Фосфоліпідна суміш, фосфоліпідна суспензія та способи їх одержання

1. Спосіб одержання фосфоліпідної суміші, що включає: (a) контактування принаймні двох фосфоліпідів з першим неводним розчинником; (b) концентрування розчину до стану густого гелю; (c) контактування густого гелю з другим неводним розчинником та (d) збирання утвореної в результаті твердої речовини. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на стадії (а) фосфоліпідами є: (і) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфатидилхолін, (іі) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3-фосфотидинова кислота, мононатрієва сіль, (ііі) N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карбамоїл)1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфатидилетаноламін, мононатрієва сіль. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що на стадії (а) перший неводний розчинник є сумішшю метанолу та толуолу. 4. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що на стадії (с) другий неводний розчинник є метил-tбутиловим ефіром. 5. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що на стадії (а) розчин нагрівають до температури, дос 2 (19) 1 3 75023 4 18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що у 26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що на розчині присутні 6,8 мг/мл хлориду натрію, 0,1 стадії (4) фільтрування виконують з використанмл/мл гліцерину, 0,1 мл/мл пропіленгліколю та ням двох картриджів стерилізаційного фільтра. 27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що на приблизно від 0,75 до 1,0 мг/мл фосфоліпідної суміші. стадії (4) картриджі стерилізаційного фільтра ма19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що у ють температуру від приблизно 70 до 80 °С. 28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що на розчині фосфоліпідна суміш присутня у кількості 0,75 мг/мл. стадії (4) застосовують 0,2 мкм гідрофільні фільт20. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що у ри. 29. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що розчині фосфоліпідна суміш присутня у кількості 1,0 мг/мл. додатково включає: 21. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що на (5) розлив відфільтрованого розчину зі стадії (4) у стадії (2) водний розчин нагрівають до температупляшечки. 30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що ри від приблизно 45 до 60 °С перед контактуванням з розчином зі стадії (1). додатково включає: 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що (6) заміну залишкового газу у пляшечці зі стадії (5) водний розчин нагрівають до температури від на перфторовуглеводневий газ. 31. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що приблизно 50 до 55 °С перед контактуванням з розчином зі стадії (1). перфторовуглеводневий газ є перфторопропаном. 23. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що 32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що додатково включає: заміну залишкового газу виконують з використан(3) нагрівання фосфоліпідної суспензії зі стадії (2) ням ліофілізатора. 33. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що до температури, що приблизно дорівнює або перевищує найвищу температуру переходу гель додатково включає: рідкокристалічна фаза фосфоліпідів, які присутні у (7) стерилізацію пляшечки зі стадії (6). 34. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що на суспензії. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що на стадії (7) пляшечку стерилізують при температурі стадії (3) фосфоліпідну суспензію нагрівають до приблизно 126-130 °С протягом 1-10 хвилин. температури принаймні приблизно 67 °С. 35. Фосфоліпідна суміш, одержана за будь-яким з 25. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що пп. 1-7, придатна для приготування ультразвуковододатково включає: го контрастуючого агента. (4) фільтрування фосфоліпідної суспензії через 36. Фосфоліпідна суспензія, одержана за будьстерилізаційний фільтр. яким з пп. 8-34, придатна для приготування ультразвукового контрастуючого агента. Даний винахід стосується, загалом, способів приготування ліпідної суміші та однорідної фільтрівної фосфоліпідної суспензії, що містить дану ліпідну суміш, така суспензія корисна як ультразвуковий контрастуючий агент. Виробництво фосфоліпідного контрастуючого агента може бути поділено на наступні стадії: (1) приготування ліпідної суміші; (2) складання основної маси розчину, що включає гідратацію та диспергування даної ліпідної суміші у по суті водному середовищі для утворення ліпідної суспензії; (3) фільтрацію даної маси розчину через стерилізаційний фільтр (и) для очищення даної суспензії від мікробних забруднювачів; (4) розлив даної стерильної суспензії в окремі пляшечки у контролюємій асептичній зоні; (5) завантаження даних пляшечок у ліофілізатор для заміни залишкового газу в пляшечках на перфторопропан (ПФП); (6) перенесення загерметизованих пляшечок після газообміну в автоклав для термічної стерилізації. У розглянутому процесі є три основні перешкоди: (1) однорідність ліпідної суміші; (2) гідратація ліпідної суміші; (3) однорідність та розмір частинок даної суспензії; та (4) стерильне фільтрування суспензії через стерилізаційний фільтр (и). Фосфоліпідні суміші звичайно одержують шляхом розчинення або суспендування потрібних ліпі дів у відповідній системі водного або неводного розчинника з наступним зменшенням об'єму шляхом ліофілізації або дистиляції. В ідеальному випадку цей процес дає змішані тверді речовини з високим ступенем однорідності та чистоти. Проте, хоча зазначений простий підхід забезпечує добрі результати у невеликому лабораторному масштабі, він часто є проблематичним при переході до одержання даного продукту у виробничому масштабі. Вузькими місцями є: (1) підтримання однорідності вмісту на стадії вилучення розчинника (що зумовлено відмінностями у розчинностях); (2) підтримання чистоти (часто ця проблема виникає при використанні води, що зумовлено побічними гідролітичними реакціями); (3) підвищення чистоти; (4) мінімізація об'єму розчинника; та (5) діставання кінцевого твердого продукту (наприклад, зіскрібання продукту із великого реактора не є доброго практикою). Після приготування ліпідної суміші кінцеве компаундування звичайно включає введення даної суміші у водне середовище. Оскільки фосфоліпіди є гідрофобними і слабо розчиняються у воді, додавання фосфоліпідів або ліпідної суміші безпосередньо у водний розчин зумовлює агрегацію ліпідного порошку з утворенням грудок, котрі дуже важко диспергувати. Таким чином, процес гідрата 5 75023 6 ції не піддається контролю протягом значного чарозчином з одержанням ліпідної суспензії. су. Безпосередня гідратація фосфоліпідів або ліпі[2] У варіанті, якому віддається перевага, недної суміші у водному середовищі призводить до водний розчинник вибирається із проиіленгліколю, утворення каламутної суспензії, розмір частинок етиленгліколю та поліетиленгліколю 300. якої варіює від 0,6 до 100мкм. Через відносно ши[3] У варіанті, якому віддається більша перевароке розподілення частинок за розмірами дану га, неводним розчинником є пропіленгліколь. суспензію неможливо відфільтрувати при темпе[4] У іншому варіанті, якому віддається перературі оточуючого середовища, коли температура вага, дана ліпідна суміш включає: розчину суспензії є нижче температури фазового (a) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3переходу гель-рідкокристалічна фаза даних ліпіфосфатиділхолін; дів. Дані ліпіди будуть накопичуватись на фільт(b) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3рах, що зумовить обмеження швидкості потоку, і у фосфотидинову кислоту, мононатрієву сіль; та більшості випадків через деякий час фільтри ціл(с) N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карбаком заблокуються. Подальше зменшення розміру моїл) -1,2 дипальмітоїл-sn-гліцеро-3частинок суспензії за допомогою відомого періофосфатиділетаноламін, мононатрієву сіль. дичного процесу дозування буде неможливим на[5] У іншому варіанті, якому віддається перевіть після довгого перемішування (наприклад, провага, на стадії (1), даний неводний розчинник петягом 6 годин) при підвищених температурах ред контактуванням із ліпідною сумішшю нагріва(наприклад, при 40-80°С) з використанням звичайють до температури приблизно 30-70°С. но застосовуємої пропелерної мішалки. [6] У іншому варіанті, якому віддається більша Хоча можлива фільтрація при підвищених теперевага, даний неводний розчинник перед контампературах, тобто при температурах вище темпектуванням із ліпідною сумішшю нагрівають до темратури фазового переходу ліпідів, при застосуванператури приблизно 50-55°С. ні нормального тиску фільтрування значна [7] У іншому варіанті, якому віддається перечастина більших за розміром ліпідних частинок вага, співвідношення ліпідної суміші та неводного буде виключена. У свою чергу, стерильний фільтрозчинника складає від приблизно 5мг ліпідної рат буде мати відмінний від порції до порції вміст суміші на мл неводного розчинника до приблизно ліпідів, у залежності від ступеня первинної гідра15мг/мл. тації даних ліпідів, що в свою чергу визначається [8] У іншому варіанті, якому віддається більша фізичними характеристиками, наприклад, морфоперевага, співвідношення ліпідної суміші та невологією вихідних матеріалів. дного розчинника складає приблизно 10мг/мл. Процеси безпосередньої гідратації ліпідів або [9] У іншому варіанті, якому віддається переліпідної суміші для одержання однорідної суспензії вага, на стадії (2), водний розчин вибирається із та фільтрації даної суспензії через стерилізаційводи, сольового розчину, суміші сольовий розний фільтр (и) можуть виявитись утрудненими та чин/гліцерин, та суміші сольовий розекономічно невигідними при переході до комерційчин/гліцерин/неводний розчинник. них обсягів виробництва, наприклад, принаймні до [10] У іншому варіанті, якому віддається біль> 20л. ша перевага, водний розчин являє собою суміш Таким чином, способи виробництва ліпідної сольового розчину та гліцерину. суміші та фосфоліпідної суспензії, згідно з даною [11] У іншому варіанті, якому віддається більзаявкою, мають на меті вирішити зазначені вище ша перевага, водний розчин являє собою суміш проблеми шляхом запровадження практичного сольового розчину, гліцерину та пропіленгліколю. способу, котрий може бути легко адаптованим до [12] У іншому варіанті, якому віддається більрізних обсягів виробництва та різних виробничих ша перевага, у розчині присутні 6,8мг/мл хлориду засобів без значного модифікування або пристонатрію, 0,1мл/мл гліцерину, 0,1мл/мл пропіленглісування існуючого устаткування. колю та приблизно від 0,75 до 1,0мг/мл ліпідної Відповідно, предметом даного винаходу є засуміші. провадження нового способу для приготування [13] У варіанті, якому віддається навіть більша ліпідної суміші. перевага, у даному розчині присутня ліпідна суміш Іншим предметом даного винаходу с запровау кількості 0,75мг/мл. дження нового способу для приготування фосфо[14] У іншому варіанті, якому віддається більліпідної суспензії із даної ліпідної суміші. ша перевага, у даному розчині присутня ліпідна Зазначені та інші предмети даного винаходу, суміш у кількості 1,0мг/мл. що стануть зрозумілими із подальшого детального [15] У іншому варіанті, якому віддається переопису, базуються на відкритті авторів, що розчивага, па стадії (2), водний розчин нагрівають до нення ліпідної суміші у прийнятному неводному температури від приблизно 45 до 60°С перед конрозчиннику до введення водного розчину дає мотактуванням з розчином зі стадії (1). жливість одержувати фосфоліпідпу суспензію. [16] У іншому варіанті, якому віддається біль[1] Таким чином, у першому варіанті даний виша перевага, водний розчин нагрівають до темпенахід запроваджує новий спосіб для приготування ратури від приблизно 50 до 55°С перед контактуфосфоліпідної суспензії, що включає: ванням з розчином зі стадії (1). (1) контактування ліпідної суміші з неводним [17] У іншому варіанті, якому віддається перерозчинником, внаслідок чого дана ліпідна суміш у вага, даний спосіб додатково включає: значній мірі розчиняється у даному неводному (3) нагрівання ліпідної суспензії зі стадії (2) до розчиннику; та температури, що приблизно дорівнює або пере(2) контактування розчину зі стадії (1) з водним вищує найвищу температуру переходу гель - рід 7 75023 8 кокристалічна фаза ліпідів, котрі присутні у даній [32] У іншому варіанті, якому віддасться пересуспензії. вага, на стадії (с), другий неводний розчинник яв[18] У іншому варіанті, якому віддається більляє собою метил t-бутиловий ефір. ша перевага, на стадії (3), ліпідна суспензія нагрі[33] У іншому варіанті, якому віддається перевається до температури принаймні приблизно вага, на стадії (а), даний розчин нагрівають до 67°С. температури, що достатня для повного розчинен[19] У іншому варіанті, якому віддається більня даних ліпідів у даному розчиннику. ша перевага, даний спосіб додатково включає: [34] У іншому варіанті, якому віддасться біль(4) фільтрування даної ліпідної суспензії через ша перевага, на стадії (а), даний розчин нагрівастерилізаційний фільтр. ють до температури приблизно від 25 до 75°С. [20] У іншому варіанті, якому віддається навіть [35] У іншому варіанті, якому віддається перебільша перевага, на стадії (4), фільтрування виковага, па стадії (d), зібрану тверду речовину проминується з використанням двох картриджей стеривають метил t-бутиловим ефіром та висушують у лізаційного фільтра. вакуумі. [21] У варіанті, якому віддається додаткова [36] У третьому варіанті даний винахід запроперевага, на стадії (4), картриджі стерилізаційного ваджує нову фосфоліпідну суспензію, що включає: фільтра мають температуру від приблизно 70 до (a) ліпідну суміш у кількості приблизно 0,7580°С. 1,0мг/мл суспензії; [22] У іншому варіанті, якому віддається дода(b) хлорид натрію у кількості приблизно ткова перевага, на стадії (4), застосовуються 6,8мг/мл суспензії; 0,2мкм гідрофільні фільтри. (c) гліцерин у кількості приблизно 0,1мл/мл су[23] У іншому варіанті, якому віддається навіть спензії; більша перевага, даний спосіб додатково включає: (d) пропіленгліколь у кількості приблизно (5) розлив відфільтрованого розчину зі стадії 0,1мл/мл суспензії; та (4) у пляшечки. (е) воду; [24] У іншому варіанті, якому віддасться додаде дану суспензію одержують за способом, що ткова перевага, даний спосіб додатково включає: включає: (6) обмін залишкового газу у пляшечці зі стадії (1) контактування ліпідної суміші з неводним (5) на перфторовуглеводневий газ. розчинником, внаслідок чого дана ліпідна суміш у [25] У іншому варіанті, якому віддається навіть значній мірі розчиняється у даному неводному більша додаткова перевага, перфторовуглеводнерозчиннику; вий газ являє собою перфторопропан. (2) контактування розчину зі стадії (1) з водним [26] У іншому варіанті, якому віддається навіть розчином з одержанням ліпідної суспензії; більша додаткова перевага, обмін залишкового (3) нагрівання ліпідної суспензії зі стадії (2) до газу проводиться з використанням ліофілізатора. температури, що приблизно дорівнює або пере[27] У іншому варіанті, якому віддається навіть вищує найвищу температуру переходу гель - рідбільша додаткова персваіа, даний спосіб додаткококристалічна фаза ліпідів, котрі присутні у даній во включає: суспензії; та (7) стерилізацію пляшечки зі стадії (6). (4) фільтрування даної ліпідної суспензії через [28] У варіанті, якому віддається ще більша стерилізаційний фільтр. додаткова перевага, на стадії (7), пляшечку стери[37] У іншому варіанті, якому віддається перелізують приблизно при 126-130°С протягом 1-10 вага, дана ліпідна суміш включає: хвилин. (a) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3[29] У другому варіанті даний винахід запровафосфатиділхолін; джує новий спосіб для приготування ліпідної сумі(b) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3ші, що включає: фосфотидинову кислоту, мононатрісву сіль; та (a) контактування принаймні двох ліпідів з пе(с) N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карбаршим неводним розчинником; моїл) -1,2 дипальмітоїл-sn-гліцеро-3(b) концентрування даного розчину до стану фосфатиділетаноламін, мононатрієву сіль. густого геля; [38] У іншому варіанті, якому віддається біль(c) контактування даного густого геля з другим ша перевага, неводний розчинник нагрівають до неводним розчинником; та температури приблизно 50-55°С перед контакту(d) збирання утвореної в результаті твердої ванням з даною ліпідною сумішшю. речовини. [39] У іншому варіанті, якому віддасться біль[30] У варіанті, якому віддається перевага, па ша перевага, співвідношення ліпідної суміші та стадії (а), дані ліпіди являють собою: неводного розчинника складає приблизно 10мг/мл. (і) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3[40] У іншому варіанті, якому віддається більфосфатиділхолін; ша перевага, даний водний розчин являє собою (іі) 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3суміш сольового розчину, гліцерину та поліпропіфосфотидинову кислоту, мононатрієву сіль; та ленгліколю. (ііі) N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карба[41] У варіанті, якому віддається навіть більша моїл) -1,2 дипальмітоїл-sn-гліцеро-3перевага, у даному розчині присутня ліпідна суміш фосфатиділетаноламін, мононатрієву сіль. у кількості 0,75мг/мл. [31] У іншому варіанті, якому віддасться пере[42] У іншому варіанті, якому віддається більвага, на стадії (а), перший неводний розчинник ша перевага, даний водний розчин нагрівають до являє собою суміш метанолу та толуолу. температури приблизно 50-55°С перед контакту 9 75023 10 ванням з розчином зі стадії (1). дів (наприклад, DPPA, DPPC та MPEG5000 DPPE) [43] У іншому варіанті, якому віддасться більз першого системою неводного розчинника. Ця ша перевага, па стадії (3), дану ліпідну суспсіпію система звичайно являє собою комбінацію рознагрівають до температури принаймні приблизно чинників, наприклад, СНСl3/МеОН, СН2Сl2/МеOН 67°С. та толуол/МеОН. Краще, коли перший неводний [44] У іншому варіанті, якому віддається додарозчинник є сумішшю толуолу та метанолу. Для ткова перевага, на стадії (4), застосовують два досягнення повного розчинення може виникнути 0,2мкм гідрофільні фільтри. потреба у нагріванні ліпідного розчину до необхідСкладання композицій ної температури. Краще, коли така температура Даний винахід, призначений для практичного дорівнює приблизно від 25 до 75°С, ще краще, застосування в обсягах принаймні декількох граколи вона знаходиться у межах 35-65°С. мів, кілограму, декількох кілограмів або на промиПісля розчинення може виникнути потреба у словому рівні. Обсяг на рівні декількох грамів, як вилученні сторонніх речовин методом гарячого прийнято у даному тексті, стосується переважно фільтрування або охолодження до кімнатної темтаких кількостей, коли принаймні один із вихідних ператури з наступним фільтруванням. Можуть матеріалів присутній у кількості 10г або більше, застосовуватись відомі методи фільтрації (наприкраще, принаймні 50г або більше, ще краще, приклад, гравітаційне фільтрування, фільтрування під наймні 100г або більше. Обсяг на рівні декількох вакуумом або під тиском). кілограмів, як прийнято у даному тексті, стосується Стадія (b): таких кількостей, коли використовується більше Потім даний розчин концентрують до стану гуодного кілограма принаймні одного із вихідних стий гель/напівтверда речовина. Краще, коли конматеріалів. Під промисловим рівнем у даному текцентрування здійснюють методом вакуумної диссті мається на думці такий обсяг, який перевищує тиляції. Можуть застосовуватись також інші лабораторний і є достатнім для постачання продуметоди концентрування розчину, наприклад, такий кту для клінічних випробувань або розподілу серед метод як ротаційне випарювання. Краще, коли споживачів. температура на даній стадії дорівнює приблизно Ліпідна суміш або фосфоліпідна суміш, репре20-60°С, ще краще, 30-50°С. зентує два або більше ліпідів, котрі були змішані. Стадія (с): Ліпідна суміш є, загалом, у порошкуватій формі. Потім даний густий гель/напівтверду речовину Краще, коли принаймні один із ліпідів являє собою диспергують у другому неводному розчиннику. фосфоліпід. Краще, коли дана ліпідна суміш місДану суміш суспендують, краще при температурі тить 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3навколишнього середовища (наприклад, 15-30°С). фосфатиділхолін (DPPC), 1,2-дипальмітоїл-snПрийнятними другими розчинниками є такі, що гліцеро-3-фосфотидинову кислоту, мононатрієву спричиняють осадження ліпідів із відфільтрованосіль (DPPA), та N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 го розчину. Краще, коли другим неводним розчинкарбамоїл)-1,2-дипальмітоїл)-sn-гліцеро-3ником є метил t-бутиловий ефір (МТВЕ). Можуть фосфагиділетаноламін, мононатрієву сіль застосовуватись також й інші ефіри та спирти. (MPEG5000-DPPE). Кількість кожного ліпіду, що Стадія (d): присутній у даній суміші, буде залежати від погрібТверді речовини, одержані після додавання ного кінцевого продукту. Співвідношення кожного з другого неводного розчинника, потім збирають. ліпідів, яким віддається перевага, наведені у розКраще, коли зібрані тверді речовини промивають ділі Приклади. У даному способі може бути викоіншою порцією другого неводного розчинника (наристаний широкий різновид інших ліпідів, таких, приклад, МТВЕ). Збирання може здійснюватись що описані у патенті Унгера (Unger) та інших, пашляхом вакуумної фільтрації або центрифугувантент США №5469854, на який у даному тексті роня, краще при температурі оточуючого середовибиться посилання. ща. Бажано, щоб після збирання дані тверді речоФосфоліпід у даному контексті являє собою вини висушувались під вакуумом при температурі жирну речовину, що містить масляний (гідрофобприблизно 20-60°С. ний) вуглеводневий ланцюг (и) з полярною (гідроЧерез ряд зазначених нижче причин перевага фільною) фосфорною головною групою. Фосфолівіддається способу "розчинення в органічному піди є амфіфільними. Вони спонтанно утворюють розчиннику - осадження" (відносно способу "водна границі та замкнуті везикули у водному середовисуспензія/ліофілізація"): щі. Фосфоліпіди складають приблизно 50% маси (1) Через добру розчинність даних ліпідів у топлазматичної мембрани тваринних клітин. луол/метанолі об'єми розчинників значно зменшеПриготування ліпідної суміші ні (відносно водної процедури). Ліпідна суміш може бути одержана з викорис(2) Через зазначену підвищену розчинність танням способу "водна суспензія - ліофілізація" температура даного процесу також нижче, ніж для або способу "розчинення в органічному розчинниводної процедури, завдяки чому виключається ку - осадження". У першому способі потрібні ліпіди гідролітична нестабільність ефірів жирних кислот. суспендують у воді при підвищеній температурі і (3) При охолодженні до кімнатної температури потім концентрують методом ліофілізації. Переварозчин ліпідів у толуол/метанолі залишається гожно застосовують спосіб розчинення в органічних могенним, що дозволяє вилучати сторонні речорозчинниках. вини фільтрацією при кімнатній температурі. Стадія (а): (4) МТВЕ осадження дозволяє швидко та легко Спосіб "розчинення в органічному розчиннику виділяти тверду фазу ліпідної суміші. У випадку осадження" включає контактування потрібних ліпіводного процесу для виділення продукту застосо 11 75023 12 вується довготривалий процес ліофілізації. якій може виконуватись стадія (1), може змінюва(5) МТВЕ осадження дозволяє також вилучати тись від кімнатної до точки кипіння вибраного розбудь-які розчинні у МТВЕ забруднення, які перечинника. Перевага віддається температурному ходять у фільтратні відходи. Дана можливість виінтервалу від приблизно 30 до приблизно 70°С, лучення забруднень не реалізується у випадку більша перевага віддається температурі від прибпрямого концентрування або ліофілізації розчину у лизно 45 до приблизно 60°С, і навіть ще більша тверду фазу. перевага віддається температурі приблизно 50, (6) Даний спосіб дає однорідну тверду фазу. 51, 52. 53, 54 або 55°С. При використанні етиленгПриготування ліпідної суспензії ліколю або поліетиленгліколю 300 перевага віддаСтадія (1): ється температурному інтервалу від приблизно 50 На першій стадії ліпідна суміш контактує з недо приблизно 60°С, і ще більша перевага темпеводним розчинником, завдяки чому дана ліпідна ратурі приблизно 55°С. Підтримання розчину при суміш у значній мірі розчиняється у даному неводпідвищеній температурі призведе до зменшення ному розчиннику. Як альтернатива, окремі ліпіди його в'язкості та полегшить приготування композиможуть контактувати з неводним розчинником поції. слідовно у такому порядку: DPPC, DPPA та Процедура розчинення ліпідної суміші, якій MPEG5000-DPPE; DPPC, MPEG5000-DPPE та віддається перевага, наступна: (а) Додати пропіDPPA; MPEG5000-DPPE, DPPA та DPPC; або ленгліколь до відповідного зваженого контейнера. MPEG5000-DPPE, DPPC та DPPA. DPPA, котрий є (b) Підігріти пропіленгліколь до температури 40найменш розчинним та найменш багатим на ліпі80°С на нагрівальній бані. (с) Завантажити зважеди, першим не додають. Додавання одного з інших ну ліпідну суміш в окремий контейнер. (d) Коли ліпідів перед додаванням або разом з додаванням температура пропіленгліколю досягне зазначених DPPA полегшує розчинення останнього. Як інша меж, перенести даний розчин у контейнер, що місальтернатива, окремі ліпіди можуть комбінуватись тить дану ліпідну суміш. (е) Знову помістити зау твердому вигляді, і дана комбінація твердих резначений контейнер на нагрівальну баню, допоки човин контактує з неводним розчинником. даний розчин не стане прозорим. (f) Перемішати у Показником суттєвого розчинення є, загалом, механічний спосіб розчин ліпідна сумомент, коли суміш ліпідної суміші та неводного міш/пропіленгліколь, щоб додатково упевнитись у розчинника стає прозорою. Як зазначалось вище, повному розчиненні та однорідному диспергуванні фосфоліпіди, загалом, нерозчинні у воді. Тому даної ліпідної суміші. пряме введення суміші фосфоліпідів у водне сеСпіввідношення ліпідної суміші та неводного редовище зумовлює агрегацію ліпідної суміші з розчинника обмежується, звичайно, розчинністю утворенням грудок, котрі дуже важко піддаються даної ліпідної суміші. На це співвідношення також диспергуванню. У даному винаході ця проблема впливає потрібна кількість ліпідної суміші у кінцевирішується шляхом розчинення даної ліпідної вому продукті. Краще, коли це співвідношення суміші у неводному розчиннику перед уведенням дорівнює від приблизно 1мг ліпідної суміші на мл водного розчину. Це дає можливість легко дисперрозчинника (мг/мл) до приблизно 100мг/мл. Ще гувати ліпідну суміш у рідині. Потім рідку дисперкраще, коли дана ліпідна суміш присутня у кількоссію можна ввести у потрібне водне середовище. ті приблизно 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або Під неводним розчинником такий розчинник 15мг/мл. Навіть ще краще, коли дана ліпідна суміш або суміш розчинників, де вміст води достатньо присутня у кількості приблизно 10мг/мл. низький, щоб стати на заваді розчиненню даної Стадія (2): ліпідної суміші. Потрібна кількість даного неводноДруга стадія включає контактування розчину зі го розчинника залежить від розчинності даної ліпістадії (1) з водним розчином для утворення ліпіддної суміші і також від потрібної кінцевої концентної суспензії. Даним водним розчином може бути рації кожного компонента. Як може оцінити будьвода, сольовий розчин, суміш сольовий розякий рядовий фахівець у даній галузі, припустимий чин/гліцерин або суміш сольовий розрівень вмісту води у даному неводному розчинничин/гліцерин/неводний розчинник. Краще, коли ку буде варіювати у залежності від розчинностей неводним розчинником є, як зазначено вище, проокремих ліпідів даної суміші у воді. Чим більша піленгліколь. Суспензією, у даному тексті, є дисперозчинність окремих фосфоліпідів у воді, тим бірсія, у якій нерозчинні частинки дисперговані у льша її кількість може бути присутньою на стадії рідкому середовищі. (1). Як неводний розчинник переважно застосовуКоли повне розчинення даної ліпідної суміші ється пропіленгліколь. Проте, можуть бути викоридосягнуто (стадія (1)), утворений в результаті розстані й інші члени сімейства поліолів, такі як етичин може бути введений у водний розчин. Даний ленгліколь та поліетиленгліколь 300. водний розчин може містити один або більше комДля реалізації повного розчинення може винипонентів, що вибрані із хлориду натрію, гліцерину кнути потреба у механічному перемішуванні ліпідта неводного розчинника. Краще, коли даний водної суміші та неводного розчинника. Фахівцеві у ний розчин містить гліцерин та хлорид натрію. даній галузі зрозуміло, що є можливість широкого Краще, коли у даному водному розчині міститься вибору засобів перемішування. Перевага віддадостатня кількість пропіленгліколю, до введення ється застосуванню гомогенізатора з високим зсурозчину зі стадії (1), що сприяє досягненню потрівним зусиллям. бної кінцевої концентрації пропіленгліколю. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що підвиПослідовність додавання потрібних компоненщення температури розчинника буде сприяти розтів, як ввижається, не впливає значним чином на чиненню даної ліпідної суміші. Температура, при утворену в результаті ліпідну суспензію. Проте, 13 75023 14 краще, коли даний розчин ліпідної суміші додаєтьвважається фільтрівним, якщо у межах нормалься до води, котра вже може містити зазначені виного процесу не спостерігається суттєвого знище додаткові компоненти. Потім можуть додаваження швидкості течії та суттєвого підвищення тись додаткові необхідні компоненти. Ще краще, перепаду тисків у даній фільтраційній системі. коли розчин ліпідної суміші додається до розчину Експериментальні дані вказують, що для води та хлориду натрію (тобто сольового розчину). спрощення процесу стерильного фільтрування Додаткова перевага віддасться, коли розчин ліпідтемпература ліпідів у даній композиції має бути за ної суміші додається до розчину води, хлориду межами температури їх фазового переходу гель натрію та гліцерину. Ще більша перевага віддарідкокристалічна фаза. Коли температура даних ється, коли розчин даної ліпідної суміші додається ліпідів нижче температури зазначеного фазового до розчину води, хлориду натрію, гліцерину та переходу, частинки суспензії знаходяться у тверпропіленгліколю. дому стані. Проте, коли їх температура вище темКраще, коли на мл даної композиції припадає ператур відповідних фазових переходів гель - рід6,8мг NaCl. Краще, коли на мл даної композиції кокристалічна фаза, вони знаходяться у більш припадає 0,1мл гліцерину. Перевага віддається вільно організованій конфігурації і тому фільтрукінцевій концентрації 0,1мл пропіленгліколю на мл ються легше. композиції. Краще, коли кінцева величина pH даDPPC та DPPA виявляють фазові переходи, ної композиції складає приблизно 5,5-7,0. відповідно, при 41 та 67°С. MPEG5000-DPPE є Дана ліпідна суміш присутня, переважно, у кірозчинним у воді і тому не дає фазового переходу лькості 0,75-1,0мг/мл композиції. гель - рідкокристалічна фаза, що є типовим для Температура даного водного розчину може більшості гідратованих ліпідних суспензій. Оскільваріювати від кімнатної до 70°С. Краще, коли вона ки всі ліпіди у композиції, якій віддасться перевага, лежить у межах від приблизно 45 до 60°С, ще мають різні температури фазових переходів гель краще, коли вона дорівнює 50, 51, 52, 53, 54 або рідка фаза, краще, коли для фільтрування даного 55°С. З метою досягнення повного розчинення розчину застосовується найвища температура дану суміш треба струшувати, краще, перемішувазазначеного фазового переходу, 67°С. При підтти. Крім того, може виникнути потреба у коректуриманні температури на рівні 67°С або за межами ванні величини pH даного розчину, що залежить цієї величини всі зазначені ліпіди будуть знаходивід необхідних властивостей кінцевої композиції. тись за межами їх відповідних фазових переходів, Такс коректування може здійснюватись за допомощо забезпечує їм вільну конфігурацію при прохогою кислоти (наприклад, НСl) або основи (напридженні через фільтри. клад, NaOH). Нагрівання може бути реалізовано шляхом роДана ліпідна суспензія буде містити частинки зміщення резервуара для змішування у оболонці з різних розмірів. Однією з переваг даного винаходу теплообмінним змійовиком. Гаряча вода/пара, що є можливість одержати суттєво невеликі частинки надходить із контролюємого джерела, наприклад, практично однорідного розміру. Так, краще, коли бані з гарячою водою або водонагрівача, забезпебільшість одержаних частинок мають діаметри чить достатню кількість тепла для підтримання менше 100нм, ще краще, менше 50нм. змішуваного розчину при заданій температурі. Процедура розчинення даної ліпідної суміші, Крім того, можуть використовуватись й інші теплоякій віддається перевага, наступна: (а) Додати ві джерела, відомі фахівцям у даній галузі. воду для ін'єкцій (WFI) у резервуар для змішуванСтадія (4): ня. (b) Розпочати змішування, контролюючи темСтадія (4) виконується шляхом фільтрування пературу, яка має дорівнювати 50-55°С. (с) Додати даної ліпідної суспензії через стерилізаційний у резервуар для змішування хлорид натрію. (d) фільтр. Вона призначена для одержання суспензії, Додати у резервуар для змішування гліцерин. Насуттєво вільної від бактеріальних забруднень. Фідати достатній час для повного змішування. (e) льтрат вважається суттєво вільним від бактеріаДодати залишок пропіленгліколю, котрий не місльних забруднень, коли вірогідність того, що даний титься у розчині ліпідна суміш/пропіленгліколь. (f) фільтрат містить принаймні один мікроорганізм, Зменшити швидкість перемішування для зниження здатний утворювати колонію, дорівнює менше 10-6. турбулентності у резервуарі для змішування. (g) Краще, коли фільтрація здійснюється з викоДодати у резервуар для змішування розчин ліпідристанням картриджей стерилізаційного фільтра. на суміш/пропіленгліколь. (h) Збільшити швидкість Крім того, може виникнути потреба у засобах, що перемішування до початкової величини. (і) Додати, сприяють проходженню розчину через фільтри при потребі, додаткову кількість WFI. (j) Продовжи(наприклад, відкачування або підвищений тиск). ти змішування протягом приблизно 25 хвилин і Оскільки розчин, котрий піддається фільтрації, забезпечити повне змішування. (к) Перевірити та необхідно підтримувати при температурі, що доріскоректувати величину pH даного розчину до невнює або перевищує найвищу температуру фазообхідного значення. вого переходу гель - рідкокристалічна фаза ліпідів Стадія (3): у даному розчині, фільтрування має проводитись Стадія (3) включає нагрівання даної ліпідної приблизно при такій самій температурі. Для реалісуспензії, що одержана на стадії (2), до темперазації зазначеного краще, коли фільтри (наприклад, тури, котра дорівнює або перевищує найвищу текартриджі стерилізаційного фільтра) розміщують в мпературу фазового переходу гель - рідкокристаоболонках з постійним нагрівом, наприклад, потолічна фаза ліпідів, що присутні у даному розчині. ком гарячої води із водяної бані з контролюємою Одне з призначень даної стадії полягає в одетемпературою, для забезпечення температури ржанні фільтрівної суспензії. Розчин/суспензія суспензії на рівні, котрий перевищує температури 15 75023 16 фазових переходів даних ліпідів. Краще, коли темСтадія (5): пература стерилізаційного фільтра дорівнює від 50 Розливання даного відфільтрованого розчину до 100°С, ще краще, коли вона лежить у межах 60у пляшечки завершує стадію (5). Краще, коли цю 90°С, і ще краще, коли вона дорівнює 70, 71, 72, стадію проводять у контрольованій асептичній 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 або 80°С. зоні. Рядовому фахівцеві у цій галузі відомо, що Для фільтрування суспензії може використовибір пляшечки та кількості суспензії, якою наповвуватись один або більше стерилізаційних фільтнюють дану пляшечку, залежить від кінцевого прирів. Потрібна кількість залежить від здатності дазначення даної ліпідної суспензії. Розлив може них фільтрів вилучати бактерії. Перевага виконуватись за допомогою множини методів та віддається застосуванню двох фільтрів. Розмір приладів, включаючи піпетку, ручний шприцевий пор фільтрів обмежується необхідністю одержання дозатор (наприклад, шприцевий дозатор Філаматік вільної від бактерій суспензії. Перевага віддається (Filamatic®)) або промислові автоматичні дозатори застосуванню 0,2мкм гідрофільних фільтрів. (наприклад, фірми Козолі (Cozzoli) чи автоматичРозчин композиції, якій віддається перевага, ний наповнювач типу TL). піддавали фільтрації у безперервному режимі чеСтадія (6): рез два 0,2мкм гідрофільні фільтри протягом 3 На стадії (6) проводять заміну залишкового гагодин при швидкості приблизно 1л за хвилину зу у пляшечці зі стадії (5) на перфторовуглеводне(1л/хвилину), тобто через зазначені фільтри було вий газ. У методі газообміну, якому віддається перепущено загалом 180л даного суспензійного перевага, пляшечки з суспензією завантажують у розчину. Експериментальні результати показують, камеру ліофілізатора, і залишковий газ заміщують що блокування даних фільтрів не спостерігається. перфторовуглеводневим газом. Газ, якому віддаЛіпідний аналіз вказує на відсутність вимірних ється перевага, являє собою перфторопропан втрат у процесі фільтрації (що могли б бути зумо(PFP).Можуть застосовуватись й інші методи гавлені накопиченням па фільтрах). зообміну, відомі фахівцям у даній галузі. Розчин композиції, якій віддається перевага, Після завершення циклу газообміну дані пляпіддавали компаундуванню при 40-80°С, і дану шечки герметизують. Коли тиск у ліофілізаційній суспензію охолоджували до температури оточуюкамері повернеться до величини атмосферного чого середовища перед стерильною фільтрацією. тиску після напуску PFP, пляшечки закривають Будь-якого засмічування даних фільтрів не спопробками. стерігалось, що вказує на те, що розмір частинок Стадія (7): даної суспензії лежить значно нижче розміру пор Стадія (7) включає кінцеву стерилізацію пляфільтра, 0,2мкм. З метою забезпечити максимальшечки після стадії (6). Один із методів кінцевої ну рекуперацію ліпідної суміші у стерильному фістерилізації реалізується за допомогою автоклава. льтраті (тобто мінімізувати можливе утримання Крім того, загерметизовані пляшечки можуть бути ліпідних частинок на фільтрах) у процесі фільтрапіддані кінцевій стерилізації у паровому стерилізації бажано застосовувати нагрів. торі, що слугує додатковою гарантією стерильності Процедура фільтрування ліпідної суспензії, даного продукту. Процес стерилізації має провоякій віддається перевага, наступна: (а) Переконадитись обережно, оскільки в результаті термічної тись, що температура всіх фільтрів в оболонках обробки в автоклаві може спостерігатись деяка знаходиться у межах 70- 80°С. (b) Переконатись, деградація ліпідів. Краще, коли пляшечки стериліщо всі клапани у фільтраційній системі закриті. (с) зують при температурі у межах приблизно 126З'єднати вхідний рукав фільтраційної системи з 130°С протягом 1-10 хвилин. виходом резервуара для змішування. (d) Відкрити Інші особливості даного винаходу стануть зроклапани для перепускання розчину через фільтри. зумілими із подальшого опису варіантів прикладів, (e) Промити дані фільтри перепусканням трьох котрі наведені для ілюстрації даного винаходу і не літрів розчину перед збиранням фільтрату. (f) обмежують його. Продовжити фільтрацію до завершення процесу. Приклади Таблиця 1 Склад ліпідної суміші Назва ліпіду DPPA DPPC MPEG5000-DPPE Загальна назва 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфатидинова кислота, мононатрієва сіль 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфатиділхолін N-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карбамоїл)-1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3фосфатиділєтаноламін, мононатрієва сіль Ваг.% Мольн.% 6,0 10 53,5 82 40,5 8 17 75023 18 Спосіб виробництва ліпідної суміші Колбу наповнюють толуолом (3,3л), метанолом (1,2л), DPPA (59,6г), DPPC (535г) та MPEG5000 DPPE (405г). Після промивання твердих контактних поверхонь 0,9л метанолу даний шлам нагрівають до 45-55°С до повного розчинення. Даний розчин відфільтровують і потім концентрують у вакуумі при 35-45°С до стану густого гелю. Додають метил t-бутиловий ефір (МТВЕ, 5,4л), і дану суміш суспендують при 15-30°С. Білу тверду речовину збирають центрифугуванням або вакуумною фільтрацією та промивають МТВЕ (0,9л). Потім тверду речовину помішують у вакуумну піч та висушують до постійної ваги при 40-50°С. Одержану висушену ліпідну суміш переносять у пляшку та зберігають температурі від-15 до-25°С. У іншому варіанті способу виробництва ліпідної суміші згідно з даним винаходом може застосовуватись також наступна процедура. Альтернативний спосіб виробництва ліпідної суміші Кількості фосфоліпідів коректували з урахуванням їх ступеней чистоти, базуючись на даних аналізу. Розмір наважки (загальна вага суміші фосфоліпідів) у даному експерименті складав 2кг. Колбу ротаційного випарника завантажують послідовно толуолом (3300мл), метанолом (1200мл), DPPA (122,9г; кількість скоректована на чистоту 97,0%), DPPC (загалом, 1098,5г; 500,8г із партії з чистотою 98,4% та 597,7г із партії з чистотою 96,7%) та MPEG5000 DPPE (815,7г; скоректована на чистоту 99,3%). Після промивання залишкових твердих речовин у колбі метанолом (900мл) дану колбу поміщують на ротаційний випарник (без застосування вакууму), і даний шлам підігрівають до температури у межах 45 55°С (зовнішня). Після повного розчинення зовнішню температуру знижують до 35-45°С, систему вакуумують, і даний розчин концентрують до білої напівтвердої речовини. Потім колбу знімають з випарника, і тверду речовину розбивають за допомогою шпателя. Дану колбу знов поміщують на випарник, і концентрування продовжують. Після завершення даного процесу (кінцевий тиск 20мбар; біла гранульована тверда речовина) через боковий відвід ротаційного випарника додають МТВЕ (5400мл), вакуум переривають, і дану суміш суспендують протягом 15-45 хвилин при 15-30°С. Тверду речовину виділяють методом центрифугування або вакуумної фільтрації, промивають МТВЕ (3800мл) та висушують до постійної ваги у вакуумній печі (40-50°С). Перед 19 75023 20 перенесенням у поліетиленові пляшки з поліпрофосфатиділхолін (DPPC); піленовими ковпачками тверду речовину пропусN-(метоксиполіетиленгліколь 5000 карбамоїл) кають через сито (отвори 0,079 дюйм) і одержу1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3ють 1966,7г (98%) ліпідної суміші (SG896) у фосфатиділетаноламін, мононатрієву сіль; вигляді білої твердої речовини. пропіленгліколь, фармацевтичної чистоти, Ліпідна суспензія, якій віддається перевага, згідно з Фармакопеєю США; гліцерин, фармацевмістить: тичної чистоти, згідно з Фармакопеєю США; хло1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3рид натрію, фармацевтичної чистоти, згідно з фосфотидинову кислоту, мононатрієву сіль Фармакопеєю США; та воду для ін'єкцій, фарма(DPPA); цевтичної чистоти, згідно з Фармакопеєю США; 1,2-дипальмітоїл-sn-гліцеро-3Таблиця 2 Склади контрастуючих агентів, яким віддається перевага Компонент NaCl, Фармакопея США Гліцерин, Фармакопея США Пропіленгліколь, Фармакопея США Ліпідна суміш** Перфторопропан pH А* 6,8мг/мл 0,1мл/мл 0,1мл/мл 1мг/мл >65% 6,0-7,0 В* 6,8мг/мл 0,1мл/мл 0,1мл/мл 0,75мг/мл >65% 6,0-7,0 *Композиція А містить 1мг/мл ліпідної суміші. Композиція В має концентрацію ліпідної суміші 0,75мг/мл. **Дана ліпідна суміш складається із 53,5ваг.% DPPC, 6,0ваг.% DPPA та 40,5ваг.% MPEG5000-DPPE. Таблиця 3 Типи контейнера та ущільнення, яким віддається перевага Компонент Пляшечка Пробка Герметик Об'єм наповнення пляшечки кінцевим продуктом може дорівнювати 1,0-2,0мл/пляшечку. У випадку приготування даної композиції, якій віддається перевага, прямим гідратуванням даної ліпідної суміші водним матричним розчином, що містить воду для ін'єкцій, хлорид натрію, гліцерин та пропіленгліколь, фільтрати містять меншу кількість ліпідів у порівнянні з попередньо відфільтрованою масою розчину. Втрати ліпідів варіюють від 12 до 48%. Дані результати демонструють, що процес стерильної фільтрації не піддається ефективному контролю, і тому вміст ліпідів у кінцевому продукті може значно змінюватись. На відміну від зазначеного, при застосуванні щойно викладеного способу результати аналізу свідчать про повну рекуперацію ліпідів під час процесу фільтрації. Розкид результатів аналізу відносно теоретичних значень лежить у межах нормального розкиду, притаманного даному аналітичному методу. Розподіл частинок за числом, Комп’ютерна верстка Л. Купенко Тип Вітон (Wheaton) 2802, ВЗЗВА, 2см3, 13мм, тип І, трубчасті пляшечки з флінту Вест (West) V50 4416/50, 13мм, сірий бутилліо, силіційовані пробки Вест (West) 3766, білий 13мм, струшувальні алюмінієві герметики об'ємом та відбивною здатністю суспензії, котра готувалась спочатку шляхом розчинення ліпідної суміші у пропіленгліколі, вказує на те, що більшість даних частинок має розміри менше 50нм у попередньо відфільтрованому масовому розчині як при 55, так і при 70°С. Профіль розподілу даних частинок не змінюється після фільтрації. Застосування Заявлений спосіб є корисним для виготовлення ультразвукових контрастуючих агентів. Такі агенти можуть знайти використання у галузях, пов'язаних з аналізом різних зображень, зокрема, як підсилювачі контрасту в ехокардіографічних та радіологічних ультразвукових зображеннях. Очевидно, що на основі викладеного вище матеріалу можливі численні модифікації та варіації даного винаходу. Тому слід розуміти, що у межах формули, котра додається, даний винахід може знайти інше практичне застосування, ніж викладене у даному тексті. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601