Спосіб аналізу активності in vitro для днк-полімерази вірусу гепатиту в (hbv) людини та спосіб скринінгу інгібіторів днк-полімерази hbv людини з його використанням

1. Спосіб аналізу активності in vitro для ДНКполімерази вірусу гепатиту В людини, який полягає у використанні як 5'-олігонуклеотиду при PCRампліфікації ДНК-полімерази вірусу гепатиту В із зразка, олігонуклеотиду з вбудованим промотором SP6-вірусної полімерази, пряму транскрипцію і трансляцію PCR-продуктів в еукаріотичних безклітинних лізатах та вимірюванні праймування ДНКполімерази вірусу гепатиту В у присутності радіоактивно-міченого агента. 2. Спосіб аналізу за п. 1, який відрізняється тим, що як радіоактивно-мічений агент використовують радіоактивно-мічений нуклеотидтрифосфат. 3. Спосіб аналізу за п. 2, який відрізняється тим, що як радіоактивно-мічений нуклеотидтрифосфат використовують dTTP або його аналог. 4. Спосіб аналізу за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що радіоактивно-мічений агент знаходиться в аналітичному буфері. 5. Спосіб аналізу за п. 4, який відрізняється тим, що комплекс відділяють від аналітичного буфера шляхом електрофорезу у поліакриламідному гелі. 2 (19) 1 3 75028 4 зу мінус- ланцюга вірусу гепатиту В, що включає леотидом, що включений у зазначену ДНК мінуспослідовність, яка може утворювати структуру ланцюг вірусу гепатиту В за визначених умов, що «стебло-петля», суттєву для реакцій зв'язування і сприяють для ДНК-праймуючої активності зазнапраймерування ДНК-полімерази вірусу гепатиту В; ченої ДНК-полімерази вірусу гепатиту В, результаd) інкубацію зразків для одержання комплексу, що том якої є утворення комплексу із згаданою ДНКмістить ДНК-полімеразу з радіоактивно-міченим полімеразою і зазначеним радіоактивно-міченим агентом; е) виділення зазначених комплексів із нуклеотидтрифосфатом; е) виділення такого комбуферного розчину для аналізу; та f) вимірювання плексу із згаданого буферного розчину для аналізу кількості радіоактивно-міченого агента в кожному в кожній зазначеній тест-пробірці і в кожній контвиділеному комплексі, причому кількість демонрольній пробірці шляхом фільтрації через мемструє ДНК-праймуючу активність ДНК-полімерази бранний фільтр з нітроцелюлози; f) вимірювання вірусу гепатиту В людини. кількості зазначеного радіоактивно-міченого нук12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що він леотидтрифосфату в кожному виділеному комплепередбачає порівняння кількості радіоактивноксі, причому така кількість свідчить про активність міченого агента у виділених комплексах. ДНК щодо включення праймеру в ДНК-полімеразі 13. Спосіб скринінгу за п.10, який відрізняється вірусу гепатиту В; і) порівняння відповідних кількотим, що його застосовують з метою тестування стей зазначеного радіоактивно-міченого нуклеотипотенційних лікарських засобів проти вірусу гепадтрифосфату у виділених комплексах, які залишититу В на здатність пригнічувати ДНК-праймуючу лись зв'язаними з мембраною з нітроцелюлози в активність ДНК-полімерази вірусу гепатиту, що кожній зазначеній тест-пробірці і в кожній зазначевключає наступні стадії: а) аналіз активності ДНКній контрольній пробірці, причому зменшення кільполімерази вірусу гепатиту В людини за пп. 1-8; b) кості згаданого радіоактивно-міченого нуклеотидтприготування принаймні одного зразка буферного рифосфату у виділених комплексах у зазначених розчину у визначеному об'ємі для аналізу, причотест-пробірках в порівнянні з такою кількістю в му кожний такий зразок містить в безклітинному контрольних пробірках, свідчить про пригнічення лізаті еукаріотів білок ДНК-полімерази вірусу гепазазначеної ДНК-праймуючої активності зазначеної титу В, трансльованої in vitro з використанням ліДНК-полімерази вірусу гепатиту В зазначеним понійного продукту PCR як матриці, і матриці РНК тенційним лікарським засобом проти вірусу гедля синтезу мінус-ланцюга вірусу гепатиту В, що патиту В. включає послідовність, яка може утворювати стру14. Спосіб одержання ДНК-полімерази вірусу гепактуру «стебло-петля»; с) інкубацію контрольної титу В безпосередньо з лінійного фрагмента ДНК, проби у еквівалентному об'ємі тест-буфера, яка що включає PCR-ампліфікацію його з використанмістить трансльований in vitro білок ДНКням 5' смислового олігонуклеотиду, в який вбудополімерази вірусу гепатиту В, з використанням вано промотор SР6-вірусної полімерази та котрий лінійного продукту PCR як матриці, і матриці РНК включає в себе перші 30 нуклеотидів кодуючої для синтезу мінус-ланцюга вірусу гепатиту В, що ділянки гена ДНК-полімерази вірусу гепатиту В включає послідовність, яка може утворювати струлюдини, причому промотор SP6 локалізований ктуру «стебло-петля» суттєву для зв'язування і проти ходу транскрипції від послідовності вірусу праймерування ДНК-полімерази вірусу гепатиту В гепатиту В у цьому олігонуклеотиді, і 3' антисмислюдини; d) інкубацію кожної зазначеної пробірки, лового олігонуклеотиду, локалізованого на відстані що випробовується, і згаданої контрольної пробір300 п.о. по ходу транскрипції від стоп-кода гена ки з еквівалентними кількостями радіоактивноДНК-полімерази вірусу гепатиту В людини. міченого нуклеотидтрифосфату, що є першим нук Полімерази - це ферменти, що мають фундаментальне значення для живих організмів. Вони відповідають за синтез нуклеїнових кислот та їхні перетворення на інші нуклеїнові кислоти, необхідні для синтезу білків. Тому, протеази знаходяться в усіх типах клітин, включаючи збуджуючий вірус ДНК для вірусу гепатиту В. Вірус гепатиту В є збудником гепатиту, однієї з найбільш поширених інфекційних хвороб людини, а гепатоцелюлярна карцинома, яка може бути наслідком гепатиту В, є одним із найбільш поширених у світі видів раку. Найбільш ефективним методом запобігання зараженню вірусом гепатиту В і захворюванню на гепатит зараз є імунізація проти вірусу гепатиту В. Дозволені зараз вакцини проти вірусу гепатиту В складаються з головного поверхневого антигену (HBsAg) в натуральній формі (одержаній з плазми), або в рекомбінантній формі (очищеній формі, одержаній з клітин дріжджів). Було показано, що антитіла, зумовлені вакциною, зв'язуються з більшістю епітопів "а" антигену, розташованими між 124 і 147 залишками HBsAg, що спричиняє ефективну нейтралізацію реплікації вірусу гепатиту В. Хоча така активна програма щеплення призвела до зменшення випадків зараження вірусом гепатиту В серед населення, спостерігається зростаюча кількість мутацій, розташованих у межах епітопів "а". Такі спричинені вірусом гепатиту В мутанти мають важливе значення, адже їх можуть не виявити навіть сучасні імунологічні системи діагностики і вони здатні на самостійну реплікацію. Той факт, що мутації на епітопах "a" HBsAg спричиняють амінокислотне заміщення у ДНКполімеразі вірусу гепатиту В, що перекривається, зокрема, при їхньому розташуванні в області обе 5 75028 6 рненої транскриптази, може означати, що такі полімерази вірусу гепатиту В пекінської качки in спричинені вакциною мутанти змінюють активність vitro для одержання лізатів, що містять функціонатранскриптази, що є ключовим фактором реплікальні ДНК-полімерази, а інша система пакує білок, ції вірусу. що активно вбудовується, ДНК-полімерази вірусу Віруси гепатиту В є вірусами, що містять ДНК, гепатиту В пекінської качки у подібні до вірусу часякі відтворюють свої геноми шляхом оберненої тинки ретротранспозону Туl дріжджів. Концентратранскрипції РНК-посередника. Пакування цього ція активної ДНК-полімерази вимірюється на осноРНК-прегенома у нуклеокапсиди і початок реплікаві її активності в реакції включення праймеру за ції залежить, перш за все, від взаємодії ДНКдопомогою радіаційно-міченого білка в присутності полімерази вірусу гепатиту В з сигналом утворенвідповідного нуклеотиду (тобто, [ -32Ρ] dΓΤΦ для ня капсиду. На прегеномній РНК містяться дві копії ДНК-полімерази вірусу гепатиту В пекінської качсигналів утворення капсиду. Причому, тільки 5' ки). Про аналогічний метод аналізу сповіщалось і копія діє як матриця для реакції включення прайдля ДНК-полімерази вірусу гепатиту В людини. меру. Після ініціації синтезу мінус-нитки ДНК, оліНекодуюча ділянка 3' полімерази з 350 пар основ, гомер ДНК (4 нуклеотиди) переноситься за допощо містить сигнал капсидування, входила до всіх могою невідомого механізму на 3' кінець опублікованих систем, що вказує на її важливість прегеномної РНК, де він гібридизується до своїх для аналізу активності in vitro. комплементарних послідовностей. Потім обернена Однією з областей безпосереднього використранскрипція продовжується в напрямку до кінця 5' тання кількісного аналізу активності in vitro ДНКматриці РНК. Взаємодія між ДНК-полімеразою полімерази вірусу гепатиту В людини може бути вірусу гепатиту В і прегеномною РНК здійснюється перевірка і пошук нових антивірусних засобів. Анз утворенням ковалентного зв'язку між залишками тивірусна терапія хронічних заражень вірусом гетирозину ДНК-полімерази з термінальними атомапатиту В все ще залишається великою проблеми азоту і специфічним нуклеотидом в сигналі камою, оскільки кілька клінічних випробувань псидування. Зворотна транскриптаза вірусу гепапоказали, що стійка реакція на інтерферон або титу В є одним з чотирьох доменів великої ДНКаналоги нуклеозидів спостерігалась тільки у 30полімерази. Інші домени містять: і) білок з термі40% досліджених пацієнтів. Така реакція спостерінальними атомами азоту, що відповідає за ковагається ще рідше у довгострокових носіях вірусу лентне зв'язування полімерази з прегеномною гепатиту В та у пацієнтів з порушеним імунітетом. РНК; іі) дистанційний домен, стійкий до мутацій та Потрібно розробити нові протоколи хіміотерапії, ііі) Η-домен рибонуклеази, що бере участь у розкпризначеної для знищення вірусу гепатиту В, тому ладі інтермедіату іРНК. що у більшості пацієнтів зараження вірусом залиАналогічно до інших полімераз, визначення шиться, і тому вони матимуть підвищений ризик активності ДНК-полімерази вірусу гепатиту В in розвитку прогресуючого захворювання печінки або vitro можна використовувати у таких трьох задагепатоцелюлярної карциноми. Особливо цікавою є чах: також оцінка антивірусного впливу таких засобів - Характеристика нового виділеного вірусу як на мутанти поверхневих антигенів вірусу гепатиту реплікативного і оцінка його відмінностей від інших В людини. відомих вірусів. Це, зокрема, стосується форм Проте, існують фактори, що обмежують антивірусу гепатиту В з мутаціями на їхніх поверхневих вірусне тестування з використанням визнаних антигенах; аналізів активності in vitro ДНК-полімерази вірусу - Визначення успішності виділення вірусу з гепатиту В людини. Одним з таких факторів є те, пробного матеріалу, взятого у зараженого об'єкта; що в усіх визнаних системах необхідний етап кло- Визначення ефективності інгібіторів поліменування, що переводить ділянку кодування ДНКраз in vitro, які можуть бути антивірусними засобаполімерази вірусу гепатиту В людини під контроль ми. промотору (наприклад, SP6 або Т7) вірусної поліБули запропоновані різні системи для визнамерази на плазміді (тобто, p-GEM-T). Крім того, чення активності ДНК-полімерази вірусу гепатиту ДНК-полімераза вірусу гепатиту В, що виділяється В in vitro за відсутності вірусної реплікації та інших в деяких системах, вимагає подальшої очистки білків вірусу. Цікавою знахідкою виявився той (тобто, імунопреципітації) перед кількісним аналіфакт, що активність ДНК-полімерази вірусу гепазом її активності. Ці стомлюючі маніпуляції не вититу В у реакції включення праймеру, яку можна конуються, зважаючи на велику кількість мутантів спостерігати, вимагає наявності не тільки білку з вірусу гепатиту В. термінальними атомами азоту, але також і функціОдин аспект цього винаходу стосується кількіональної області зворотної транскриптази. Тому, сного аналізу активності in vitro ДНК-полімерази однією загальною характеристикою таких систем є вірусу гепатиту В людини, який полягає у викорисвизначення активності ДНК-полімерази вірусу гетанні як 5' олігонуклеотиду при PCR-ампліфікації патиту В в реакції включення праймеру, що визназразка ДНК- полімерази вірусу гепатиту В, олігонучає активність ДНК-полімерази вірусу гепатиту В. клеотиду, який містить промотор вірусної полімеДві з таких систем використовують ДНКрази SP6; безпосередній транскрипції і трансляції полімеразу вірусу гепатиту В пекінської качки, і продуктів PCR у безклітинних лізатах еукаріотів і для обох було встановлено, що активність їхньої вимірюванні включення праймеру в ДНКзворотної транскриптази залежить від матриці і їй полімеразу вірусу гепатиту В за присутності радіосприяє білок, що бере участь в реакції включення активно-міченого реагенту. праймеру. Одна з систем на основі вірусу гепатиту Другий аспект цього винаходу стосується виВ пекінської качки використовує трансляцію ДНКкористання методу аналізу, зазначеного в першо 7 75028 8 му аспекті, для кількісного аналізу активності різтивно-міченого нуклеотидтрифосфату у виділених них зразків сироватки і/або для визначення інгібікомплексах в пробірках, що випробовується в поторів ДНК-полімерази вірусу гепатиту В. рівнянні з такою кількістю в контрольних пробірках, Третім аспектом цього винаходу забезпечувказує на пригнічення активності ДНК щодо вклюється використання методу аналізу, зазначеного в чення праймеру у виделеній ДНК-полімеразі вірусу першому пункті, для випробування і/або визначенгепатиту В потенційними ліками проти вірусу гепаня здатності потенційних ліків проти вірусу гепатититу В, що згадувалися. ту В пригнічувати активність ДНК у реакції вклюЦей винахід стосується спрощеного кількісного чення праймеру в ДНК-полімеразі вірусу гепатиту аналізу активності ДНК-полімерази вірусу гепатиту В. Такого роду використання, переважно, включає В, швидшого, ніж попередні методи аналізу. Цей такі етапи: метод використовує включення промотору вірусної a) приготування, принаймні, одного зразка у полімерази SP6 в олігонуклеотид, який потім виковизначеному об'ємі буферного розчину для аналіристовується як 5' олігонуклеотид для PCR амплізу, причому кожний такий зразок містить в безкліфікації ДНК-полімерази вірусу гепатиту В у зразках тинному лізаті еукаріотів білок ДНК-полімерази сироватки. Продукти PCR ампліфікації, що містять вірусу гепатиту В, трансльованої in vitro з викорисвсю кодуючу ділянку і 300 bр 3' некодуючу ділянку танням лінійного продукту PCR як матриці, і матз сигналом капсидування, безпосередньо транскриці РНК для синтезу мінус-нитки вірусу гепатиту рибуються і транслюються в безклітинному екстВ, що включає послідовність, яка може утворюваракті проростків пшениці. Синтез праймеру ДНКти стволові петлі; полімерази вірусу гепатиту В на проміжній матриці b) приготування контрольного зразка в еквіваРНК, що є ключовим показником ферментної актилентному об'ємі буферного розчину для аналізу, вності ДНК-полімерази, вимірюється в присутності причому контрольний зразок містить білок ДНКрадіоактивно-міченого [ -32Р] dTTP. Можливе виполімерази вірусу гепатиту В, трансльованої in користання цього винаходу для кількісного аналізу vitro з використанням лінійного продукту PCR як активності різних зразків сироватки (включаючи матриці, і матриці РНК для синтезу мінус-нитки зразки вірусу гепатиту В з мутаціями на його головірусу гепатиту В, що включає послідовність, яка вному поверхневому антигені) також і для визнаможе утворювати стволові петлі, суттєві для реакчення інгібіторів ДНК-полімерази вірусу гепатиту В. цій зв'язування і включення праймеру ДНКВинахід передбачає спрощений процес кількіполімерази вірусу гепатиту В; сного аналізу in vitro активності ДНК-полімерази c) інкубація зразків для одержання комплексу вірусу гепатиту В людини безпосередньо для матДНК-полімерази з радіоактивно-міченим реактириці ДНК, ампліфікованої зі зразків сироватки. Бівом, лок, що бере участь в аналізі активності, в загальd) відділення комплексів від буферного розчиному випадку синтезується в безклітинній системі ну для аналізу; та проростків пшениці шляхом сполучення транскриe) вимірювання кількості радіоактивнопції і трансляції на матриці лінійної ДНК, яка місміченого реактиву, яка свідчить про активність тить промотор вірусної полімерази SP6 на кінці 5'. ДНК щодо включення праймеру в ДНК-полімеразі Для досягнення цієї та інших цілей, цей винавірусу гепатиту В. хід передбачає метод одержання ДНК-полімерази Етапи с), d) і є) можна замінити такими: вірусного гепатиту В безпосередньо з лінійного c) інкубація кожної зазначеної пробірки, що фрагменту ДНК, ампліфікованого у зразку сировавипробовується, і зазначеної контрольної пробірки тки. У присутності радіоактивно-міченого реактиву, з еквівалентними кількостями радіоактивнотакого, як [ -32Р] dTTP, аналізується активність міченого нуклеотидтрифосфату, що є першим нукбілку, що утворився, щодо ініціювання синтезу леотидом, що включається у зазначену мінуспраймера, який є вирішальним етапом реплікації нитку ДНК вірусу гепатиту В за визначених умов, вірусу гепатиту В. які сприяють включенню праймера в ДНК зазначеЦей винахід представляє простий, чутливий і ної ДНК-полімерази вірусу гепатиту В, результашвидкий метод кількісного аналізу, специфічний том якої є утворення комплексу згаданої ДНКдо активності ДНК-полімерази вірусу гепатиту В. полімерази із зазначеним радіоактивно-міченим Винахід пропонує метод визначення активності нуклеотидтрифосфатом; ДНК-полімерази вірусу гепатиту В у зразках сироd) відділення згаданого комплексу від буферватки, що включає такі етапи: ного розчину в кожній пробірці, що випробовуєть- одностадійна екстракція вірусної ДНК вірусу ся, і в кожній контрольній пробірці шляхом фільтгепатиту В з сироватки за допомогою суміші ферації через мембранний фільтр з нітроцелюлози; нол/хлороформ; e) вимірювання кількості зазначеного радіоак- PCR ампліфікація кодуючої ділянки ДНКтивно-міченого нуклеотидтрифосфату в кожному полімерази вірусу гепатиту В (2400 пар основ) та її виділеному комплексі, причому, така кількість сві3' некодуючої ділянки (310 пар основ). 5' олігонукдчить про активність ДНК щодо включення прайлеотид містить проксимальний промотор вірусної меру в ДНК-полімеразі вірусу гепатиту В; полімерази SP6; f) порівняння відносних кількостей радіоактив- Трансляція ДНК-полімерази вірусу гепатиту но-міченого нуклеотидтрифосфату в зазначених in vitro на матриці продуктів PCR ампліфікації; виділених комплексах, які залишились зв'язаними - Аналіз активності екстрактів, що містять траз мембраною з нітроцелюлози в кожній виділеній нсльовану ДНК-полімеразу вірусу гепатиту В, в пробірці, що випробовується, і в кожній контрольприсутності радіоактивно-міченого нуклеотиданій пробірці, причому зменшення кількості радіоакпраймера. 9 75028 10 Інші елементи винаходу включають реактиви має молекулярну масу 90кД (кілодальтон). Числа для здійснення цього методу аналізу, метод визліва означають положення маркерів молекулярзначення впливу речовин-інгібіторів активності ного розміру (маркери міграції білків Rainbow, Амполімерази і застосування цього методу для вистердам). значення активності полімерази видів вірусу гепаНа Фіг.5 зображена авторадіограма, що свідтиту В з мутаціями на поверхневому антигені. чить про активність ДНК-полімерази вірусу гепатиВідповідно до цього винаходу, зразок сироватту В дикого типу (стрілка 1) щодо включення ки може містити вид вірусу гепатиту В з невизнапраймеру in vitro, мутанти поверхневого антигену ченою активністю ДНК-полімерази. Цей винахід 's' 145 (стрічка 2) і 's' 126 (стрічка 3) у присутності дозволяє якісно визначити таку активність. Для [ -32Р] dTTP. Стрілкою позначена мічена [ -32Р] випадків, коли потрібні кількісні вимірювання актиdTTP ДНК-полімераза, яка, як вважається, має вності ДНК-полімерази, метод аналізу активності, молекулярну масу 90кД (кілодальтон). Числа зліва представлений цим винаходом, може бути розроозначають положення маркерів молекулярного блений далі (наприклад, визначення кількості ДНКрозміру (маркери міграції білків Rainbow, Амстерполімерази з праймером на мембрані з нітроцедам). люлози). Для випадків, які вимагають визначення Фіг.6 представляє сумарний анти-праймерний впливу молекул інгібіторів на ДНК-полімеразу, вплив аналогів нуклеотиду на ДНК-полімеразу кількість ДНК-полімерази з праймером може порівірусу гепатиту В людини. Стовпчики на діаграмі внюватися з її кількістю в контрольному зразку, де представляють кількість (у м.к.) радіаційно-міченої немає молекул інгібіторів. ДНК-полімерази вірусу гепатитут В людини, що Щоб скласти краще уявлення прo цей винахід, залишилась на мембрані з нітроцелюлози. Контнаводяться приклади його використання з малюнроль означає активність полімерази вірусу гепатиками: ту В людини щодо включення праймеру in vitro за На Фіг.1 зображена лінійна структура генома присутності аналогів нуклеотиду. Аналогічним чивіруса гепатита В людини. За цим винаходом, у ном позначені результати аналізу активності за PCR ампліфікації бере участь кодуюча ділянка присутності конкретного аналогу нуклеотиду (наДНК-полімерази вірусу гепатиту В людини (параприклад, результати аналізу за присутності dTTP лелепіпед) та її некодуюча 3' ділянка (червона позначені "+ddTTP"). У порівнянні з контролем, лінія). Числа знизу означають положення adw підочевидний анти-праймерний ефект не спостерігатипа генома віруса гепатиту В дикого типу, визнається, якщо інкубація відбувається в присутності чені за Генетичним Банком: стрілки означають або ddTTP, або ddATP. На відміну від цього, при положення і напрямки олігонуклеотидів, що викоінкубації з ddGTP або ddCTP, спостерігається приристовуються для PCR ампліфікації, а їхні послігнічення активності. Відповідно до наших резульдовності представлені над (5') або під (3') значком татів, аналогічний анти-праймерний ефект спостестрілки. На додаток до послідовності, що відповірігається при додаванні ламівудину, який є (-)дає початковій частині ДНК-полімерази вірусу геенантіомером 3'-тіацитідину - дідеоксинуклеотидпатиту В (перші 27 основ кодуючої ділянки), в 5' ного аналога, який широко використовується в олігонуклеотид включається вірусний промотор клінічній практиці для лікування носіїв вірусу гепаSP6 (ATTTAGGTGACACTATAGAACTC). Смислотиту В і пацієнтів з активною реплікацію вірусу. вий 5' олігонуклеотид розташований з 2309 по ДНК вірусу гепатиту В дикого типу екстрагу2335 залишок (стрілка), а антисмисловий 3' олігоється із зразків сироватки сумішшю фенуклеотид займає область від 1917 до 1940 залинол/хлороформ. На першому етапі цього винаходу шку (стрілка). здійснюється PCR ампліфікація з використанням На Фіг.2 представлена фотографія результатів специфічних олігонуклеотидів (Фіг.1). Смисловий електрофорезу продуктів PCR ампліфікації з вико5' олігонуклеотид відповідає першим 27 нуклеотиристанням вірусної ДНК, виділеної з сироватки, дам кодуючої ділянки ДНК-полімерази вірусу гепаяка містить вірус гепатиту В дикого типу. Фрагтиту В і включає промотор SP6 на проксимальномент, що містить, як очікується, 2800 пар основ, му кінці. Антисмисловий 3' олігонуклеотид має позначений стрілкою. На стрічці "М" також відмічекомплементарну ділянку, розташовану на відстані ні положення маркерів молекулярного розміру (1kb 300 пар основ нижче від кодону зупинки ДНКланцюг ДНК, МВІ Fermentas). полімерази вірусу гепатиту В. Продукти лінійної На Фіг.3 зображена авторадіограма ДНКампліфікації ДНК, що містять 2800 пар основ полімерази вірусу гепатиту В дикого типу в лізаті (Фіг.2), підлягають прямій транскрипції/трансляції проростків пшениці, трансльованої in vitro безпоin vitro в безклітинній системі проростків пшениці середньо з продукту PCR ампліфікації в присутновідповідно до інструкції, що надається виробником сті [35S] метіоніну. Стрмкою позначена мічена [35S] (Promega, США). ДНК-полімераза, яка, як вважається, має молекуПри синтезі в присутності [35S] метіоніну, транлярну масу 90кД (кілодальтон). Числа зліва ознасляція in vitro призводить до одержання продукту з чають положення маркерів молекулярного розміру молекулярною масою близько 90кД, як це перед(маркери міграції білків Rainbow, Амстердам). бачається для поліпептиду полімерази, що містить На Фіг.4 зображена авторадіограма, що свід843 амінокислотних залишки (Фіг.3). Цей результат чить про активність ДНК-полімерази вірусу гепативідповідає попереднім повідомленням про активту В дикого типу (синтезованої в лізаті проростків ність ДНК-полімерази вірусу гепатиту В пекінськьої пшениці) щодо включення праймеру in vitro в прикачки, і, що більш важливо, свідчить про те, що сутності [ -32Р] dTTP. Стрілкою позначена мічена ДНК-полімераза вірусу гепатиту В людини була належним образом трансльована з використанням [ -32Р] dTTP ДНК-полімераза, яка, як вважається, 11 75028 12 продукту лінійної PCR ампліфікації як матриці. (ACAGTAGCTCCAAATTCTTTATAAGGGTCA), що Для визначення активності ДНК-полімерази вімав ділянку комплементарності на 300 пар основ русу гепатиту В людини, реакційна суміш, яка пісменшу від кодону зупинки ДНК-полімерази вірусу ля трансляції in vitro містить полімеразу, вдруге гепатиту В (положення з 1940 до 1911 геному вірусинтезовану у відсутності будь-яких радіоактивносного гепатиту В дикого типу). Тому одержаний 35 мічених амінокислот (тобто [ S] метіоніну), інкубупродукт PCR був коротший, ніж встановлений в ється в розчині, що містить dATP, dCTP, dGTP і опублікованих роботах (на 50 пар основ). Препарадіоактивно-мічений [ -32Р] dTTP. Хоча будь-які рати [ -32Р] dTTP (3000Кі/ммоль) і [35S] метіонін мітки, що за звичай використовуються при аналізі (1000Кі/ммоль) одержували з Амстердаму. Немінуклеотидів, такі, як флуоресцентна або абсорбчені dATP, dCTP і dGTP одержували від Promega. ційна, можуть використовуватись для маркування Якщо інше не відмічається, аналіз активності нуклеотидів, які будуть включатись до ініційованої полімерази виконували в розчині, що містив полімерази, краще використовувати радіоактивну 100мМ Тріс НСI (pH 7,5), 10мМ MgCl2, 30мМ NaCl, 10% гліцерину, 4мМ дитіотреітолу, 100мкМ кожномітку. У цьому винаході, використовувався [ -32Р] го з немічених деоксирибонуклеотидтрифосфату dTTP через його вищу праймерну специфічність у порівнянні з іншими трьома нуклеотидами. (dACT, dCTP і dGTP) та 5мкКі [ -32Р] dTTP. РеакВ залежності від типу мітки, що використовуційну суміш витримували в інкубаторі при 30°С ється, детектування радіоактивно-міченої полімепротягом 30 хвилин, після чого додавали аліквоти рази з вбудованим праймером може здійснювапо 5мкл до 85мкл буферного розчину (Novex, тись за допомогою будь-яких відповідних засобів. США) для гель-електрофорезу в додецилсульфаті Загалом таке детектування може включати етап натрію/поліакриламіді (SDS-PAGE) і по 10мкл анавідділення мічених мононуклеотидів (наприклад, лізували на 10% SDS-PAGE. Після елекрофорезу, гелі фіксували з допомогою обробки в суміші 10% [ -32Р] dTTP) від радіоактивно-міченого продукту метанолу та 10% оцтової кислоти і сушили у вакуініціювання полімерази. У цьому винаході продукт умі. Плівку, чутливу до рентгенівських променів, реакції включення праймеру, в основному, аналіекспонували з висушеними гелями й одержані сигзувався за допомогою електрофорезу в гелі SDSнали підраховувались за допомогою лазерного поліакриламід. На Фіг.4 наведені результати анаденситометра. лізу активності в реакції включення праймеру у Приклад 1 ДНК-полімеразу вірусу гепатиту В людини дикого Аналіз активності полімерази мутанту поверхтипу за присутності [ -32Р] dTTP, який є специфічневого антигену вірусу гепатиту В ним нуклеотидом-праймером фермента людини.Одним з випадків безпосереднього викорисДетектування сигнала білка певного розміру на тання спрощеного методу аналізу активності ДНКавторадіограмі вказує на активність ДНКполімерази вірусу гепатиту В людини, наведених в полімерази вірусу гепатиту В в реакції включення цьому винаході, є оцінка відносної активності вірупраймерау. су гепатиту В з мутаціями на головному поверхнеАналіз активності полімерази можна також вому антигені, зокрема, такими мутаціями, які здійснювати з використанням фільтрації через спричиняються щепленням (наприклад, 's' 145). мембранний фільтр з нітроцелюлози. За відповідВірусну ДНК екстрагували так, як описано вище, із них умов, можна спостерігати кількісне зв'язування зразків сироватки, що містили такі типи вірусу герадіоактивно-міченої полімерази з праймером при патиту В. До мутантів, про які йде мова в цьому дуже незначній кількості [ -32Р] dTTP, що не зв'явинаході, відносяться 's' 145 (мутації гліцин - алазався і залишився на мембрані з нітроцелюлози. нін) та 's' 126 (мутації треонін - аланін), які можуть Цей винахід проілюстрований наведеними дане визначатись доступними зараз імунологічними лі Прикладами; проте, він, ні в якому разі не повисистемами детектування і здатні на незалежну нен обмежуватись лише цими Прикладами. реплікацію. Використовуючи таку ж пару олігонукПриклади леотидів, виконували PCR ампліфікацію матриці Загальні експериметальні методи вірусної ДНК на системі для термічного циклуванВірусну ДНК виділяли з сироватки, що містила ня ДНК (Perkin-Elmer, Cetus) для 35 циклів, виковірус гепатиту В дикого типу, таким чином: 200мкл ристовуючи Taq полімеразу (Promega, США), при зразка сироватки додавали до 400мкл лізисного цьому, кожний цикл становив 1,5хв. при темперабуферу (10мМ Тріс хлорид; pH 7,4; 1мМ ЕДТА; 2% турі денатурації (94°С), 2хв. при температурі віднатрію додецилсульфату) і 25мкл протеїнкінази палу (53°С) і 4хв. при температурі подовження К(20мг/мл) і тримали в інкубаторі при 65°С протя(72°С). гом 3 годин. Вірусну ДНК потім екстрагували суміПродукт PCR, що містив промотор SP6, який шшю фенол/хлороформ і осаджувли етанолом. був ампліфікований для кожного мутанту вірусу PCR ампліфікацію здійснювали з використанням гепатиту В, додавали до безклітинної системи на таких олігонуклеотидів: 5' олігонуклеотид був смиоснові проростків пшениці. Проводили супряжену словим транскрипцію/трансляцію in vitro за інструкціями, (AAATTTAGGTGACACTATAGAATATGCCCCTATC наданими виробником (Promega, США). Коротко: TTATCAACACTTCC) і містив промотор SP6 на 10мкл продукту PCR додавали до 25мкл екстракту проксимальному кінці (підкреслена послідовність), проростків пшениці, який містив РНК-полімеразу і мав ділянку компліментарності на початку кодуюSP6, суміш амінокислот (за відсутності [35S] метіочої ділянки ДНК-полімерази вірусу гепатиту В (поніну), інгібітор РНК-ази і буферний розчин. Реакложення з 2309 до 2340 геному вірусного гепатиту ційну суміш тримали в інкубаторі при 30°С протяВ дикого типу). 3' олігонуклеотид був антисмислогом 60 хвилин. Одержані екстракти, що містили вим олігонуклеотидом 13 75028 14 трансльовану ДНК-полімеразу вірусу гепатиту В, мічений продукт реакції гібридної полімерази задодавали до розчину, описаного в розділі "Загальтримується нітроцелюлозною мембраною. Якщо ні експериментальні методи", і аналізували активвикористовується радіоактивна мітка, як у випадку ність полімерази так, як наведено вище. Результаспрощеного методу аналізу, показаного в цьому ти такого аналізу, наведені на Фіг.5, вказують на винаході, то кількість радіоактивних частинок, що те, що ДНК-полімераза вірусу гепатиту В як з музатримались на фільтрі можна визначити, викоританту 's' 145 (стрічка 2), так і 's' 126 (стрічка 3) мастовуючи сцинтиляційний лічильник для пластин. ють активність включення праймеру, аналогічну до Такий метод вимірювання має явні переваги над ферменту дикого типу (стрічка 1). Як альтернатипопереднім методом, описаним в цьому винаході, ву, можна виконати вимірювання за допомогою через те, що він не включає етап електрофорезу. лазерного денситометра, які дозволяють порівнюВикористовуючи цей винахід, можна аналізувати інтенсивність радіаційно-мічених полімераз з вати праймерну активність таких аналогів нуклеопраймерами. тидів, здатних пригнічувати активність ДНКПриклад 2 полімерази вірусу гепатиту В: ddTTP, ddGTP, Тестування інгібіторів ДНК-полімерази вірусу ddCTP, ddATP та ламівудин. Умови проведення гепатиту В людини аналізу аналогічні до умов, вказаних в розділі "ЗаВизначення інгібіторів ДНК-полімерази вірусу гальні експериментальні методи". Коротко: нуклегепатиту В людини забезпечить винайдення нових отид в суміші для аналізу заміщується відповідним терапевтичних засобів проти зараження вірусом аналогом нуклеотиду при тестуванні антипраймегепатиту В, оскільки ефективне пригнічення активрної активності конкретного аналогу нуклеотиду ності полімерази призведе до пригнічення реплі(наприклад, dGTP повинен заміщуватись ddGTP кації вірусу гепатиту В. Спрощений метод аналізу для тестування анти-праймерної активності активності, наведений у цьому винаході, дозвоddGTP). Навпаки, жоден нуклеодтид не заміщувалить швидше здійснити аналіз інгібіторного впливу вся при тестуванні антипраймерної активності нових речовин на ДНК-полімеразу типів вірусу ddTTP (оскільки радіоактивно міченим нуклеотигепатиту В, які містять мутації на головному поведом в цьому винаході є dTTP) та ламівудину. Після рхневому антигені. Коротко: можливий інгібітор інкубації реакційну суміш обережно краплями песпочатку витримували в інкубаторі з ДНКреносять на нітроцелюлозній мембрані (2 2см). полімеразою вірусу гепатиту В людини дикого тиРадіоактивно-мічений dTTP відділяють промиванпу, який був підданий PCR ампліфікації і трансляням нітроцелюлозної мембрани в 400мл TrisHCl ції in vitro так, як описується в цьому винаході. Ін(pH 7,5), 100мМ NaCl, 20мМ MgCl2 і 0,5% бичачого кубацію проводили в присутності [ -32Р] dTTP, а сироваткового альбуміну. Кількість радіоактивновсі інші умови були такими, як зазначено вище. міченої ДНК-полімерази вірусу гепатиту В людини, Інгібіторний ефект можна визначити або за допощо затрималась на нітроцелюлозній мембрані, могою лазерної денситометрії після SDS-PAGE потім вимірювалась сцинтиляційним лічильником аналізу, або з допомогою вимірювання кількості для пластин. Результати, наведені на Фіг.6, свідрадіоактивно міченої ДНК-полімерази вірусу гепачать про суттєво меншу кількість ДНК-полімерази титу В, що зв'язується з нітроцелюлозною мемвірусу гепатиту В людини, міченої [32Р] в присутнобраною під час фільтрації. Важливо, що аналіз сті ddCTP і ddGTP, ніж у контрольній пробі (за відінігібіторних ефектів таких противірусних засобів сутності будь-якого аналогу нуклеотиду), що вкаможе також використовуватись і для різних типів зує на їхню анти-праймерну активність. вірусу гепатиту В, включаючи спричинений вакциЦей винахід базується на спрощеному методі ною мутант 's' 145, також описаний в цьому винакількісного аналізу активності ДНК-полімерази віході (Фіг.5). Подальший аналіз потенційного інігібірусу гепатиту В людини. Він дозволяє швидко виторного ефекту, похідний від аналізу, вказаного значати активність ДНК-полімерази вірусу гепативище, можна розповсюдити на інші системи, такі ту В безпосередньо для зразків сироватки без як культури клітин, що виробляють вірус гепатиту попереднього етапу клонування, який необхідний В і трансгенні тваринні моделі. зараз. Тому від забезпечує швидку оцінку і контВ залежності від типу мітки, що використовуроль зростаючої кількості типів вірусу гепатиту В з ється, детектування міченої гібридної ДНКмутаціями на головному поверхневому антигені. полімерази вірусу гепатиту В можна здійснити за Цей винахід також дозволяє виконувати легкододопомогою відповідних засобів. В загальному виступний аналіз інгібіторних ефектів антивірусних падку, таке детектування може включати етап відзасобів проти цих типів вірусу гепатиту В, придіділення міченого мононуклеотиду від міченої ДНКляючи особливу увагу на таким типами, які виниполімерази вірусу гепатиту В людини. Переважно, кають після щеплення (наприклад, 's' 145), пов'ядетектування виконують після фільтрації експеризаного із захворюваннями печінки, і які знайдені у ментальної суміші (яка на такому етапі аналізу пацієнтів, у яких не було виявлено симптомів, що містить мічену ДНК-полімеразу вірусу гепатиту В могло призвести до захворювання печінки. людини і надлишок міченого мононуклеотиду) крізь мембрану з нітроцелюлози. Надлишок міченого мононуклеотиду проходить крізь мембрану, а 15 75028 16 17 75028 18 19 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 75028 Підписне 20 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601