Ряд проб крови был взят у пациента, имеюще го повышенный ALT, но отрицательный относительно анти тела к С100-3. Пять проб крови, полученные перед полной сероконверсией (С100-3 положительное) были объединены и использованы при анализе в растворе 1:2000. Анализ был проведен по методике, описанной в разделе IV.A. Однако, один дубликатный набор булавок был инкубирован козлиной антисывороткой к иммуноглобулину G че ловека, меченой HRP, тогда как другой набор был инкубирован специфической козлиной антисывороткой к иммуноглобулину М человека, меченой HRP. Эпито пы, иммунореактивные с антителами иммуноглобулина М, являются ранними эпитопами. Результа ты анализа показали, что большинство ранних эпитопов нахо дятся в области, расположенной приблизительно от аминокислоты 480 до приблизительно аминокислоты 650. Особенно сильные эпитопы иммуноглобулина М представляли собой октамеры, начинающиеся от аминокислот с номерами 506, 510, 423, 553, 562, 580 и на участке от 590 до 620. Анализы, в которых используются антигены, несущие эпитопы из этого участка, позволяют диагностировать инфекцию HCV в бо лее ранний момент, чем анализы, в которых используются другие антигены. Дополнительно были исследованы образцы плазмы, взятой у пяти пациентов с открытым сердечным пост-паренте ральным гепатитом NaNB, которые находились под наблюдением в течение 3–12 лет. Интервал взятия первоначальных проб составлял менее одной недели. Каждый образец исследовали на иммуноглобулин G и иммуноглобулин М с помощью иммуноферментативного анализа относительно одного антигена ядра (С22), двух анти генов оболочки (Е1 и Е2) и трех антигенов неструктур ного участка (С33с, С100 и NS5). Было установлено, что реакция иммуноглобулина М на С22 и С33с предшествовала реакции иммуноглобулина G на указанные антигены. NS5 также вызывал реакцию иммуноглобулина М, но эта реакция не предшествовала реакции иммуноглобулина G на этот антиген. Таким образом, можно провести анализы, способные определить очень ранние стадии инфекции путем использования эпито пов, выделенных из участков C22 и С33с, и анализа связи иммуноглобулина М. Анти тела к участку С33с сохраняются в течение самого длительного интерва ла времени, что дает возможность предположить, что диагностический анализ на С33с должен быть наиболее надежным. IV.C. Изменения последовательности в изолятах HCV, взяты х от различных пациентов. Изоляты HCV, со держащие последовательности, кото рые отклоняются от последовательностей CDC/HCVI, были идентифи цированы у людей, некоторые из кото рых имели положительную серологическую реакцию на антитела к С100-3 (ЕСІ0 обладал отрицательной реакцией на антитело). Идентифи кация указанных новых изолятов осу ществлялась путем клонирования и секвенирования сегментов генома HCV, кото рый был усилен с помощью метода PCR, используя последовательности CDC/HCVI. Способ использует затравки и пробы, основанные на последова тельностях кДНК HCV, приведенных в данном описании. На первой стадии этого мето да осуществляется синтез кДНК либо с геномом HCV, либо с его репликативным интермедиатом, используя обратную транскриптазу. После синтеза кДНК HCV и перед амплификацией РНК, содержащаяся в пробе, расщепляется способами известными специалистам. Обозначенный сегмент кДНК HCV затем амплифицируется за счет использова ния соответствующи х затравок. Амплифи цированные последовательности клонируются и клоны, содержащие амплифи цированные последовательности, выявляются с помощью пробы, которая комплементарна последовательности, лежащей между затравками, но не перекрывающая их. IV.C.1. Изоляты HCV, вы деленные у жителей США. Образцы крови, которые использовались в качестве источника вирионов HCV, были получены от Американского Красного Креста в г. Шарлотт, шт. Северная Каролина, а также из Канзаского Общественного центра по переливанию крови, г. Канзас-Сити, шт. Миссури. Образцы были скринированы на антитела к антигену С100-3 HCV, используя анализ ELISA, и подвергнуты дополнительному анализу методом вестерн-блотирования, используя поликлональную антисыворотку к иммуноглобулину человека, меченой HRP для измерения антител к HCV. Было установлено, что по данным этих анализов два образца, 23 и 27, полученные от Американского Красного Креста и Канзаского Общественного центра по переливанию крови, соответственно, показывают положительную реакцию на HCV. Вирусные части цы, присутствующие в сыворотке указанных образцов, выделяются с помощью ультрацентрифугирования в условиях, описанных Bradley et al. (1985). РНК экстрагировали из частиц путем ферментации с протеиназой К и додецилсуль фатом натрия при конечной концентрации протеиназы К, равной 10 мкг/мл и 0,1% додецилсульфата натрия; ферментация осуществлялась в течение 1 часа при 37оС. Затем вирусная РНК очища лась путем экстракции с фенолхлорформом. РНК HCV при приготовлении РНК была обратно транскрибирована в кДНК. Затем обе нити кДНК были синтезированы, после чего полученная кДНК амплифи цировалась с помощью метода PCR. кДНК в трех клонах, вы деленных из каждого изолята HCV, подвергалась последовательному анализу. Ана лиз в основном прово дился по способу, описанному Chen and Seeburg (1985). Обобщающие типичные последовательности клонов, выделенных из образцов 23 и 27, показаны на фиг. 3 и фи г. 4 соответственно. На этих фигурах также показаны переменные последовательности, как и аминокислоты, закодированные в обобщающих ти пичных последовательностях. На фиг. 5 и 6 приводится сравнение нуклеотидных последовательностей с выравненной плюс нитью (фиг. 5) и возможных аминокислотных пос 23 40572 ледовательностей (фиг. 6) образцов 23, 27 и HCVI. Аминокислотная последовательность HCVI, показанная на фиг. 6, представляет собой аминокислоты с числами 129– 467 полипротеина HCV, закодированного большой открытой считывающей рамкой в геномной РНК HCV. Из фиг. 5 и 6 видно, что последовательности трех выделенных клонов отличаются друг от друга. Вариации последовательностей на нуклеотидном уровне и аминокислотном уровне обобщены в нижеприведенной таблице. В указанной таблице полипептиды, обозначенные S и NSI представляют собой аминокислотные числа от 130 до приблизительно 380 и от 380 до приблизительно 470 соответственно, что согласуется с ранее известными данными об этих доменах. Нумерация начинается от условного инициатора метионина. Термины S и NSI основаны на положении последовательностей, кодирующих полипептиды, используя модель Flavivirus. Однако, как было показано выше, недавно полученные данные позволили предположить, что не существует полной корреляции между HCV и Flavivirus относительно доменов вирусных полипептидов, особенно в условных доменах E/NSI. Действительно, полипептиды HCV и их кодирующие домены могут показывать значительное отклонение от модели Flavivirus. Гомология первичных структур сравниваемых нуклеиновых кислот Нуклеотид, кодирующий закодированную аминокислоту общая % S% NSI % общая % S% NSI % HCVI/HCV23 93 95 91 92 95 87 HCVI/HCV27 89 93 84 89 95 82 HCV23/HCV27 89 93 85 90 93 84 Хо тя во вновь выделенных последовательностях HC V имеются вариации, каждая клонированная последовательность из образцов 23 и 27 (названные HCV23 и HCV27) содержат 1019 нуклеоти дов, что указывает на недостаток делеции или добавления мутантов на этом участке в выбранных клонах. Как видно из фиг. 5 и 6, выделенные последовательности на этом участке не перестроены. Сравнение обобщающих ти пичных последовательностей HCVI и других изолятов HCV обобще ны в вышеприведенной таблице. Отличия последовательностей изолята HCVI, взято го у шимпанзе, и изолята HCV, выделенного из организма человека, примерно те же самые, что и между изолятами HCV, выделенными из человеческого организма. Представляет интерес тот факт, что вариации последовательностей в двух возможных доменах не однородны. По-видимому, последовательность на условном S участке относительно постоянна и имеет случайный разброс на всем участке. В отличие от этого, условный участок NSI имеет более высокую сте пень изменчивости, чем общая последовательность, при этом, по-видимому, вариация нахо дится на гиперизменчивом участке из 28 аминокислот, расположенном приблизительно на 70 аминокислот ниже от условного N-конца условного полипротеина. Хо тя утверждение о том, что обнаруженные вариации были вызваны процессом амплификации, является спорным, маловероятно, что все вариации явились результатом этого. Было предположено, что полимераза Taq вводит ошибки в последовательность на приблизительно одном гетероциклическом основании нуклеиновых кислот на 10000 оснований матрицы ДНК на цикл /Saiki et al. (1988)). Основываясь на этом предположении, можно утверждать, что при амплифи кации PCR фрагмента ДНК, содержащего 1019 комплементарных пар, возможно вве дение до 7 ошибок. Однако три субклона HCV-23 и HCV-27 вызвали 29 и 14 вариаций оснований соответственно. Следую щее дает возможность предположить, что эти вариации имеют естественное происхождение. Около 60% вариаций оснований являются молчащими мутациями, кото рые не изменяют аминокислотную последовательность. Ожидается, что ва риации, вызванные в процессе амплификации PCR полимеразой Taq происходят случайно; однако, результаты показывают, что различные последовательности груп пируются по меньшей мере на одном специфическом участке. IV.С.2. Изоляты HCV, вы деленные у жителей Италии и США. Сегменты РНК HCV, присутствующие в различных изолятах, бы ли амплифицированы способом HCV/cPCR. Указанные сегменты перекрывают участок от приблизительно 0,6 Kb до приблизительно 1,6 Kb, расположенный ниже метионина, кодирующе го инициирующий кодон возможного полипротеина HCV. Изоляты взяты из биологических образцов, полученных от пациентов, инфи цированных HCV. Более конкретно, изолят НСТ № 18 получен из человеческой плазмы от американского пациента, изоляты ЕС1 и ЕС10 – из биопсии печени жите ля Италии, а изолят Th – из периферийной фракции мононуклеоцита крови жителя США. Сравниваемые сегменты РНК HCV были выделены от шимпанзе. РНК экстрагировали из образцов человеческой плазмы, используя фе нол: CHCl3 : изоамилспиртовую экстракцию. 0,1 мл или 0,01 мл плазмы разводили до конечного объема, равного 1,0 мл, с раствором TENB /протеиназы К/ додецилсуль фата натрия /0,05 М трис-HCL, рН равно 8,0, 0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1 М NaCl, 1 мг/мл протеиназы К и 0,5% додецилсуль фата натрия/, содержащего от 10 до 40 мкг/мл полиадениловой кислоты, и инкубировали в течение 60 минут при 37оС. После ферменти рования протеиназы К образованные фракции плазмы были депротеинизированы путем экстрагирования с ТЕ (50 мМ трис-HCl, рН 8.0, 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты), насыщенным фенолом, рН 6.5. Фенольную фазу отделяли центрифугированием и 24 40572 реэкстрагировали с TENB, содержащим 0,1% додецилсуль фата натрия. Полученные от каждой экстракции водные фазы группировали и дважды экстрагировали с равным объемом смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (1:1/99:1), а затем дважды с равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (99:1). После сепарации фа зы центрифугированием водную фазу приводили к конечной концентрации 0,2 М ацета та натрия, а нуклеиновые кислоты осаждали путем добавления двух объемом этанола. Осажденные нуклеиновые кислоты восстанавливали ультрацентрифугированием в сепараторе SW 41 в те чение 60 минут при 38 К и 4оС или в микроцентрифуге в течение 10 минут при 10 К и 4 оС. РНК, экстрагированная из биопсии печени, была предоставлена д-ром F. Bonino, Ospedale Maggiore di S. Giovanni. Battista, Турин, Италия. Фракция мононуклеоцита была получена путем седиментации аликвотной пробы крови через Ficoll-Paque (Pharmacia Corp.), пользуясь инструкциями изготовителя. Общую РНК экстрагировали из фракции, используя гуанидин-тиоцинатную процедуру, описанную Choo et al. (1989). Синтез кДНК HCV из образцов осуществлялся с использованием обратной транскриптазы. После осаждения этанолом осажденную РНК или фракцию нуклеиновой кислоты высуши вали и ресуспендировали в дистиллированной воде, обработанной ДЕРС. Вторичные структуры в нуклеиновых кислотах разрывались путем нагревания при 65оС в течение 10 минут, после чего образцы сразу же охлаждали на льду. Синтез кДНК осуществляли, используя от 1 до 3 мкг общей РНК из печени или из нуклеиновых кислот (или РНК), экстрагированных из 10–100 мкл плазмы. Синтез проводили с использованием обратной транскриптазы в 25 мкл реактива по процедуре, оговоренной изготовителем, BRL. Все реагирующие смеси для синтеза кДНК содержали 23 единицы ингибитора РНКаз, араназина (Fisher/Promega). После синтеза кДНК реаги рующие смеси разбавляли водой, подвергали кипячению в течение 10 минут и быстро охлаждали на льду. Каждый набор образцов подвергали двум циклам амплифи кации PCR. Затравки для реакций выбирали так, чтобы амплифи цировать участки, обозначенные как "EnvL" и "En vR". Участок "EnvL" включал в себя нуклеотиды 669–1243 и условные аминокислоты от 117 до 308; участок "EnvR" включает в се бя нуклеотиды 1215–1629 и кодирует условные аминокислоты 300–408 (условные аминокислоты нумеруются, начиная от инициирующего кодона условного метионина). Реакция PCR в основном выполняли в соответствии с инструкциями изготовителя (CetusPerkin-Elmer), за исключением добавки 1 мкг РНКаз А. Реакции проводились в конечном объеме, равном 100 мкл. PCR выполнялась в 30 циклах, используя следующий режим: 94оС (1 мин), 37оС (2 мин) и 72оС (3 мин) с 7-минутным продлением последнего цикла при 72оС. Затем образцы экстрагировали смесью фенол:CHCl3, дважды осаждали этанолом, ресуспендировали в 10 мМ трис-HCl, рН 8.0, и концентрировали, используя фильтрацию с помощью Centricon-30 (Amicon). С помощью этой процедуры эффективно удаляются олигонуклеотиды, размер кото рых составляет меньше 30 нуклеотидов; таким образом, удаляются затравки при первом цикле амплификации PCR. Затем образцы, сконцентрированные с помощью Centricon-30, подвергали вто рому циклу амплифи кации PCR. Амплифи кацию посредством PCR осуществляли в 35 циклах, используя режим 94оС (1 мин), 60оС (1 мин) и 72оС (2 мин) с 7-минутным удлинением последнего цикла при 72оС. Далее образцы экстрагировали смесью фенол:CHCl3, дважды осаждали и ферментировали с помощью EcoRI. Продук ты реакции PCR анализировали путем их сепарации электрофорезом на 6% полиакриламидовых ге лях. ДНК с приблизительно установленным размером ожидаемого продукта PCR электроэлюцинировали из гелей и субклонировали либо в вектор плазмиды pGEM-4 или в l gtII. Размеры ожидаемого продукта для En vL и EnvR составляют 615 и 683 комплементарных пары после первого цикла амплифи кации; после второго цикла амплифи кации размеры ожидаемого продукта составляют для EnvL и EnvR 414 и 575 комплементарных пар соответственно. Плазмиды, содержащие амплифицированные продукты, использовали для трансформации клеток-хозяевов; плазмиду pGEM-4 использовали для трансформации DH5-альфа, а l gtII использовали для трансформации С600 дельта-HFL. Клоны трансформированных клеток, которые были либо гибридизированы до соответствующих проб HCV, либо имели вставки правильного размера, были отселектированы. Затем вставки клонировали в М13 и секвенировали. Пробы для всех продуктов HCV/cPCR состояли из меченых 32 Р участков в кДНК HCV, которые приготавливали с помощью амплификации PCR. Информация о последовательностях на вариантах участка EnvL была получена от трех клонов из НСТ № 18, двух клонов из ECI и от клонов HCVI. Сравнение составной нуклеотидной последовательности каждого изолята, выделенного из этих клонов, показано на фиг. 7. На этой фигуре каждая последовательность имеет от 5 до 3 связей для смысловой нити на участке EnvL, при этом последовательности выравнены. Вертикальные линии и заглавные буквы указывают на гомологию последовательности, отсутствие линии и прописная буква указывает на отсутствие гомологии. Последовательности, расположенные по строкам, соответствуют: строка 1 – Thorn; строка 2 – ECI; строка 3 – НСТ № 18; строка 4 – HCVI. Информация о последовательностях на вариантах участка EnvR была получена от двух клонов ЕС10, и от клонов HCVI. Два клона EC10 отличаются друг от др уга только одним нуклеотидом. Сравнение нуклеотидных последовательностей ЕС10 (клон 2) и композита последовательностей HCVI показано на фиг. 8; как видно из фигуры, каждая последовательность имеет от 5 до 32 связей для смысловой нити участка EnvR, при этом последовательности вы равнены. Двойные точки между последовательностями указывают на гомологию последовательностей. Сравнение аминокислотных последовательностей, закодированных на EnvL (аминокислоты 117– 308) и EnvR (аминокислоты 300– 438) участках каждого изолята, показано на фиг. 9 и 10 соот 25 40572 ветственно. В фигуры вк лючены последовательности вышеописанных изолятов JH23 и JH27. Также показаны последовательности японского изолята, представленного д-ром T.Mi yamura, Япония. На указанных фигурах аминокислотная последовательность на участке для HCVI приводится полностью, кроме того, указаны негомологичные аминокислоты различных изолятов. Как показано на фиг. 9, на участке EnvL имеется приблизительно 93-процентная гомология между HC VI и другими изолятами. Изоляты HCT18, Th и ECI имеют почти 97-процентную гомологию с HCVI; изоляты JH23 и JH27 имеют почти 96- и 95-процентную го мологию с HCVI соответственно. Из фиг. 10 видно, что го мологии на участке EnvR значительно меньше, чем на участке EnvL; более того, один субучасток, видимо, является гипернеустойчивым (аминокислоты 383405). Эти данные обобщены в нижеприведенной таблице. Гомология участка EnvR Изолят Cohen, Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2110. Cousens et al., Gene (1987) 61:265. De Boer et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 292:128. Dreesman et al., J Infect Dis (1985) 151:761. S.M. Feinstone and J.H. Hoofnagle, New Engl J Med (1984) 311:185. Felgner et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:7413. Fields & Knipe (1986), "Fundamental Virology" (Raven Press, N.Y.). Fiers et. al., Nature (1978) 273:113. R.J. Gerety et al., in "Viral Hepatitis and Liver Disease" (B.N. Vyas, J.L. Dienstag, and J.H. Hoofnagle, eds) Glennie et al., Nature (1982) 295:712. Gluzman, Cell (1981) 23:175. Goeddel et al., Nuc Acids Res (1980) 8:4057. Graham and Van der Eb, Virology (1978) 52:546. Grunstein and Hogness, Proc Natl Acad Sci USA (1975) 73:3961. Grych et al., Nature (1985) 316:74. Gubler and Hoffman Gene (1983) 25:263. Hahn, Virology (1988) 162:167. Hammerling et al., (1981), "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas". Han, Biochemistry (1987) 26:1617. Helfman, Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80:31. Hess et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7:149. Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci USA (1978) 75:1929. Hitzeman et al., J Biol Chem (1980) 255:2073. Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900. Holland, J Biol Chem (1981) 256:1385. Holland and Holand, J Biol Chem (1980) 255:2596. Hoopes et al., Nuc Acids Res (1981) 9:5493. Houghton et al., Nuc Acids Res (1981) 9:247. T.V. Hunyh et al., (1985) in "DNA Cloning Techniques; A Practical Approach" (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U.K.) pp. 49– 78. Immun Rev (1982) 62:185. Ito et al., Agric Biol Chem (1984) 48:341. Iwarson, British Medical J (1987) 295:946. Kennett et al. (1980) "Monoclonal Antibodies". Kniskern et al., Gene (1986) 46:135. Kyte and Doolittle, J Mol Bio (1982) 157:105– 132. Laemmli, Nature (1970) 227:680. Lee et al., Science (1988) 239:1288. Luckow and Summers, Virol (1989) 17:31. Mackett et al., J Virol (1984) 49:857. T. Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning; A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning; A Laboratory Manual", Second Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Manning and Mocarski, Virol (1988) 167:477. Ma yer and Walker, eds. (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Academic Press, London). Ma xam et al., Meth En zymol (1980) 65:499. MacNamara et al., Science (1984) 226:1325. Messing et al., Nuc Acids Res (1981) 9:309. Процент гомологии с HCVI АА330–АА438 АА383–АА405 JH23 (США) 83 57 JH27 (США) 80 39 Японский 73 48 ЕСІ0 (Италия) 84 48 VI.Промышленная применимость. Эпитопы, приведенные в данном описании, могут быть использованы для производства полипептидных продук тов, как это описано выше, и применяться для скрининга крови при инфекции HCV, клинической диагностики HCV, выработки анти тел и приго товления медикаментов. Др угие возможные применения описаны выше, а ряд других оче видны для специалистов в дан ной области со средней квалификацией. VII. Библиография Barr et al., Biotechniques (1986) 4:428. Bradley et al., Gastroenterology (1985) 88:773. Botstein, Gene (1979) 8:17. M.A. Brinton, (1986) in "The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae" (Series eds. FraenkelConrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p. 327– 374. Broach (1981) in: "Molecular Biology of the Yeast – Saccharomyces, Vol. 1, p. 445, Cold Spring Harbor Press. Broach et al., Meth En zymol (1983) 101:307. Catty (1988), "Antibodies, Volume 1: A Practical Approach" (IRL Press). Chaney et al., Cell Mol Genet 12:237. Chakrabarti et al., Mol Cell Biol (1985) 5:3403. Chang et al., Nature (1977) 198:1056. Chen and Seeburg, DNA (1985) 4:165. Chirgwin et al., Biochemistry (1979) 18:5294. Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem (1987) 162:156. Choo et al., Science (1989) 244:359. Clewell et al., Proc Natl Acad Sci USA (1969) 62:1159. Clewell, J Bacteriol (1972) 110:667. 26 40572 Messing, Meth Enzymol (1983) 101:20– 37. Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepati Schlesinger et al., J Virol (1986) 60:1153. M. Schreier et al., (1980) "Hybridoma Techniques" Scopes (1984), "Protein Purification, Principles and Practice", 2nd Ed., (Springer-Verlag, N.Y.). Shimatake et al., Nature (1981) 292:128. Singh et al., Nuc Acids Res (1983) 11:4049. Sippel, Eur J Biochem (1973) 37:31. Smith et al., Mol Cell Biol (1983) 3:2156– 2165. Steimer et al., J Virol (1986) 58:9. Stollar (1980), in "The Togaviruses" (R.W. Schlesinger, ed.), pp. 584– 622. Stuve et al., J Virol (1987) 61:326. Sumiyoshi et al., Virol (1987) 161:497. Taylor et al., Biochim Biophys Acta (1976) 442:324. Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:4350. Tsu and Herzenberg (1980), in "Selected Methods In Cellular Immunology" (W.H. Freeman and Co.) pp. 373– 391. Vytdehaag et al., J Immunol (1985) 134:1225. P. Valenzuela et al., Nature (1982) 298:344. P. Valenzuela et al., (1984), in "Hepatitis B" (I. Millman et al., ed, Plenum Press) pp. 225– 236. Warner, DNA (1984) 3:401. Ward et al., Nature (1989) 341:544. Wu and Grossman, Meth Enzymol (1987), 154 "Recombinant DNA", Part E. Wu, Meth Enzymol (1987), 155, "Recombinant DNA", part F. Zoller, Nuc Acibs Res (1982) 10:6487. U.S. Patent No 4341761 U.S. Patent No 4466917 U.S. Patent No 4399121 U.S. Patent No 4472500 U.S. Patent No 4427783 U.S. Patent No 4491632 U.S. Patent No 4444887 U.S. Patent No 4493890 U.S. Patent No 4816467 tis. Monath (1986) in "The Viruses: The Togaviradae And Flaviviridae" (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), pp. 375– 440. Moss (1987) in "Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells" (Miller and Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), p. 10. Nagahuma et al., Anal Biochem (1984) 141:74. Neurath et al., Science (1984) 224:392. Nisonoff et al., Clin Immunol Immunopathol (1981) 21:397– 406. L.R. Overby, Curr Hepatol (1985) 5:49. L.R. Overby, Curr Hepatol (1986) 6:65. L.R. Overby, Curr Hepatol (1987) 7:35. Pachl et al., J Virol (1987) 61:315. Peleg, Nature (1969) 221:193. Pfefferkom and Shapiro (1974), in "Comprehensive Virology", Vol. 2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds., Plenum, N.Y.) pp. 171– 230. A.M. Prince, Ann Rev Microbiol (1983) 37:217. Rice et al., Science (1985) 229:726. Rice et al., (1986) in "The Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae" (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p. 279– 328. Roehrig (1986) in "The Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae" (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press) Sadler et al., Gene (1980) 8:279. Saiki et al., Nature (1986) 324:163. Saiki et al., Science (1988) 239:487. Sanger et al., Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:5463. Setlow, ed. (1988), "Genetic Engineering" Vol. 10, pp. 195– 219 (Plenum Publishing Co., N.Y. Фиг. 1-1 27 40572 Фиг. 1-2 28 40572 ( ) – Гетерогенность, обусловленная, возможно, артефактом клонирования на 5’– или 3’– конце. Фиг. 1-3 29 Фиг. 2-1 40572 30