Очищення і застосування білкового фактора, що сприяє загоєнню ран

Номер патенту: 94442

Опубліковано: 10.05.2011

Автори: Мйордерстам Анна, Вінге Стефан, Найссер-Свае Андреа

Є ще 2 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб одержання композиції, що включає очищений білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, вибраний з групи, що включає фактор росту гепатоцитів (HGF), фактор росту тромбоцитів (PDGF), фактор росту епідермісу (EGF), що трансформує фактор росту альфа (TGF-α), що трансформує фактор росту бета ((TGF-β), інсуліноподібний фактор росту (IGF-1) і фактор росту фібробластів (FGF), отриманих з різних джерел, зокрема крові, що містять білковий фактор, який сприяє загоєнню ран, який відрізняється тим, що включає операції очищення, які проводять в присутності антитромбіну III (AT-III).

2. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції:

(і) розморожування замороженої крові, видалення осаду і подальшу обробку супернатанту,

(іі) контактування супернатанту з матриксом для аніонообмінної хроматографії в буферному розчині, необхідному для аніонообмінної хроматографії, причому буферний розчин повинен містити солі в концентраціях, близьких до фізіологічних, а значення рН, близьким до нейтрального,

(iii) відділення аніонообмінного матриксу і одержання білкового розчину,

(iv) контактування білкового розчину з матриксом для афінної хроматографії на основі іммобілізованого гепарину,

(v) відділення розчину і обробка матриксу для афінної хроматографії на основі іммобілізованого гепарину елююючим буфером з іонною силою, достатньою для десорбції білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, від матриксу для афінної хроматографії на основі іммобілізованого гепарину,

(vi) збирання елююючого буферу, який містить білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP.

3. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції:

(і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанту,

(іі) додавання неорганічного адсорбуючого матеріалу, такого як діатомова земля, силікагель або глинозем і інкубація протягом достатнього часу для зв'язування небажаних домішок,

(iii) додавання нижчого аліфатичного спирту, наприклад, спирту С1-С4 для одержання фракції Кона І,

(iv) видалення преципітату, якщо такий є, і неорганічного адсорбуючого матеріалу,

(v) пропускання супернатанту фракції Кона І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (HAH) зв'язалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми не зв'язувалася з матриксом і вимивалася із колонки,

(vi) елюція й збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінної хроматографії.

4. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції:

(і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанту,

(іі) контактування супернатанту з матриксом для аніонообмінної хроматографії в буферному розчині, необхідному для аніонообмінної хроматографії, причому буферний розчин містить солі в концентраціях, близьких до фізіологічних і має значення рН, близьке до нейтрального, оскільки основна частина білків перебуває в розчині (включаючи білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, АТ-III, HRGP, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і ін.), а специфічні білки й протеази зв'язуються з аніонною смолою (наприклад, протромбін, фактор X, фактор IX і ін),

(iii) відділення матрикса для аніонообмінної хроматографії для одержання розчину, що містить білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ, HRGP, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і ін.

(iv) додавання неорганічного адсорбуючого матеріалу, такого як діатомова земля, силікагель або глинозем і інкубація протягом достатнього часу для зв'язування небажаних домішок, наприклад, фактора XII, активатора прекаллікреїну і т.д.,

(v) додавання нижчого аліфатичного спирту, наприклад, спирту С1-С4 для одержання фракції Кона І,

(vi) видалення преципітату, якщо такий є, і неорганічного адсорбуючого матеріалу,

(vii) пропускання супернатанту фракції Кона І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і т.д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися із колонки,

(viii) елюювання і збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінноїхроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, причому промивний буфер повинен мати більшу іонну силу, достатню для десорбції білків з домішками, але недостатню для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран).

5. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції:

(і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальшу обробку супернатанту,

(іі) пропущення супернатанта через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і т. д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися із колонки,

(iii) елюювання і збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, причому промивний буфер повинен мати більшу іонну силу, достатню для десорбції білків з домішками (наприклад, кофактор гепарину II), але недостатню для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран.

6. Спосіб за пп. 2-5, який відрізняється тим, що зібрані фракції концентрують і/або піддають діафільтрації для одержання концентрованого розчину.

7. Спосіб за пп. 2-6, який відрізняється тим, що включає операцію інактивації вірусу, зокрема, після операції (vi).

8. Спосіб за будь-яким з пп. 2-7, який відрізняється тим, що після операції інактивації вірусу проводять аніонообмінну хроматографію.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 2-8, який відрізняється тим, що катіонообмінну хроматографію проводять, зокрема, після аніонообмінної хроматографії.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 2-9, який відрізняється тим, що проводять хроматографію на фосфаті целюлози.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 2-10, який відрізняється тим, проводять нанофільтрацію.

12. Спосіб за пп. 2-11, який відрізняється тим, що фракцію, отриману в ході операції (vi) за пунктами 2 або 3, операції (viii) за пунктом 4 або операції (iii) за пунктом 5, піддають інактивації вірусу за допомогою хімічних речовин, інактивуючих віруси.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що фракцію, оброблену хімічними речовинами, інактивуючими віруси, піддають хроматографії на фосфаті целюлози.

14. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що фракцію, оброблену хімічними речовинами, інактивуючими віруси, піддають послідовно аніонообмінній хроматографії і катіонообмінній хроматографії.

15. Спосіб за п. 8 або 14, який відрізняється тим, що катіонообмінний матрикс обробляють буфером з іонною силою, необхідною для елюції фракції А1, що містить основну частину (>90 %) АТ-ІІІ, і далі обробляють буфером з більшою іонною силою, необхідною для переважної елюції білкового фактора, що сприяє загоєнню ран і HRGP, які потім збирають.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, і HRGP піддають концентрації або діафільтрації для одержання фракції А2.

17. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що до концентрату додають преципітаційний буфер, розчин фільтрують, і до преципітату додають буфер для відновлення білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, і АТ-ІІІ.

18. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що отриманий концентрат білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, обробляють за допомогою одного або декількох нижчеописаних методів для очищення від патогенів:

(і) інактивація вірусу за допомогою розчину сольвенту/детергенту.

(іі) інактивація вірусу за допомогою опромінення світлом, наприклад, УФС, або радіоактивного опромінення;

(iii) інактивація вірусу шляхом нагрівання;

(iv) видалення вірусних часток за допомогою фільтрації.

19. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що подальше очищення отриманого концентрату білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, проводять з використанням катіонообмінної смоли, для того, щоб забезпечити зв'язування білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP з катіонообмінною смолою, для чого може бути застосована одна або кілька нижчеописаних операцій:

(і) фракцію білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP елююють з катіонообмінної смоли буфером, з провідністю 10-450 мсм/см при кімнатній температурі, більш переважно 20-200 мсм/см, найбільше переважно 30-100 мсм/см;

(іі) при проведенні хроматографії рН підтримується на рівні 6-9, більш переважно 6,5-8, найбільше переважно 6,75-7,25;

(iii) заряджені групи катіонообмінної смоли приєднані до матеріалу смоли за допомогою слабогідрофобних полімерних вуглецевих ланцюгів, що складаються з 10-100 мономерів.

20. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що концентрат білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, піддають подальшому очищенню шляхом висалювання, преципітуючого HRGP, за таких умов:

(і) для вибору солі для висалювання використовують ряди Гофмейстера, переважно вибрані з групи, що містить сульфат натрію, фосфат натрію, цитрат натрію, сульфат амонію і їх комбінації;

(іі) концентрація солі вибрана в межах 0,3-3 М, зокрема 0,5-2 М або 0,75-1,5 М;

(iii) рН розчину вибрана в межах 4-10, зокрема 6-9 або 7-8;

(iv) отриманий преципітат відділяють шляхом фільтрації або центрифугування.

21. Композиція за будь-яким з вищеназваних пунктів, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, або їхню комбінацію.

22. Композиція за п. 21, яка відрізняється тим, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, а також АТ-ІІІ для підвищення стабільності білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro.

23. Композиція за п. 21 і/або 22, яка відрізняється тим, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, а також HRGP для підвищення стабільності білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro.

24. Композиція за будь-яким з пунктів 21-23, яка додатково містить хімічні стабілізатори, вибрані з групи, що включає поліоли, сахариди і/або амінокислоти.

25. Фармацевтична композиція, що містить композицію за будь-яким з пунктів 21-24.

26. Фармацевтична композиція за п. 25, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, у рідкій або ліофілізованій формі, що наноситься разом з гелем або спреєм.

27. Фармацевтичний препарат за п. 26, що має форму гелю, мазі або спрею.

28. Фракція, збагачена HRGP, отримана за способом, описаним у пп. 1-20.

29. Білкова фракція за п. 28, отримана за способом, у якому після афінної хроматографії на гепариновому матриксі і інактивації вірусу отриману суміш речовин піддають хроматографії на фосфаті целюлози.

Текст

1. Спосіб одержання композиції, що включає очищений білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, вибраний з групи, що включає фактор росту гепатоцитів (HGF), фактор росту тромбоцитів (PDGF), фактор росту епідермісу (EGF), що трансформує фактор росту альфа (TGF-α), що трансформує фактор росту бета ((TGF-β), інсуліноподібний фактор росту (IGF-1) і фактор росту фібробластів (FGF), отриманих з різних джерел, зокрема крові, що містять білковий фактор, який сприяє загоєнню ран, який відрізняється тим, що включає операції очищення, які проводять в присутності антитромбіну III (AT-III). 2 (19) 1 3 (v) пропускання супернатанту фракції Кона І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (HAH) зв'язалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми не зв'язувалася з матриксом і вимивалася із колонки, (vi) елюція й збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінної хроматографії. 4. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції: (і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанту, (іі) контактування супернатанту з матриксом для аніонообмінної хроматографії в буферному розчині, необхідному для аніонообмінної хроматографії, причому буферний розчин містить солі в концентраціях, близьких до фізіологічних і має значення рН, близьке до нейтрального, оскільки основна частина білків перебуває в розчині (включаючи білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, АТ-III, HRGP, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і ін.), а специфічні білки й протеази зв'язуються з аніонною смолою (наприклад, протромбін, фактор X, фактор IX і ін), (iii) відділення матрикса для аніонообмінної хроматографії для одержання розчину, що містить білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ, HRGP, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і ін. (iv) додавання неорганічного адсорбуючого матеріалу, такого як діатомова земля, силікагель або глинозем і інкубація протягом достатнього часу для зв'язування небажаних домішок, наприклад, фактора XII, активатора прекаллікреїну і т.д., (v) додавання нижчого аліфатичного спирту, наприклад, спирту С1-С4 для одержання фракції Кона І, (vi) видалення преципітату, якщо такий є, і неорганічного адсорбуючого матеріалу, (vii) пропускання супернатанту фракції Кона І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і т.д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися із колонки, (viii) елюювання і збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, причому промивний буфер повинен мати більшу іонну силу, достатню для десорбції білків з домішками, але недостатню для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран). 5. Спосіб за пунктом 1, що включає наступні операції: (і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальшу обробку супернатанту, (іі) пропущення супернатанта через колонку афінної хроматографії, для того, щоб білковий фактор, 94442 4 що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, Іg, трансферин, гаптоглобулін і т. д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися із колонки, (iii) елюювання і збирання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матриксу для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, причому промивний буфер повинен мати більшу іонну силу, достатню для десорбції білків з домішками (наприклад, кофактор гепарину II), але недостатню для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. 6. Спосіб за пп. 2-5, який відрізняється тим, що зібрані фракції концентрують і/або піддають діафільтрації для одержання концентрованого розчину. 7. Спосіб за пп. 2-6, який відрізняється тим, що включає операцію інактивації вірусу, зокрема, після операції (vi). 8. Спосіб за будь-яким з пп. 2-7, який відрізняється тим, що після операції інактивації вірусу проводять аніонообмінну хроматографію. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 2-8, який відрізняється тим, що катіонообмінну хроматографію проводять, зокрема, після аніонообмінної хроматографії. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 2-9, який відрізняється тим, що проводять хроматографію на фосфаті целюлози. 11. Спосіб за будь-яким з пп. 2-10, який відрізняється тим, проводять нанофільтрацію. 12. Спосіб за пп. 2-11, який відрізняється тим, що фракцію, отриману в ході операції (vi) за пунктами 2 або 3, операції (viii) за пунктом 4 або операції (iii) за пунктом 5, піддають інактивації вірусу за допомогою хімічних речовин, інактивуючих віруси. 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що фракцію, оброблену хімічними речовинами, інактивуючими віруси, піддають хроматографії на фосфаті целюлози. 14. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що фракцію, оброблену хімічними речовинами, інактивуючими віруси, піддають послідовно аніонообмінній хроматографії і катіонообмінній хроматографії. 15. Спосіб за п. 8 або 14, який відрізняється тим, що катіонообмінний матрикс обробляють буфером з іонною силою, необхідною для елюції фракції А1, що містить основну частину (>90 %) АТ-ІІІ, і далі обробляють буфером з більшою іонною силою, необхідною для переважної елюції білкового фактора, що сприяє загоєнню ран і HRGP, які потім збирають. 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, і HRGP піддають концентрації або діафільтрації для одержання фракції А2. 17. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що до концентрату додають преципітаційний буфер, розчин фільтрують, і до преципітату додають буфер для відновлення білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, і АТІІІ. 5 94442 6 18. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що отриманий концентрат білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, обробляють за допомогою одного або декількох нижчеописаних методів для очищення від патогенів: (і) інактивація вірусу за допомогою розчину сольвенту/детергенту. (іі) інактивація вірусу за допомогою опромінення світлом, наприклад, УФС, або радіоактивного опромінення; (iii) інактивація вірусу шляхом нагрівання; (iv) видалення вірусних часток за допомогою фільтрації. 19. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що подальше очищення отриманого концентрату білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, проводять з використанням катіонообмінної смоли, для того, щоб забезпечити зв'язування білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP з катіонообмінною смолою, для чого може бути застосована одна або кілька нижчеописаних операцій: (і) фракцію білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP елююють з катіонообмінної смоли буфером, з провідністю 10-450 мсм/см при кімнатній температурі, більш переважно 20-200 мсм/см, найбільше переважно 30-100 мсм/см; (іі) при проведенні хроматографії рН підтримується на рівні 6-9, більш переважно 6,5-8, найбільше переважно 6,75-7,25; (iii) заряджені групи катіонообмінної смоли приєднані до матеріалу смоли за допомогою слабогідрофобних полімерних вуглецевих ланцюгів, що складаються з 10-100 мономерів. 20. Спосіб за будь-яким з вищеназваних пунктів, який відрізняється тим, що концентрат білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, піддають подальшому очищенню шляхом висалювання, преципітуючого HRGP, за таких умов: (і) для вибору солі для висалювання використовують ряди Гофмейстера, переважно вибрані з гру пи, що містить сульфат натрію, фосфат натрію, цитрат натрію, сульфат амонію і їх комбінації; (іі) концентрація солі вибрана в межах 0,3-3 М, зокрема 0,5-2 М або 0,75-1,5 М; (iii) рН розчину вибрана в межах 4-10, зокрема 6-9 або 7-8; (iv) отриманий преципітат відділяють шляхом фільтрації або центрифугування. 21. Композиція за будь-яким з вищеназваних пунктів, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, або їхню комбінацію. 22. Композиція за п. 21, яка відрізняється тим, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, а також АТ-ІІІ для підвищення стабільності білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro. 23. Композиція за п. 21 і/або 22, яка відрізняється тим, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, а також HRGP для підвищення стабільності білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro. 24. Композиція за будь-яким з пунктів 21-23, яка додатково містить хімічні стабілізатори, вибрані з групи, що включає поліоли, сахариди і/або амінокислоти. 25. Фармацевтична композиція, що містить композицію за будь-яким з пунктів 21-24. 26. Фармацевтична композиція за п. 25, що містить активовану і/або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, у рідкій або ліофілізованій формі, що наноситься разом з гелем або спреєм. 27. Фармацевтичний препарат за п. 26, що має форму гелю, мазі або спрею. 28. Фракція, збагачена HRGP, отримана за способом, описаним у пп. 1-20. 29. Білкова фракція за п. 28, отримана за способом, у якому після афінної хроматографії на гепариновому матриксі і інактивації вірусу отриману суміш речовин піддають хроматографії на фосфаті целюлози. Даний винахід відноситься до процесів очищення і застосування білкового фактора, який отримують із плазми крові, для полегшення загоєння ран. У винаході розглядаються особливості методів очищення й захисту білкової молекули від деградації in vivo і in vitro. HGF є одним з білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. Цей білок експресується в клітинах мезенхимального походження, як то: у легеневих макрофагах і фібробластах, купферовських клітинах у печінці й лейкоцитах. HGF є цитокіном, що секретується при ушкодженні клітин, що очевидно відіграє важливу роль у регенерації певних органів і загоєнні ран. Молекула HGF являє собою глікопротеїн, який синтезується в клітині у вигляді нативного (неактивного) попередника. Згодом молекула попередника розщеплюється в ушкодженому органі з одержанням активного HGF за допомогою спеціального активатора. HGF і інші білкові фактори зв'язуються з гепарином; це зв'язок, певно, необхідний для активації HGF і зв'язування його зі своїм рецептором. Рецептором, який зв'язується з HGF, є с-МЕТ. Оскільки експресія сМЕТ знижена тільки в ушкоджених органах, тільки клітини цих органів реагують на взаємодію HGF з рецептором. Прикладами білкових факторів росту, що зв'язуються з гепарином і впливають на процес загоєння ран, можуть служити: тромбоцитарний фактор росту (platelet-derived growth factor, PDGF), фактор росту епидерміса (epidermal growth factor, EGF), трансформуючий фактор росту α (transforming growth factor α,TGF-α), трансформуючий фактор росту (transforming growth factor β,TGFβ), інсуліноподібний фактор росту (insulin like growth factor, IGF-1) і фактор росту фібробластів (fibroblast growth factor, FGF). Антитромбін III (AT-III) - глікопротеїн плазми, що інгібує серинові протеази в каскаді коагуляції і, 7 таким чином, відіграє найважливішу роль у регулюванні згортання крові. АТ-ІІІ є інгібітором факторів згортання крові ІХа, Ха, XI, ХІІа, а також тромбіну. Таким чином, АТ-ІІІ регулює утворення згустку на різних щаблях каскаду коагуляції. Навіть невелике зниження концентрації АТ-ІІІ у крові приводить до підвищення ризику тромбоемболії. Концентровані препарати АТ-ІІІ використовуються для профілактики і лікування тромбоемболічних захворювань у пацієнтів з уродженим або придбаним дефіцитом АТ-ІІІ. Крім того, було показано, що АТІІІ приймає участь у багатьох інших біологічних процесах, включаючи ангіогенез і реакції запалення. Механізм дії АТ-ІІІ у цих процесах ще не розкритий повністю. Існує стандартна методика очищення АТ-ІІІ за допомогою афінної хроматографії, яка використовує гепарини в якості ліганда, пов'язаного із твердофазним носієм. У роботі Міллер-Андерссона й співавт. описується використання гепаринівсефарози для очищення людського АТ-ІІІ (MillerAndersson et al., Thrombosis Research 5, 439-452, 1974). Описана методика, що включає іонообмінную й гель-фільтраційну хроматографію, забезпечує вихід продукту 34%. Збагачений гістидином глікопротеїн (histidmerich glycoprotein, HRGP) - одноланцюговий протеїн плазми крові, уперше виділений в 1972 p., Фізіологічна функція HRGP дотепер точно не відома. Оскільки HRGP взаємодіє з гепарином, фібриногеном і фібрином, плазміногеном і активованими тромбоцитами, передбачається, що HRGP є модулятором коагуляції й фібринолізиса (Koide, Т. In: Fibrinolysis: current prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., London 1988, p. 55-63). Поліпептидний ланцюг HRGP містить 507 поліпептидних залишків і містить ділянки гомології з іншими білками плазми, наприклад, АТ-ІІІ (Koide, Т. Et al., (1986) Biochemistry 25, 2220-2225). Активна форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, швидко руйнується в організмі, особливо в області ран, де активується коагуляція і система протеолізу, що включає протеази. У процесі очищення також важливо запобігти деградації як нативної, так і активної форм білкового фактора, що сприяє загоєнню ран. Про один з факторів, HGF, відомо, що він переноситься в крові у формі неактивного попередника й активується під час процесу загоєння ран особливими активаторами. Наприклад, неактивна (денатурована) форма HGF може бути виділена в невеликих кількостях за допомогою практично всіх методів очищення, які пройшли тестування, у той час як активована і/або неактивована форма може бути виділена тільки за допомогою методу, описаного в справжньому винаході. Було виявлено, що виділення домішок протеаз і/або неактивних попередників протеаз у сполученні зі спільним очищенням двох стабілізаторів HGF (AT-III і/або HRGP) приводило до збільшення виходу активованої або неактивованої форми HGF, що легко переводиться в активну форму. Оскільки в нормі HGF циркулює в крові у формі неактивного попередника, мабуть, що медичний препарат, являє собою нативну й/або активну форму HGF, може бути корисним при лікуванні бага 94442 8 тьох захворювань і порушень в організмі, особливо там, де можливо місцеве нанесення препарату, наприклад, при загоєнні ран. Подібне може виявитися дійсним і для інших факторів росту, що зв'язуються з гепарином, як то: тромбоцитарного фактора росту (PDGF), фактора росту епідерміса (EGF), трансформуючого фактора росту α (TGF-α), трансформуючого фактора росту β (TGF-(β), інсуліноподібного фактора росту (IGF-1) і фактора росту фібробластів (FGF). Очікується, що присутність АТ-ІІІ і HRGP поліпшить результати очищення й застосування цих факторів росту. Залежно від способу застосування, активована й/або неактивована форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, може поставлятися за присутності або за відсутності двох специфічних стабілізаторів, АТ-ІІІ і HRGP. За опублікованим даними, ці білки є інгібіторами протеолітичної деградації нативної і активованої форми білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, таким чином, їхнє використання підвищує ефективність і час життя препарату. Залежно від способу нанесення, у деяких випадках бажано поставляти пацієнтові тільки активовану або неактивовану форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, в інших випадках, переважно поставляти суміш цих форм із додаванням специфічних стабілізаторів АТ-ІІІ і HRGP. Це залежить від того, наскільки швидко повинен діяти білковий фактор, що сприяє загоєнню ран. Очевидно, що подібний принцип підходить і для інших факторів росту, що зв'язуються з гепарином і мають подібні з HGF властивості, як то: тромбоцитарного фактора росту (PDGF), фактора росту епідерміса (EGF), трансформуючого фактора росту α (TGF-α), трансформуючого фактора росту β (TGF-β), інсуліноподібного фактора росту (IGF-1) і фактора росту фібробластів (FGF). Винахід відноситься до способу виробництва очищеного білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, який складається із суміші похідних, отриманих з різних джерел, що містять білковий фактор, який сприяє загоєнню ран, зокрема, крові. Очищення білкового фактора ведеться в присутності антитромбіну III (АТ-ІІІ), збагаченого гістидином глікопротеїна (HRGP) або їхньої комбінації. Білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, вибираються із групи, що включає в себе фактор росту гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF), тромбоцитарний фактор росту (PDGF), фактор росту епідерміса (EGF),трансформуючий фактор росту α (TGFα),трансформуючий фактор росту β (TGF-β), інсуліноподібний фактора росту (IGF-1) і фактор росту фібробластів (FGF), отримані з різних джерел, зокрема, крові, що містять білковий фактор, що сприяє загоєнню ран. Деякі етапи цього процесу проводяться в присутності антитромбіну III (AT-III). Методика, описана у винаході, містить наступні кроки: (і) розморожування замороженої крові, видалення осаду й подальша обробка супернатанта. (іі) контакт супернатанта з матриксом для аніонообмінної хроматографії в буферному розчині, який необхідний для аніонообмінної хроматографії. Буферний розчин повинен містити солі в концентраціях, близьким до фізіологічного й повинен 9 мати значення рН, близький до нейтрального, оскільки основна частина білків перебуває в розчині (включаючи білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, AT-III, HRGP, альбумін, lg, трансферин, гаптоглобулин і ін.) і специфічні білки й протеази зв'язуються аніонною смолою (наприклад, протромбін, фактор X, фактор IX та ін). (ііі) за допомогою методу аніонообмінной хроматографії одержання розчину, що містить білкові фактори, які сприяють загоєнню ран, AT-III, HRGP, альбумін, IgG, транферин, гаптоглобін та ін.). (iv) контакт розчину з матриксом для афінної хроматографії на основі імобілізованого гепарина, у той час як основна частина білків перебуває в розчині (альбумін, IgG, транферин, гаптоглобін та ін.). (ν) відділення розчину й обробка матрикса для афінної хроматографії на основі імобілізованого гепарина елюююючим буфером з іонному силою, достатньою для десорбції білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, від матрикса для афінної хроматографії на основі імобілізованого гепарина (можливо, але не обов'язково промити гепаринсефарозу промивним буфером до десорбції фракції, що містить білкові фактори, що сприяють загоєнню ран. Промивний розчин повинен містити солі в проміжній концентрації, достатньої для десорбції білків з домішками (наприклад, кофактор гепарина II), але недостатньої для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. (vi) збір елююючого буфера, що містить білкові фактори,які сприяють загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP. Другий варіант методики, який описаний у винаході, може містити наступні кроки: (і) розморожування замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанта. (іі) додавання неорганічного адсорбуючого матеріалу, такого як діатомова земля, силікагель або глинозем і інкубація протягом достатнього часу для зв'язування небажаних домішок, наприклад, фактора XII, активатора прекаллікреїна й т.д. (ііі) додавання нижчого аліфатичного спирту, наприклад, спирту С1-С4 для одержання фракції Кону І. (iv) видалення преципітату, якщо такий є, і неорганічного адсорбуючого матеріалу. (ν) пропущення супернатанта фракції Кону І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб нативна й активна форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (нативна й активна форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP далі в тексті позначені НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, IgG, трансферин, гаптоглобулін і т.д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися з колонки. (vi) елюція й збір білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матрикса для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. Промивний буфер повинен мати більшу іонну силу, достатню для десорбції білків з 94442 10 домішками (наприклад, кофактор гепарина II і ін.), але недостатню для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. Третій варіант методики, який описаний у винаході, може містити в собі наступні кроки: (і) розмороження замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанта. (іі) контакт супернатанта з матриксом для аніонообмінної хроматографії в буферному розчині, необхідному для аніонообмінної хроматографії. Буферний розчин повинен містити солі в концентраціях, близьких до фізіологічних і повинен мати значення рН, близьке до нейтрального, оскільки основна частина білків перебуває в розчині (включаючи білкові фактори, що сприяють загоєнню ран, АТ-ІІІ, HRGP, альбумін, IgG, трансферин, гаптоглобулін та ін.), специфічні білки й протеази зв'язуються аніонною смолою (наприклад, протромбін, FX, FIX і ін.). (ііі) відділення матрикса для аніонообмінної хроматографії для одержання розчину,який містить білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ, HRGP, альбумін, IgG, трансферин, гаптоглобулін та ін. (iv) додавання неорганічного адсорбуючого матеріалу, такого як діатомова земля, силікагель або глинозем і інкубація протягом достатнього часу для зв'язування небажаних домішок, наприклад, фактора XII, активатора прекаликреїна й т.д. (ν) додавання нижчого аліфатичного спирту, наприклад, спирту С1-С4 для одержання фракції Кона І. (vi) видалення преципітату, якщо такий є, і неорганічного адсорбуючого матеріалу. (vii) пропущення супернатанта фракції Кона І через колонку афінної хроматографії, для того, щоб активна форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (HAH) зв'язувалася з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, IgG, трансферин, гаптоглобулін і т.д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися з колонки. (viii) елюція й збір білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матрикса для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографический матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. Промивний буфер повинен мати велику іонну силу, яка достатня для десорбції білків з домішками(наприклад, кофактор гепарина II), але недостатня для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран). Четвертий варіант методики, який описаний у винаході, може містити в собі наступні кроки: (і) розмороження замороженої плазми крові, видалення можливого осаду й подальша обробка супернатанта. (іі) пропускання супернатанта через колонку афінної хроматографії, для того, щоб активна форми білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, АТ-ІІІ і HRGP (НАН) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (наприклад, альбумін, IgG, трансферин, гапто 11 глобулін і т.д.) не зв'язувалися з матриксом і вимивалися з колонки. (ііі) елюція й збір білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з матрикса для афінної хроматографії (можливо, але не обов'язково, промити хроматографічний матрикс промивним буфером перед десорбцією білкових факторів, що сприяють загоєнню ран. Промивний буфер повинен мати велику іонну силу,яка достатня для десорбції білків з домішками (наприклад, кофактор гепарина II), але недостатня для десорбції білкових факторів, що сприяють загоєнню ран). В особливому втіленні справжнього винаходу, методика містить у собі інактивацію вірусу, зокрема, після кроку (vi). Інактивація вірусу на даному етапі методики здійснюється переважно за допомогою хімічних речовин, здатних інактивувати вірус. Подібний процес інактивації, так званий процес сольвент/детергентної інактивації, докладно розглянутий у патентній заявці № ЕР-А-131740. Розкриття патентної заявки №ЕР-А-131740 проведено шляхом посилання. Після етапу інактивації вірусу можливе проведення аніонообмінної хроматографії. Також можливе проведення катіонообмінної хроматографії, зокрема, після аніонообмінної хроматографії. У подальшому втіленні винаходу проводиться хроматографія на фосфаті целюлози. Хроматографія на фосфаті целюлози може бути переважною, оскільки така хроматографія є достатньою. Але, може бути переважним проведенням хроматографії на фосфаті целюлози в комбінації з аніонообмінною і/або катіонообмінною хроматографією. Як правило, фракція, що містить HGF, наноситься на целюлозофосфатний матрикс у буфері, що дозволяє HGF адсорбуватися на целюлозофосфатному матриксі. Елюція HGF звичайно проводиться буферами з іонною силою ≥ 0,05М хлориду натрію або його еквівалента. Відповідно до даного винаходу, фракції, отримані при виконанні варіантів методики, можуть бути сконцентровані або піддані діафільтрації для одержання білкового концентрату. Цей концентрат може бути підданий подальшій обробці, зокрема, до нього може бути доданий катіонообмінний матрикс. Катіонообмінний матрикс може бути оброблений буфером з іонною силою, необхідною для елюції фракції А1, що містить основну частину (>90%) АТ-ІІІ, і далі оброблений буфером з більшою іонною силою, необхідною для переважної елюції білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, і HRGP, які потім збираються. Білковий фактор, що сприяє загоєнню ран і HRGP піддаються концентрації або діафільтрації для одержання фракції А2. У другому варіанті методики, яка описана в даному винаході, що включає в себе додавання до концентрату преципітаційного буфера, розчин фільтрується, і до преципітату додається буфер для перекладу білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, і HRGP у розчинену форму. і' Подальше очищення отриманого концентрату нативних білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, може проводитися з використанням катіонообмінної смоли, для того, щоб забезпечити зв'я 94442 12 зування білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP з катіонообмінною смолою. Для цього може бути застосований один або кілька нижчеописаних методів: (і)фракція білкових факторів, що сприяють загоєнню ран, і HRGP елююється з катіонообмінної смоли буфером, що має провідність 10-450 мсм/см при кімнатній температурі, більш переважно 20200 мсм/см, найбільше переважно 30-100 мсм/см. (іі) при проведенні хроматографії рН підтримується на рівні 6-9, зокрема, 6,5-8 або 6,75-7,25. (ііі) Заряджені групи катіонообмінної смоли приєднані до матеріалу смоли за допомогою слабогідрофобних полімерних вуглецевих ланцюжків, що складаються з 10-100 мономерів. Нижче розглянуті більш докладно умови для проведення другого варіанта методики очищення отриманого концентрату білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, з використанням методу висалювання, прєципітуючого HRGP: (і) для вибору солі для висалювання використовуються ряди Гофмейстера; кращий вибір із групи, що містить сульфат натрію, фосфат натрію, цитрат натрію, сульфат амонію і їхнього сполучення. (іі) Обрана концентрація солі перебуває в межах 0,3-3 М, приміром, 0,5-2 Μ або 0,75-1,5 М. (ііі) Обрана рН розчину перебуває в межах 410, приміром, 6-9 або 7-8 (iv) отриманий преципітат відділяється шляхом фільтрації або центрифугування. Для одержання придатного до комерційного вживання білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, отриманий концентрат нативного білкового фактора, який сприяє загоєнню ран, обробляється за допомогою однієї або декількох нижче описаних методик з метою очищення від патогенів: (і) інактивація вірусу за допомогою розчину сольвенту/детергенту. (іі) Інактивація вірусу за допомогою опромінення світлом, наприклад, УФС, або радіоактивного опромінення. (ііі) Інактивація вірусу шляхом нагрівання. (iv) Видалення вірусних часток за допомогою фільтрації. Предметом даного винаходу є також композиція речовин, одержана за допомогою методики, описаної в даному винаході, що містить активовану й/або неактивовану форми білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, активну форму білкового фактора, що сприяє загоєнню ран або їхню комбінацію. В одному втіленні винаходу, у складі речовини втримується активована й/або неактивована форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, а також АТ-ІІІ для підвищення стабільності білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro. В іншому втіленні винаходу до складу речовини входить активована й/або неактивована форма білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, до якого додається HRGP для підвищення стабільності нативного білкового фактора, що сприяє загоєнню ран, in vivo і in vitro. Зокрема, білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, повністю перебуває в активованій формі або білковий фактор, що 13 сприяє загоєнню ран, перебуває в неактивній формі. Краще додавати стабілізатори до білкових фракцій, що містять білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, і HRGP. Стабілізатори можуть бути обрані із групи, що містить сахариди й амінокислоти. Як правило, у ролі стабілізаторів можуть виступати поліол, аргінін, трегалоза, лізин, манітол або їхні комбінації. Предметом даного винаходу також є фармацевтичний препарат, до складу якого входять речовини, описані в даному винаході. У фармацевтичному препараті білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, може бути присутнім в активованій і/або неактивованій формі. Переважно, щоб білковий фактор, що сприяє загоєнню ран, утримувався в препараті в рідкій або ліофілізованій формі в складі для місцевого застосування, такого як гель, спрей або аналогічного препарату, у концентрації, що забезпечує приблизне дозування 1-10 нг білкового фактора, що сприяє 2 загоєнню ран на см рани в день. Залежно від способу застосування, препарат також може вводитися внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно, інтратекально, ректально або шляхом інгаляції. Експериментальні методи Кількісне визначення АТ-ІІІ Для виміру біологічної активності АТ-ІІІ вимірялася його активність у якості кофактора гепарина в реакції ферментативного розщеплення хромогенного субстрату Pip-Arg-pNA*2 HCІ (Chromogenix, Sweden) тромбіном у присутності гепарина й АТ-ІІІ. Більше повний опис методики див. Frantzen Handeland et al. (Scand. J. Haematol. 31, 427-436, 1983) і van Voorhuizen et al. (Thromb. Haemostas. 52(3), 350-353, 1984). Тотальний білок Концентрація тотального білка визначалася шляхом виміру поглинання світла з довжиною хвилі 280 нм (А280). Концентрація (мг/мл) для розчинів АТ-ІІІ розраховувалася з використанням коефіцієнта 6,4 МЕ/мг. Специфічна активність (SA) АТ-ІІІ визначалося як відношення між активністю кофактора гепарина, обчислювальної в МЕ/мл, і А280. Кількісне визначення збагаченого гістидином глікопротеїна Кількісне визначення HRGP велося з використанням методу ракетного електрофорезу, у якому висота «ракети» пропорційна концентрації антигену (Laurell, C-B, (1966) Analyt. Biochem. Vol. 15, p. 45; and Laurell, C-B (1972) J. Clin. Lab. Invest. Vol. 29, suppl. 124, p. 21). Кролячі антитіла проти HRGP (Behringwerke) додавалися в 1% гель із агарози A (Amersham Pharmacia Biotech). Зразок HRGP об'ємом 5 мкл наносився на гель, електрофорез проводився протягом ночі при 150У і 1 B/см. Комплекс, що вийшов, антиген-антитіло забарвлювався й порівнювався зі стандартом (сироватка крові людини). Ізоелектричне фокусування Ізоелектричне фокусування проводилося з використанням системи PhastSystem (Amersham Pharmacia Biotech) на готових гелях; ізоелектрическая точка рІ 3-9 відповідно до інструкції за мето 94442 14 дикою поділу білків Phast файл №100 (див. додане зображення). Характеризация HGF Щоб підтвердити присутність інтактного HGF, що має повний спектр властивостей, властивих цьому цитокіну, проводився аналіз за методикою Вестерн-блот. Для цього спочатку проводився електрофорез білків у поліакриламідному гелі (SDS-PAGE), як у присутності, так і при відсутності агентів, що відновлюють. Після переносу білків з гелю на нітроцелюлозну мембрану, мембрана інкубувалась у розчині антитіл, специфічних до людського HGF (наявні в продажі антитіла виробництва R&D Systems, Inc.), а потім у розчині кон'югованих других антитіл, специфічних до перших антитіл (наявні в продажі антитіла виробництва R&D Inc.). Візуалізація антигену (білка) проводилася за допомогою кольорової реакції. Кількісне визначення HGF Для визначення відносних масових часток HGF природного походження використовувалася наявна в продажі система для проведення твердофазного імуноферментного аналізу (solid phase ELISA, виробництво R&D Systems, Inc.), розроблена для визначення рівня HGF у культуральному середовищі, сироватці й плазмі крові. Планшет для імуноферментного аналізу попередньо покривався антитілами до HGF. Зразки й контролі наносилися в лунки планшета, у результаті чого весь HGF, присутній у розчинах, зв'язувався з іммобілізованими антитілами. Після відмивання незв'язаних речовин, у лунки додавалися поліклональні антитіла, специфічні до HGF, ковалентно пов'язані з ферментом. Після відмивання лунок з метою видалення незв'язаних антитіл у комплексі з ферментом, у лунки додавався розчин субстрату. Субстрат розщеплюється ферментом з утворенням забарвленого продукту, таким чином, інтенсивність кольору пропорційна кількості HGF, що зв'язувались із антитілами в ході першого етапу методики. Після зупинки кольорової ферментативної реакції, визначалася оптична щільність розчину в кожній лунці при довжині хвилі 450 нм за допомогою рідера для мікропланшетів. Біологічна активність HGF Біологічна активність визначалася за допомогою наявних у продажі тестів на загоєння експериментальної рани, міграцію й проліферацію клітин. Див. В. Rafferty et al. (J. Immunol. Methods 258 (2001) 1-11). Приклади Приклад 1 Очищення нативного (активного) HGF, стабілізованого присутністю АТ-ІІІ і HRGP відповідно до методики, описаної у винаході. Етап 1 Об'єднана свіжозаморожена плазма крові здорових донорів у кількості 1200 кг розморожувалась при 0°С. Отриманий кріопреципітат, що містить, зокрема, фактор VIII і фібронектин, віддалявся за допомогою центрифугування. Преципітат звичайно використовувався для виділення й очищення фактора VIII. Етап 2 15 Кріосупернатант, отриманий у результаті виконання етапу 1, пропускали через аніонообмінну колонку (70 літрів DEAE-Сефароза FF, виробництво Amersham Pharmacia Biotech) для зв'язування вітамін К-залежних факторів (фактор IX, фактор X, фактор II, протеїн С, протеїн S і ін.). Колонку промивали буферним розчином, що містить 0,14 Μ хлориду натрію й 5 мМ фосфату натрію, рН 7,0. Фракція незв'язаних білків (приблизна вага 1270 кг) піддавалася подальшій обробці згідно етапу 3, у той час як білки, що зв'язалися з матриксом колонки, піддавалися подальшому очищенню з метою одержання фактора IX, тромбіну та ін. Етап 3 Фракція незв'язаних білків, отримана в результаті етапу 2, піддавалася подальшій обробці шляхом додавання етилового спирту до досягнення масової частки 8% для одержання преципітату фракції Кона І, що містить, зокрема, фібриноген і ліпопротеїди (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед додаванням етилового спирту до розчину білків було додано 5,5 кг діатомової землі (Hyflow Super сel). Преципітат і діатомова земля видалялися за допомогою центрифугування. Етап 4 рН супернатанта фракції Кона І (приблизна вага близько 1400 кг) доводився до 7,8; після цього супернатант пропускався через колонку афінної хроматографії (120 літрів, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech). Нативний (активний) HGF, AT-III і HRGP (HAH) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (альбумін, lg і ін.) проходили через колонку. Колонка промивалася 600 кг буферного розчину (0,4 Μ хлориди натрію, 0,01 Μ фосфату натрію, рН 7,8) для видалення неактивних форм білків, і після цього фракція НАН элюювалась 500 кг буферного розчину (2,3 Μ хлориду натрію, 0,01 Μ фосфату натрію, рН 7,8). Отриманий елюат НАН був сконцентрований і підданий діафільтрації проти розчину 0,05 Μ фосфату натрію, рН 7,5 через мембрану для ультрафільтрації (Віоmах-10, Millipore). Отриманий концентрат НАН, підданий діафільтрації, позначався UF1. Приклад 2 Очищення нативного (активованого й/або неактивованого) HGF, стабілізованого за допомогою АТ-ІІІ і HRGP, відповідно до методики, описаної у винаході. Етап 1 Об'єднана свіжозаморожена плазма крові здорових донорів у кількості 1200 кг розморожувалась при 0°С. Отриманий кріопреципітат, що містить, зокрема, фактор VIII і фібронектин, видалявся за допомогою центрифугування. Преципітат звичайно використовувався для виділення й очищення фактора VIII. Етап 2 94442 16 Кріосупернатант, отриманий у результаті виконання етапу 1, піддавався подальшій обробці шляхом додавання етилового спирту до досягнення масової частки 8% для одержання преципітату фракції Кона І, що містить, зокрема, фібриноген і ліпопротеїди (Cohn et al. (1946) Am. Chem. Soc. 68, 459-475). Перед додаванням етилового спирту до розчину білків було додано 5,5 кг діатомової землі (Hyflow Super сel), і розчин перемішувався протягом 1-2 г. Преципітат і діатомова земля видалялися за допомогою центрифугування. Етап 3 рН супернатанта фракції Кона І (приблизна вага близько 1400 кг) доводився до 7,8; після цьогосупернатант пропускався через колонку афінної хроматографії (120 літрів, гепарин-сефароза FF, Amersham Pharmacia Biotech). Нативный (активний) HGF, AT-III і HRGP (HAH) зв'язувалися з матриксом колонки, у той час як основна маса інших білків плазми (альбумін, lg і ін.) проходили через колонку. Колонка промивалася 600 кг буферного розчину (0,4 Μ хлориди натрію, 0,01 Μ фосфату натрію, рН 7,8) для видалення неактивних форм білків, і після цього фракція НАН елюювалася 500 кг буферного розчину (2,3 Μ хлориди натрію, 0,01 Μ фосфату натрію, рН 7,8). Отриманий елюат НАН був сконцентрований і підданий діафільтрацїї проти розчину 0,05 Μ фосфату натрію, рН 7,5 через мембрану для ультрафільтрації (Biomax-10, Millipore). Отриманий концентрат НАН, підданий діафільтрацїї, позначався UF1. Приклад 3 Подальше очищення нативного HGF з метою видалення АТ-ІІІ. Методика проводилася при кімнатній температурі (+22°С). Концентрат UF1, отриманий у Прикладі 1 або 2, (А280=23,6; Фіг.1, доріжка 1) розводився потрійним об'ємом дистильованої води. Розведений розчин (маса 2050 г; провідність 2,6 мсм/см) пропускався через колонку (Pharmacia Biotech Bioprocess Column, діаметр 15 см), заповнену катіонообмінним матриксом Fractogel® EMD SO З-650 (Μ) (1,7 л). Попередньо колонку врівноважували розчином 10 мм цитрату натрію, рН 7,5, провідність 2,6 мсм/см. Швидкість потоку становила 9 л/г. Після того, як колонка навантажувалася білковим розчином, вона промивалася семиразовим об'ємом врівноважуючого буфера. Речовини, що не адсобувалися на колонку, змішувалися із промивним буфером (14,6 кг, позначений «Фракція А1», Фіг.1, доріжка 2). Білки, більш сильно пов'язані з матриксом колонки, елюювалися з колонки з 1,9 кг буферного розчину (1 Μ NaCl, 10 мм цитрату натрію, рН 7,5, провідність 106 мсм/см). Елюат (масою 1,9 кг) концентрувався й піддавався діафільтрації проти розчину, що містить 0,1 Μ цитрату натрію/1% сахарози, рН 7,0. Отримана фракція, позначена «А2», містила активний HGF і HRGP (табл. 1 і Фіг.1, доріжка 3). 17 94442 18 Таблиця 1 Поділ фракцій АТ-ІІІ і HGF/HRGP відповідно до методики, описаної у винаході А280 33 4,5 >80 >95 Присутність нативного HGF + 16 UF1 (НАН) Фракція А1 (АТ-ІІІ) Фракція А2 (HGF+HRGP) Вміст АТ-ІІІ (%) 95 Приклад 5 Щоб з'ясувати, наскільки важлива присутність АТ-ІІІ і HRGP для найкращого виходу HGF, було розпочато наступний експеримент: А. Фракцію незв'язаних з гепарин-сефарозой продуктів, отриману за прикладом 2 (етапи 1-3), піддавали подальшій обробці. У цю фракцію, що не містила HGF, активного АТ-ІІІ, вносили HGF, але не АТ-ІІІ або HRGP. Після обробки сольвентом/детергентом (Octoxynol, ΤnΒΡ), розчин пропускали через фільтр із розміром пор 0,45 мкм і наносили на колонку з Q-Сефарозой XL (аніонообмінна смола). Колонку промивали розчином Tris/HCl (концентрація 20 мМ, рН 7,0), який також видаляв сліди сольвенту/детергенту. Після промивання білки, що зв'язалися з колонкою, елюювалися буфером Tris/HCl рН 7,0, що містить 0,2 Μ NaCl. Елюат наносився на колонку з матриксом Fractogel EMD SO3. Після промивання, матеріал елюювався з колонки 10 мм розчином цитрату натрію рН 5,5 і 1 Μ NaCl. В. Процедура очищення проводилася аналогічно описаній в частині А, але одночасно з HGF у розчин був внесений очищений АТ-ІІІ. Результати: Оцінка різних фракцій, отриманих у ході застосування методики А і В показала, що поетапний вихід обох хроматографічних процесів був значно вище в присутності АТ-ІІІ, ніж за його відсутності, особливо у випадку хроматографії на Fractogel Присутність нативного HGF + + HRGP (мг/мл) + EMD SО3. У присутності АТ-ІІІ поетапний вихід HGF перевищував поетапний вихід HGF за відсутності АТ-ІІІ у два рази. Слід також зазначити, що за відсутності АТ-ІІІ, HGF виявлявся також в інших фракціях, крім елюату, у той час як у присутності АТ-ІІІ у випадку В HGF був сконцентрований в елюаті, а в проточній і промивній фракції присутність HGF не виявлялася. Таким чином, отримані результати демонструють, що присутність АТ-ІІІ значно підвищує поетапний вихід HGF. Особливо це стосується процесів аніонообмінної і катіонообмінної хроматографії, описаних вище. Приклад 6 Елюат, отриманий з колонки з гепаринсефарозой, а також фракція UF1, отримана відповідно до методики, описаної в прикладі 2, тобто HGF, АТ-ІІІ і HRGP оброблялися сольвентом/детергентом за методикою, описаною в прикладі 5, пропускалися через фільтр з діаметром пор 0,45 мкм і наносилися на колонку з фосфатом целюлози. Колонка промивалася фосфатним буфером з концентрацією 1 мм, рН 6,0. Елюювання HGF проводилося 1М NaCl у фосфатному буфері. При використанні такого хроматографічного процесу для видалення сольвенту/детергенту й подальшого очищення HGF, поетапний вихід HGF досягав більше 50% від вмісту HGF у вихідному матеріалі. 19 Комп’ютерна верстка А. Рябко 94442 Підписне 20 Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Purification and use of a factor for supporting wound healing

Автори англійською

Neisser-Svae Andrea, Winge Stefan, Mjaerdestam Anna

Назва патенту російською

Очищение и применение белкового фактора, который содействует заживлению ран

Автори російською

Найссер-Свае Андреа, Винге Стефан, Мйордерстам Анна

МПК / Мітки

МПК: A61K 38/17, A61K 38/36, C07K 1/18, C07K 1/22, A61K 38/18, C07K 1/34, C07K 1/36, A61P 17/02

Мітки: сприяє, загоєнню, білкового, очищення, застосування, ран, фактора

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/10-94442-ochishhennya-i-zastosuvannya-bilkovogo-faktora-shho-spriyaeh-zagoehnnyu-ran.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Очищення і застосування білкового фактора, що сприяє загоєнню ран</a>

Подібні патенти