Спосіб визначення полоксамерів

1. Спосіб кількісного визначення полоксамеру в рідкому зразку білка, що передбачає стадії, в ході яких згаданий зразок піддають: (a) стадії поділу за допомогою колонки ексклюзійної гель-хроматографії; (b) стадії елюції рухомою фазою; і (c) стадії детектування полоксамеру, де білок має молекулярну масу 5-70 кДа, переважно 20-70 кДа, при цьому рН рухомої фази, яку використовують на стадії елюції, встановлений нижче 3. 2. Спосіб за п. 1, в якому полоксамер являє собою Полоксамер 188. 3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому білок являє собою гетеродимерний білок. 4. Спосіб за п. 3, в якому білок являє собою гонадотропін, вибраний з FSH, LH, hCG, TSH. 5. Спосіб за п. 1 або 2, в якому аналізований білок являє собою інтерферон-β або гормон росту (GH). 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, в якому зразок являє собою водну фармацевтичну композицію, що містить FSH, LH, hCG, TSH, GH або інтерферон-β. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, в якому рухомою фазою є водний, зокрема буферний, розчинник. 8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому рН рухомої фази встановлений близько 1,9-2,0. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, в якому стадія детектування полоксамеру включає аналіз коефіцієнта заломлення. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, в якому колонка ексклюзійної гель-хроматографії являє собою колонку SE-HPLC, заповнену матрицею на полімерній основі, що містить кульки. 11. Спосіб за п. 10, в якому кульки в матриці мають розмір частинок 10 або 17 мкм. 12. Спосіб за п. 10 або 11, в якому кульки матриці мають розмір пор близько 200 Å. UA (21) a200804714 (22) 14.09.2006 (24) 10.08.2011 (86) PCT/EP2006/066383, 14.09.2006 (31) 05108439.0 (32) 14.09.2005 (33) EP (31) 60/717,642 (32) 16.09.2005 (33) US (46) 10.08.2011, Бюл.№ 15, 2011 р. (72) РОССІ МАРА, IT (73) АРЕС ТРЕЙДІНГ С.А., CH (56) WO A 2004/104025, 02.12.2004. MAO Y ET AL: "Quantitation of poloxamers in pharmaceutical formulations using size exclusion chromatography and colorimetric methods" JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, NEW YORK, NY, US, 2004, vol. 35, no. 5, P. 1127-1142. JEWELL R.C. ET AL: "Pharmacokinetics of RheothRx injection in healthy male volunteers" JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 1997, vol. 86, no. 7, P. 808-812. MANOHAR KATAKAM ET AL: "Effect of Surfactants on the Physical Stability of Recombinant Human Growth Hormone" JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION. WASHINGTON, US, 1995, vol. 84, no. 6, P. 713-716. OGHIMI S M ET AL: "Causative factors behind poloxamer 188 (Pluronic F68, Flocor(TM))-induced complement activation in human sera - A protective role against poloxamer-mediated complement activation by elevated serum lipoprotein levels" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. MOLECULAR BASIS OF DISEASE, AMSTERDAM, NL, 2004, vol. 1689, no. 2, P. 103-113. C2 2 (19) 1 3 льгуючі агенти, солюбілізуючі агенти і диспергуючі агенти. Добре відомим аналітичним підходом в характеризації полоксамеру є калориметричний спосіб, в якому аналізують поглинання ультрафіолетового випромінювання (UV) на довжинах хвиль 320 і 620 нм, що дається при формуванні комплексу полоксамеру з тіоціанатом кобальту (II). Yun Mao et al (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35 (2004), 1127) описують використання для визначення полоксамеру ексклюзійної гель-хроматографії (SEC) із застосуванням колонки, що містить THF як рухому фазу, і визначення коефіцієнта заломлення (RI). Спосіб був застосований до фармацевтичних складів Avapro, Neurontin і Sudafed, в яких активний початок являє собою «малу молекулу». Малі молекули можуть бути легко відділені за допомогою SEC від полоксамерів з великою молекулярною масою. Ексклюзійна гель-хроматографія (SEC), яка також називається хроматографією на проникному гелі (GPC), використовує пористі частинки для поділу молекул різних розмірів. Вона звичайно використовується для поділу полімерних молекул і для визначення молекулярної маси, а також розподілів молекулярної маси полімерів. Молекули, які менші, ніж розмір пори, можуть проникати всередину частинок, і тому робити більш довгий шлях, що займає більший час, ніж більш великі молекули, які не в змозі проникнути всередину частинок. Всі молекули, розміри яких більші, ніж розмір пор, не затримуються і елюються разом. Молекули, які здатні проникнути в пори, мають середній час перебування в частинках, який залежить від розміру і форми молекули. Різні молекули, відповідно, мають різний загальний час проходження через колонку. До цього часу не розроблено способу кількісного визначення полоксамерів в зразку білка, в якому білок має молекулярну масу, яка порівнянна з такою полоксамерів. Існує, зокрема, необхідність в кількісному визначенні полоксамерів в зразках білка, в яких білок має молекулярну масу між 5 і 70 кДа (кілодальтон), переважно між 20 і 70 кДа. Суть винаходу Даний винахід належить до способу, що забезпечує кількісне визначення полоксамеру в зразку білка, зокрема, в рідкому зразку білка, наприклад, в рідкому фармацевтичному складі. Зокрема, даний винахід надає спосіб кількісного вимірювання концентрації полоксамеру в зразку білка. Таким чином, кількість полоксамеру в складі може бути визначена в будь-який час протягом терміну зберігання білкових складів близько 2 років. Спосіб кількісного визначення полоксамеру в рідкому зразку білка включає в себе стадії, в ході яких згаданий зразок піддається: (a) стадії поділу інгредієнтів згаданого зразка за допомогою колонки ексклюзійної гельхроматографії; і (b) стадії детектування полоксамеру за допомогою аналізу коефіцієнта заломлення; 95461 4 Переважно, даний винахід належить до способу кількісного визначення полоксамеру в рідкому зразку білка, що передбачає стадії, в ході яких згаданий зразок піддається: (a) стадії поділу, за допомогою колонки ексклюзійної гель-хроматографії; (b) стадії елюції з участю рухомої фази; і (c) необов'язково, стадії детектування полоксамеру. Таким чином, ексклюзійна гель-хроматографія, скомбінована зі стадією елюції рухливою фазою, дозволяє відділити полоксамер від інших інгредієнтів. Полоксамер детектується в ході наступної стадії шляхом аналізу елюйованої фази, наприклад, з використанням системи детектування RI (коефіцієнта заломлення). Короткий опис креслень Фіг. 1 показує хроматограму кількісного визначення Полоксамеру 188 в складі, що включає hCG. Площа піка Полоксамеру 188 в цьому прикладі отримана при часі елюції близько 14-16 хвилин (час утримання може варіювати в залежності від швидкості потоку). Площа під криву дозволяє кількісно визначити Полоксамер 188 в зразку hCG. Скорочення У описі даного винаходу використовуються нижченаведені скорочення: FSH: фолікулостимулюючий гормон; r-FSH; r-LH; r-hCG; r-GH; r-IFN r-TSH: рекомбінантний FSH, LH, hCG, GH, INF, TSH; hFSH: FSH людини; r-hFSH: рекомбінантний FSH людини RI: Коефіцієнт заломлення KD або Kd або kDa: кілодальтон SEC: ексклюзійна гель-хроматографія RT: Кімнатна температура WFI: вода для ін'єкцій Полоксамер 188: синонім Pluronic F68 (фірма BASF Inc.) Докладний опис винаходу Даний винахід належить до зручного способу, що забезпечує кількісне визначення полоксамеру, який являє собою поверхнево-активну речовину, в зразку білка. Переважно, зразок білка являє собою рідкий зразок білка. Рідкий зразок білка може бути в формі якого-небудь рідкого складу, переважно це рідкий фармацевтичний склад, як описано нижче. У одному варіанті втілення, згаданий рідкий фармацевтичний зразок білка міститься в пляшечці для разового або багатодозового введення. У ще одному варіанті втілення зразок білка для аналізу, висушений заморожуванням, і він повинен бути перед аналізом солюбілізований у прийнятному водному розчиннику. Спосіб кількісного визначення полоксамеру в рідкому зразку білка передбачає стадії, в ході яких досліджуваний зразок піддається: (a) стадії поділу інгредієнтів згаданого зразка за допомогою колонки для ексклюзійної гельхроматографії (зокрема, колонки SE-HPLC); і (b) стадії детектування полоксамеру за допомогою аналізу коефіцієнта заломлення. Переважно, даний винахід представляє спосіб кількісного визначення полоксамеру в рідкому зра 5 зку білка, що передбачає стадії, в ході яких згаданий досліджуваний зразок піддається: (a) стадії поділу інгредієнтів за допомогою колонки для ексклюзійної гель-хроматографії; (b) стадії елюції рухомою фазою; і (c) необов'язково, стадії детектування полоксамеру. Звичайною колонкою для ексклюзійної гельхроматографії є колонка SE-HPLC. У одному варіанті втілення полоксамер являє собою Полоксамер 188. У переважному варіанті втілення білок в рідкому зразку білка має молекулярну масу, яка порівнянна з масою полоксамеру. У особливо переважному варіанті втілення білок в рідкому зразку білка має молекулярну масу між 5 і 70 кДа, більш переважно між 20 і 70 кДа. Співвідношення маси білка до відповідної маси полоксамеру може, переважно, складати між 1:3 і 10:1, переважно між 1:2 і 7:1. Приклади білків за даним винаходом включають в себе білки ссавців, такі як, наприклад, гормон росту, включаючи в себе гормон росту людини і гормон росту бика; рилізинг-фактор гормону росту; гормон навколощитоподібної залози; тереоїд-стимулюючий гормон; ліпопротеїни; а-1антитрипсин; ланцюг А інсуліну; ланцюг В інсуліну; норинсулін; фолікулостимулюючий гормон; хоріонічний гонадотропін; кальцитонін; лютеїнізуючий гормон; глюкагон; фактори згортання, такі як фактор VIIIC, фактор IX, тканинний фактор і фактор фон Віллебранда; протизсідні фактори, такі як білок С; передсердний натрійуретичний фактор; легеневий сурфактант; активатор плазміногену, такий як азурокіназа або активатор плазміногену тканинного типу (t-PA); бомбезин; тромбін; фактор некрозу пухлин- і -; енкефаліназа; RANTES (експресується і виділяється Т-клітинами при активації); запальний протеїн макрофагів людини (МІРІ-); сироватковий альбумін, такий як сироватковий альбумін людини; антимюллерів гормон; ланцюг А релаксину; ланцюг В релаксину; прорелаксин; білок, пов'язаний з гонадотропін-рилізинг гормоном; ДНКаза; інгібін; активін; фактор росту ендотелію судин (VEGF); рецептори гормонів або факторів росту; інтегрин; білки А або D; ревматоїдні фактори; нейротрофічний фактор, такий як нейротрофічний фактор кісткового мозку (BDNF), нейротрофін-3, -4, -5 або -6 (NT-3, NT-4, NT-5 або NT-6), або фактор росту нервів, такий як NGF-P; тромбоцитарний фактор росту (PDGF); фактор росту фібробластів, такий як aFGF і bFGF, зокрема, FGF-18; епідермальний фактор росту (EGF); трансформуючий фактор росту (TGF), такий як TGF- і TGF-, включаючи TGF-1, TGF-2, TGF3, TGF-4 або TGF-5; інсуліноподібний фактор росту-І і -II (IGF-I і IGF-II); дез(І-3)-IGF-І (IGF-I мозку); білки, зв'язуючі інсуліноподібний фактор росту; білки CD, такі як CD3, CD4, CD8, CD19 і CD20; еритропоетин (ЕРО); тромбопоетин (ТРО); остеоіндуктивні фактори; остеопонтин; імунотоксини; морфогенетичний білок кістки (BMP); інтерферон, такий як інтерферон -, - і -; колонієстимулюючі фактори (CSF), наприклад, M-CSF, GM-CSF і GCSF; інтерлейкіни (IL), наприклад, IL-1 - IL-10; су 95461 6 пероксидисмутазу; рецептори Т-клітин; білки поверхневої мембрани; фактор гемолізу (DAF); вірусний антиген, такий як, наприклад, частина оболонки вірусу набутого імунодефіциту (AIDS); транспортні білки; "хомінг"-рецептори; адресний; регуляторні білки; імуноадгезини; антитіла; і біологічно активні фрагменти або варіанти якого-небудь з перерахованих поліпептидів. Переважно, білки за даним винаходом вибрані з фолікулостимулюючого гормону (FSH), хоріонічного гонадотропіну (CG), лютеїнізуюючого гормону (LH), інтерферону- (IFN-), пегильованого інтерферону- (PEG-IFN-), гормону росту (GH), тереоїд-стимулюючого гормону (TSH), фактор росту-18 фібробластів (FGF-18) або остеопонтину. FSH, CG, LH і TSH є глікопротеїнами, що належить до класу гонадотропінів. Гонадотропіни використовують в лікуванні безпліддя. IFN- є глікопротеїном, що належить до класу інтерлейкінів. IFN- використовують в лікуванні розсіяного склерозу. PEG-IFN- являє собою IFN-, дериватизований ланцюгом поліетиленгліколю, який додає підвищеної стабільності. Гормон росту є неглікозильованим білком. Він застосовується в лікуванні дітей або дорослих з дефіцитом гормону росту. FGF-18 застосовують в лікуванні остеоартриту. Остеопонтин є глікозильованим одноланцюжковим поліпептидом. У одному переважному варіанті втілення згаданий білок являє собою гетеродимер, такий як гонадотропіни (FSH, LH, CG, TSH, а також варіанти). У ще одному варіанті втілення білок являє собою гормон росту (GH) або інтерферон- (IFN- або варіанти, наприклад, пегильовані варіанти). У ще одному варіанті втілення, білок являє собою FGF-18 або остеопонтин. У переважному варіанті втілення, рідкий зразок білка включає в себе один або більше терапевтичних білків. Переважно, такий зразок не включає в себе небілковий терапевтичний засіб, такий як низькомолекулярні хімічні сполуки. Фолікулостимулюючий гормон або FSH, оскільки це використовується в даному документі, означає FSH, продукований як повнорозмірний зрілий білок, який включає в себе, але не обмежується або, FSH людини або «hFSH», або продукований він рекомбінантно або виділений з людини як джерела, такого як сеча постменопаузних жінок. Спосіб придатний для природних, так само як і рекомбінантних білків. У одному варіанті втілення склад білка являє собою рекомбінантний FSH, LH, CG, TSH, GH або IFN- людини. Фолікулостимулюючий гормон (FSH) являє собою глікопротеїн, що належить до класу гонадотропінів. FSH застосовують при лікуванні безпліддя і порушень функції відтворювання у пацієнтів як жіночої, так і чоловічої статі, наприклад, для індукції сперматогенезу у чоловіків, страждаючих олігоспермією. Лютеїнізуючий гормон (LH) являє собою гонадотропін, секретований передньою долею гіпофізу. LH застосовують в комбінації з FSH у пацієнтів 7 95461 жіночої статі при індукції овуляції (OI) і в контрольованій гіперстимуляції яєчників (СОН), особливо у тих пацієнтів, які мають дуже низький рівень ендогенного LH або володіють резистентністю до LH, таких як жінки, які страждають на гіпогонадотрофний гіпогонадизм (НН, Всесвітня Організація Охорони здоров'я (WHO) група І) або у немолодих пацієнтів (наприклад, 35 років і старше), а також у пацієнток, що мають проблеми з імплантацією зародка або з раннім викиднем. Хоріонічний гонадотропін (CG) являє собою гонадотропін, продукований плацентою і отриманий з сечі вагітних жінок. CG діє на той самий рецептор, що і LH, і викликає ті ж самі реакції. CG володіє більш тривалим часом півжиття при циркуляції, ніж LH, і тому звичайно використовується як довготривале діюче джерело активності LH. CG застосовують при режимах OI і СОН з метою імітувати природний пік LH і запустити овуляцію. Ін'єкція хоріонічного гонадотропіну людини (hCG) застосовується для запуску овуляції в кінці стимуляції за допомогою FSH або суміші FSH і LH. CG може також бути використаний разом з FSH в ході стимуляції для OI і СОН, з метою забезпечити активність LH в ході стимуляції у пацієнток, у яких бажана активність LH, таких як згадані вище. FSH, LH і CG є членами сімейства гетеродимерних глікопротеїнових гормонів, яке також включає в себе тереоїд-стимулюючий гормон (TSH). Члени цього сімейства є гетеродимерами, що включають в себе - і -субодиниці. Субодиниці пов'язані нековалентними взаємодіями. Гетеродимер FSH людини (hFSH) складається зі (і) зрілої -субодиниці глікопротеїну, що містить 92 амінокислоти, яка також є спільною для інших членів цього сімейства у людини (тобто хоріонічний гонадотропін («CG»), лютеїнізуючий гормон («LH») і тереоїд-стимулюючий гормон («TSH»); і (іі) зрілої -субодиниці, що містить 111 амінокислот, яка унікальна для FSH. Гетеродимер LH людини складається з (і) зрілої -субодиниці глікопротеїну, що містить 92 амінокислоти; і (іі) зрілої -субодиниці, що містить 112 амінокислот, яка унікальна для LH. - і -субодиниці глікопротеїнів можуть бути схильні до дисоціації в сполуках внаслідок взаємодії з консервантом, поверхнево-активною речовиною і іншими експіцієнтами. Дисоціація субодиниць веде до втрати біологічної активності. FSH готують в сполуках для внутрішньом'язової (IМ) або підшкірної (SC) ін'єкції. У одному варіанті втілення FSH постачається в ліофілізійній (твердій) формі в пляшечках або ампулах 75 міжнародних одиниць (МО)/пляшечка і 150 МО/пляшечка з часом зберігання півтора року і FSH два роки, якщо зберігається при 2-25°С. Розчин для ін'єкції отримують шляхом розбавлення ліофілізійного продукту у воді для ін'єкцій (WFI). До того ж, рідкі склади FSH доступні (Gonal-F pen) із вмістом 22 мкг/0,5 мл, 33 мкг/0,75 мл або 66 мкг/1,5 мл FSH, а також Полоксамеру 188, сахарози, буфера, метіоніну і м-крезолу. Отже, FSH готують як в однодозовій, так і в багатодозовій формах, в пляшечках або ампулах. Однодозові форми повинні залишатися стабільними і дійовими при зберіганні до використання. Багатодозові форми повинні не тільки залишатися стабільними і дійовими при зберіганні до використання, але також повинні залишатися стабільними і дійовими і відносно вільними від бактерій протягом періоду багатодозового введення після того як герметичність ампули була порушена. З цієї причини багатодозові форми звичайно містять бактеріостатичний агент, наприклад, бензиловий спирт або м-крезол. LH готують в сполуках для внутрішньом'язової (IМ) або підшкірної (SC) ін'єкції. LH постачають в ліофілізійній (твердій) формі в пляшечках або ампулах по 75 МО/пляшечка з часом зберігання від півтора до двох років при 2-25°С. Розчин для ін'єкції отримують розбавленням ліофілізійного продукту водою для ін'єкцій (WFI). Luveris™ містить крім LH наступні ексціпієнти: сахарозу, буфер, Polysorbat 20, метіонін. Останнім часом описані склади LH, що містять Полоксамер 188 (WO 2004/087213). Рідкі фармацевтичні композиції, що містять hCG, також присутні на ринку, наприклад, Ovitrelle™, що містить манітол в фосфатному буфері при рН 7, метіонін, Полоксамер 188. Вираз «варіант» призначений охопити такі молекули, які відрізняються по послідовності амінокислот, типу глікозилювання або з'єднанню між субодиницями від FSH, LH, CG, TSH, IFN- або GH людини, але що виявляють відповідну біологічну активність FSH, LH, CG, TSH, IFN- або GH. Приклади включають в себе CTP-FSH, рекомбінантний FSH з пролонгованою дією, що містить субодиницю дикого типу і гібридну -субодиницю, в якій карбосикінцевий пептид hCG сполучений з С-кінцем -субодиниці FSH, як описано в LaPolt et al; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; or Klein et al.; Development and characterization of a long-acting r-hFSH agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. Також включений одноланцюжковий CTP-FSH, одноланцюжкова молекула, що складається з наступних послідовностей (від N-кінця до С-кінця): phCG-CTP(l 13-145) в якій FSH означає -субодиницю FSH, hCG CTP (113-145) означає карбоксильний кінець пептиду hCG, a FSH означає -субодиницю FSH, як описано в Klein et al; (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic ganodotrophin carboxy terminal 8 FSH peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility, 2002, 77, 1248-1255). Інші приклади варіантів FSH включають в себе молекули FSH, що мають додаткові сайти глікозилювання, включені в - і/або субодиницю, як описано в WO 01/58493 (фірма Махуgen), особливо, як описано в пп. 10 і 11 WO 9 01/58493, і молекули FSH з S-S-зв'язками між субодиницями, як описано в WO 98/58957. Варіанти FSH, що згадуються в даному документі, також включають в себе делеції карбоксильного кінця -субодиниці, яка коротша, ніж повнорозмірний зрілий білок FSH. Гетеродимери FSH або варіанти гетеродимерів FSH можуть бути отримані будь-яким відповідним способом, таким як рекомбінантний, шляхом виділення або очищення з природних джерел, що може бути найбільш вірним, або шляхом хімічного синтезу, або якою-небудь їх комбінацією. «Варіанти» також включають в себе пегильовані форми білків. Використання терміну «рекомбінантний» належить до препаратів FSH, LH, CG, TSH, GH, IFN або варіантів, які отримані за допомогою рекомбінантної ДНК-технології (див., наприклад, WO 85/01958). Один з прикладів способу експресування FSH або LH за допомогою рекомбінантної технології - це трансфекція еукаріотних клітин послідовностями ДНК, що кодують - і -субодиницю FSH або LH, незалежно від того, на одному векторі або на двох векторах для кожної субодиниці, що мають окремі промотори, як описано в Європейських патентах №№ ЕР 0211894 і ЕР 0487512. Іншим прикладом застосування рекомбінантної технології для отримання FSH або LH є використання гомологічної рекомбінації для вставки гетерологічного регуляторного сегмента в оперативній сполуці з ендогенними послідовностями, що кодують субодиниці FSH або LH, як описано в Європейському патенті № ЕР 0505500 (фірма Applied Research Systems ARS Holding NV). FSH або варіант FSH, що використовуються відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані не тільки рекомбінантними засобами, включаючи в себе такі на клітинах ссавців, але також можуть бути очищені з інших біологічних джерел, таких як сеча. Прийнятні методології включають в себе такі, описані в Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69,1997; Keene, et al., J. Biol. Chem., 264: 4769-4775, 1989; CerpaPoljak, et al., Endocrinology, 132: 351-356,1993; Dias, et al, J. Biol. Chem., 269:25289-25294,1994; Flack, et al., J. Biol. Chem., 269:14015-14020,1994; і Valove, et al., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994, патент США 3119740 і патент США № 5767067. Термін «лютеїнізуючий гормон» або LH, так, як він використовується в даному документі, належить до LH, отриманому як повнорозмірний зрілий білок, який включає в себе, але не обмежується ним, LH людини, або отриманий він рекомбінантно або виділений з джерел людського походження, таких як сеча постменопаузних жінок. Білкова послідовність -субодиниці глікопротеїну людини представлена в SEQ ID NO: 1, а білкова послідовність -субодиниці LH людини подана в SEQ ID NO: 6. У переважному варіанті втілення LH є рекомбінантним. Вираз «варіант LH» призначений, щоб охопити такі молекули, які відрізняються по амінокислотній послідовності, типу глікозилювання або зв'язку між субодиницями LH людини, але виявляють активність LH. 95461 10 Гетеродимери LH або гетеродимери варіантів LH можуть бути отримані яким-небудь відповідним способом, таким як рекомбінантний, шляхом виділення або очищення з природних джерел, що найбільш звичайно, або шляхом хімічного синтезу, або якої-небудь їх комбінації. Рідкі зразки білків за даним винаходом також включають в себе суміші FSH/LH і варіанти (WO 2004/087213), так само як FSH і hCG, і варіанти (WO 2004/105788). Термін «водний розріджувач» належить до рідкого розчину, який містить воду. Водні розчинні системи можуть складатися тільки з води або можуть складатися з води з додаванням одного або більше змішуваних розчинів і можуть містити розчинені речовини, такі як цукор, буфери, солі або інші наповнювачі. Більш звичайними у використанні неводними розчинниками є органічні спирти з короткими ланцюгами, такі як, метанол, етанол, пропанол, кетон з короткими ланцюгами, такі як ацетон, і багатоосновні спирти, такі як гліцерин. Термін «бактеріостатик» або «бактеріостатичний агент» належить до сполуки або композицій, доданих до складу, щоб діяти як антибактерійний агент. Склади, що містять FSH або варіант FSH, або FSH і LH з консервантом за даним винаходом, переважно відповідають законним або регулюючим правилам для ефективності консерванту, щоб бути комерційно життєздатним продуктом багаторазового використання, переважно на людині. Приклади бактеріостатиків включають в себе фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілапарабен (метил, етил, пропіл, бутил і подібне), бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, дегідроацетат натрію і тимеросал. Термін «буфер» або «фізіологічно прийнятний буфер» належить до розчинів сполук, які відомі як безпечні для фармацевтичного або ветеринарного застосування в складах і які мають ефект підтримки або контролю рН складу в бажаному для складу діапазоні рН. Прийнятні для контролю рН на рівні помірного кислого рН помірно основного рН буфери включають в себе, але не обмежуються ними, такі речовини, як фосфат, ацетат, цитрат, аргінин, TRIS і гістидин. «TRIS» означає 2-аміно-2гідроксиметил-1,3,-пропандіол і деякі його фармакологічно прийнятні солі. Переважні буфери являють собою фосфатні буфери з фізіологічним розчином або прийнятною сіллю. Термін «фосфатний буфер» належить до розчинів, що містять фосфорну кислоту або її солі, встановлених на бажаному рівні рН. Загалом, фосфатні буфери готують з фосфорної кислоти або солей фосфорної кислоти, включаючи в себе, але, не обмежуючись ними, натрієву і калієву солі. Декілька солей фосфорної кислоти відомі в даній галузі техніки, такі як одноосновний натрій і калій, двоосновні і триосновні солі кислоти. Також відомо, що солі фосфорної кислоти зустрічаються як гідрати солей, що зустрічаються. Фосфатні буфери можуть охоплювати діапазон рН, такий як від близько рН 4 до близько рН 10, а переважні діапазони від близько рН 5 до близько рН 9, а найбільш переважним є діапазон від 6,0 або близько того до 11 8,0 або близько того, найбільш переважно -рН 7,0 або близько того. Термін «пляшечка» належить в широкому значенні до резервуара, придатного, щоб містити FSH в твердій або рідкій формі в стерильному стані. Приклади пляшечок, як вони вживаються в даному документі, включають в себе ампули, касети, блістерні упаковки або інші такі ємності, придатні для введення FSH пацієнту за допомогою шприца, насоса (включаючи в себе осмотичний), катетер, трансдермальний пластир, легеневий спрей або спрей для слизової. Пляшечки, придатні для упаковування продуктів для парентерального, легеневого, через слизову або трансдермального введення відомі і визнані в даній галузі техніки. Вираз «багатодозове застосування» призначений, щоб включити в себе використання однієї пляшечки, ампули або касет із складом FSH або складом білка для більш ніж однієї ін'єкції, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6 або більше ін'єкцій. Ін'єкції проводять переважно в період щонайменше 12 годин, 24 годин, 48 годин і т.д. або близько того, переважно в період 12 днів або близько того. Ін'єкції можуть бути розділені проміжками часу, наприклад, в 6, 12, 24, 48 або 72 години. Термін «стабільність» належить до фізичної, хімічної і конформаційної стабільності даного білка в складі за даним винаходом (включаючи в себе підтримку біологічної активності). Нестабільність складу білка може бути викликана хімічним розкладанням або агрегацією молекул білка з утворенням полімерів більш високого порядку, дисоціацією гетеродимерів в мономери, деглікозилюванням, модифікацією глікозилювання, окисленням (особливо в гетеродимерах субодиниці) або якою-небудь іншою структурною модифікацією, яка зменшує щонайменше один вид біологічної активності поліпептиду, включеного в даний винахід. «Стабільний» розчин або склад є таким, в якому міра розкладання, модифікації, агрегації, втрати біологічної активності і подібного білків в розчині або складі прийнятним чином контролюється і не зростає неприйнятним чином з плином часу. Переважно, склад зберігає щонайменше 80% або близько того активність згаданого білка в період до 2 років. Проблема, яка лежить в основі даного винаходу, полягає в тому, щоб надати зручний і швидкий спосіб визначення кількості полоксамеру в зразку білка. Полоксамер може бути використаний як поверхнево-активна речовина і вибирається з блоку-співполімерів етиленоксиду і пропіленоксиду, переважно Pluronico F77, Pluronic F87, Pluronic F88 і Pluronico F68, особливо переважно Pluronic F68 (фірма BASF, Pluronic F68 також відомий як Полоксамер 188). Як згадувалося вище, фармацевтичні склади повинні мати час зберігання до 2 років при температурі зберігання 2-25°С. Це має на увазі, що склад залишається стабільним протягом цього часу. Оскільки рідкі склади містять різні наповнювачі, які можуть впливати безпосередньо або опосередковано через розкладання на стабільність складу білка, існує необхідність в аналітичному 95461 12 інструменті, щоб добитися згаданої стабільності складу. Більш конкретно, полоксамерні поверхневоактивні речовини є блок-співполімерами етиленоксиду (ЕО) і пропіленоксиду (РО). Блок пропіленоксиду (РО) укладений між двома блоками етиленоксиду (ЕО). Полоксамери синтезують в двостадійному процесі: - Гідрофобна речовина бажаної молекулярної маси утворюється шляхом контрольованого додавання пропіленоксиду до двох гідроксильних груп пропіленгліколю; і - Етиленоксид додавали до сендвічу гідрофобної речовини між гідрофільними групами. Полоксамерні поверхнево-активні речовини також відомі як плюроніки. У Pluronico F77 процент поліоксиетилену (гідрофільного) становить 70%, і молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілен) становить приблизно 2306 Да. У Pluronic F87 процент поліоксиетилену (гідрофільного) становить 70%, і молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілен) становить приблизно 2644 Да. У Pluronic F88 процент поліоксиетилену (гідрофільного) становить 80%, і молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілен) становить приблизно 2644 Да. У Pluronic F68 процент поліоксиетилену (гідрофільного) становить 80%, і молекулярна маса гідрофобної речовини (поліоксипропілен) становить приблизно 1967 Да. Типові властивості Pluronic F77 перераховані нижче: Середня молекулярна маса: 6600; Температура плавлення/застигаючого: 48°С; Фізична форма при 20°С: тверда; В'язкість (Brookfield) сантипуаз: 480 [рідини при 25°С, пастоподібні при 60°С і тверді при 77°С]; Поверхневе натягнення, дин/см 25°С; конц. 0,1%: 47,0 конц. 0,01%: 49,3 конц. 0,001%: 52,8 Натягнення на межі поділу фаз, дин/см 25°С проти Nujol; конц. 0,1%: 17,7 конц. 0,01%: 20,8 конц. 0,01%: 25,5 Час змочування по Дрейвзу, секунд при 25°С конц. 1,0%: >360 конц. 0,1%: >360 Висота піни Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 50°С: 100 Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 26°С: 47 Динамічна, 0,1%, мм, 400 мл/хв: >600 Температура помутніння у водному розчині, °С 13 Конц. 1%:>100 Конц. 10%: >100 HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 25 Типові властивості Pluronic F87 перераховані нижче: Середня молекулярна маса: 7700; Температура плавлення/застигаючого: 49°С; Фізична форма при 20°С: тверда; В'язкість (Brookfield) сантипуаз: 700 [рідини при 25°С, пастоподібні при 60°С і тверді при 77°С]; Поверхневе натягнення, дин/см 25°С; Конц. 0,1%: 44,0 Конц. 0,01%: 47,0 Конц. 0,001%: 50,2 Натягнення на межі поділу фаз, дин/см, 25°С проти Nujol; Конц. 0,1%: 17,4 Конц. 0,01%: 20,3 Конц. 0,01%: 23,3 Час змочування по Дрейвзу, секунд при 25°С Конц. 1,0%: >360 Конц. 0,1%: >360 Висота піни Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 50°С: 80 Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 26°С: 37 Динамічна, 0,1%, мм, 400 мл/хв: >600 Температура помутніння у водному розчині, °С Конц. 1%: >100 Конц. 10%: >100 HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 24 Типові властивості Pluronic F88 перераховані нижче: Середня молекулярна маса: 11400; Температура плавлення/застигаючого: 54°С; Фізична форма 20°С: тверда; В'язкість (Brookfield) сантипуаз: 2300 [рідкі при 25°С, пастоподібні при 60°С і тверді при 77°С]; Поверхневе натягнення, дин/см 25°С; Конц. 0,1%: 48,5 Конц. 0,01%: 52,6 Конц. 0,001%: 55,7 Натягнення на межі поділу фаз, дин/см, 25°С проти Nujol; Конц. 0,1%: 20,5 Конц. 0,01%: 23,3 0,01%: 27,0 Час змочування по Дрейвзу, секунд при 25°С Конц. 1,0%:>360 Конц. 0,1%:>360 Висота піни Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 50°С: 80 Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм, 26°С: 37 Динамічна, 0,1%, мм, 400 мл/хв: >600 Температура помутніння у водному розчині, °С Конц. 1%: >100 Конц. 10%: >100 HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 28 Типові властивості Pluronic F68 перераховані нижче: Середня молекулярна маса: 8400; Температура плавлення/застигаючого: 52°3; 95461 14 Фізична форма 20°С: тверда; В'язкість (Brookfield) сантипуаз: 1000 [рідкі при 25°С, пастоподібні при 60°С і тверді при 77°С]; Поверхневе натягнення, дин/см 25°С; Конц. 0,1%: 50,3 Конц. 0,01%: 51,2 Конц. 0,001%: 53,6 Натягнення на межі поділу фаз, дин/см, 25°С в порівнянні з Nujol; Конц. 0,1%: 19,8 Конц. 0,01%: 24,0 Конц. 0,01%: 26,0 Час змочування по Дрейвзу, секунд при 25°С Конц. 1,0%: >360 Конц. 0,1%: >360 Висота піни Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм 50°С: 35 Проба Росса і Майльса на піноутворюючу здатність, 0,1%, мм 26°С: 40 Динамічна, 0,1%, мм 400 мл/хв: >600 Температура помутніння у водному розчині, °С Конц. 1%: >100 Конц. 10%: >100 HLB (гідрофільно-ліпофільний баланс): 29 Інші полоксамерні полімери, що мають властивості, схожі з такими, які перераховані вище, також можуть бути використані в сполуках за даним винаходом. Переважною полоксамерно поверхнево-активною речовиною, присутньою в складі білка, які аналізуються даним способом, є Pluronic F68 (= Полоксамер 188). Переважно концентрація Pluronic, особливо Pluronic F68, в рідких складах білка складає від 0,01 мг/мл або близько того до 1 мг/мл або близько того, більш переважно від 0,05 мг/мл або близько того до 0,5 мг/мл або близько того, особливо більш переважно від 0,2 мг/мл або близько того до 0,4 мг/мл або близько того, найбільш переважно 0,1 мг/мл або близько того. Склади білка, що аналізуються відповідно до способу за даним винаходом, мають рН між 6,0 або близько того і 8,0 або близько того, більш переважно від 6,8 або близько того до 7,8 або близько того, включаючи в себе рН близько 7,0, рН 7,2 і 7,4. Переважним буфером є фосфат, з переважним протиіоном, що є іоном натрію або калію. Фосфатні сольові буфери добре відомі в даній галузі техніки, такі як фосфатний сольовий буфер Дульбекко. Концентрації буферів в сумарному розчині можуть варіювати між 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ і 500 мМ або близько того. Переважно, концентрація буфера становить 10 мМ або близько того. Особливо переважний буфер 10 мМ з іонами фосфату і рН 7,0. Переважно, склади FSH, що аналізуються відповідно до способу за даним винаходом, мають рН між 6,0 або близько того і 8,0 або близько того, більш переважно - від 6,8 або близько того до 7,8 або близько того, включаючи в себе рН близько 7,0, рН 7,2 і 7,4. Переважним буфером є фосфат з переважними протиіонами, що є іонами натрію або калію. Переважно, склади сумішей FSH і LH, що аналізуються відповідно до способу за даним винахо 15 дом, мають рН між 6,0 або близько того і 9,0 або близько того, більш переважно від 6,8 або близько того до 8,5 або близько того, включаючи в себе рН близько 7,0, рН 8,0 і 8,2, найбільш переважно на рівні рН 8,0 або близько того. Переважно, склади hCG, що аналізуються відповідно до способу за даним винаходом, мають рН між 6,0 або близько того і 8,0 або близько того, більш переважно між 6,8 або близько того і 7,8 або близько того, включаючи в себе рН близько 7,0, рН 7,2 і 7,4. Зразок білка переважно являє собою рідкий склад для разового або багатодозового введення. Рідкі склади за даним винаходом, які призначені для багатодозового застосування, переважно включають в себе бактеріостатик, такий як фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловий спирт, алкілпараамінобензойної кислоти (метил, етил, пропіл, бутил і ним подібне), тимол, бензалконію хлорид, бензетонію хлорид, дегідроацетат натрію і тимеросал. Особливо переважними є фенол, бензиловий спирт і м-крезол, більш переважними є фенол і м-крезол, найбільш переважним є м-крезол. Бактеріостатичний агент використовують в кількості, яка дає концентрацію, ефективну для підтримки складу загалом вільного від бактерій (придатної для ін'єкції) в період багатодозових ін'єкцій, який може складати від 12 або 24 години або близько того до 12 або 14 днів або близько того, переважно від 6 днів або близько того до 12 днів або близько того. Бактеріостатик переважно присутній в концентрація від 0,1% або близько того (маса бактеріостатика/маса розчинника) до 2,0% або близько того, більш переважно на рівні 0,2% або близько того до 1,0% або близько того. У разі бензилового спирту, особливо переважною є концентрація 0,9%). У разі фенолу, особливо переважною є концентрація 0,5% або близько того. У разі м-крезолу, особливо переважно є концентрація 0,3% або близько того (наприклад, на рівні 3 мг/мл або близько того в WFI). Колонки для ексклюзійної гель-хроматографії добре відомі фахівцям в даній галузі техніки. Їх вибирають виходячи з відповідного білка і полоксамеру в зразку. Гель в колонці повинен бути матрицею на полімерній основі. Переважною колонкою є колонка SE-HPLC, що має позначення TSK G3000PW фірми TosoHaas Inc. Кульки матриці мають розмір частинок 10 або 17 мкм, розмір пор близько 200А. Колонка комерційно доступна. Стадія визначення може бути виконана за допомогою якої-небудь системи визначення RI, яка відома фахівцям в даній галузі техніки. 95461 16 Було виявлено, що в більш кислих умовах полоксамер може бути більш легко відділений від білків. Таким чином, рухома фаза, що використовується відповідно до способу за даним винаходом, являє собою водний розчинник, такий як вода або буферний розчин. У конкретному варіанті втілення, рН рухомої фази встановлюють на рівні нижче ніж 7, переважно нижче ніж 3, більш переважне - між близько 1,6 і 2,0, а найбільш переважно між 1,9 і 2,0. У одному варіанті втілення білок являє собою гетеродимер, такий як FSH, CG, LH або TSH. У кислих умовах гетеродимерний білок схильний до розпаду на субодиниці, які рухаються більш легко, поліпшуючи таким чином стадії поділу і детектування (розрізнення). Кислотні агенти, придатні для встановлення рН, можуть бути підібрані фахівцями в даній галузі техніки. Найбільш переважною кислотою є трифтороцтова кислота (TFA). Звичайно, зразки, які повинні бути визначені, готують і ін'єктують в колонку. Що стосується коефіцієнта заломлення на стадії детектування за даному способом, отримували хроматограму, що містить площу піка полоксамеру, так само як і щонайменше ще один пік відповідний білку (білкам) і наповнювачам. Оцінка площі піка дозволяє кількісну оцінку полоксамеру, присутнього в зразку, що аналізується. Кількісне визначення можливе, оскільки готували стандартну криву полоксамерів (див. Приклади). Приклади Тут даний винахід буде проілюстрований за допомогою Прикладів. Приклад (ілюстрований Фіг. 1) Метою даного Прикладу було проаналізувати концентрацію Полоксамеру 188 в зразку комерційно доступного рідкого складу hCG Ovitrelle™ через 18 місяців зберігання при кімнатній температурі. Таким чином, оцінювали стабільність рідкого складу по відношенню до Полоксамеру 188. Концентрація полоксамеру 188 в момент виготовлення складала близько 100 мкг/мл. Протокол кількісного визначення Полоксамеру 188 в Ovitrelle™ був наступним. Рідкий ін'єкційний Ovitrelle™ містив наступні інгредієнти: хоріонічний гонадотропін-, маніт, Lметіонін, Полоксамер 188, фосфорна кислота, NaOH і вода. 1. Обладнання і матеріали HPLC ALLIANCE mod. 269 Детектор RI мод. 2414 BASF Підтримка по математичному забезпеченню Персональний комп'ютер Полоксамер 188 Lutrol F68 код 010293-1 Трифтороцтова кислота (TFA) код. 9470 (10(1 мл) Аналітична колонка TSKgel G3000 PWxI код 08021 D(-)Маніт код 1.05983 L-Метіонін код 1.05707 Орто-Фосфорна кислота 85% код 1.00573 Постачальник Waters Waters Waters IBM (або еквівалентний) BASF J.T.Baker TOSOH MERCK MERCK MERCK 17 95461 Гідроксид натрію 50% код 7067 Етанол градієнтної чистоти код 1.11727 Шприци Ovitrelle - рідкий склад hCG 250 мкг 2. Процедура 2.1 Елюент A (H2O/TFA 0,5%) До 950 мл очищеної води в 1 літровому градуйованому циліндрі додавали 5 мл трифтороцетної кислоти (TFA) і при перемішуванні доводили до 1000 мл. рН елюенту складав між 1,7 і 1,9. 2.2 Елюент В (20% Етанол) До 750 мл очищеної води в 1 літровому градуйованому циліндрі додавали 200 мл етанолу і доводили при перемішуванні до 1000 мл. 2.3 Відмитий розчин для автоматичної піпетки для відбору проб (10% Метанол) До 850 мл очищеної води в 1 літровому градуйованому циліндрі додавали 100 мл метанолу і доводили при перемішуванні до 1000 мл. 2.4 Розчинник для закупорювання (5% Метанол) До 900 мл очищеної води в 1 літровому градуйованому циліндрі додавали 50 мл метанолу і доводили при перемішуванні до 1000 мл. 2.5 Розчин для стандартної кривої розбавлення (рідкий склад без Полоксамеру 188) До 850 мл очищеної води в 1 літровому градуйованому циліндрі додавали 54,6 г D(-)маніту, 0,98г 85%-ний ортофосфорної кислоти і 200 мкг Lметіоніну. Розчин доводили до рН 7,0 краплинним доданням 50% гідроксиду натрію і доводили до 1мл. Розчин фільтрували через фільтр 0,45 мкм. Як альтернатива як розчин для стандартної кривої розбавлення може бути використана вода. 2.6 Концентрований розчин для стандартної кривої 18 J.T. Baker MERCK SERONO 200 мг Полоксамеру 188 розчиняли в 80 мл очищеної води в градуйованому циліндрі на 100мл і доводили до 100 мл. Стандартну криву готували, основуючись на очікуваній концентрації в зразку, що аналізується. У цьому Прикладі в рідкому ін'єкційному Ovitrelle™ концентрація Полоксамеру 188 очікувалася близько 100 мкг/мл, таким чином, стандартна крива побудована в діапазоні 50-160 мкг/мл. 3 Приготування зразків Пустий зразок Ін'єктували 0,05 мл розчини для стандартної кривої розбавлення. Зразки Всі зразки тестували без якої-небудь попередньої обробки, і ін'єктували 0,05 мл. 4. Експлуатаційні умови 4.1. Набір інструментів Нижченаведені розчини подавали в лінії HPLC: Лінія А: Елюент A (H2O/TFA 0,5%) Лінія В: Елюент В (Етанол 20%) Лінії А і В заповнювали, систему продували і промивали при швидкості потоку 2 мл/хв протягом 3 хвилин. Включали вбудований дегазатор, при наявності такого. Перед аналізом соленоїдний клапан детектора RI потоку включали в режимі продування щонайменше на 30 хвилин на лінії А. Продування проточного елементу виконували для впускання свіжої рухомої фази в еталонну частину елементу. З'єднання колонки з інструментами і введення наступних параметрів: температура детектора RI температура колонки: швидкість потоку через колонку швидкість потоку Elium: 30°С +20±5°С 0,5 мл/хв 20 мл/хв (у разі відсутності в лінії дегазатора) температура автоматичної піпетки для відбо+4°С ру проб Петля автоматичної піпетки для відбору проб 200 мкл Розмір шприца: 250 мкл Тривалість аналізу: 40 хв Наступна ін'єкція: 5 хв 4.2 Урівноваження колонки Колонку промивають елюентом А для урівноваження колонки. Урівноваження закінчується, коли базова лінія стає стабільною. 4.3 Зберігання колонки Після завершення аналізу колонку промивають щонайменше 30 мл очищених води, після чого 30 мл 20% етанолу. 4.4 Визначення концентрації Полоксамеру 188 в зразках Ovitrelle Моделлю, використаною для розрахунку концентрації Полоксамеру 188 в зразках Ovitrelle, є лінійна регресія. Y=a+bx, у якому Y = загальна площа піка Полоксамеру 188 а = величина відрізка b = величина кута нахилу х = концентрація Полоксамеру 188 в мкг/ін'єктований мл. Піки зразка інтегрували, як показано на Фіг. 1. Величина відрізка (а) і кут нахилу (b) стандартної кривої розраховували, за допомогою математичного забезпечення Statgraphics plus розраховували лінійну регресію. Наступну формулу застосовували для розрахунку концентрації Полоксамеру 188. уа C полоксамер 188   FD (FD = показник b розбавлення) Рівняння 1 19 95461 Рішення рівняння 1 дає концентрацію Полоксамеру 188 в кожному із зразків Ovitrelle, виражену в мкг/мл. Концентрація полоксамеру, виявлена в зразках за даному Прикладом (див. Фіг.1) склала близько 94 мкг/мл. Приклад 2 Мета цього Прикладу полягає в тому, щоб проаналізувати концентрацію Полоксамеру 188 в зразку комерційно доступного рідкого складу hFSH - Gonal-F RFF Pen™ через 18 місяців зберігання при кімнатній температурі. Таким чином, була оцінена стабільність рідкого складу, що стосується Полоксамеру 188. Концентрація Полоксамеру 188 в момент приготування складала близько 100мкг/мл. Протокол кількісного визначення Полоксамеру 188 в Gonal-F RFF Pen™ був ідентичний показаному в Прикладі 1 для Ovitrelle, за винятком Комп’ютерна верстка Мацело М. 20 того, що швидкість потоку через колонку становила 0,75 мл/хв. Полоксамер міг бути відділений від hFSH і кількісно визначений окремо. Приклад 3 Мета цього Прикладу полягає в тому, щоб проаналізувати концентрацію Полоксамеру 188 в зразку комерційно доступного рідкого складу hGH Serostim™. Протокол був ідентичний такому в Прикладі 2. Полоксамер міг бути відділений від hGH і кількісно визначений окремо. Приклад 4 Метою цього Приклад був аналіз концентрації Полоксамеру 188 в зразку рідкого складу hlFN-p. Протокол був ідентичний такому Прикладу 2. Полоксамер міг бути відділений від hlFN- і кількісно визначений окремо. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601