Водний розчин полімеризованого гемоглобіну (варіанти), спосіб його одержання (варіанти) та спосіб переливання

Цей винахід має відношення до способів та апаратів для одержання еритроцитарних замінних продуктів, наприклад, гемоглобінових продуктів. Додатково, він має відношення до безклітинного еритроцитарного замінника, до складу якого входить, по суті, вільний від тетрамерів, структурований, полімеризований, піридоксильований гемоглобіновий розчин, вільний від домішок, які мають відношення до строми. Опис знаного рівня техніки Впродовж ряду років банки крові забезпечують постачання цільної крові ,для поповнення крововтрати під час хір ургічного втр учання внаслідок травми або у інших ситуаціях. Однак, цільна кров, одержана від людейдонорів, є непридатною для цілого ряду варіантів використання. Зокрема, використання цільної крові є проблематичним внаслідок потреби у донорі з певною групою крові, проблем, пов'язаних зі стабільністю та строком придатності, а також токсичністю, спричиненою вірусами та іншими домішками. Згадані проблеми особливо загострюються за надзвичайних обставин, наприклад, у разі використання крові військовими. Внаслідок цього, багато зусиль було присвячено розробці замінників цільної крові, одержаної від людейдонорів. Наслідки цих розробок втілились у різноманітних модифікаціях крові, одержаної з різних джерел: від людей або інших ссавців. У цій галузі техніки відомо, що гемоглобін, вільний від строми, є здатним до транспортування кисню та оборотного зв'язування кисню (або ліганду). Оскільки проблеми токсичності виключають його використання, як замінника крові, гемоглобін, вільний від строми, потребує подальшого модифікування для перетворення його на нетоксичний, придатний до застосування фармацевтичний продукт. До цих модифікацій належать наведені далі: (1) повне або, по суті, повне позбавлення гемоглобіну від строми та домішок, які мають відношення до строми; (2) піридоксилювання; (3) полімеризація або структур ування (зшивання); (4) видалення тетрамеру; та (5) модифікування монооксидом вуглецю або іншими лігандами. Однак, незважаючи на здатність до перенесення кисню у кількостях, достатніх для підтримання життєдіяльності, згадані гемоглобінові розчини, одержані за допомогою наведених перед тим способів, мають надлишок небажаних побічних ефектів та властивостей. Наприклад, головним побічним ефектом, який викликає занепокоєння, є зниження активності нирок. Гадали, що ці зміни було обумовлено наявністю небажаних домішок, наприклад, бактеріального ендотоксину або фрагментів еритроцитарних мембран (строми). Згадані домішки дійсно можуть викликати зміни у функціонуванні нирок, однак, з гемоглобінові розчини, по суті, позбавлені згаданих перед тим домішок, як і раніше, викликають суттєве порушення активності нирок. Причину порушення функціонування нирок пояснювали присутністю фізіологічно неприйнятних кількостей неполімеризованого гемоглобінового тетрамеру. До інши х небажаних побічних ефектів впорскування тетрамерного гемоглобіну належить звуження кровоносних судин, гемоглобінурія, уповільнення частоти серцевих скорочень, підвищення середнього артеріального тиску крові та транссудація розчину, який було впорскнуто, до очеревинної порожнини. За практичних обставин, жоден з гемоглобінпохідних замінників крові не є повністю позбавленим проблем, пов'язаних з токсичністю. Згадані продукти, крім того, мають неприйнятно низькі напівперіоди існування після введення пацієнтам, якими є люди. Згадані напівперіоди існування потребують неодноразового поповнення об'єму крові впродовж коротких періодів часу. Цим обумовлена значна потреба у гемоглобінових продуктах, які позбавлено токсичних властивостей відносно пацієнтів та які мають значні напівперіоди існування після введення. Згадані продукти, звичайно, повинні бути здатними до оборотного транспортування кисню до тканин у спосіб, подібний до того, що забезпечується цільною кров'ю. Суть винаходу Цей винахід надає гемоглобінові замінники, які позбавлено токсичних властивостей відносно людини та які мають значні напівперіоди існування, які дорівнюють, як мінімум, 15 годинам у разі введення людям. Згадані гемоглобінові продукти за цим винаходом є вільними від строми, піридоксильованими та полімеризованими, а також є вільними від вірусних та інших токсичних домішок. Згадані продукти, на додаток до цього, є, по суті, вільними від лейкоцитів (білих клітин крові) та тромбоцитів. Цим винаходом також охоплюються способи одержання гемоглобінових замінників, які відповідають цьому винаходу. Згадані способи включають видалення лейкоцитів та тромбоцитів з крові; промивання та лізис еритроцитів; видалення домішок, які мають відношення до строми, та самої строми за допомогою фільтрування та теплової обробки; одержання деоксигемоглобіну; піридоксилювання та полімеризацію; додаткове очищення та концентрування; та деоксигенування. Одержаний гемоглобіновий продукт після цього може вводитись до складу лікарської форми, яка має рівні різних електролітів у межах нормальних фізіологічних діапазонів. Цей винахід надає також водну лікарську форму піридоксильованого, полімеризованого гемоглобіну, до складу якої згаданий гемоглобін входить у формі глутаральдегідполімеризованого гемоглобіну, який включає тетрамерний матеріал з профілем молекулярної ваги, який наведено на Фігурі 3. Згадана лікарська форма може бути застосована для одержання безклітинного еритроцитарного замінника. У цьому аспекті, згадану лікарську форму спочатку піддають очищенню для видалення тетрамеру з наступним поєднанням з відповідними кількостями електролітів для одержання фізіологічно прийнятного безклітинного еритроцитарного замінника, який, у подальшому, може бути використано для лікування пацієнту, яким є людина та який потребує впорскування переносника кисню. Короткий опис малюнків Фігура 1 - схематична діаграма, на якій відображено частину згаданого способу та обладнання, які використовують для одержання деоксигенованого гемоглобінового розчину, придатного для піридоксилювання та полімеризації. Фігура 2 - схематична діаграма, на якій відображено частину згаданого способу та апарат з започаткуванням піридоксилювання та полімеризації та одержанням деоксигенованого, очищеного, піридоксильованого, полімеризованого гемоглобінового продукту та частину згаданого способу та апарат, які використовують для одержання кінцевого гемоглобінового продукту, який має фізіологічні рівні електролітів. Фігура 3 - визначення вмісту полімеризованого матеріалу засобами високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) після обробки гліцином перед очищенням. Полімеризований продукт вказано піками у час утримання (RT) 15,57, 16,08, 17,00 та 18,19. Тетрамерний матеріал вказано піками у RT 19,88 та 20,51. Полімер складає 76,2% згаданого матеріалу. Фігура 4 - визначення вмісту гемоглобінового продукту за цим винаходом. Полімеризований гемоглобін вказано піками у RT 15,7, 16,33, 17,32 та 18,56. Тетрамер вказано піками у RT 21,18. Фігура 5 - схематична діаграма, на якій відображено спосіб очищення за допомогою хроматографування на колонках, який було застосовано у цьому винаході. Фігура 6 - схематична діаграма, на якій відображено спосіб очищення за допомогою фільтрування через фільтри з пористою перегородкою, який було застосовано у цьому винаході. Докладний опис переважного варіанту втілення Цей винахід має відношення до безклітинного еритроцитарного замінника, до складу якого входить, по суті, вільний від тетрамерів, структурований, полімеризований, піридоксильований гемоглобін, по суті, вільний від строми, домішок, які мають відношення до строми, та інших домішок. Термін "структурований", який використано у цьому описі, означає хімічне вміщення молекулярних "містків" на або до молекули, або між молекулами з метою змінення форми, розміру, функції або фізичних характеристик згаданої молекули. Структуровані молекули можуть бути полімеризованими або неполімеризованими, тобто структуровані молекули можуть бути тетрамерними. Термін "тетрамер", який використано у цьому описі, означає гемоглобінові молекули, які мають молекулярну масу, приблизно, 64 кілодальтон; тобто, згаданий термін означає як нативні, так і міжмолекулярні структуровані гемоглобінові молекули. Термін "по суті, вільний від тетрамеру", який використано у цьому описі, означає рівень чистоти відносно вмісту тетрамерних домішок, при якому зникають певні біологічні реакції на тетрамер, який введено ссавцю. Головним критерієм є відсутність змін у функціонуванні нирок при введенні фармацевтично ефективних кількостей, тобто, при рівні чистоти, який дорівнює, приблизно, 99% або більше (присутнім є, приблизно, менше 1% тетрамеру). До складу переважного продукту, одержаного за допомогою способу за цим винаходом, входить, приблизно, не більше 0,8% тетрамеру, ви ходячи з маси загального вмісту гемоглобіну (ТНЬ). Іншими словами, до складу, по суті, вільного від тетрамеру продукту за цим винаходом, входить не більше фізіологічно прийнятних кількостей неполімеризованого гемоглобінового тетрамеру. До складу особливо переважних продуктів за цим винаходом входигь, приблизно, менше ніж 0,5% тетрамеру; зокрема, до складу найбільш переважних продуктів за цим винаходом, входить, приблизно, 0,3-0,4% тетрамеру. Встановлено, що такі кількості тетрамеру є фізіологічно прийнятними. Термін "надочищений продукт" або "очищений продукт", який використано у цьому описі, має те ж саме значення, що і термін "по суті, вільний від тетрамеру". Загальний відсотковий вміст гемоглобіну (ТНЬ) у цьому описі визначається у грамах гемоглобіну/100мл розчину. Термін "полімеризований розчин", який використано у цьому описі, означає розчин, до складу якого входить "структур увальний" або полімеризувальний агент, наприклад, глутаральдегід, імідоефіри, діаспірин або інші у біохімічно придатному носії. Термін "полімеризований", який використано у цьому описі, означає введення молекулярних містків між молекулами або тетрамерними субодиницями, завдяки чому розмір або маса одержаної полімеризовакої молекули підвищується відносно нативного або тетрамерного гемоглобіну. Полімеризований гемоглобін не є тетрамерним гемоглобіном. Термін "розчин гемоглобіну", який використано у цьому описі, означає розчин молекул тетрамерного гемоглобіну або полімеризованого гемоглобіну, причому згадані молекули не входять до складу еритроцитів. Такий розчин не обов'язково повинен бути вільним або, по суті, вільним від еритроцитарної строми або домішок, які мають відношення до строми. Переважні полімеризовані гемоглобінові розчини, однак, є вільними від еритроцитарної строми та домішок, які мають відношення до строми. Термін "напівпроникна мембрана" означає мембрану, проникну для молекул деяких типів, але не для інших, тобто, це є мембрана, яка діє, як вибірковий фільтр, який виключає молекули певної молекулярної маси. Продукт, одержаний за допомогою згаданого способу за цим винаходом, з підданого тепловій обробці, вірусно інактивованого тетрамерного гемоглобіну, тобто полімеризований, піридоксильований, гемоглобіновий розчин, по суті, вільний від тетрамерного (нативного або міжмолекулярно структурованого) гемоглобіну, домішок, які мають відношення до строми, або різних інших домішок, є фізіологічно прийнятним, а також терапевтично та клінічно придатним. Згаданий продукт має здатність до оборотного зв'язування кисню, що є необхідним для забезпечення властивостей транспортування кисню. Найбільше заслуговує на увагу те, що згаданий продукт демонструє добрі характеристики навантаження та розвантаження під час застосування, що корелює з наявністю кривої дисоціації кисень-гемоглобін (P50), подібної до відповідної кривої цільної крові. Згаданий продукт зв'язує кисень з високою спорідненістю у капілярах через легені з наступним адекватним виділенням кисню у тканинах тіла. Згаданий продукт, крім того, не потребує визначення сумісності з реципієнтом. Згаданий продукт, крім того, має напівперіод існування, у разі введення людині, який складає, як мінімум, приблизно, 15 годин і, більш переважно, приблизно, 24 години. Згаданий гемоглобіновий продукт може вливатись пацієнтам у кількостях, які дорівнюють, приблизно, 3,0л або навіть, приблизно, 5,0л. Іншими словами, згаданий гемоглобіновий продукт за цим винаходом може бути використано для поповнення, по суті, всього об'єму крові пацієнту, яким є людина, без звуження кровоносних судин, ниркової токсичності, гемоглобінурії або інших проблем, пов'язаних з вн утрішньовенним введенням синтетичних або напівсинтетичних переносників кисню та замінників крові. Таким чином, цей винахід включає спосіб вливання пацієнту, у переважному випадку, пацієнту, яким є людина, такої кількості вільного від строми, вільного від тетрамеру, полімеризованого, піридоксильованого гемоглобінового продукту, яка є нетоксичною для згаданого пацієнту, причому згадана кількість складає, як мінімум, приблизно, 5,0л. Такий спосіб включає підключення згаданого пацієнту або суб'єкту до пристрою для впорскування або іншого подібного обладнання для впорскування або переливання згаданому пацієнту. Спосіб за цим винаходом є унікальним, оскільки він забезпечує одержання продукту, вміст те трамеру у якому не перевищує, приблизно, 1% (мас.) і, у більш переважному випадку, не перевищує, приблизно, 0,8% (мас), виходячи з маси загального вмісту гемоглобіну у згаданому розчині. Додатковою перевагою згаданого процесу за цим винаходом є те, що він забезпечує одержання кінцевого продукту, по суті, вільного від мікробних та вірусних антигенів га патогенів. Вміст згаданих мікробних та вірусних антигенів та патогерів зменшується до рівнів, які не піддаються визначенню, тобто згаданий продукт є стерильним, відповідно до аналізу, який наведено у XXIII розділі Фармакопеї США. До прикладів таких антигенів та патогенів належать бактеріальні, рикетсіозні, грибкові, протозойні, вірусні та інші мікроорганізми. Найважливішим є те, що згаданий спосіб надає біологічний продукт, вільний від вірусів, які викликають гепатит та синдром набутого імунодефіциту (СНІД). Щодо фізіологічних властивостей, згаданий біологічний продукт за цим винаходом, у разі впорскування у кількостях, як мінімум, приблизно, до 5,0л, не викликає звуження кровоносних судин, ниркової токсичності, гемоглобінурії та інших проблем, пов'язаних з внутрішньовенним введенням відомих гемоглобінових розчинів, до складу яких входять фізіологічно небажані кількості тетрамерного гемоглобіну. Внутрішньовенне введення згаданого продукту, одержаного за допомогою способу, опис якого наведено, не викликає значного зменшення продукування сечі, значного зниження рівня гломерулярної фільтрації, значної транссудації до очеревинної порожнини та значної зміни кольору продукованої сечі. Таким чином, згаданий спосіб за цим винаходом забезпечує одержання безклітинного еритроцитарного замінника, який може знайти застосування при лікуванні травм, інфаркту міокарду, "удару", гострої анемії та розладів, пов'язаних з кисневим голодуванням, наприклад, гіпоксемії, гіпоксії та гіпоксії кінцевої стадії, викликаних порушенням або нездатністю легень до повного оксигенування крові. Згаданий продукт є придатним також при лікуванні будь-якого захворювання або медичного стану, який потребує застосування реанімаційної рідини (наприклад, травма, зокрема, геморагічний шок), заміннику внутрішньосудинного вмісту або обмінного переливання крові. На додаток до медичного лікування, згаданий продукт може бути придатним для консервування органів, призначених для трансплантування. Згаданий спосіб за цим винаходом складається з наступних етапів: 1. аспірація та фільтрування еритроцитів 2. промивання/лізис клітин 3. теплова обробка 4. концентрування шляхом ультрафільтрації 5. знегажування 6. хімічна модифікація 7. очищення 8. концентрування за допомогою послідовно розміщених ультрафільтрів 9. деоксигенування 10. введення до складу лікарської форми Переважним вихідним матеріалом у згаданому способі за цим винаходом є цільна людська кров з вичерпаним строком придатності або еритроцитарна маса. На додаток до цього, може також використовува тись кров з невичерпаним (дійсним) строком придатності. У переважному варіанті, у цьому способі не використовують цільну кров, у разі, якщо час її зберігання після вичерпання строку придатності, який зазначено на мішку, перевищено більше, ніж на 2 тижні. Використання цільної крові з перевищенням вичерпаного строку придатності більше, ніж на 2 тижні, є пов'язаним з додатковими труднощами під час екстрагування гемоглобіну та видалення клітинних залишків, наприклад, білків, які мають відношення до строми, та домішок. Усі розкриті у цьому описі способи є придатними для обробки крові інших ссавців з можливими незначними модифікаціями у фахови х межах цієї галузі техніки. Більша частина згаданого способу може здійснюватись при температурі, приблизно, від 2°С до, приблизно, 8°С, у переважному варіанті, при температурі, приблизно, 4°С. Під час аспірації та фільтрації еритроцитів, їх, за асептичних умов, видаляють з мішків з донорською кров'ю без попадання до неї повітря, та пропускають через ряд фільтрів з одержанням, внаслідок цього, еритроцитарної суспензії зі зменшеним вмістом лейкоцитів та тромбоцитів. Після цього одержану суспензію піддають промиванню та лізису. Згадану суспензію у атмосфері монооксиду вуглецю промивають за допомогою, приблизно, 1% розчину NaCl з метою видалення залишкових білків плазми. Після цього промиті еритроцити піддають обробці водою для впорскувань (WFI) для лізису клітин, і одержану суміш освітлюють за допомогою фільтрувальної установки з поперечним потоком. Після цього освітлений продукт піддають тепловій обробці з метою осадження додаткового матеріалу, який має відношення до строми і який видаляють шляхом фільтрування. Продукт, одержаний таким чином, є гемоглобіновим розчином, вільним від строми (SFH), загальний вміст гемоглобіну у якому дорівнює, приблизно, 3% (у відношенні маси до об'єму). Вільний від строми гемоглобіновий розчин, який було піддано тепловій обробці та до складу якого входить карбоксигемоглобін, концентрують та знегажують для одержання SFH розчину, до складу якого входить деоксигемоглобін. Знегаження, по-перше, залучає насичення карбоксигемоглобінового розчину киснем, приблизно, впродовж 16 годин, для одержання розчину оксигенованого гемоглобіну, до складу якого входить, приблизно, 7% (мас.) карбоксигемоглобіну, ви ходячи з загальної маси гемоглобіну. На наступному етапі згаданий кисень відганяють з азотом, аргоном або гелієм для одержання розчину, до складу якого входить вільний гемоглобін, тобто гемоглобін без комплексних сполук, та, приблизно, 7% (мас.) оксигемоглобіну, виходячи з загальної маси гемоглобіну. Одержаний знегажений розчин фільтрують та переносять до поємника для хімічного модифікування. Після етапу знегажування, згаданий вільний від строми гемоглобіновий розчин піддають піридоксилюванню за допомогою піридоксаль-5'-фосфату (Р5Р) з молярним відношенням піридоксаль-5'фосфа ту до гемоглобіну, приблизно, від 1:1 до 3:1. У альтернативному варіанті, вільний від строми гемоглобін може бути піридоксильованим за допомогою 2-N- або 2-формілпіридоксаль-5'-фосфату. До згаданої піридоксильованої суміші додають відновлювач, наприклад, ціаноборогідрид натрію або, у переважному варіанті, борогідрид натрію. Надлишкові кількості реагентів та солей видаляють діалізом проти вільної від пірогенів води або, у переважному варіанті, діафільтруванням з WFI. Піридоксильований гемоглобін після цього полімеризують розчином глутаральдегіду. Вільний від строми піридоксильований гемоглобіновий розчин полімеризують за допомогою водного розчину глутаральдегіду. Тривалість полімеризації та кількість доданого глутаральдегіду залежить від об'єму гемоглобінового розчину, необхідного виходу полімерів та необхідного розподілу молекулярної маси. Взагалі, подовжений час полімеризації підвищує ви хід та розподіл молекулярної маси згаданих полімерів. Впродовж, приблизно, 16-18 годин одержують вихід полімерів, який дорівнює, приблизно, 75% (мас), виходячи з загальної маси гемоглобіну. Переважною кінцевою точкою полімеризації визначається така точка, у якій згаданий розчин вміщує, приблизно, 75% (мас.) полімерів, виходячи з загальної маси гемоглобіну, за даними високоефективної рідинної гель-хроматографії. У альтернативному варіанті, кінцевою точкою полімеризації визначається така точка, у якій згаданий розчин вміщує, приблизно, 65% (мас.) полімерів, виходячи з загальної маси гемоглобіну, тобто, приблизно, 2,5 години. Згадану реакцію полімеризації зупиняють доданням холодного водного розчину гліцину. Згаданий буфер необхідно додавати з максимальною можливою швидкістю. Після цього поперечні міжмолекулярні зв'язки стабілізуються шляхом додання, знову ж таки, з максимальною можливою швидкістю, водного розчину борогідриду натрію. У подальшому, згаданий полімеризований розчин концентрують та діафільтрують у атмосфері кисню з метою оксигенування згаданого розчину. На кінцевому етапі, до згаданого розчину додають воду у кількості, при якій вміст гемоглобіну у згаданому розчині складає, приблизно, 4% (мас). Наслідком полімеризації за цим винаходом є високий вихід полімерів, які мають вузький діапазон молекулярної маси, як показано на наведеній далі Фігурі 3 та у Прикладі 1. Після цього полімеризований, піридоксильований гемоглобіновий розчин очищають шляхом хроматографування на колонках, фільтрування, наприклад, фільтрування через фільтри з пористою перегородкою, або одночасно тим і іншим, з метою видалення зі згаданого розчину залишкового неполімеризованого (тетрамерного) гемоглобіну. Після цього очищений полімеризований гемоглобіновий розчин концентрують, приблизно, до 6% за допомогою ультрафільтрувальної установки для підготовки до газообміну. Після цього концентрований розчин піддають деоксигенуванню азотом. Згадане деоксигенування відбувається при температурі, приблизно, 10-12°С доти, доки кількість оксигемоглобіну у згаданому розчині не досягає рівня, приблизно, меншого ніж 16% (мас.) від загального вмісту гемоглобіну. Після цього одержаний деоксигенований, очищений та полімеризований гемоглобіновий розчин концентрують шляхом ультрафільтрації у атмосфері азоту у о холоджуваному поємнику. Рівень рН доводять, приблизно, до 8,8-9,0; рівні електролітів доводять, за необхідністю, до рівнів, які відповідають рівням нормальної плазми. На додаток до цього, факультативно, можуть бути також введені традиційні антиоксиданти, наприклад, глутатіон, аскорбат або глюкоза. Після того, як згаданий розчин концентрують до необхідного рівня вмісту полімеризованого, піридоксильованого, очищеного, вільного від тетрамеру, вільного від строми гемоглобіну, який дорівнює, приблизно, 10% (мас), згаданий розчин стерилізують шляхом фільтрування та, за допомогою пристрою для стерильного перенесення, переміщують до придатних фармацевтично прийнятних контейнерів. Характеристики одержаного гемоглобінового розчину наведено далі: Загальний вміст гемоглобіну (г/дл)1 Метгемоглобін (% від загального вмісту гемоглобіну)1 Карбоксигемоглобін (% від загального вмісту гемоглобіну)1 Pso (тор)1 Осмолярність (ммоль/кг)2 Натрій (ммоль/л)3 Калій (ммоль/л)3 Хлорид (ммоль/л)3 Розчинне залізо (частин на мільйон)4 Розподіл молекулярної маси-пік 128кд (%)5 Розподіл молекулярної маси-пік 192кд (%)5 Розподіл молекулярної маси-пік 256кд (%)5 Тетрамер (64кд) (%)5 Ендотоксин (ендотоксинові одиниці/мл)6 Фосфоліпіди (нг/г гемоглобіну)7 Гліколіпіди (нг/г гемоглобіну)7 1 Полімеризований гемоглобін 9,5-12,0