Поліпептид, glp – 1-молекулярний комплекс на його основі, фармацевтична композиція (варіанти ) та спосіб одержання glp – 1-молекулярного комплексу

1 Полипептид формулы Ri -X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-TyrLeu-YGly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-LysGlyArg-R2, где Ri выбран из группы, включающей в себя Lгистидин, D-гистидин, дезамино-гистидин, 2амино-гистидин, -гидрокси-гистидин, гомогистидин, альфа-фторометил-гистидин и альфаметил-гистидин, X выбран из группы, включающей в себя Val, Thr, Не и альфа-метил-АІа, Y выбран из группы, включающей в себя Glu, Gin, Ala, Thr, Sern Gly, Z выбран из группы, включающей в себя Glu, Gin, Ala, Thr, Sern Gly, R2 выбран из группы, включающей в себя Nbb и Gly-OH, при условии, что указанное соединение имеет изоэлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,0 2 Полипептид по п 1, где Ri выбран из группы, включающей в себя His и дезамино-гистидин 3 Полипептид по п 1, где X представляет собой Val 4 Полипептид по п 1, где Y выбран из группы, включающей в себя Glu и Gin 5 Полипептид по п 1 где Z выбран из группы, включающей в себя Glu и Gin 6 Полипептид по п 1, где Ri представляет собой L-гистидин, X представляет собой Val, Y представляет собой Glu, Z представляет собой Glu, и R2 представляет собой Gly-OH 7 Полипептид по п 1, где Ri представляет собой L-гистидин, X представляет собой Val, Y представляет собой Gin, Z представляет собой Glu, и R2 представляет собой Gly-OH 8 Полипептид по любому из пп 1-7, или его фармацевтически приемлемая соль, для использования при лечении диабета 9 GLP-1-молекулярный комплекс, состоящий из катиона двухвалентного металла, ассоциированного и способного к совместному осаждению с полипептидом по любому из пп 1-7 10 Комплекс по п 9, отличающийся тем, что указанный катион двухвалентного металла представляет собой цинк 11 Комплекс по п 9 или п 10, или его фармацевтически приемлемая соль, для использования при лечении диабета 12 Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит комплекс по п 9 или п 10, или его фармацевтически приемлемую соль, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями 13 Способ получения GLP-1-молекулярного комплекса по п 9 или п 10, включающий смешивание GLP-1-молекулы с катионом двухвалентного металла 14 Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит полипептид по любому из пп 1-7, или его фармацевтически приемлемую соль, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями О (О (О 44696 Настоящее изобретение относится к области фармацевтической и органической химии, а, в частности, к новым соединениям и фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы для увеличения экспрессии инсулина из островковых В-клеток поджелудочной железы млекопитающего и для лечения ювенильного сахарного диабета у млекопитающих Внутренняя секреция островков Лангерганса находится под комплексным контролем, осуществляемым не только посредством метаболитов крови /глюкозы, аминокислот, катехоламинов, и т п /, но и также посредством локальной паракринной регуляции Главные гормоны островков Лангерганса (глюкагон, инсулин, и соматотропин) взаимодействуют друг с другом в их специфических клетках (А-, В- и D-клетках, соответственно), модулируя секреторный ответ, опосредованный вышеуказанными метаболитами Хотя секреция инсулина регулируется, главным образом, уровнями глюкозы в крови, однако, глюкозоопосредованная секреция инсулина ингибируется соматостатином Кроме того, помимо предполагаемой межостро в ко вой паракринной регуляции секреции инсулина, имеются основания предположить о существовании инсулинотропных факторов в кишечнике Это предположение было сделано на основании наблюдений, которые показали, что глюкоза введенная перорально, является более сильным стимулятором секреции инсулина, чем то же самое количество глюкозы, введенное внутривенно Гормон человека, глюкагон, продуцируемый Аклетками поджелудочной железы, представляет собой пептид, состоящий из 29 аминокислот Этот гормон принадлежит к мультигенному семейству структурно родственных пептидов, таких, как секретин, пептид, угнетающий секрецию желудка, вазоактивный интестинальный пептид, и глицентин Указанные пептиды по-разному регулируют углеводный обмен, гастроинтестинальную подвижность, и секреторное процессирование Однако, главной из известных функций глюкагона поджелудочной железы является стимулирование гликогенолиза и глюконеогенеза в печени, что приводит к повышению уровней сахара в крови С этой точки зрения, действие глюкагона является противоположным регулирующему действию инсулина, и стимулирует гипергликемию, являющуюся симптомом сахарного диабета [(Lund, P К и др , Proc Natl Acad Sci U S A , 79 345-349, (1982)] Было установлено, что глюкагон может связываться со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности клеток, продуцирующих инсулин Связываясь с этими рецепторами, глюкагон стимулирует быстрый синтез сАМР этими клетками Было также установлено, что сАМР, в свою очередь, стимулирует экспрессию инсулина [formen, LY, и др, Diabetes, 34 717-722 (1985)], а инсулин способствует подавлению синтеза глюкагона [Ganong, W Р , Review of Medical Physiology, Lange Publication, Los Altos, California, p 273 (1979)] Таким образом, экспрессия глюкагона строго регулируется инсулином, и в конечном счете уровнем глюкозы в сыворотке Первоначальная трансляция гена глюкагона происходит из предшественника, имеющего 360 пар оснований, и в результате этой трансляции синтезируется полипептид препроглюкагона [(Lund и др , Proc Natl Acad Sci и S A , 79 345-349 (1982)] Затем, этот полипептид подвергается посттрансляционному процессингу с образованием проглюкагона После этого, как было показано PatzeltC и др [(nature, 282 260-266 (1979)], образовавшийся проглюкагон расщепляется на глюкагон и второй полипептид В своих последующих работах Lund Р К и др , Lopez L С И др, Proc Natl Acad Sci U S A, 80 5485-5489 (1983), и Bell G 1 и др , Nature 302 716-718 (1983) продемонстрировали, что молекула проглюкагона расщепляется на участке, расположенном непосредственно после дипептидных остатков лизинааргинина Исследования проглюкагона, продуцируемого кошачьим сомиком (Ictalurus punctata) показали, ,что глюкагон, полученный от этого животного, также был протеолитически отщеплен на участке, расположенном непосредственно после дипептидных лизин-аргининовых остатков [Andrews PC и др , Т Biol Chem , 260, 3910-5914 (1985), Lopez С и др , Proc Natl Acad Sci U S A , 80 5485-5489 (1983)] Bell G I и др (см выше) обнаружили, что проглюкагон млекопитающего расщепляется у лизин-аргининовых или аргининаргининовых дипептидов, и показали, что молекула проглюкагона состоит из трех дискретных и высокогомологичных пептидных молекул, которым были даны следующие названия глюкагон, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид 2 (GLP-2) На основании этого, Lopez, и др был сделан вывод, что глюкагоноподобный пептид 1 имеет длину в 37 аминокислотных остатков, а глюкагоноподобный пептид 2 имеет длину в 34 аминокислотных остатков Аналогичные исследования структуры препроглюкагона крыс выявили сходную картину протеолитического расщепления, происходящего на участке между смежными дипептидными лизинаргининовыми аргинин-аргининовыми остатками,, и приводящего к образованию глюкагона, GLP-1 и GLP-2 [(HemnchG et al , Endocnnol , 115 21762181 (1984)] Было установлено, что у человека, крысы, быка и хомячка, последовательности GLP1 являются идентичными [(Ghighone М , et al , Diabetologia, 27 599-600(1984)] Вывод относительно размера последовательности GLP-1, высказанный Lopez и др , был подтвержден работой Uttenthal L О , и др (J Clm Endocnnol Metabol , 61 472-479, - Uttenthal L О и др исследовали молекулярные формы GLP-1, которые присутствуют в поджелудочной железе человека Результаты этого исследования показали, что GLP-1 и GLP-2, присутствующие в поджелудочной железе, представляют собой пептиды, состоящие, соответственно, из 37 и 34 аминокислот В более ранних исследованиях, исходя из аналогии между GLP-1 и глюкагоном, было сделано предположение, что GLP-1 также может обладать биологической активностью И хотя некоторыми исследователями было установлено, что GLP-1 индуцируется клетками головного мозга крысы с последующим синтезом cAMP [(Hoosem N М , et al , Febs Lett 178, 83-86 (1984)], однако, другим исследователям не удалось выявить какую-либо физиологическую роль GLP-1 (Lopez L С , et al) Эта безуспешная попытка идентифицировать какие-либо физиологические функции GLP-1 поставила исследователей перед решением важной задачи, а именно является ли на самом деле GLP-1 гормоном, и имеется ли действительно родство между глюкагоном и GLP1, либо предполагаемое родство является лишь артефактом 44696 натощак является необходимым условием для достижения полной нормализации обмена веществ, которая является достаточной для предупреждения осложнений гипергликемии Однако, если учитывать тот факт, что существующие формы инсулина редко нормализуют продуцирование глюкозы в печени, не стимулируя, при этом, значительной гиперинсулинемии и гипогликемии (Galloway J А , и Galloway J А и др , см выше), то необходимо разработать другие альтернативные способы регулирования уровней глюкозы в крови Внутривенные вливания GLP-1 (7-36)NH2 с продуцированием сывороточных концентраций, вдвое превышающих нормальную концентрацию, показали результаты, представленные в нижеприведенной таблице Кроме того, были также получены и исследованы варианты GLP-1 (7-37) и их аналоги Такими вариантами и аналогами являются, например,Gin9 -GLP-1 (7-37), D-GIn9-GLP-1 (7-37), ацетил-Lys 9 GLP-1 (7-37), Thr16 - Lys 1 8 - GLP-1 (7-37), Lys 1 8 GLP-1 (7-37) и T п , а также их производные, включая, кислые аддитивные соли, карбоксилатные соли, низшие алкиловые сложные эфиры, и амиды (см , например, WO 91/11457) Известно, что, в основном, вышеуказанные формы стимулируют секрецию (инсулинотропное действие) и образование сАМР [(см , например, Mojsov S , Int J Peptide Protein Reseach, 40, 333-343 (1992)] При этом, важно отметить, что многими исследователями была проиллюстрирована связь между лабораторными экспериментами и инсулинотропными ответами млекопитающих, в частности человека, на введение GLP-1, а конкретно GLP-1 (7-36) МН2 и GLP-1 (7-37) [(см , например, NauckMA et al, Diabetologia, 36 741-744 (1993), Gutmak M , et al New England J of Medicine , 326(20) 1316-1322 (1992), Nauck M A , et al , J, Chn Invest, 91301-307 (1993), и Thorens В , et al , Diabetes, 42 1219-1225 (1993)] В частности, было показано, что главными нарушениями, вызывающими гипергликемию при заболевании ювенильным диабетом, являются уменьшение секреции эндогенного инсулина и резистентность к действию инсулина в мышцах и печени [(Galloway J S , Diabetes Care, 13 12091239 (1990)] Последнее из указанных нарушений приводит к чрезмерному продуцированию глюкозы в печени Так, например, у здорового индивидуума, высвобождение глюкозы происходит со скоростью примерно 2мг/кг/мин , тогда, как у пациентов с ювенильным диабетом, количество высвобождаемой глюкозы обычно превышает 2,5мг/кг/мин , что приводит к избыточному продуцированию глюкозы, составляющему, по крайней мере, 70 грамм глюкозы за 24 часа Факт существования исключительно высокой степени корреляции между продуцированием глюкозы в печени, содержанием глюкозы в крови натощак, и полным метаболическим контролем, как показали измерения гликогемоглобина [(Galloway J A, см выше, и Galloway J А и др, Chn Therap, 12 460-472 (1990)], со всей очевидностью свидетельствует о том, что регулирование уровня глюкозы в крови Нормальные индивидуумы Гликемия при приеме пищи (1) Гликемия натощак Содержание глюкагона натощак (2) Содержание глюкагона после приема пищи (1) Секреция эндогенного инсулина в ответ на прием пищи Пациенты с ювенильным диабетом без изменений пониженная пониженная пониженное пониженное без изменений повышенная пониженное (3) пониженное (2) О) Содержание свободных жирных кислот (1) Gutmak M , и др , см выше (2) Uauck MA и др , Diabetologia, см выше (3) OrskovC и др, Diabetes,42 658-661, (1993) Однако, стабильность GLP-1, а в частности стабильность GLP-1 как компонента фармацевтической композиции, предназначенной для введения млекопитающим, не является достаточно долговременной И действительно, при хранении при температуре 4°С, уже через 11 месяцев после получения образцов были обнаружены побочные продукты GLP-1 (7-37) (Mojsov S , см выше) Поэтому совершенно очевидно, что необходимо получить более стабильное соединение GLP-1, которое можно было бы без всякого риска вводить млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении Кроме того, биологическое время полужизни молекул GLP-1, а в частности, молекул, подвергающихся воздействию дипептидил-пептидазы IV (DPP IV), является очень непродолжительным Например, биологическое время полужизни GLP-1 44696 (7-37) составляет лишь 3-5 минут, и кроме того, после его парентерального введения млекопитающему, он быстро абсорбируются Поэтому, желательно также получить такое соединение GLP-1, абсорбция которого происходит через более длительный промежуток времени после его введения млекопитающему В соответствии с вышеуказанным необходимо отметить, что настоящее изобретение позволяет разрешить проблемы, связанные с нестабильностью нативных молекул GLP-1, присутствующих в сыворотке, а также с их непродолжительным временем полужизни Кроме того, соединения настоящего изобретения после их парентерального введения, обладают замедленной абсорбцией, а значит и более продолжительным биологическим временем полужизни Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения настоящего изобретения, а также к способам использования этих соединений Настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из катиона двухвалентного металла, ассоциированного и способного к совместной преципитации с соединением формулы RrX-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-lle-Ala-TrpLeu-Val-Lys-Gly-Arg-R2 где Ri выбирают из группы, включающей в себя L-гистидин, D-гистидин, дезамино-гистидин, 2-амино-гистидин, р-гидрокси-гистидин, гомогистидин, альфа-фторометил-гистидин, и альфаметил-гистидин, X выбирают из группы, включающей в себя Ala, Gly, Val, Thr, lie, и альфа-метил-АІа, Y выбирают из группы, включающей в себя Glu, Gin, Ala, Thr, Ser, и Gly, Z выбирают из группы, включающей в себя Glu, Gin, Ala, Thr, Ser, и Gly, R2 выбирают из группы, включающей в себя NH2, и Gly-OH, при условии, что указанное соединение имеет изоэлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,0, и при условии, что если Ri является His, X является Ala, Y является Glu, a Z является Glu, то R2 должен представлять собой NH2 Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение настоящего изобретения в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями, или наполнителями Кроме того, настоящее изобретение относится к способу увеличения экспрессии инсулина, заключающемуся в обеспечении островковых Вклеток поджелудочной железы эффективным количеством соединения настоящего изобретения, а также к способу лечения ювенильного диабета, заключающемуся во введении млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества соединения настоящего изобретения В одном из вариантов своего осуществления, настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из молекулы GLP-1, имеющей изоэлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,0, и из катиона двухвалентного металла 8 Используемый в настоящем описании термин "молекула GLP-1" относится к натуральным глюкагоноподобным пептидам 1 (GLP-1) (7-36) NH2 и GLP-1 (7-37), к натуральным или денатуральным функциональными аналогам и производным этих пептидов, и к их солям Аминокислотная последовательность пептида GLP-1 (7-36) NH2 хорошо известна специалистам, однако, для удобства читателя, эта последовательность приводится ниже 7 10 15 His -Ala-Glu-Gly -Thr-Phe-Thr-Ser-Asp -Val20 25 Ser-Ser-Tyr-l_eu -Glu-Gly-Gln-Ala-Ala -Lys-Glu30 35 Phe-lle-Ala -Trp-Leu-Val-Lys-Gly -Arg-NH2 В случае GLP-1 (7-37), карбокс и-концевая 36 амидная функциональная группа Arg заменена на Gly в 37-положении молекулы GLP-1 (7-36) NH2 Кроме того, существование и получение многочисленных защищенных, незащищенных и частично защищенных натуральных и ненатуральных функциональных аналогов и производных молекул GLP-1 (7-36) NH2 и GLP-1 (7-37) раскрываются в литературе (см , например, патенты США №№5120712 и 5118666, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки, и OrskovC, и др, J Biol Chem, 264(22) 1282612829 (1989), и WO 91/11457 [(Buckley D I , и др , опубл 8 авг 1991)] Известно, что аминокислотные остатки могут существовать в защищенной форме, в которой обе амино- и карбокси-группы имеют соответствующие защитные группы, в частично-защищенной группе, в которой либо амино-, либо карбокси-группа имеет соответствующую защитную группу, или в незащищенной форме, в которой ни амино-, ни карбокси-группа не имеет соответствующей защитной группы В литературе описано множество реакций, используемых для образования и удаления защитных групп, см , например, такие работы, как "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press (London and New York, 1973), Green T H , "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley (Hew York, 1981), и "The Peptides", vol 1, Sehroder & Lubke, Academic Press (London and UewYork, 1965) Характерными аминозащитными группами являются, например, формил, ацетил, изопропил, бутоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, карбобензилокси, и т п Характерными карбоксизащитными группами являются, например, бензиловый сложный эфир, метиловый сложный эфир, этиловый сложный эфир, т-бутиловый сложный эфир, пнитрофениловый сложный эфир, и т п Помимо защищенных форм, в которых аминои карбокси-группы имеют соответствующие защитные группы, термин "защищенный" также относится к таким молекулам GLP-1, в которых нейтрализуется или ингибируется активность дипептидил-пептидазы IV [(см , например, Mentlein R, и др, EurJBiochem, 214 829-835 (1993)] Помимо GLP-1 (7-36) NH2, предпочтительными являются молекулы, которые защищены от активности DPP IV, а более предпочтительными являются Gly8 - GLP-1 (7-36) NH2, Val8-GLP-1(737)OH, a-Me™n-Ala8-GLP-1 (7-36)NH2 и Gly8-Gln GLP-1 (7-37)OH 44696 10 рат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлоробензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метокс и бензоат, фталат, сульфонат, ксилолсулъфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гаммагидроксибутират, гликолат, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат, и т п Предпочтительными являются кислые аддитивные соли, образованные минеральными кислотами, такими, как хлористоводородная и бромистоводородная кислота, а предпочтительно, хлористоводородная кислота Основными аддитивными солями являются соли, образованные неорганическими основанияК молекулам GLP-1 настоящего изобретения ми, такими, как гидроксиды, карбонаты, и бикартакже относятся аналоги GLP-1 (7-36)NH2 и GLP-1 бонаты аммония, щелочных металлов и щелочно(7-37), где одна или несколько аминокислот, не земельных металлов, и т п Основаниями, которые присутствующих в исходной последовательности, могут быть использованы для получения солей являются добавленными, либо одна или нескольнастоящего изобретения, являются гидроксид нако аминокислот являются делетированными, а трия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карботакже производные указанных аналогов В частнонат калия, и т п Соединения настоящего изобрести, в вышеуказанных молекулах, предпочтительтения в виде соли являются особенно но, если Ri представляет собой His и дезаминоп ре д п очтител ь н ы м и гистидин, при условии, что изоэлектрическая точка всей молекулы находится в диапазоне от около 6 Если соединения настоящего изобретения исдо 9 Кроме того, предпочтительно, если в полопользуются в фармакотерапевтических целях, то жении "X" присутствуют Ala, Sly и Val, при условии, само собой разумеется, что эти соединения также что изоэлектрическая точка всей молекулы нахомогут быть получены в виде соли, но эти соли дится в диапазоне от около 6 до 9 Аналогичным должны быть фармацевтически приемлемыми образом, предпочтительно, если в положение "Y" Так, например, помимо вышеуказанных GLP-1 присутствуют Glu и Gin, при условии, что изоэлекмолекул, настоящее изобретение также включает трическая точка всей молекулы находится в диав себя молекулы GLP-1, которые обладают функпазоне от около 6 до 9 Также предпочтительно, циональной инсулинотропной активностью Тересли в положении "Z," присутствуют Glu и Gin, при мин "инсулинотропная активность" означает споусловии, что изоэлектрическая точка всей молекусобность данного соединения стимулировать или лы находится в диапазоне от около 6 до 9 И наиндуцировать стимуляцию синтеза или экспрессии конец, предпочтительно, если F 2 представляет ? инсулина собой Gly-OH, при условии, что изоэлекстрическая Инсулинотропные свойства соединения могут точка всей молекулы находится в диапазоне от быть определены путем обработки клеток животоколо 6 до 9 ного данным соединением, или путем инъецирования данного соединения животному с послеКроме того, настоящее изобретение включает дующим наблюдением высвобождения в себя солевые формы молекулы GLP-1 GLP-1 иммунореактивного инсулина (IRI) в среду или в молекулы настоящего изобретения могут иметь систему кровообращения животного, соответстдостаточно кислотные, достаточно основные, или венно Присутствие IRI может быть обнаружено с кислотные и основные функциональные группы, и помощью радиоиммуноанализа, позволяющего в соответствии с этим, указанные молекулы могут осуществлять специфическую детекцию инсулина вступать в реакцию с любыми из соответствующих неорганических оснований, и неорганических и Хотя в целях настоящего изобретения может органических кислот с образованием соли Для быть использован любой радиоиммунный анализ, образования кислых аддитивных солей обычно способный обнаруживать присутствие IRI, однако, используют неорганические кислоты, такие, как предпочтительно использовать модификацию соляная кислота, бромистоводородная кислота, аналитического метода Albano, J D М et al [(Acta йодистоводородная кислота, серная кислота, Endocnnol , 70 487-509 (1972)] Эта модификафосфорная кислота, и т п , и органические кислоция предусматривает применение фосфатноты, такие, как п-толуолсульфоновая кислота, меальбуминового буфера с рН 7,4 Среду для инкутан-сульфоновая кислота, щавелевая кислота, пбации приготавливают путем последовательного бромофенилсульфоновая кислота, угольная кидобавления 500мкл фосфатного буфера, 50мкл слота, янтарная кислота, лимонная кислота, бенперфузируемого образца или стандартную норму зойная кислота, уксусная кислота, и т п Примеракрысиного инсулина в перфузате, ЮОмкл антиинми таких солей могут служить сульфат, сулиновой антисыворотки (Wellcome laboratories, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, разведение 1 40000), и ЮОмкл [125і]-инсулина, в фосфат, монобифосфат, дибифосфат, метафосрезультате чего получают полный объем 750мкл в фат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, стеклянной пробирке (10 х 75мм) для одноразовопропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, го использования, После инкубации в течение 2-3 изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксадней при 4°С, свободный инсулин отделяют от лат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумаинсулина, связанного с антителом, методом разПроизводными природных молекул GLP-1 являются такие пептиды, которые могут быть получены путем фрагментации нативной последовательности, или путем синтеза, проводимого на основании имеющихся данных о природной аминокислотной последовательности из генетического материала (ДНК или РНК), кодирующего эту последовательность Термин "производные" также относится к химическим модификациям натуральной или ненатуральной молекулы GLP-1 Способы получения таких производных хорошо известны специалистам в области органической и пептидной химии (см , например, WO 91/11457, см выше) 11 44696 12 деления с использованием активированного угля сится к гистидиновой функциональной группе, коЧувствительность анализа составляет 1торая была изменена химическим или биологиче2мкЕд/мл Для оценки высвобождения IRI в кульским способом, либо к уже измененной туральную среду клеток, выращиваемых в тканегистидиновой функциональной группе, которая вой культуре, предпочтительно вводить в проинбыла синтезизована de novo, но которая, при сулин радиоактивную метку В этих целях может этом, сохранила свою способность связываться с быть использована любая радиоактивная метка, металлом способная к мечению полипептида, однако, для Многие из таких модифицированных гистидиполучения меченного проинсулина предпочтиновых функциональных групп, а также способы их тельно использовать Зн-лейцин Мечение может получения являются известными, например, Dбыть осуществлено в течение любого периода гистидин (WO 91/11457), дезамино-гистидин [(WO времени, достаточного для образования обнару92/18531), 2-амино-гистидин (Levme-Pmto Н , et al , живаемого меченного пула проинсулиновых молеBiochem Biophys Res Commun , 103(4) 1121 -1130 кул, но, тем не менее, инкубирование клеток в (1981)], р-гидрокси-І_-гистидин [(Owa T, et al , присутствии радиоактивной метки предпочтительChemistry Letters pp 1873-1874 (1988)], Lно проводить в течение 60 минут ГОМОГИСТИДИН [(Altman J , et al , Synthetic Commun , 19 (11 £12)2069-2076 (1989)] , а-фторометилДля оценки инсулинотропных свойств соедигистидин (патент США № 4347374), и анения могут быть использованы многие клеточные метилгистидин [(Q'Donnell МJ , Synthetic линии, способные экспрессировать инсулин, однаGommun , 19(78) 1157-1165 (1989)] ко, предпочтительно использовать клетки инсулиномы крысы, а особенно клетки инсулиномы крыКроме того, необходимо, чтобы GLP-1сы RIN-38 Эти клетки могут быть культивированы молекулы настоящего изобретения имели изов любой подходящей среде, но тем не менее, электрическую точку в диапазоне от около 6,0 до предпочтительной является DME - среда, содероколо 9,0 о В литературе описаны многие молекужащая 0,1% BSA и 25мм глюкозы лы GLP-1, имеющие изоэлектрическую точку в Инсулинотропная способность соединения указанном диапазоне, например может быть также определена путем панкреатиGLP-1 (7-36 )NH 2 ческого вливания In situ - выделенную перфузиGly8 -GLP-1 (7-36 )NH 2 руемую поджелудочную железу крысы получали в Gln9-GLP-1 (7-37) соответствии с модифицированным методом D-Gln9-GLP-1 (7-37) PenhosJC et al Diabetes, 18 733-738 (1969) Беацетил -Lys9-GLP-1 (7-37) лых крыс-самцов штамма Charles River, весом Thr9-GLP-1 (7-37 350-600, и находящихся на голодной диете, анеD-Thr9-GLP-1 (7-37) стезируют путем внутрибрюшинной инъекции Asn9-GLP-1 (7-37) амиталнатрия (Amytal Sodium) (Eh Lilly & Co, D-Asn9-GLP-1 (7-37) 160нг/кг) Почки, надпочечник, желудок, и кровеSer22-Arg23-Arg -Gin26- GLP-1 (7-37) носные сосуды нижней части толстой кишки лигиThr16-Lys18-GLP-1 (7-37) руют Весь кишечник удаляют за исключением Lys18-GLP-1 (7-37) примерно 4см двенадцатиперстной кишки, и нисArg23-GLP-1 (7-37) ходящей ободочной и прямой кишки Поэтому, Arg24-GLP-1 (7-37), и т п (например, WO лишь небольшая часть кишечника подвергается 91/11457, см выше) Кроме того, если GLP-1 моперфузии, что минимизирует возможное влияние лекулы настоящего изобретения вместо гистидикишечного материала на глюкагоноподобную реновых функциональных групп имеют вышеуказанактивность Перфузат представляет собой модиные модифицированные гистидиновые фицированный по способу Кребсарингера бикарфункциональные группы, то их изоэлектрическая бонатный буфер, содержащий 4% декстранаТ70 и точка должна находиться в вышеуказанном диа0,2% альбуминабычьей сыворотки (фракция V), и пазоне Способы вычисления или эксперименбарботированный 95% Ог и 5% СО2 При этом истального определения изоэлектрической точки пользуют 4-каналъный перистальтический насос, других молекул GLP-1 хорошо известны специадающий непульсирующий поток (Buchler polystatic листам Buchler Instruments Division, Nuclear-Chicago Способы получения GLP-1 молекул настоящеCorp), а переключение с одного источника перфуго изобретения также хорошо известны любому зата на другой осуществляют с помощью треххоспециалисту в области пептидной химии дового запорного крана Перфузию, слежение, и В одном из таких способов, молекулы GLP-1 анализ осуществляют по методу WeirG С et al , получают в соответствии с хорошо известными J Chn Inestigat, 54 1403-1412 (1974), который процедурами твердофазного петидногр синтеза, вводится в настоящее описание посредством описанного Mernfield J M , Chem Soc, 85 2149 ссылки (1962), и Stewart & Young, Solid Phase Peptide При этом, необходимо, чтобы GLP-1Synthesis, pp 24-66, Freeman (Сан-Франциско, молекулы настоящего изобретения имели в своем 1969) Однако, отдельные фрагменты проглюкагоамино-конце гистидиновые функциональные групнового полипептида или GLP-1 (1-37) могут быть пы GLP-1-1-молекулы настоящего изобретения, также получены путем фрагментации нативной могут также иметь модифицированные гистидиноаминокислотной последовательности с использовые функциональные группы вместо требуемых ванием, например, протеолитического фермента гистидиновых функциональных групп Кроме того, нужные фрагменты проглюкагонового пептида или GLP-1 (1-37) могут быть получены с Термин "модифицированный гистидин" отно 13 44696 использованием техники рекомбинантных ДНК, описанной MamatisT, et al, Molecular Biology-A Laboratory Manual CSH (Cold Spring Harbo, 1982), Более того, пользуясь достижениями современной молекулярной биологии, каждый специалист может использовать и другие средства для получения соединений настоящего изобретения И хотя, как указывалось выше, для получения соединений настоящего изобретения могут быть использованы методы твердофазного пептидного синтеза или рекомбинантные методы, однако, благодаря возможности получить более высокие выходы, рекомбинантные методы могут оказаться предпочтительными Рекомбинантный метод продуцирования включает в себя следующие стадии a) выделение натуральной ДНКпоследовательности, кодирующей GLP-1молекулу, или конструирование синтетической или полусинтетической ДНК-последовательности, кодирующей GLP-1 молекулу, b) введение кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии белков либо в изолированном виде, либо в виде гибридных белков, c) трансформация соответствующей эукариотической или прокариотической хозяйской клетки с использованием экспрессирующего вектора, d) культивирование трансформированной хозяйской клетки в условиях, благоприятствующих экспрессии молекулы GLP-1, и e) выделение и очистка рекомбинантно продуцированной молекулы GLP-1 Как было указано выше, кодирующие последовательности могут быть полностью синтезированы, либо, они могут быть получены в результате модификации более крупной нативной глюкагонкодирующей ДНК ДНК-последовательность, кодирующая препроглюкагон, приводится в работе Lund и др (proc Natl Acad Sci U S A , 79 345-349 (1982)), и может быть использована в качестве исходного материала в полусинтетическом продуцировании соединений настоящего изобретения путем модификации нативной последовательности с получением нужных результатов Синтетические гены, которые посредством in vitro или in vivo-транскрипции и трансляции продуцируют молекулу GLP-1 могут быть сконструированы известными способами Каждому специалисту известно, что вследствие естественного вырождения генетического кода, может быть сконструировано вполне определенное число ДНКпоследовательностей, кодирующих молекулы GLP-1 Методика конструирования синтетического гена хорошо известна специалистам См , например, Brown и др (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N Y , Vol 68, pp 109-151 ДНКпоследовательности, кодирующие молекулу GLP1, могут быть сконструированы исходя из аминокислотных последовательностей, раскрытых в настоящем описании После осуществления генетических построений, сама последовательность может быть генерирована с использованием стандартной аппаратуры для синтеза ДНК, например, такой, как ДНК-синтезаторы модели 380А или 380В (PE-Apphed Biosystems, Inc, 850 Lincoln 14 Center Drive, Poster City, CA 94404) Для осуществления экспрессии молекулы GLP-1, сконструированную синтетическую ДНКпоследовательность вставляют в один из многих экспрессируюших векторов, подходящих для экспрессии рекомбинантной ДНК, с использованием соответствующих рестриктирующих эндонуклеаз См , например, Mamatis и др (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N Y , Vol 1-3 Сайты рестрикции эндонуклеазы конструируют на любом конце ДНК, кодирующей молекулу GLP-1, для облегчения ее выделения из известных амплифицирующих и экспрессирующих векторов, и интеграции в эти векторы Выбор конкретных эндонуклеаз может быть осуществлен исходя из рестрикционной карты используемого исходного вектора экспрессии, Рестрикционные сайты выбирают так, чтобы кодирующая последовательность была правильно ориентирована по отношению к регуляторным последовательностям для осуществления правильного считывания с сохранением рамки и экспрессии нужного белка Кодирующая последовательность должна быть вставлена с сохранением рамки считывания по отношению к промотору и сайту связывания с рибосомой экспрессирующего вектора, которые являются функциональными в хозяйской клетке, предназначенной для экспрессии белка Для эффективного осуществления транскрипции синтетического гена, этот ген должен быть правильно присоединен к области промотораоператора Поэтому, область промотораоператора синтетического гена помещают в той же самой ориентации по отношению к инициирующему кодону ATG синтетического гена Для трансформации прокариотических и эукариотических клеток могут быть использованы различные экспрессирующие векторы, хорошо известные специалистам См , например, The Promega Biological Research Products Catalogue (1982) (Promega Corp, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl, 53711-5389), и The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp , 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) Кроме того, в патенте США № 4710473 описаны трансформирующие кольцевые ДНК-плазмидные векторы, используемые для экспрессии экзогенных генов в Е coll с высокими уровнями экспрессии Указанные плазмиды могут быть использованы в качестве трансформирующих векторов при продуцировании рекомбинантных ДНК, и (а) несут в себе способность к автономной репликации в клетке-хозяине, (о) регулируют автономную репликацию плазмиды при температуре, при которой содержатся культуры клеток-хозяев, (c) обеспечивают сохранение плазмиды в популяциях клеток-хозяев, (d) регулируют синтез белкового продукта, что свидетельствует о сохранении плазмиды в популяции клеток-хозяев, (e) обеспечивают распознавание серией рестриктируюших эндонуклеаз сайтов, уникальных для данной плазмиды, и (f) обеспечивают терминацию транскрипции 15 44696 16 мРНК Продукт, полученный в результате этой реакции, и представляющий собой кристаллическую Указанные кольцевые ДНК-плазмиды могут или аморфную суспензию, выделяют и очищают с быть использованы в качестве векторов при происпользованием стандартной техники дуцировании рекомбинантных ДНК для обеспечения высоких уровней экспрессии экзогенных генов Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим После того, как вектор для экспрессии молесоединение настоящего изобретения в комбинакулы GLP-1 будет сконструирован, его необходиции с фармацевтически приемлемым носителем, мо ввести в соответствующую клетку в целях созразбавителем, или наполнителем Такие фармадания рекомбинантной хозяйской клетки для цевтические композиции могут быть получены в экспрессии полипептида Техника трансформации соответствии со стандартной техникой, обычно клетки с использованием рекомбинантных ДНКиспользуемой в фармацевтической практике, и векторов хорошо известна специалистам, и опивведены пациенту либо отдельно, либо в сочетасана в таких фундаментальных работах, как нии с другими терапевтическими средствами, Mamatis и др (см выше) Клетки-хозяева могут предпочтительно парентерально Особенно предбыть сконструированы из эукариотических или почтительным является внутримышечное и подпрокариотических клеток кожное введение В основном, прокариотические клетки-хозяева продуцируют более высокие уровни белка, и легче Суточная парентеральная доза, предпочтиподдаются культивированию Белки, продуцируетельно, разовая суточная доза составляет от окомые в бактериальных системах с высоким уровло 1 пг/кг до около 1000мкг/кг веса тела, хотя могут нем экспрессии, обычно представляют собой агребыть также использованы меньшие или более гаты типа гранул или тел включения, которые высокие дозы Требуемая доза зависит от тяжести содержат высокие уровни сверхпродуцированного состояния пациента, а также от таких факторов, белка Указанные белковые агрегаты, как правило, как рост пациента, его вес, пол, возраст, и история должны быть солюбилизированы, денатурироваболезни ны и подвергнуты повторной укладке с использоПри изготовлении композиций настоящего ванием известной техники См , например, Kreuger изобретения, активный ингредиент, содержащий, et al , (1990),"Protein Poldmg" Gierasch & King, eds , по крайней мере, одно соединение настоящего pp 136-142, American Association for the изобретения, обычно смешивают с наполнителем, Advancement of Science Publication No 89-185, или разводят наполнителем Если наполнитель Washington, D С , и патент США № 4923967 используют в качестве разбавителя, то этот наполнитель может быть твердым, полутвердым или После получения нужной молекулы GLP-1, жидким материалом, действующим как раствориимеющей изоэлектрическую точку в пределах от тель, носитель, или среда для активного ингредиоколо 6,0 до около 9,0, изготавливают комплексы ента настоящего изобретения, содержащие указанную GLP-1 молекулу и катион двухвалентного металПри изготовлении композиции, может оказатьла, с использованием хорошо известной методики ся необходимым измельчить активное соединение комплексообразования Примерами указанных в целях получения нужных размеров частиц перед катионов двухвалентного металла могут служить смешиванием этого соединения с другими ингреZn , Mn , Fe , Со , Cd , Ni и т п Из этих медиентами Если активное соединение является, в таллов предпочтительным является Zn ++ основном, нерастворимым, то обычно, его измельчают до образования частиц размером приОбычно, нужную GLP-1-молекулу, имеющую близительно менее, чем 200меш Если активное требуемую изоэлектрическую точку, объединяют соединение является, в основном, водорастворисо смесью соответствующего буфера и соответстмым, то это соединение размалывают с получевующей формой катиона металла нием размеров частиц, имеющих однородный граПодходящими для этой цели являются такие нулометрический состав в данной композиции, и буферы, которые способны поддерживать рН смесоставляющих, например, около 40меш си в пределах от около 6,0 до около 9,0, и которые, кроме того, не оказывают неблагоприятного Примерами подходящих наполнителей являдействия на реакцию Предпочтительными являются лактоза, декстроза, сахароза, трегалоза, ются буферы Гуда, в частности HEPES, а также сорбит и маннит Композиции настоящего изобреТрис- и Трис-ацетатный буферы тения могут быть изготовлены в виде препаратов с быстрым, замедленным или пролонгированным Подходящими формами катионов металлов высвобождением активного ингредиента после являются любые формы катиона двухвалентного введения этих препаратов пациенту, и способы металла, которые способны образовывать комизготовления таких композиций хорошо известны плексы с GLP-1-молекулой настоящего изобретеспециалистам ния Для этих целей, предпочтительной использовать избыточное количество катионной соли Предпочтительно, если композиции настоящедвухвалентного металла, такой, как хлорид цинка, го изобретения изготавливают в виде разовой в молярном соотношении, составляющем примерунифицированной лекарственной формы, которая но до 50 молекул катиона двухвалентного металобычно содержит от около 50мкг до около 100мг, ла на каждую молекулу GLP-1 -субстрата а, в основном, от около 1мг до около 10мг активного ингредиента Термин "разовая унифицироТемпература, используемая на этой стадии, ванная лекарственная форма" относится к физидолжна быть достаточной для полного завершечески дискретным единичным формам, ния реакции Обычно, такую реакцию проводят используемым в качестве разовых лекарственных при комнатной температуре 17 44696 18 доз для введения человеку и другим млекопиночастицы, и нанокапсулы, или в виде макротающим, причем, каждая из указанных единичных эмульсий Техника изготовления таких препаратов лекарственных форм содержит заранее опредеописана в Remington's Pharmaceutical Sciences ленное количество активного ингредиента, доста(1980) точное для продуцирования нужного терапевтичеСоединения настоящего изобретения облаского эффекта, в сочетании с подходящим дают инсулинотропной активностью Поэтому, в фармацевтическим наполнителем другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу увеличения Композиции, предназначенные для парентеэкспрессии инсулина, заключающемуся в том, что рального введения, и содержащие соединение В-клетки панкреатических островков млекопитаюнастоящего изобретения, предпочтительно смещего обрабатывают эффективным количеством шивают с дистиллированной водой, а рН доводят соединения настоящего изобретения до значения, составляющего от около 6,0 до около 9,0 Аналогично, настоящее изобретение относится к способу лечения ювенильного сахарного диаДля регулирования продолжительности выбета у млекопитающих, предпочтительно у челосвобождения, могут быть использованы дополнивека, заключающемуся в том, что, тельные методы фармацевтической практики млекопитающему, нуждающемуся в таком лечеПрепараты с регулируемым высвобождением монии вводят эффективное количество соединения гут быть получены с использовании полимеров или композиции настоящего изобретения для образования комплексов с соединениями настоящего изобретения или для абсорбции соедиНиже, в целях иллюстрации настоящего изонений настоящего изобретения Регулируемая бретения, приводятся соответствующие примеры доставка активного ингредиента к нужным оргаОднако, эти примеры не должны рассматриваться нам или тканям может быть обеспечена посредсткак некое ограничение объема изобретения вом выбора соответствующих макромолекул (наПример 1 пример, сложных полиэфиров, полиаминокислот, Отдельные аликвоты 5 различных GLP-1поливинилпирролидона, этиленвинилацетата, молекул получали хорошо известным способом метил целлюлозы, карбоксиметил целлюлозы, и твердофазного пептидного синтеза, а затем лиопротаминсульфата), концентрации этих макромофилизовали в небольших сосудах К этим аликволекул, а также методов включения там добавляли части 0,1 М HEPES-буферов (N-2гидроксиэтилпиперазин-1\1-2-этансульфоновая Другим возможным методом получения прекислота) /рН 7,4/, содержащие различные количепаратов с пролонгированным высвобождением ства хлорида цинка, с получением концентрации является введение соединения настоящего изобелка около 0,1мг/мл Полученные образцы смебретения в полимерные частицы таких материашивали и хранили при комнатной температуре лов, как сложные полиэфиры, полиаминокислоты, (22°С) в течение приблизительно 18 часов Затем гидрогели, сополимеры поли молочной кислоты) и смеси центрифугировали (Fisher Model 235 С сополимеры этилена и винилацетата micro-centrifuge) в течение 5 минут Прозрачные Альтернативно, вместо введения в указанные супернатанты пипетировали из пробирок Содерполимерные частицы, соединения настоящего жание белка в супернатантах оценивали путем изобретения могут быть введены в микрокапсулы, измерения их оптической плотности при 280нм полученные, например, с использованием техники при помощи спектрофотометра при помощи спеккоасервации или межфазной полимеризации, а трофотометра (Gilford 260) Теоретическое значеименно, в гидроксиметилцеллюлозные или желание оптической плотности при этой длине волны тиновые капсулы, соответственно, либо соединедля 0,1 мг/мл раствора GLP-1 -молекул в 1 смния настоящего изобретения могут быть, введены кюветах составляет 0,207 Результаты этого эксв виде коллоидальных систем доставки лекарстперимента представлены в таблице 1 венного средства, например, таких, как липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наТаблица 1 Table 1 Zn/GLP-1 Молекула Molecule Молярное отношение Molar Ratio 0 03 05 07 10 ЗО Оптическая плотность при 280нм 280nm Absorbance GLP-1 (7-36) NH2 0 172 0 099 0 057 0 035 0 039 0 048 Gly-GLP-1 (7-36) NH2 0 136 0 079 0 070 0 058 0 057 0 044 Этот пример проиллюстрировал, что для об Метил a-metmy Gly"-Gln" VarGLP-1 AlaAGLP-1 GLP-1 (7-37)OH (7-36) NH2 (7-37)OH 0 187 0 163 0 167 0 191 0 134 0113 0 184 0 098 0 082 0 180 0 079 0 069 0 173 0 076 0 065 0110 0 055 0 055 разования комплекса требуется лишь небольшое количество цинка, и что из указанных разведен 19 20 44696 ных растворов осаждается значительная молекул GLP-1 часть Пример 2 5мг GLP-1 (7-36) NH2 полностью растворяли в 2,5мл 0,1 М HEPES - буфера /рН 7,4/, не содержащего цинка Затем быстро добавляли еще 2,5мл 0,1 М HEPES - буфера /рН 7,4/, содержащего 0,6мМ хлорида цинка В полученном образце, молярное отношение цинка к GLP-1 /7-36/ NH2 составляло приблизительно 1 1 После добавления, раствор сразу становился мутным, и тотчас стал образовываться осадок Смесь хранили при комнатной температуре /22°С/ в течение 18 часов Образовавшийся осадок прочно прикреплялся ко дну стеклянного сосуда Супернатант полностью декантировали с помощью пипетки Затем осадок целиком растворяли в 5,0мл 0,01 н соляной кислоты Для супернатанта и для растворов вновь растворенного осадка определяли оптическую плотность при 280нм Содержание цинка в этих растворах определяли с помощью атомноабсорбционной спектрофотометрии Результаты этого эксперимента представлены в таблице 2 Супернатант /5мл/ Вновь растворенный преципитат Оптическая плотность при 280 нм 0,118 1,932 Таблица 2 Концентрация цинка /млн д/ 9,02 13,3 В этом примере показано, что при добавлении цинк-содержащего HEPES-раствора, из раствора осаждается большая часть GLP-1 /7-36/ Nbb Значение оптической плотности при 280нм, равное 1,932, указывает на то, что концентрация GLP-1 /7-36/ NH2 во вновь растворенном преципитате составляет 0,933мг/мл или 283мкМ Концентрация цинка в этом же самом растворе, составляющая 13,3 частей на миллион, эквивалентна концентрации цинка 203мкМ Поэтому, молярное отношение цинка к GLP-1 /7-36/ NH2 в преципитате составляет 0,717 1 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90