Комбінація послідовностей епітопів вірусу гепатиту с (hcv), спосіб виявлення антитіл до вірусу гепатиту с (hcv), набір для виконання аналізу при виявленні антитіл до антигену гепатиту с (hcv)

1. Комбинация последовательностей эпитопов вируса гепатита С (HCV) в одном или более полипептидов, полученная путем химического синтеза или рекомбинантной экспрессии, иммобилизованная на поверхности твердой матрицы, пригодной для выявления HCV при помощи иммуноанализа, отличающаяся тем, что она содержит первую последовательность эпитопа из домена С полипротеина HCV, вторую последовательность эпитопа из второго домена полипротеина HCV, причем доменом является домен NS3 полипротеина HCV, домен NS4 полипротеина HCV или домен NS5 полипротеина HCV, и третью последовательность эпитопа из третьего домена полипротеина HCV, причем доменом является домен NS3 полипротеина HCV, домен NS4 полипротеина HCV или домен NS5 полипротеина HCV, при этом третий домен отличается от второго домена, при условии, что указанная комбинация отлична от комбинаций пептида р1 с С100-3, пептида р35 с С1003 или пептида р99 с С100-3. 2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что вторым доменом является NS3. 3. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что вторым доменом является NS4. 4. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит первую последовательность эпитопа из домена С полипротеина HCV, вторую после C2 (54) КОМБІНАЦІЯ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ЕПІТОПІВ ВІРУСУ ГЕПАТИТУ С (HCV), СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ ДО ВІРУСУ ГЕПАТИТУ С (HCV), НАБІР ДЛЯ ВИКОНАННЯ АНАЛІЗУ ПРИ ВИЯВЛЕННІ АНТИТІЛ ДО АНТИГЕНУ ГЕПАТИТУ С (HCV) 41266 ствлять иммуноанализы широкого диапазона на анти-HCV антитела. Заболевание, которое ранее было известно как не-А, не-В гепатит (NANBH), считалось трансмиссивной болезнью или семейством болезней, индуцированных вирусом, которые отличались от других форм, вызванных вирусом болезней печени, включая болезни , вызванные известными вирусами гепатита, например, вирусом гепатита А (HАV), вирусом гепатита В (HВV) и вирусом гепатита дельта (HDV), а также гепатита, вызванного цитомегаловирусом (CМV) или вирусом Эпштейна-Барра (ЕВV). NANBH был впервые обнаружен у пациентов, подвергнутых внутреннему вливанию крови. Перенос вируса от человека к шимпанзе и последовательный перенос у шимпанзе обнаружил, что заболевание NANBH вызвано переносимыми инфекционными агентами или агентом. Эпидемиологические наблюдения подтвердили, что может быть три типа NANBH: зарождаемый в воде эпидемический тип; зарождаемый в крови или парентерально трансмиссавный тип; и тип спорового происхождения (общеприобретенного типа). Однако, до недавнего времени никакого агента переноса, ответственного за NANАH, обнаружено не было, и клинический диагноз и идентификация NANBH осуществлялись главным образом путем исключения других вирусных маркеров. Из числа методов, используемых для обнаружения путативных NANBH агентов и антител, можно назвать агаро-гелевую диффузию, противоиммуноэлектрофорез, иммунофлюоресцентную микроскопию, иммуноэлектронную микроскопию, радиоиммуноанализ, ферментосвязанный иммуносорбентный анализ. Однако, ни один из этих методов анализа не был в достаточной степени чувствительным, специфическим и воспроизводимым для того, чтобы использоваться в качестве диагностического теста на NANBH. В 1987 году "Чирон Корпорейшн" (владельцы данного патента) идентифицировали первую нуклеиновую кислоту, определенным образом связанную с зарождаемым в крови NANBH. См., например, публикацию патента ЕРО № 318216; Houghton и др., Science, 244, 359 (1989 г.). В этих публикациях описывается клонирование изолята от нового вирусного класса, вируса гепатита С (HCV), прототипного изолята, который описывается в данной публикации как "HCV I". НСV является вирусом типа Флави с геномом РНК. В патентной заявке США № 456637 (Houghton и др.), рассматриваемый здесь как библиографический материал, описывается получение различных рекомбинантных НС полимептидов путем экспрессии комплементарной ДНК (кДНК) НСV и отбор данных полипептидов на иммунологическое действие сывороткой от пациентов с НСV. Этот ограниченный отбор показал, что по меньшей мере пять испытываемых полипептидов являются очень иммуногенными; и особенно полипептиды, идентифицированные как 5-1-1, С100, С33с, СА279а и СА29Са. Из этих пяти полипептидов 5-11 располагается в путативном NS4 домене; С100 располагается в промежутке между путативными NS3 и NS4 доменами: С33c располагается в путативном NS3 домене и СА279а и СА290а располагаются в путативном С домене. Кроме того, дан ный отбор показал, что никакой одиночный испытываемый полипептид не является иммунологически активным со всеми сыворотками. В связи с этим желательны улучшенные испытания, которые бы обнаруживали реакцию полипептида со всеми или с большим числом образцов, взятых от пациентов с положительным показателем на НСV. Авторы провели дополнительные серологические исследования на антигены HСV, которые подтвердили, что ни один одиночный HCV полипептид, идентифицированный на сегодняшний день, не является иммунологически активным со всеми сыворотками. Отсутствие одиночного полипептида, который универсально активен со всеми сыворотками от пациентов с НСV может быть обусловлено, наряду с другими факторами, непостоянством от штамма к штамму в HCV эпитопах, непостоянством гормональной реакции от пациента к пациенту и/или непостоянством серологии с определенным состоянием заболевания. Эти дополнительно проведенные исследования также позволили авторам идентифицировать комбинации антигенов HСV, которые обеспечивают более эффективное обнаружение антител НСV, чем одиночного HСV полипептида. Таким образом, согласно еще одному аспекту данного изобретения предусматривается комбинация антигенов НСV, включающая: (а) первый антиген HCV от С домена; и (в) по меньшей мере один дополнительный антиген НСV, выбранный из группы включающий: (i) антиген НСV от NS3 домена; (ii) антиген НСV от NS4 домена; (iii) антиген НСV от S домена; и (iv) антиген НСV от NS5 домена. Согласно одному из аспектов данного изобретения комбинация антигенов НСV имеет фору гибридного белка, состоящего из антигенов. Согласно другому возможному аспекту данного изобретения комбинация антигенов имеет форму отдельных антигенов, связанных с общей твердой матрицей. Согласно еще одному аспекту данного изобретения, комбинация антигенов имеет форму смеси отдельных антигенов. Следующим аспектом настоящего изобретения является способ обнаружения антител к НСV в компоненте организма млекопитающего животного, который, как ожидается, заключает в себе указанные антитела, который (способ) включает контактирование указанного компонента организма с описанной выше комбинацией антигенов НСV в условиях, допускающих реакцию антителоантиген, и обнаружение присутствия имунных комплексов указанных антител и указанных антигенов. Следующим аспектом изобретения является способ обнаружения антител к НСV в компоненте организма млекопитающего, который, как ожидается, содержит в себе указанные антитела, который (способ) включает контактирование указанного компонента организма с группой антигенов НСV, одновременно или последовательно, включающей: (а) первый антиген HCV от С домена; и (в) по меньшей мере один дополнительный антиген HCV, выбранный из числа следующих: (i) антиген НСV от NS3 домена; 2 41266 (ii) антиген НСV от NS4 домена; (iii) антиген НСV от S домена; и (iv) антиген НСV от NS5 домена, в условиях, допускающих реакцию антителоантиген, и обнаружение присутствия имунных комплексов указанных антител и указанных антигенов. Следующим аспектом данного изобретения является комплект средств для осуществления анализа с целью обнаружения антител к НСV в компоненте организма млекопитающих животных, который, как ожидается, заключает в себе указанные антитела, который (комплект) включает упаковку из: (а) указанной комбинации антигенов НСV; (в) стандартных контрольных реагентов; и (с) инструкций для осуществления анализа. Фиг. 1 показывает нуклеотидную последовательность чувствительной и анти-чувствительной кДНК нити полипротеина HCV и аминокислотную последовательность, кодированную чувствительной нитью (SEQ ID NO: 9) и (SEQ ID NO: 10). Фиг. 2 показывает схему аминокислотной последовательности, представленной на фиг. 1, иллюстрирующую путативные домены полипептида НСV. "Антиген HCV" означает полипептид, состоящий не менее чем из 5 аминокислот, обычно не менее чем примерно из 8-10 аминокислот, который заключает в себе эпитоп, обнаруженный в изоляте НСV. Этот эпитоп является предпочтительно уникальным для НСV. Когда антиген обозначается альфа-цифровым кодом, то эпитоп взят от НСV домена с данным альфа-цифровым кодом. Понятие "синтетический", используемое для определения антигена HCV, означает, что антиген HCV либо выделен из естественных источников, либо получен искусственно путем химического или рекомбинантного синтеза. "Домены" - это те сегменты полипротеина НСV, показанные на фиг. 2, которые обычно соответствуют путативным структурным и неструктурным белкам НСV. Домены имеют обозначения, обычно принятые для флавивирусных белков. Положения доменов, доказанные на фиг. 2, являются лишь приближенными. Название "NS" означает "неструктурные домены", названные "S" означает оболочковый домен, и "С" означает нуклеокапсидный или сердцевинный домен. "Гибридный полипептид" - это полипептид, в котором антигены (или антиген) НСV составляют часть непрерывной цепи аминокислот, которая не является цепью естественного происхождения. Антигены НСV могут быть связаны непосредственно друг с другом пептидными связями или могут быть отделены путем вставки аминокислотных последовательностей. Гибридные полипептиды могут заключать в себе также аминокислотные последовательности экзогенные к HСV. "Общая твердая матрица" означает твердое тело, с которым связываются отдельные антигены НСV или гибридный полипептид, состоящий из антигенов HСV, посредством ковалентных или нековалентных связей, например путем гидрофобной адсорбции. "Компонент организма млекопитающего" означает жидкость или ткань млекопитающего жи вотного (например, человека), которая обычно содержит антитела, образуемые этими млекопитающими животными. Каждый такой компонент известен и включает (не ограничиваясь только ими) кровь, плазму, сыворотку, спинной мозг, жидкую лимфу, продукты выделения дыхательных путей, желудочного или мочеполового тракта, слезы, слюну, молоко, белые кровяные клетки, миеломы. Понятие "иммунологически активный" означает, что данный антиген должен специфически взаимодействовать с анти-HCV антителами, обычно присутствующими в значительной части сыворотки от индивидуумов, инфекционно зараженных НСV. "Имунный комплекс" - это комбинация или скопление, образуемое при связывании антитела с эпитопом на антигене. Комбинации антигенов HCV На фиг. 2 показаны путативные домены полипротеина НСV. Этими доменами, от которых взяты антигены, используемые в комбинациях, являются: С, S (или Е), NS3, NS4 и NS5. Домен С заключает в себе нуклеокапсидный белок НСV. Он простирается от N-конца полипротеина примерно до аминокислоты 120, как показано на фиг. 1. Домен S заключает в себе белок оболочки вируса и возможно белок матрицы (M), и простирается от примерно аминокислоты 120 до аминокислоты 400, как показано на фиг. 1. Домен NS3 простирается примерно от аминокислоты 1050 до аминокислоты 1640 и составляет протеазу вируса. Домен NS4 простирается от конца NS3 до примерно аминокислоты 2000. Функция белка NS4 неизвестна на сегодняшний день. И, наконец, домен NS5 простирается примерно от аминокислоты 2000 до конца полипротеина и заключает в себе полимеразу вируса. Последовательность, показанная на фиг. 1, представляет собой последовательность изолята НСV I. Предполагается, что последовательности других штаммов зарожденного в крови HСV могут отличаться от последовательности, показанной на фиг. 1, особенно в доменах оболочки (S) и нуклеокапсида (С). Использование НСV антигенов, имеющих такие отличающиеся последовательности, охватывается сферой действия данного изобретения, при условии, однако, что это различие незначительно снижает иммунологическую активность антигена к сыворотке от пациентов, зараженных НСV. Как правило, антигены HCV должны заключать в себе полные или срезанные домены, при этом доменные фрагменты легко отбираются на антигенность непосредственно самими специалистами в данной области. Отдельные антигены HCV, используемые в комбинации, должны включать предпочтительно иммунодоминантный участок (то есть участок, ответственный прежде всего за иммунологическую активность полипептида) указанного домена. В случае С домена желательно, чтобы антиген С домена заключал в себе наибольшую часть всей последовательности домена. Особенно предпочтителен антиген, имеющий обозначение С22 (см. пример 4, ниже). Антиген S домена заключает в себе предпочтительно гидрофобный субдомен в N-терминальном конце данного домена. Этот гидрофобный субдомен прости 3 41266 рается примерно от аминокислоты 199 до аминокислоты 328, как показано на фиг. 1. Особенно предпочтителен антиген HCV, имеющий обозначение S2 (см. пример 3, ниже). При желании в антиген S домена может быть включена последовательность, идущая от гидрофобного субдомена. Предпочтительным антигеном NS3 домена является антиген под названием С33с. Этот антиген заключает в себе аминокислоты 1192-1457, как показано на фиг. 1. Предпочтительным антигеном NS4 является С100, который заключает в себе аминокислоты 1569-1931, как показано на фиг. 1. Предпочтительный антиген NS5 заключает в себе аминокислоты 2054-2464, как показано на фиг. 1. Антиген НСV может иметь форму полипептида, состоящего полностью из аминокислотной последовательности НСV или может заключать в себе последовательность экзогенную по отношению к НСV (то есть он может быть в форме гибридного белка, который включает экзогенную последовательность). В случае рекомбинантно продуцируемого антигена HСV продуцирование данного антигена как гибридного белка, например с SOD, альфа-фактором или убикитином (см. патенты США общего владельца № 4751180, 4870008 и патентную заявку (США) № 390599, поданную 7 августа 1989 года, описания которых здесь рассматриваются, в которых обсуждается экспрессия SOD, альфа-фактора и убикитиновых гибридных белков), может увеличивать степень экспрессии и/или увеличения растворимости в воде данного антигена. Гибридные белки, такие как альфафактор и убикитиновый гибрид, подвергаются воздействию хозяина экспрессии для удаления гетерологической последовательности. Альфафактор является, однако, системой секреции, в то время как убикитиновые гибриды остаются в цитоплазме. Кроме того, комбинация антигенов может быть продуцирована как гибридный белок. Так например, непрерывный фрагмент ДНК, кодирующий С22 и С33с, может быть построен, клонирован в вектор экспрессии и использован для экспрессии гибридного белка С22 и С33с. Аналогичным образом могут быть получены гибридные белки С22 и С100; С22 и S2; С22 и антиген NS5; С22, С33с и S2; 2СС, С100 и S2, и С22, С33с, С100 и S2. Могут быть также использованы и другие заменяющие их фрагменты от приведенного домена. Получение антигенов HCV Антигены НСV, отвечающие данному изобретению, продуцируются предпочтительно рекомбинантно или путем известного твердофазного синтеза. Однако, они могут быть выделены также из диссоциированных НСV или частиц HСV методом хроматографии сродства с использованием антител к антигенам. При получении рекомбинантными способами могут использоваться стандартнее процедуры построения ДНК, кодирующей данный антиген, клонирования данной ДНК в векторы экспрессии, трансформации клеток хозяев, таких как бактерии, дрожжи и вредные насекомые, или клеток млекопитающих животных, и экспрессии такой ДНК для продуцирования антигена. Как указывалось ранее, может быть желательна экспрессия антигена как гибридного белка для усиления экспрессии, облегчения очистки или повышения растворимости. Специальные процедуры продуцирования типичных антигенов НС описываются в изложенных ниже примерах и в основной патентной заявке серии № 456637. Получение антигенов, предназначенных для использования в аммуноанализе Антигены НСV могут быть комбинированы путем получения их в форме гибридного белка, состоящего из двух или более антигенов, путем иммобилизации их поотдельности на общей твердой матрице, или путем их физического перемешивания. Гибридные белки антигена могут быть также иммобилизированы на твердую матрицу (связаны с ней). В данной области науки уже известны способы и средства ковалентного и нековалентного связывания белков с твердыми матрицами. Природа твердой поверхности будет различной в зависимости от типа анализа. Для анализа, осуществляемого на миаротитрованных ячейках, твердой поверхностью будет стенка ячейки или микротитровальной чашки. Для анализа с использованием шариков твердой поверхностью будет являться поверхность шариков. Для анализа с использованием удлиненных частиц (то есть твердых частиц, полученных из пористого или волокнистого материала, такого как ткань или бумага) твердой поверхностью будет являться поверхность материала, из которого изготавливаются эти удлиненные частицы. При агглютинационном анализе твердой поверхностью будет являться поверхность частиц латекса или желатина. В случае, когда отдельные антигены связываются с матрицей, они могут равномерно распределяться по поверхности или распределяться в виде определенного рисунка, например полос, так что можно распознать картину связывания антигена. Простые смеси антигенов включают антигены в любом подходящем растворителе или в диспергирующей среде. Типы анализа с использованием комбинаций антигенов Антигены HСV могут использоваться фактически в любом типе анализа, где применяется известный антиген для обнаружения антител. Общей особенностью всех этих анализов является то, что антиген контактирует с компонентом организма, содержащим антитела HCV, в условиях, позволяющих антигену связываться с любым таким антителом, присутствующим в данном компоненте организма. Такими условиями обычно являются: физиологическая температура, величина рН и ионная сила при использовании избытка антигена. Инкубация антигена с образцом сопровождается обнаружением иммунных комплексов, включающих антиген. Иммуноанализ имеет очень много разновидностей, и существует много принципов его осуществления. Так, например, иммуноанализ может осуществляться с использованием твердых носителей или путем иммуноосаждения. В большинстве анализов используется меченое антитело или полипептид; индикаторами могут быть, например, ферментные, хемилюминесцентные, радиоактивные или окрашивающие молекулы. Известны также анализы, которые усиливают сигналы от имун 4 41266 ного комплекса; примерами являются анализы, в которых используются биотин и авидин, и иммуноанализы с индикацией ферментом и с промежуточным средством, такие как ферментный иммуносорбентный анализа (ЕLISА). Иммуноанализ может быть гетерогенным или гомогенным и может быть стандартного или конкурирующего типа. В гетерогенном анализе полипептид обычно связывается с твердой матрицей или носителем для ускорения отделения образца от полипептида после инкубации. Примерами твердых носителей, которые могут использоваться, являются нитроцеллюлоза (например, в форме мембраны или микротитровальных ячеек), поливинилхлорид (например, в форме листов или микротитровальных ячеек), полистирольный латекс (например, в форме шариков или микротитровальных чашек), поливинилиденфторид (известный как Иммулон), диазотированная бумага, найлоновые мембраны, активированные стеклянные шарики и шарики Протеина А. Так, например, в гетерогенном анализе могут использоваться микротировальные чашки "Динатех Иммулон 1 или Иммулон 2" или полистиролевые шарики размером 0,25 дюйма (6,3 мм) ("Presision Plastic Ball"). Твердый носитель, содержащий антигенные полипептиды, обычно промывается после отделения его от испытываемого образца и до обнаружения связанных антител. В данной области науки известны уже как стандартный, так и конкурирующий методы анализа. В гомогенном анализе испытываемый образец инкубируется с комбинацией антигенов в растворе. Так например, это может осуществляться в таких условиях, в которых происходит осаждение любых комплексов антиген-антитело, которые образуются. Как стандартный, так и конкурирующий приемы при осуществлении данных анализов уже известны в данной области. При осуществлении стандартного приема непосредственно измеряется количество антитела HСV, образующего комплекс антитело-антиген. Это может осуществляться путем определения того, связываются ли меченые анти-ксеногенные (например, анти-человеческие) антитела, которые распознают эпитоп на анти-HCV антителах, за счет образования комплекса. При осуществлении конкурентного приема количество антител НСV в образце определяется по данным конкурирующего действия на связывание известного количества меченого антитела (или другого конкурирующего лиганда) в данном комплексе. Образуемые комплексы, включающие антиНСV антитела (или в случае конкурирующих анализов количество конкурирующего антитела) обнаруживаются любым из ряда известных способов, в зависимости от типа анализа. Так, например, немеченые антитела НСV в комплексе могут быть обнаружены с использованием коньюгата антиксеногенного Ig, образующего комплекс с индикатором (например, ферментным индикатором). В иммуноосадительном или агглютинационном анализе в результате реакции между антигенами HСV и антителом образуется сетка, которая осаждается из раствора или суспензии и образует видимый слой или пленку осадка. Если в испытываемом образце нет никакого анти-НСV антитела, то не образуется никакого видимого на глаз осадка. Антигены НСV обычно упаковываются в форме комплекта, предназначенного для использования в данных иммуноанализах. Этот комплект обычно содержит в отдельных емкостях комбинацию антигенов (либо уже связанных с твердей матрицей, либо разделенных реагентами для связывания их с матрицей), контрольные рецептуры антитела (положительные и/или отрицательные), меченое антитело, когда для данного типа анализа требуются одинаковые и генерирующие сигнал реагенты (например, ферментный субстрат), если данный индикатор не генерирует сигнал непосредственно. В данный комплект обычно включены инструкции (например, в написанном виде, в форме ленты, УСR, СD-RОМ и т.д.) для осуществления анализа. Нижеследующие примеры даются с целью иллюстрации настоящего изобретения, но не для его ограничения. Пример 1: Синтез антигена НСV С33c Антиген НСV С33c содержит последовательность от домена NS3. В частности, он заключает в себе аминокислоты 1192-1457, как показано на фиг. 1. Данный антиген продуцируется в бактериях как гибридный белок человеческой супероксиддисмутазой (SOD) следующим обрезом. Вектор p SOD c f1 Steiner и др., 1986 г., Virol 58: 9) вываривается до конца вместе с EcoRI и BamHI, и образующийся фрагмент ЕсоRІ, BamHI сшивается с указанным ниже линкером с образованием pcfIEF: GATC CTG GAA ITC IGA TAA (послед. ID NO: 1) GAC CTT AAG ACT ATT TTA A (послед. ID NO: 2). Клон кДНК, кодирующий аминокислоты 11921457 и имеющий концы ЕсоRІ, вставляется в pcfIEF, в результате чего образуется рсfIEF/С33с. Эта экспрессионная структура трансформируется в клетки D/210 E.coli. Данные трансформанты используются для экспрессии гибридного белка, состоящего из SOD у N-концов и внутрирамочного антигена HСV С33с у С-концов. Экспрессия осуществляется инокуляцией 1500 мл питательного бульона Luria, содержащего ампициллин (100 мкг/мл) с 15 мл ночной культуры данных трансформант. Клетки выращиваются до оптической плотности 0,3, добавляется изопропилтиогалактозид до достижения конечной концентрации 0,2 мМоля, и выращивание продолжается до тех пор, пока не достигается оптическая плотность 1, и в этот момент их собирают путем центрифугирования с ускорением центрифуги 3000хg при температуре 4°C в течение 20 минут. Уплотненные клетки могут храниться при температуре -80°С в течение нескольких месяцев. Для очистки полипептида SOD-C33c бактериальные клетки, в которых выражается полипептид, подвергаются воздействию осмотического удара и механическому разрыву, нерастворимая фракция, содержащая SOD-C33c, извлекается и подвергается дифференциальной экстракции щелочным NаСl раствором, и гибридный полипептид в экстракте очищается методом колончатой хроматографии с заполнением колонок S-Сефарозой и QСефарозой. Сырой экстракт, полученный в результате воздействия осмотического удара и механическо 5 41266 го разрыва, обрабатываются следующим образом. Один грамм уплотненных клеток суспензируется в 10 мл раствора, содержащего 0,02 Мол. Tpиc-HCI, pН 7,5, 10 мМол. этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕDТА), 20% сахарозы, и инкубируется в течение 10 минут во льду. Затем клетки осаждаются центрифугированием при ускорении центрифуги 4000хg в течение 15 минут при температуре 4°C. После удаления поверхностного слоя клеточные осадки снова суспензируются в 10 мл Буфера А1 (0,01 Мол. Трис. НСІ, рН=7,5, 1 мМол. ЕDТА, 14 мМол бета-меркаптоэтанола (ВМЕ)), и инкубируются во льду в течение 10 минут. Клетки снова осаждаются центрифугированием при ускорении центрифуги 4000хg в течение 15 минут при температуре 4°C. После удаления прозрачного поверхностного слоя (периплазматическая фракция I) клеточные осадки снова суспензируются в Буфере А1, инкубируются во льду в течение 10 минут и снова центрифугируются с ускорением центрифуги 4000хg в течение 15 минут при 4°С. Прозрачный поверхностный слой (периплазматическая фракция II) удаляется, и клеточный осадок снова суспензируется в 5 мл Буфера А2 (0,02 Мол. Трис. НСI, рH=7,5, 14 мМол. ВМЕ, 1 мМол. ЕDТА, 1 мМол. фенилметилсульфонилфторида (РМSF)). Для разрыва клеток данная суспензия (5 мл) и 7,5 мл промытых свободной от свинца кислотой стеклянных шариков, измельченных в мельнице Dino (диаметром 0,10-0,15 мм) (получены фирмой Глен-Милло Инк.) помещаются в пробирку Fa/соп, и подвергаются вихревому перемешиванию с максимальной скоростью в течение двух минут, а затем охлаждаются во льду в течение не менее чем 2 минут; процедуры вихревого перемешивания охлаждения повторяются еще четыре раза. После вихревого перемешивания данная суспензия фильтруется через сцинциллируемую стеклянную воронку со слабым отсосом; стеклянные шарики промываются два раза Буфером А2, и фильтрат и промывные жидкости соединяются. Нерастворимую фракцию сырого экстракта извлекают путем центрифугирования с ускорением центрифуги 20000хg в течение 15 минут при температуре 4°С, двукратно промывают 10-ю мл Буфера А2, снова суспензируют в 5 мл воды Milli-Q. Фракцию, содержащую SOD-С33c, извлекают из нерастворимого материала путем добавления в данную суспензию NаОН (2 Мол) и NaCI (2 Мол) до конечной концентрации каждого 20 мМoл, вихревого перемешивания смеси в течение 1 минуты, центрифугирования ее в центрифуге с ускорением 20000хg в течение 20 минут при 4°С, и сохранения поверхностного слоя. Для очистки SOD-C33c на Сефарозе-S, всплывшую фракций доводят до конечной концентрации 6 Мол. мочевины, 0,05 Мол. Трис. НСl, рH=7,5, 14 мМол. ВМЕ, 1 мМол. ЕDТА. Затем эту фракцию вводят в колонку высокоскоростного потока с SСефaрозой (1,5 см х 10 см), которая уравновешивается c Буфером В (0,05 Мол. Трис. HCI, рH=7,5, 14 мМол. ВМЕ, 1 мМол. ЕDТА). После ввода, колонку промывают Буфером В в количестве, равном двум объемам колонки. Проходящий через колонку поток и промывочные фракции соединяются. Скорость потока и промывки составляют 1 мл/мин; объем собранных фракций составляет 1 мл. Для идентификации фракций, содержащих SOD-С33c, аликвоты этих фракций анализируются методом электрофореза на 10% полиакриламидных гелях, содержащих SDS, с последующим окрашиванием красителем Комасси синий. Данные фракции могут также анализироваться точечным методом Вестерна с использованием антитела к SOD. Собираются фракции, содержащие SODС33с. Последующая очистка SOD-С33с осуществляется в колонке c Q-Сефарозой (1,5х5 см), которая уравновешивается с Буфером В. Собранные фракции, содержащие SOD-С33с, полученные методом хроматографии на S-Сефарозе, вводятся в колонку. Затем колонка промывается Буфером В и элюируется 60-ю мл градиента от 0,0 до 0,4 Моля NaСІ в Буфере В. Скорость потока через колонку, промывки и скорость элюирования составляют 1 мл/мин; собранные фракции составляют в объеме 1 мл. Все фракции из колонки с Q-Сефарозой анализируются как описало для колонки с S-Сефарозой. Максимум SОD-С33с, элюируемого из колонки, соответствует примерно 0,2 Мол NaCI. SOD-С33с полученный в колонке с Q-Сефарозой, имеет степень чистоты более чем примерно 90%, что подтверждается анализом на полиакриламидных гелях SDS и методам иммуно-точечного анализа с использованием моноклонального антитела к человеческому SOD. Пример 2: Синтез Антигена НСV С100 Антиген НСV С100 заключает в себе последовательности от доменов NS3 и NS4. В частности, он заключает в себе аминокислоты 1569-1931, как показано на фиг. 1. Данный антиген продуцируется в дрожжах. Приготавливается фрагмент кДНК на 1270 основных пap (bp), кодирующий указанные выше аминокислоты и имеющий конец ЕсоRI. Построение дрожжевого вектора экспрессии, в котором данный фрагмент сливается непосредственно с промотором S. сerevisiae ADH2/GAP, осуществляется согласно процедуре, которая включает усиление последовательности С100 с использованием метода PСR, с последующим вшиванием данной усиленной последовательности в клонирующий вектор. После клонирования последовательность С100 отделяется и вместе с последовательностью, заключающей в себе промотор ADH2/GAP, вшивается в широкий фрагмент дрожжевого вектора, в результате чего образуется дрожжевой вектор экспрессии. Усиление РСR антигена С100 осуществляется с использованием в качестве матрицы вектора pS3-56C100m, который был выравнен в линейную последовательность путем вываривания с Sal I. pS3-56, который является производным рВR322, заключает в себе экспрессионную кассету, которая состоит из гибридного дрожжевого промотора АDH2/GAPDH, расположенного до человеческого супероксидодисмутазного гена, и следующего за транскрипционным терминатором альфа фактора. Данные олигонуклеотидные праймеры, используемые для усиления, предназначены для ускорения клонирования в вектор экспрессии и для ввода трансляционного конеевого кодона. В частности, новые сайты 5'-Hind III и 3'-Sal I создаются с олигонуклеотидами РСR. Олигонуклеотид, содержащий сайт Sаl I, также кодирует двойные конце 6 41266 ваются в чашках на URА-сорбите, и затем отдельные трансформанты штрихуются на чашках с Leu-. Отдельные клоны культивируются в среде Lеu-, urа- с 2% глюкозы при 30°С в течение 2436 часов. Один литр пептонной среды дрожжевого экстракта (УЕР), содержащий 2% глюкозы, инокулируется 10-ю мл ночной культуры и полученная культура выращивается при 30°С со скоростью перемешивания 400 об/мин и скоростью аэрации 1 л воздуха на 1 л среды в минуту (lvvm) в течение 48 часов. Величина рH среды не регулируется. Данная культура выращивается в ферментере Bio Flo II, изготавливаемом фирмой "Нью Брансвик Сайнс Корп". После ферментации клетки выделяются и анализируются на экспрессию С100. Анализ выраженного полипептида С100 посредством трансформированных клеток осуществляется на лизате всех клеток, и сырые экстракты приготавливаются из одиночных дрожжевых колоний, полученных из посева на чашках се средой Leu-. Клеточные лизаты и сырые экстракты анализируются методом электрофореза на пополиакриламидных гелях SDS и точечным методом Вестерна. Точки Вестерна анализируются кроличьими поликлональными антителами к полипептиду SOD-С100, выраженному в дрожжах. Предполагаемый размер полипептида С100 составляет 364 аминокислоты. Гелевый анализ данного выраженного полипептида показал, что он имеет МWf 39,9 К. Оба метода анализа продемонстрировали, что выраженный полипептид С100 присутствует во всем клеточном лизате, но отсутствует в сырых экстрактах. Эти результаты подтверждают, что выраженный полипептид С100 может быть нерастворимым. Пример 3: Экспрессия антигена HCV S2 Антиген HCV S2 заключает в себе последовательность от гидрофобного N-конца домена S. Он включает аминокислоты 199-328, показанные на фиг. 1. Процедура построения вектора экспрессии, кодирующего полипептид S2, и процедура его экспрессии в дрожжах аналогичны данным процедурам, осуществляемым для экспрессии полипептида С100, описанным в примере 2. Матрица для реакции РCR представляет собой вектор рВR322/Pil4a, который был выравнен в линейную последовательность путем вываривания с Hind III. Pil4a, представляет собой клон кДНК, который кодирует аминокислоты 199-328. Олигонуклеотиды, используемые как затравки для усиления посредством РСR кодирующей последовательности S2, нижеследующие: Для 5'-участка последовательности S2: вые кодоны, ТАА и ТGA. Олигонуклеотид, содержащий сайт Нind III, заключает в себе также нетранслированную лидерную последовательность, образованную от гена рgар 63, расположенную непосредственно до кодона АUG. Ген рЕсо63GAPDH был описан Holland и Holland (1980 г.) и Knis Kern и др., 1986 г. Последовательности праймера PСR, используемые для прямой экспрессии С100m, следующие: 5' GAC TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGC CTC ACT TTC TAT CCC AGA CAA AGC AGA GT3' (посл. ID NO: 3) и 5' GAG-TGC TCG TCG ACT CAT TAG GGG GAA ACA TGG TTC CCC CGG GAG GCG AA 3' (посл. ID NO: 4). Усиление последством PCR с использованием праймеров и матрицы, осуществляется с помощью комплекта Celus-Perkin Elmer, и согласно указаниям изготовителя. Условия PCR следующие: 29 циклов при 94°С в течение минуты, 37°С в течение 2 минут, 72°С в течение 3 минут; и конечная инкубация при 72°С в течение 10 минут. Данная ДНК может храниться при 4°С или -20°С в течение ночи. После усиления продукты PCR вывариваются с Hind III и Sal I. Основной продукт на 1,1 основных пар (кв) очищается путем электорофореза на геле, и элюированный очищенный продукт сшивается с большим фрагментом Sal I-Hind III плазмиды pBR322. Для того, чтобы выделить правильные рекомбинанты компетентные клетки НВ101 трансформируются с данными рекомбинантными вектора, и после клонирования желаемые рекомбинанты идентифицируются на основе предсказанного размера фрагментов Hind III-Sal I, эксцизированных из данных клонов. Один из клонов, который заключает в себе фрагмент Hind III-Sal I правильного размера, называется pBR322/C100-d. Подтверждением того, что данный клон содержит усиленную С100, является результат анализа прямой последовательности фрагмента Hind III-Sal I. Вектор экспрессии, заключающий в себе С100, строится путем сшивки фрагмента Hind IIISal I от рВR322/С100 d с фрагментом BamHI-SaI I на 13,1 кв от рВS24.1, и фрагментом BamHI-SaI I на 1369 вр, содержащим промотор АDH2/GАР. (Последний фрагмент описывается в патенте ЕP 0164556). Вектор pBS24.1 описывается в патентной заявке US № 382805, поданной 19 июля 1989 года, совместного владельца. Фрагмент промотора АDН2/GАР получается путем вываривания вектора рРGAР/АG/ Hind III с Hind III и BamHI с последующей очисткой фрагмента 1369 бр на геле. Компетентные клетки НВ101 трансформируются рекомбинантными векторами; правильные рекомбинанты идентифицируются посредством образования фрагмента 2464 вр и фрагмента 13,1 кб, получаемых путем вываривания клонированных векторов с BamHI и Sal I. Один из клонированных правильных рекомбинантных векторов носит название рС100 d#3. Для экспрессии С100 компетентные клетки штамма Saеcharomyces cerevisiae AB122 (MATa leu2 ura 3-53 prb 1-1122 pep 4-3 prcl-407 (icr-0)) трансформируются с вектором экспрессии pC100-d#3. Трансформированные клетки высеи 5' GAG TGC TCA AGC TTC AAA ACA AAA TGG GGC TCT ACC ACC TCA CCA ATG ATT GCC CTA AC 3'; (поcл. ID NO: 5) и для 3'-участка последовательности S2: 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA GGG GAC CAG TTC ATC ACC ATA TCC CAT GCC AT 3' (поcл. ID NO: 6) Затравка для 5'-участка вводит сайт Hind III и инициирующий кодон АTG в усиленный продукт. Затравка для 3'-участка вводит трансляционные терминирующие кодоны и сайт Sal I в данный усиленный продукт. 7 41266 рующую С, непосредственно слитую с промотором АDН2/GАР, идентифицируется как рС22. Анализ выраженного полипептида С посредством трансформированных клеток осуществляется на полных клеточных лизатах и сырых экстрактах, полученных из единичных дрожжевых колоний, полученных из чашек с посевом в среде Leu-. Эти клеточные лизаты и сырые экстракты анализируются путем электрофореза на полиакриламидных гелях SDS. Полипептид С, как предполагается, заключает в себе 122 аминокислоты и согласно гелевому анализу этот выраженный полипептид имеет значение Wr примерно 13,6 кd. Пример 5: Синтез полипептида NS5 Данный полипептид заключает в себе последовательность от N-конца домена NS5. В частности, он включает аминокислоты от 2054 до 2464, показанные на фиг. 1. Процедура построения данного вектора экспрессии, кодирующего полипептид NS5, и процедура его экспрессии, аналогичны процедурам, осуществляемым для экспрессии С333с (см. пример 1). Пример 6: Радиоиммуноанализ на антитела к НСV Антигены HСV из примеров 1-5 испытываются методом РIА на их способность обнаруживать антитела к НCV в сыворотке пациентов с клиническим диагнозом как пациенты с HCV (H-A, не-В) в сыворотке, взятой из крови здоровых доноров. Радиоиммуноанализ (RIА) основан на способе TSU и Herzenberg (1980), Selected methods in cellular immunology (W.H. Freeman and Co.), с. 373391. Обычно микротитровальные пластины (Иммулон 2, удаляемые из ячеек полоски) покрывают очищенным антигеном HСV. Эти покрытые пластинки инкубируются с образцами сыворотки или соответствующими контрольными образцами. В ходе инкубации антитело, если оно присутствует, иммунологически связывается с твердофазным антигеном. После удаления несвязанного материала и промывки микротитровальных пластин комплексы антитело - антиген NANBV обнаруживаются путем инкубиции с меченым 125І овечьим анти-человеческим иммуноглобулином. Несвязанное меченое антитело уделяется путем отсоса, и пластины промываются. Определяется радиоактивность в отдельных ячейках; количество связанного человеческого анти-НСV антитела пропорционально радиоактивности в ячейках. В частности, стомикролитровые аликвоты, содержащие от 0,1 до 0,5 мкг антигена НСV в 0,125 Мол. буферного раствора бората натрия, рН=8,3, 0,075 Мол. NaCI (BВS) вводятся в каждую ячейку микротитровальной пластины (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). Эта микротитровальная пластина инкубируется при 4°С в течение ночи во влажной камере, после чего раствор антигена удаляется, и ячейки три раза промываются BBS, содержащим 0,02% Тиитона Х-100 (BBST). Для предотвращения неспецифического связывания, ячейки покрываются бычьим сывороточным альбумином (ВSА) путем ввода 100 микролитров раствора ВSА (5 мг/мл) в ВВS, c последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа; после этой инкубации раствор ВSА удаляется. Антигены в покрытых ячейках реагируют с сывороткой в результате добавления 100 микро Условия для РСR следующие: 29 циклов с температурой 94°С в течение минуты, 37°С в течение 2 минут, 72°С в течение 3 минут, и конечная инкубация при 72°С в течение 10 минут. Основным продуктом реакции РСR является фрагмент 413 вр, который подвергается гелевой очистке. Этот очищенный фрагмент сшивается с большим фрагментом, полученным из рВR322, вываренного с фрагментом Hind III и Sal I, в результате чего получается плазмида pВR322/S2d. В результате сшивки фрагмента Hind III-Sal I из 413 бр с фрагментом BamHI-Hind III на 1,36 кв, заключающим в себе промотор АDН2/GAР, и с большим фрагментом BamHI-Sal I дрожжевого вектора PBS24.1, получаются рекомбинантные векторы, в которые клонируются. Правильные рекомбинантные векторы идентифицируются по присутствию фрагмента 1,77 кс после вываривания с BamНІ и Sal I. Вектор экспрессии, построенный из данной усиленной последовательности и содержащий последовательность, кодирующую S2, слитую непосредственно с промотором АDН2/GАР, идентифицируется как рS2d#9. Пример 4: Синтез антигена HCV C Антиген НСV С22 является антигеном от домена С. Он включает аминокислоты 1-122 показанные на фиг. 1. Процедура построения данного вектора экспрессии, кодирующего полипептид С и процедура его экспрессии в дрожжах аналогичны процедурам, осуществляемым для экспрессии полипептида С100, описанным выше, за исключением следующего: Для 5'-участка последовательность С: 5' GAG TGC AGC TTC AAA ACA AAA TGA GCA CGA ATC CTA AAC CTC AAA AAA AAA AC 3 (посл. ID NO: 7) и для 3'-участка последовательность С: 5' GAG TGC TCG TCG ACT CAT TAA CCC AAA TTG CGC GAC CTA CGC CGG GGG TCT GT 3' (посл. ID NO: 8) Затравка для 5-участка вводит сайт Hind III в данный усиленный продукт, и затравка для 3'участка вводит трансляционные ининциирующие кодоны и сайт Sal I. РСR осуществляется следующим образом: 29 циклов с температурой 94°С в течение 1 минуты, 37°С в течение 2 минут, 72°С в течение 3 минут и конечная инкубация при 72°С в течение 10 минут. Основным продуктом усиления РСR является полинуклеотид 331 вр. В результате сшивки этого фрагмента с большим фрагментом Sal I-Hind III плазмиды pВR322 получается плазмида рВR322/С2. В результате сшивки с кодирующего фрагмента Hind III-Sal I (381 вp) эксцизированного из рВР322/С2, с фрагментом BamHI Hind III (1,36 кв), содержащим промотор АDH2/GАР, и с большим фрагментом BamHI-Sal I дрожжевого вектора рВS24.1, получаются рекомбинантные векторы, которые клонируются. Правильные рекомбинантные векторы идентифицируются по присутствию фрагмента 1,74 кв после вываривания с BamHI и с Sal I. Вектор экспрессии, построенный из данной усиленной последовательности и заключающий в себе последовательность, коди 8 41266 литров сывороточных образцов, с разбавлением 1:100 в 0,01 Мол. буферный раствор фосфата натрия рН=7,2, 0,15 Мол. NaCI (PBS), содержащий 10 мг/мл ВSА, и инкубации ячеек с данной сывороткой в течение 1 часа при 37°С. После инкубации сывороточные образцы удаляются путем отсоса, и ячейки пятикратно промываются ВВSТ. Антитело, связанное с данным антигеном, обнаруживается по связыванию меченого 125І F' (ав)2 овечьего анти-человеческого IgG с покрытыми ячейками. В каждую ячейку вводятся 100-микро литровые аликвоты меченой пробы (удельная активность 5-20 микроКори/микрограмм), и пластины инкубируются при 37°С в течение 1 часа, после чего избыток пробы удаляется путем отсоса, и осуществляется пять промывок BBST. Степень радиоактивности в каждой ячейке определяется путем подсчета с помощью счетчика, обнаруживающего гамма-излучение. В табл. 1 представлены результаты испытаний сыворотки от пациентов, имеющих диагноз как пациентов с НСV. Таблица 1 Table 1 Пациент Антиген 9 41266 Продолжение табл. 1 Пациент Антиген 10 41266 Продолжение табл. 1 Пациент Антиген 11 41266 Продолжение табл. 1 Пациент Антиген 12 41266 Продолжение табл. 1 Пациент Антиген 13 41266 Продолжение табл. 1 Пациент Антиген АVH = острый вирусный гепатит CVH = хронический вирусный гепатит PTVH = послетрансфузионный вирусный гепатит IVDA = внутривенный ввод лекарства crypto = криптогенный гепатит NOS = неочевидный источник Р = положительный N = отрицательный 14 41266 Как показывают эти результаты, ни один одиночный антиген не реагирует со всеми сыворотками. С22 и С33с являются самыми активными, и S2 реагирует с некоторыми сыворотками при некоторых случаях предполагаемого острого НСV, с которыми никакой другой антиген не реагирует. На основе этих результатов можно сделать вывод, что комбинацией двух антигенов, которая обеспечит наибольший диапазон обнаружения, является комбинация С22 и С33с. Если будет желательно обнаружение максимума острых инфекций, то в данную комбинацию необходимо включить S2. В нижеследующей табл. 2 представлены результаты испытания на донорах крови. Таблица 2 Table 2 Антигены Antigens Донор 15 41266 Продолжение табл. 2 Антигены Antigens Донор 16 41266 Продолжение табл. 2 Антигены Antigens Донор 17 41266 Продолжение табл. 2 Антигены Antigens Донор 18 41266 Продолжение табл. 2 Антигены Antigens Донор 19 41266 Продолжение табл. 2 Антигены Antigens Донор Результаты, подученные на здоровых донорах, обычно подтверждают результаты, полученные за сыворотке инфекционно зараженных пациентов. Пример 7: Определение антител HСV методом ферментативного иммуносорбентного анализа с использованием комбинации антигенов НСV Пластины, покрытые комбинацией антигенов С22 и С33с, приготавливаются следующим образом. Раствор, содержащий наносимый в качестве покрытия буфер (50 мМол. борта натрия, рН=9,0), 21 мл/пластина, BSА (25 мкг/мл), С22 и С33с (2,50 мкг/мл каждый), приготавливается непосредственно до ввода на пластины Removawell Immulon I (Dynatech Corp.). После перемешивания в течение 5 минут, на пластины подается 0,2 мл/ячейка раствора, на них наносится покрытие, и они инкубируются в течение 2 часов при 37°С, после чего раствор удаляется путем отсоса. Ячейки промываются один раз 400 микролитрами промывочного буферного раствора (100 Ммол. фосфата натрия, рН=7,4, 140 мМол. хлорида натрия 0,1% (вес/об) казеина, 1% (вес/об) Тритона х-100, 0,01% (вес/об) Тимеросаля). После удаления промывочного раствора вводят 200 мкл/ячейка последующего за покрытием раствора (10 мМол фосфата натрия, рН=7,2, 150 мМол. хлорида натрия, 0,1% (вес/об) казеина, 3% сахарозы и 2 мМол. фенилметилсульфонилфторида (PMSF), пластины свободно покрываются для предотвращения испарения, и их выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем ячейки подвергаются отсосу для удаления раствора и подвергаются сухой лиофилизации в течение ночи без самопроизвольного нагрева. Приготовленные таким путем пластины могут храниться при температуре 2-8°С в запаянных алюминиевых емкостях с осушителем (упаковки по 3 грамма Sorbit). Для осуществления ферментативного иммуносорбентного анализа (ELISA), 20 микролитров образца сыворотки или контрольного образца вводится в ячейку, содержащую 200 мкл разбавителя образца (100 мМол. фосфата натрия, рН=7,4 500 мМол. хлорида натрия, 1 мМол. ЕDTА, 0,1% (вес/об) Казеина, 0,01% (вес/об) Тимеросаля, 1% (вес/об) Тритона X-100, 100 мкг/мл дрожжевого 20 41266 экстракта). Пластины запаиваются и инкубируются при 37°С в течение 2 часов, после чего раствор удаляется путем отсоса, и ячейки трехкратно промываются 400-ми микролитрами промывочного буфера (фосфатосолевой буферный раствор (PBS), содержащий 0,05% Твина 20). Промытые ячейки обрабатываются 200 микролитрами коньюгата мышиный анти-человеческий IgG – пероксидаза ложечницы приморской (HRP), содержащегося в растворе коньюгатного разбавителя Орто (10 мМол. фосфата натрия, рН=7,2, 150 мМол. хлорида натрия, 50% (об/об) сыворотки бычьего эмбриона, 1% (об/об) термически обработанной лошадиной сыворотки, 1 мМол. к3Fe (СN)6, 0,05 (вес/об) Твина 20, 0,02% (вес/об) Тимеросаля). Обработка осуществляется в течение 1 часа при 37°С, раствор удаляется путем отсоса, и ячейки трехкратно промываются 400 миллилитрами промывочного буфера, который также удаляется путем отсоса. Для определения количества связанного ферментного коньюгата, вводится 200 мкл раствора субстрата (10 мг О-фенилендиаминдихлоргидрата на 5 мл раствора Проявителя). Раствор проявителя содержит 50 мМол. цитрата натрия с величиной рН=5,1, создаваемый посредством фосфорной кислоты, и 0,6 мкл/мл 30%-ной Н2О2. Пластины, содержащие данный раствор субстрата, инкубируются в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре, реакции прекращаются путем ввода 50 мкл/мл 4-нормальной серной кислоты, и определяется оптическая плотность (OD). Аналогичным образом могут осуществляться анализы ELISA с использованием гибридных белков С22 и C33c и С22, С33с и S2, а также комбинации С22 и С100, С22 и S2, С22 и анатигена NS5, С22, С33с и S2, и С22, C100 и S2. Модификации описанных выше приемов осуществления настоящего изобретения, которые очевидны для специалистов в области молекулярной биологии, иммунологии и смежных областях науки, не должны выходить из сферы действия данного изобретения, которая определена изложенной формулой изобретения. Перечень последовательностей Информация о последовательности ID NO: 1: (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 19 основных пар (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (X) Описание последовательности: GATCCTGGAA TTCTGATAA (2) Информация о последовательности ID NO: 2: (i) Характеристики последовательности: (А) Длина: 19 основных пар (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (хi) Oписание последовательности: ID NO: 2: ААТТТТАТСА GAАТТССАС (2) Информация о последовательности ID NO: 3: (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 56 основных пар (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (хi) Описание последовательности: ID NO: 3: GAGTGCTCAA GCTTCAAAAC AAAATGGCTC АСТТТСТАТС ССАGАСАААС САGАGТ (2) Информация о последовательности ID NO: 4 (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 50 основных пар (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (хi) Описание последовательности ID NO: 4 GAGTGCTCGT CGACTCATTA GGGGGAAACA TGGTTCCCCC GGGAGGCGAA (2) информация о последовательности ID NO: 5: (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 59 основных пар (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (х) Описание последовательности: ID NO: 5: GAGTGCTCAA GCTTCAAAAC AAAATGGGGC TCTACCACGT CACCAATGAT ТGСССТACС (2) Информация о последовательности ID NO: 6: (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 53 основных пары (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (х) Описание последовательности: ID NO: 6 GAGTGCTCGT СGACTСАТТА AGGGGACCAG ТТСАТСАТСА TATCCCATGC CAT (2) Информация о последовательности ID NO: 7 ( ) Характеристики последовательности: (А) Длина: 53 основные пары (В) Тип: нуклеиновокислотный (С) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (хi) Описание последовательности: ID NO: 7: GАGТGCAGCT ТСААААСAАА ATGAGCACGA АТССТАААСС TCAAAAAAAA AAC (2) Информация о последовательности ID NO: 8 (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 53 основные пары (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: единственная (D) Топология: линейная (хi) Описание последовательности: ID NO: 8: GAGTGCTCGT CGACTCATTA ACCCAAATTC CGCGACCTAC GCCGGGGGTC TGT (2) Информация о последовательности ID NO: 9: (i) Характеристики последовательности: (А) Длина: 9401 основных пары (B) Тип: нуклеиновокислотный (C) Число нитей: неизвестно (D) Топология: неизвестна (ii) Молекулярный тип: ДНК (геномная) 21 41266 22 41266 23 41266 24 41266 25 41266 26 41266 (2) Информация о последовательности ID NO: 10 (i) Характеристики последовательности: (A) Длина: 3011 аминокислот (B) Тип: аминокислотный (C) Число нитей: неизвестно (D) Топология: неизвестна (ii) Молекулярный тип: белок (ix) Характерные особенности (A) Название/Определитель; Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 9 (D) Другая информация: /Метка = Аrg или Lys/ (Примечание: "Аминокислота 8 может быть либо Аrg либо Lys") (iх) Характерные особенности: 27 41266 (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 11 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Asn либо Trh") (ix) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 176 (D) Друга информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Thr либо Ile") (ix) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 334 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Val либо Met") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 603 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Ile либо Leu") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 848 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Asn либо Tyr") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1114 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Pro либо Ser") (ix) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение 1117 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Ser либо Thr) (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1276 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Leu либо Pro") (х) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1328 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Gly либо Val") (iх) Характерные особенности (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1454 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Tur либо Cys") (iх) Характерные особенности (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1471 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Ser либо Thr") (х) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1877 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Glu либо Gly") (iх) Характерные особенности (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1948 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо His либо Leu") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 1949 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либo Cys либо Ser") (х) Характерные особенности: (А) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (В) Местоположение: 2021 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Gly либо Val") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2349 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Thr либо Ser") (х) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2385 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Phl либо Тyr") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2386 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Ser либо Ala'') (iх) Характерные особенности (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2502 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Leu либо Phe") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2690 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Gly либо Arg") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2921 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Gly либо Arg") (iх) Характерные особенности: (A) Название/Определитель: Модифицированный - сайт (B) Местоположение: 2996 (D) Другая информация: (Примечание: "Данная аминокислота может быть либо Leu либо Pro") (iх) Описание последовательности: ID NO: 10 28 41266 29 41266 30