Коротколанцюжкові олігонуклеотиди, їх застосування для виробництва лікарського засобу

Реферат: Заявлений винахід належить до коротких одноланцюжкових олігонуклеотидів довжиною у 8-26 нуклеотидів, де щонайменше одна з нуклеотидних ланок представляє ланку біциклічної нуклеїнової кислоти (LNA); зазначені олігонуклеотиди застосовують для виробництва лікарського засобу для лікування захворювань або патологічного розладу, вибраного з групи, що складається з підвищеного рівня холестерину в плазмі, атеросклерозу, гіперхолестеринемії, гіперліпідемії і гепатиту С. UA 100112 C2 (12) UA 100112 C2 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід стосується фармацевтичних композицій, що включають LNA-вмісні одноланцюжкові олігонуклеотиди, здатні інгібувати мікроРНК, що викликають захворювання, зокрема, людські мікроРНК - miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 і miR-375. Попередній рівень техніки МікроРНК - нові регулятори експресії генів МікроРНК (міРНК) належать до широкого класу коротких ендогенних РНК, які діють як посттранскрипційні регулятори експресії генів за допомогою спарювання основ з основами їх мРНК-мішеней. Зрілі міРНК послідовно процесуються з більш довгих шпилькових транскриптів під дією рибонуклеаз РНКази III Drosha (Lee et al. 2003) і Dicer (Hutvagner et al. 2001, Ketting et al. 2001). На жовтень 2005 у базі даних мікроРНК, miRBase, версія 7.1, є більше, ніж 3400 міРНК хребетних, безхребетних і рослин (Griffith-Jones 2004, Griffith-Jones et al. 2006), а також було ідентифіковано багато міРНК, що відповідають передбачуваним генам. У більшості тварин, міРНК розпізнають свої сайти-мішені, локалізовані в 3'-UTR, за допомогою неповного спарювання основ, що приводить до придушення трансляції генівмішеней (Bartel 2004). Більш широкомасштабні дослідження показали, що міРНК тварин грають фундаментальну біологічну роль у зростанні і апоптозі клітин (Brennecke et al. 2003), у диференціюванні гемопоетичних клітин (Chen et al. 2004), у регуляції тривалості життя клітин (Boehm and Slack 2005), у диференціюванні фоторецепторів (Li and Carthew 2005), у регуляції генів гомеобоксу (Yekta et al., 2004, Hornstein et al., 2005), у формуванні асиметрії нейронів (Johnston et al. 2004), у секреції інсуліну (Poy et al. 2004), у морфогенезі головного мозку (Giraldez et al. 2005), у проліферації і диференціюванні м‟язових клітин (Chen, Mandel et al. 2005, Kwon et al. 2005, Sokol and Ambros 2005), у кардіогенезі (Zhao et al. 2005) та у пізньому ембріональному розвитку хребетних (Wienholds et al. 2005). МікроРНК, що беруть участь у розвитку захворювань людини міРНК беруть участь у розвитку великої кількості людських захворювань. Одним з таких захворювань є м‟язова атрофія спинного мозку (SMA), нейродегенеративні захворювання у дітей, що викликаються зниженням рівнів білка або мутацією, що обумовлено втратою функції гена, відповідального за виживання рухових нейронів (SMN) (Paushkin et al. 2002). Нещодавно було виявлено, що мутація у сайті-мішені miR-189 людського гена SLITRK1 асоціюється з розвитком синдрому Туретта (Abelson et al. 2005), хоча в інших нещодавно проведених дослідженнях повідомлялося, що РНК-вмісний геном вірусу гепатиту С взаємодіє з мікроРНК клітини-хазяїна, тобто з печінко-специфічною miR-122a, і, тим самим, полегшує її реплікацію у хазяїні (Jopling et al. 2005). Іншими захворюваннями, у розвитку яких беруть участь міРНК, або які викликані механізмами їх процесингу, є розумова відсталість, що асоційована з синдромом ламкої Х-хромосоми (FXMR) і що викликається відсутністю білка, відповідального за розвиток вказаного синдрому ламкої Х-хромосоми, що приводить до зниження тривалості життя (FMRP) (Nelson et al. 2003, Jin et al. 2004), і синдрому Ді Георге (Landthaler et al. 2004). Крім того, повідомлялося, що при багатьох ракових захворюваннях людини спостерігалося порушення профілів експресії міРНК. Так, наприклад, у більшості випадків хронічного Вклітинного лімфоцитарного лейкозу (ХЛЛ) людські гени міРНК miR15a і miR16-1 піддаються делеції або інгібуванню, і нещодавно було показано, що унікальна «сигнатура» з 13 генів міРНК може бути використана для прогнозу прогресування захворювання (Calin et al. 2002, Calin et al. 2005). Роль міРНК у розвитку раку підтверджується тим фактом, що більше 50% людських генів міРНК розташовано в асоційованих з раком геномних областях або у «ламких» сайтах (Calin et al. 2004). Нещодавно проведений аналіз системної експресії у людей з різними злоякісними захворюваннями показав, що у пухлинах, у порівнянні з нормальними тканинами, відбувається загальне інгібування міРНК (Lu et al. 2005). Слід зазначити, що класифікація низькодиференційованих пухлин на основі міРНК була проведена успішно, тоді як у тих самих зразках профілі міРНК виявилися у високій мірі неточними. Було також виявлено, що порушення регуляції міРНК відбувається при раку молочної залози (Iorio et al. 2005), раку легенів (Johnson et al. 2005) і раку товстої кишки (Michael et al. 2004), і повідомлялося, що кластер miR-17-92, який ампліфікується у людських В-клітинних лімфомах, а також miR-155, який активується у лімфомі Беркітта, є головними людськими міРНК-онкогенами (Eis et al. 2005, He et al. 2005). Таким чином, у майбутньому, людські міРНК можуть бути з успіхом використані не тільки як біомаркери для діагностики раку, але також, як вже обговорюється останнім часом, як привабливі мішені для лікування захворювань із застосуванням олігонуклеотидної технології. 1 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інгібування мікроРНК з використанням одноланцюжкових олігонуклеотидів Для інгібування міРНК було описано декілька способів із застосуванням олігонуклеотидної технології. У WO03/029459 (Tuschl) заявлені олігонуклеотиди, що кодують мікроРНК і їх комплементи довжиною у 18-25 нуклеотидів, які можуть включати нуклеотидні аналоги. Було також висловлене припущення, що можливим нуклеотидним аналогом є LNA, хоча у даній заявці LNA-вмісні олігонуклеотиди не описані. У заявці Tuschl вказується, що олігонуклеотиди міРНК можуть бути використані у терапії. У заявці US2005/0182005 описаний 24-мерний олігорибонуклеотид 2'OMe-РНК, комплементарний найдовшій формі miR21, який, як було виявлено, знижує рівень miR21індукованої репресії, тоді як еквівалентний ДНК-вмісний олігонуклеотид не має такої функції. Термін «2'OMe-РНК» означає аналог РНК, де у 2-положенні є заміщення метилом (2'O-метил). Заявка US2005/0227934 (Tuschl) стосується mir-інгібуючих молекул (antimir), що містять до 50% залишків ДНК. Також повідомлялося, що 2'-OMe-РНК, які містять молекули antimir, можуть бути використані для придушення мікроРНК підшлункової залози, однак фактичні структури цих олігонуклеотидів не описані. В US20050261218 (ISIS) заявлена олігомерна сполука, що включає першу область і другу область, де, щонайменше, одна область містить модифікацію, а частина олігомерної сполуки націлена на невелику некодуючу нуклеїнову кислоту, що є РНК-мішенню, де вказаною невеликою некодуючою нуклеїновою кислотою, яка являє собою РНК-мішень, є міРНК. Були також заявлені олігомерні сполуки, що мають довжину у 17-25 нуклеотидів. Приклади стосуються, головним чином, 2'-ОMe-PS-сполук, 21-мерів і 20-мерів, і 2'OMe-геп-мерних олігонуклеотидів, націлених на ряд пре- міРНК і зрілих міРНК-мішеней. У роботі Boutla et al. 2003 (Nucleic Acids Research 31: 4973-4980) описане використання антисмислових ДНК-олігонуклеотидів, комплементарних 11 різним міРНК у дрозофіл (Drosophila), а також їх використання для інактивації міРНК шляхом введення ДНКолігонуклеотидів в ембріони мух. З 11 антисмислових ДНК-олігонуклеотидів, лише 4 конструкції викликали значне придушення нормального розвитку, а інші 7 олігонуклеотидів не давали якоїнебудь зміни фенотипу, що, ймовірно, обумовлено їх нездатністю інгібувати міРНК, що розглядається. Hutvagner et al. (2004) і Leaman et al. (2005) був описаний альтернативний метод, в якому антисмислові 2'-O-метил-олігонуклеотиди, комплементарні зрілій міРНК, можуть бути використані як сильнодіючі і необоротні інгібітори функції короткої інтерферуючої РНК (кіРНК) і міРНК in vitro та in vivo у Drosophila і С. elegans, а, отже, як індуктори фенотипу, що характеризуються відсутністю таких функцій. Недоліком такого методу є необхідність проведення експериментів з трансфекції та ін'єкції високих концентрацій 2'-O-метилолігонуклеотидів (100 мікромоль), які можуть бути токсичними для тварини. Цей метод був нещодавно застосований у дослідженнях на мишах і включає кон‟югування антисмислових 2'O-метил-олігонуклеотидів, комплементарних чотирьом різним міРНК, з холестерином для сайленсингу РНК in vivo (Krützfedt et al. 2005). Ці так звані антагоністи mir (antagomir) були введені мишам шляхом внутрішньовенних ін'єкцій. Хоча такі експерименти приводили до ефективного сайленсингу ендогенних міРНК in vivo, який, як було виявлено, був специфічним, ефективним і тривалим, однак, головним недоліком такого методу є те, що для ефективного сайленсингу необхідно вводити високу дозу (80 мг/кг) 2'-O-Me-antagomir. Інгібування мікроРНК з використанням LNA-модифікованих олігонуклеотидів було описане у роботах Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033, Lecellier et al. Science 2005, 308, 557-560, Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006 8 (3), 278-84 і Ørum et al. Gene 2006 (доступних он-лайн з 24 лютого 2006). У всіх випадках, LNA-модифіковані олігонуклеотидиантагоністи mir були комплементарні повнорозмірній зрілій мікроРНК, тобто мали довжину у 2023 нуклеотиди, що перешкоджало ефективному поглинанню цих молекул in vivo і їх широкому біологічному розподілу. У роботі Naguibneva (Naguibneva et al. Nature Cell Biology 2006, 8) описане використання змішаного антисмислового олігонуклеотиду «ДНК-LNA-ДНК», направленого проти mir, для інгібування функції мікроРНК miR-181 in vitro, де блок з 8 нуклеотидів LNA розташований у центрі молекули, фланкованої 6 нуклеотидами ДНК біля 5'-кінця і 9 нуклеотидами ДНК біля 3'кінця, відповідно. Головним недоліком такої антисмислової конструкції є її низька стабільність in vivo, обумовлена низькою резистентністю фланкуючих ДНК-кінців до нуклеази. У своїх дослідженнях, Chan et al. (Chan et al. Cancer Research 2005, 65 (14) 6029-6033) і Ørum et al. (Ørum et al. Gene 2006) (доступних он-лайн з 24 лютого 2006), не описують конструювання LNA-модифікованих молекул-антагоністів mir, а Lecellier et al. (Lecellier et al. 2 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Science 2005, 308, 557-560) описують використання геп-мерного антисмислового LNA-ДНК-LNAолігонуклеотиду, що є антагоністом mir, з метою інгібування функцій мікроРНК, де у вказаному олігонуклеотиді, блок з 4 LNA-нуклеотидів розташований біля 5'- і 3'-кінця, відповідно, при цьому, у центрі даної молекули є «вікно» з 13 ДНК-нуклеотидів. Головним недоліком такої антисмислової конструкції є низький рівень поглинання in vivo, а також низька стабільність in vivo, обумовлені присутністю у вказаному олігонуклеотиді-антагоністі mir ДНК-фрагменту з 13 нуклеотидів. Таким чином, необхідність у підвищенні здатності олігонуклеотидів інгібувати мікроРНК залишається актуальною. Опис суті винаходу Даний винахід базується на виявленні того факту, що використання коротких олігонуклеотидів, сконструйованих для високоафінного зв‟язування з міРНК-мішенями, є у високій мірі ефективним для ослаблення репресії мРНК під дією мікроРНК in vivo. Не обмежуючись якою-небудь конкретною теорією, потрібно лише зазначити, що високоефективне націлювання на міРНК in vivo може бути здійснене шляхом конструювання олігонуклеотидів для одержання у високій мірі стабільного дуплексу з міРНК-мішенню in vivo. Це може бути досягнуто з використанням високоафінних нуклеотидних аналогів, таких як, щонайменше, один з LNA-залишків та інших придатних високоафінних аналогів нуклеотидних аналогів, таких як LNA, 2'-MOE-РНК, що складаються з 2'-фтор-нуклеотидних аналогів, а саме, таких як олігонуклеотиди, що складаються з 10-17 або 10-16 нуклеотидних основ. В одному з аспектів, метою винаходу є одержання олігонуклеотиду, що має довжину, недостатню для утворення кіРНК-комплексу (тобто, короткого олігонуклеотиду), і що містить достатню кількість високоафінних нуклеотидних аналогів, завдяки яким такий олігонуклеотид майже завжди зв'язується зі своєю міРНК-мішенню, що приводить до ефективного утворення стабільного і нефункціонального дуплексу з міРНК-мішенню. Авторами даного винаходу було виявлено, що такі конструкції є значно більш ефективними, ніж відомі олігонуклеотиди, а зокрема, геп-мерні і блок-мерні конструкції, і олігонуклеотиди, що мають довгу послідовність, наприклад, 20-23мери. Термін «2'-фтор-ДНК» означає аналог ДНК, в якому у 2'-положенні є заміщення фтором (2'F). Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає олігонуклеотид, що має довжину у 8-17, наприклад, 10-17, а саме 8-16 або 10-16 нуклеотидних залишків, фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад‟ювант, де, щонайменше, один з нуклеотидних залишків одноланцюжкового олігонуклеотиду являє собою високоафінний нуклеотидний аналог, такий як залишок нуклеотидної основи блокованої нуклеїнової кислоти (LNA), і де вказаний одноланцюжковий олігонуклеотид є комплементарним людській послідовності мікроРНК, вибраній з групи, що складається з людських мікро-РНК miR-19b, miR21, miR-122A, miR-155 і miR-375. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає олігонуклеотид, що має довжину у 10-26 нуклеотидів, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад‟ювант, де вказаний олігонуклеотид містить корову ДНК-послідовність у положеннях 2-7 або від положень 3-8, якщо рахувати від 3'-кінця, 3'-acgttt-5' (SEQ ID NO 6, 5'tttgca-3'), де, щонайменше, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три ДНК-залишки у вказаній послідовності були заміщені відповідними нуклеотидами LNA, і де, але необов'язково, вказаний олігонуклеотид не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків ДНК. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає олігонуклеотид, що має довжину у 10-26 нуклеотидів, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад‟ювант, де вказаний олігонуклеотид містить корову ДНК-послідовність у положеннях 2-7 або від положень 3-8, якщо рахувати від 3'-кінця, 3'-ctсаса 5' (SEQ ID NO 7, 5'-acactc 3'), де, щонайменше, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три ДНК-залишки у вказаній послідовності були замінені відповідними залишками LNA, і де вказаний олігонуклеотид, але необов'язково, не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків ДНК. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає олігонуклеотид, що має довжину у 10-26 нуклеотидів, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад‟ювант, де вказаний олігонуклеотид містить корову ДНК-послідовність у положеннях 2-7 або від положень 3-8, якщо рахувати від 3'-кінця, 3'-ttacga 5' (SEQ ID NO 8, 5'-agcatt 3'), де, щонайменше, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три ДНК-залишки у вказаній послідовності були замінені відповідними залишками LNA, і де, але необов'язково, вказаний олігонуклеотид не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків ДНК. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає одноланцюжковий олігонуклеотид, що має довжину у 10-26 нуклеотидів, і фармацевтично прийнятний 3 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розріджувач, носій або ад‟ювант, де вказаний олігонуклеотид містить корову ДНК-послідовність у положеннях 2-7 або від положень 3-8, якщо рахувати від 3'-кінця, 3'-acaagc 5' (SEQ ID NO 9, 5'-cgaaca 3'), де, щонайменше, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три ДНК-залишки у вказаній послідовності були замінені відповідними нуклеотидами LNA, і де вказаний олігонуклеотид, необов'язково, не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків ДНК. Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає одноланцюжковий олігонуклеотид, що має довжину у 10-26 нуклеотидів, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад‟ювант, де вказаний олігонуклеотид містить корову ДНК-послідовність у положеннях 2-7 або від положень 3-8, якщо рахувати від 3'-кінця, 3'-cgaata 5' (SEQ ID NO 10, 5'-ataagc 3') де, щонайменше, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три ДНК-залишки у вказаній послідовності були заміщені відповідними залишками LNA, і де вказаний олігонуклеотид, необов'язково, не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків ДНК. Високоафінними нуклеотидними аналогами є нуклеотидні аналоги, що утворюють олігонуклеотид, який, у випадку, якщо він утворює дуплекс з комплементарним нуклеотидом РНК, має більш високу термостабільність, ніж у випадку його афінного зв‟язування з еквівалентним нуклеотидом ДНК. Таку властивість звичайно визначають шляхом вимірювання T m. Автори даного винаходу, при використанні вказаних коротких високоафінних олігонуклеотидів, направлених проти специфічних міРНК, не виявили яких-небудь небажаних ефектів. Дійсно, дані, наведені у даній заявці, вказують на те, що вплив на експресію мРНК обумовлений присутністю послідовності, комплементарної міРНК-мішені (первинній мРНКмішені), в мРНК, або вторинною дією на мРНК, які регулюються первинними мРНК-мішенями (вторинними мРНК-мішенями). При цьому, не було виявлено якої-небудь токсичної дії, що вказувало на відсутність яких-небудь явних негативних побічних ефектів. Даний винахід також стосується застосування олігонуклеотиду відповідно до винаходу, такого як олігонуклеотид, який може утворювати частину фармацевтичної композиції, з метою приготування лікарського засобу для лікування захворювання або патологічного розладу, асоційованого з присутністю або з надекспресією (активацією) мікроРНК. Даний винахід також стосується способу лікування захворювання або патологічного розладу, асоційованого з присутністю або з надекспресією мікроРНК, де вказаний спосіб включає стадію введення композиції (такої як фармацевтична композиція) відповідно до винаходу індивідууму, який потребує такого лікування. Даний винахід також стосується способу зниження ефективної кількості міРНК у клітині або в організмі, що включає введення композиції (такої як фармацевтична композиція) відповідно до винаходу або одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу у вказану клітину або у вказаний мікроорганізм. У контексті даного опису, зниження ефективної кількості означає зниження кількості функціональної міРНК, присутньої у даній клітині або у даному організмі. При цьому потрібно зазначити, що переважні олігонуклеотиди відповідно до винаходу не завжди можуть значно знижувати фактичну кількість міРНК, присутньої у клітині або в організмі, оскільки вони звичайно утворюють у високій мірі стабільні дуплекси зі своїми міРНК-мішенями. Даний винахід також стосується способу дерепресії мРНК-мішені для міРНК у клітині або організмі, що включає введення композиції (такої як фармацевтична композиція) або одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу у клітину або організм. Даний винахід також стосується використання одноланцюжкового олігонуклеотиду довжиною у 8-16, наприклад, 10-16 нуклеотидних основ з метою приготування лікарського препарату для лікування захворювання або розладу, асоційованого з присутністю або з надекспресією мікроРНК. Даний винахід також стосується способу лікування захворювання або патологічного розладу, асоційованого з присутністю або з надекспресією мікроРНК, де вказаний спосіб включає введення композиції (такої як фармацевтична композиція), що містить одноланцюжковий олігонуклеотид довжиною у 8-16, наприклад, 10-16 нуклеотидних основ індивідууму, який потребує такого лікування. Даний винахід також стосується способу зниження ефективної кількості міРНК-мішені (тобто, кількості міРНК, яка є достатньою для інгібування мРНК-мішеней) у клітині або в організмі, де вказаний спосіб включає введення композиції (такої як фармацевтична композиція), що містить одноланцюжковий олігонуклеотид довжиною у 8-16, наприклад, 10-16 нуклеотидних основ у клітину або організм. 4 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід також стосується способу дерепресії мРНК-мішені для міРНК у клітині або організмі, що включає введення одноланцюжкового олігонуклеотиду довжиною у 8-16, наприклад, 10-16 нуклеотидних основ (або композиції, що містить вказаний олігонуклеотид) у клітину або в організм. Даний винахід також стосується способу синтезу одноланцюжкового олігонуклеотиду, направленого проти людської мікро-РНК, вибраної з групи, що складається з людських мікроРНК miR-19b, miR-21, miR-122A, miR-155 і miR-375, такого як описаний тут одноланцюжковий олігонуклеотид, де вказаний спосіб включає стадії: a. необов'язкового вибору першої, рахуючи з 3'-кінця, нуклеотидної основи, яка являє собою нуклеотидний аналог, такий як нуклеотидна основа LNA; b. необов'язкового вибору другої, рахуючи з 3'-кінця, нуклеотидної основи, яка являє собою нуклеотидний аналог, такий як нуклеотидна основа LNA; с. вибору області одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка відповідає унікальній області (seed-області) міРНК, де вказана область визначена у даній заявці; d. необов'язкового вибору сьомої і восьмої нуклеотидної основи, визначеної у даній заявці; е. необов'язкового вибору 1-10 додаткових нуклеотидних основ, які можуть бути вибрані з групи, що складається з нуклеотидів (х) і нуклеотидних аналогів (X), таких як LNA; f. необов'язкового вибору 5'-області одноланцюжкового олігонуклеотиду, визначеного у даній заявці; g. необов'язкового вибору 5'-кінцевого одноланцюжкового олігонуклеотиду, визначеного у даній заявці. Якщо вказаний синтез здійснюють шляхом послідовного приєднання областей, визначених у стадіях а-g, то цей синтез може бути проведений або у напрямі 3'-5' (a-g), або у напрямі 5'-3' (g-a), де вказаний одноланцюжковий олігонуклеотид є комплементарним послідовності міРНКмішені. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу конструюють так, щоб він не піддавався зв‟язуванню під дією RISC або не міг опосередковувати RISCнаправлене розщеплення міРНК-мішені. При цьому, вважається, що при використанні довгих олігонуклеотидів, наприклад, 21- або 22-мерів, а зокрема, РНК-олігонуклеотидів або РНКолігонуклеотидів-“аналогів”, які комплементарні міРНК-мішені, вказаний олігонуклеотид може конкурувати з мРНК-мішенню за зв‟язування з RISC-комплексом, і тим самим ослаблювати репресію мРНК, що є мішенню для міРНК, за допомогою включення олігонуклеотиду, який конкурує як субстрат за зв‟язування з міРНК. Однак, даний винахід був розроблений для попередження такого небажаного розщеплення мРНК-мішені або інгібування її трансляції шляхом створення олігонуклеотидів, здатних до комплементарного, а, у деяких випадках, ймовірно, майже до необоротного їх зв‟язування зі зрілою мікроРНК. Це, очевидно, приводить до запуску механізму захисту від деградації або розщеплення (наприклад, під дією RISC або РНКази Н або інших ендо- або екзо-нуклеаз), і такий запуск не може приводити до значного або навіть значимого зниження рівнів міРНК у клітині (наприклад, як було визначено за допомогою нозерн-блот-аналізу, що проводиться з використанням LNA-зондів), але гарантує значне зниження ефективної кількості міРНК, як було визначено в аналізі на дерепресію. Тому, в одному зі своїх аспектів, даний винахід стосується олігонуклеотидів, які були спеціально сконструйовані так, щоб вони були несумісні з RISCкомплексом, і щоб міРНК можна було видаляти шляхом титрування олігонуклеотидом. Не обмежуючись якою-небудь конкретною теорією, що пояснює причину такої ефективності олігонуклеотидів відповідно до винаходу, можна лише зазначити, що, якщо провести аналогію з РНК-олігонуклеотидами (або повнорозмірними 2'OMe-олігонуклеотидами), то стає очевидним, що олігонуклеотиди відповідно до винаходу діють за механізмом неконкурентного інгібування функції міРНК, оскільки вони ефективно видаляють наявну міРНК з цитоплазми, тоді як відомі олігонуклеотиди є альтернативними субстратами для міРНК, які можуть діяти як конкурентні інгібітори, ефективність яких повинна у високій мірі залежати від концентрації олігонуклеотиду у цитоплазмі, а також від концентрації мРНК- і міРНК-мішені. Не обмежуючись якою-небудь конкретною теорією, потрібно зазначити, що ще однією проблемою, яка може виникати у випадку використання олігонуклеотидів, що мають довжину, приблизно аналогічну довжині міРНК-мішеней (тобто, міРНК), є те, що ці олігонуклеотиди можуть утворювати кіРНК-подібний дуплекс з міРНК-мішенню, а це приводить до зниження ефективності олігонуклеотиду. Можливо також, що самі олігонуклеотиди можуть бути використані як ведучий ланцюг у RISC-комплексі, внаслідок чого виникає можливість здійснення RISC-направленої деградації неспецифічних мішеней, які випадково можуть бути досить комплементарними «ведучому» олігонуклеотиду. 5 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ці проблеми можна вирішити шляхом вибору коротких олігонуклеотидів для націлювання на послідовності міРНК. Короткі олігонуклеотиди, які включають LNA, відомі фахівцям, працюючим з такими реагентами, як LNA (див., наприклад, WO 2005/098029 і WО 2006/069584). Однак, молекули, призначені для їх використання з метою діагностики або як реагенти, за своєю конструкцією сильно відрізняються від олігонуклеотидів, що використовуються у фармацевтичних цілях. Так, наприклад, кінцевими нуклеотидними основами цих олігонуклеотидних реагентів звичайно є ДНК, а не LNA, а міжнуклеозидними зв'язками звичайно є інші, нефосфортіоатні зв'язки, тобто зв'язки, які не є переважними для використання в олігонуклеотидах відповідно до винаходу. Тому, даний винахід, по суті, стосується нового класу олігонуклеотидів. Даний винахід також стосується (одноланцюжкового) олігонуклеотиду, описаного у розділі, присвяченому фармацевтичній композиції відповідно до винаходу, де вказаний олігонуклеотид включає: (i) щонайменше, один фосфортіоатний зв'язок і/або (ii) щонайменше, один 3'-кінцевий залишок LNA, і/або (iii) щонайменше, один 5'-кінцевий залишок LNA. Для більшості терапевтичних застосувань, переважно, щоб олігонуклеотид був повністю фосфортіолований, за винятком терапевтичних олігонуклеотидів, що застосовуються для лікування захворювань ЦНС, таких як захворювання головного мозку або хребта, де таке фосфортіолування може бути токсичним, що обумовлено відсутністю нуклеаз, при цьому фосфордіефірні зв'язки можуть бути використані навіть між суміжними ДНК-залишками. Як вказується у даній заявці, відповідно до інших переважних аспектів винаходу, олігонуклеотидом відповідно до винаходу є олігонуклеотид, в якому друга нуклеотидна основа і/або 9-а і 10-а нуклеотидні основи (від 3'-кінця) можуть також являти собою LNA. Авторами даного винаходу було виявлено, що можуть бути також застосовані й інші методи запобігання розщепленню РНК (такому як деградація під дією екзонуклеаз у сироватці крові або RISC-асоційоване розщеплення олігонуклеотиду відповідно до винаходу), а тому даний винахід також стосується одноланцюжкового олігонуклеотиду, який містить: a. залишок LNA у положенні 1 і 2 від 3'-кінця і/або b. залишок LNA у положеннях 9 і/або 10, також рахуючи від 3'-кінця, і/або с. будь-який один або два залишки 5'-LNA. Хоча переваги вказаних інших аспектів можна продемонструвати на прикладі більш довгих олігонуклеотидів, таких як нуклеотиди довжиною до 26 нуклеотидних основ, однак, беручи до уваги вказані відмітні ознаки, можна також використовувати і більш короткі олігонуклеотиди, описані у даній заявці, такі як олігонуклеотиди, що мають 8-17, 8-16, 10-17 або 10-16 нуклеотидних основ. Особливо переважно, щоб олігонуклеотиди містили високоафінні нуклеотидні аналоги, такі як аналоги, описані у даній заявці, а найбільш переважно, залишки LNA. Авторами даного винаходу було несподівано виявлено, що правильно сконструйовані одноланцюжкові олігонуклеотиди, що містять залишки блокованої нуклеїнової кислоти (LNA) у визначеному порядку, грають важливу роль у сайленсингу мікроРНК, що приводить до зниження рівнів мікроРНК. Було виявлено, що важливе значення має жорстке зв‟язування вказаних олігонуклеотидів з так званою унікальною (seed) послідовністю мікроРНК-мішеней у положеннях нуклеотидів 2-8 або 2-7 від 5'-кінця. Нуклеотид 1 мікроРНК-мішеней являє собою основу, що не спарюється, і, ймовірно, приховану у зв'язувальному кармані білка Ago 2. Не висловлюючи якої-небудь конкретної теорії, автори даного винаходу лише зазначають, що за допомогою відбору послідовностей унікальної області, а зокрема, області, що включає олігонуклеотиди, які містять LNA, а переважно, залишки LNA в області, комплементарній унікальній області, тобто, де дуплекс, утворений між міРНК і олігонуклеотидом, є особливо ефективним для націлювання на міРНК, можна уникнути виникнення побічних ефектів, і надавати олігонуклеотиду іншу відмітну властивість, яка дозволяла б запобігати RISCнаправленій дії на міРНК. Авторами даного винаходу було несподівано виявлено, що сайленсинг мікроРНК може виявитися навіть ще більш сильним у тому випадку, якщо LNA-модифіковані одноланцюжкові олігонуклеотиди не містять нуклеотиду біля 3'-кінця, відповідного даному неспареному нуклеотиду 1. Було також виявлено, що два залишки LNA біля 3'-кінця олігонуклеотидів відповідно до винаходу надають вказаним олігонуклеотидам високий рівень резистентності до нуклеази. Було також виявлено, що олігонуклеотиди відповідно до винаходу, які мають, щонайменше, один нуклеотидний аналог, такий як нуклеотид LNA у положеннях, що відповідають 6 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 положенням 10 і 11 від 5'-кінця мікроРНК-мішені, можуть попереджувати розщеплення олігонуклеотидів відповідно до винаходу. Відповідно до цього, в одному зі своїх аспектів, даний винахід стосується олігонуклеотиду, що має довжину від 12 до 26 нуклеотидів, де: i) перший нуклеотид, від 3'-кінця, являє собою залишок блокованої нуклеїнової кислоти (LNA); ii) другий нуклеотид, від 3'-кінця, являє собою залишок LNA; і iii) дев'ятий і/або десятий нуклеотиди, від 3'-кінця, являють собою залишок LNA. Даний винахід також стосується визначених тут олігонуклеотидів, які можуть бути використані як лікарський засіб. Даний винахід також стосується композицій, що містять визначені тут олігонуклеотиди і фармацевтично прийнятний носій. Як згадувалося вище, мікроРНК асоціюються з розвитком ряду захворювань. Отже, у своєму четвертому аспекті, даний винахід стосується застосування визначеного тут олігонуклеотиду з метою одержання лікарського засобу для лікування захворювань, асоційованих з експресією мікроРНК, і вибраних з групи, що складається з атрофії м'язів хребта, синдрому Туретта, захворювання, що викликається вірусом гепатиту С, розумової відсталості, тобто синдрому «ламкої» Х-хромосоми, синдрому Ді Георге і раку, такого як хронічний лімфоцитарний лейкоз, рак молочної залози, рак легенів і рак товстої кишки. В іншому своєму аспекті, даний винахід стосується способу зниження рівнів мікроРНКмішені, який включає контактування мікроРНК-мішені з визначеним тут олігонуклеотидом, де вказаний олігонуклеотид: 1. є комплементарним мікроРНК-мішені 2. не містить нуклеотиду біля 3'-кінця, що відповідає першому нуклеотиду біля 5'-кінця мікроРНК-мішені. Даний винахід також стосується олігонуклеотиду, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 82, SEQ ID NO 83, SEQ ID NO 84, SEQ ID NO 85, SEQ ID NO 86, SEQ ID NO 87, SEQ ID NO 88 і SEQ ID NO 89; де малі букви означають азотисті основи залишку ДНК, а великі букви означають азотисті основи залишку LNA, і де цитозини LNA є, але необов'язково, метильованими, або його кон‟югату. Даний винахід також стосується олігонуклеотиду, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 90, SEQ ID NO 91, SEQ ID NO 92, SEQ ID NO 93, SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96, SEQ ID NO 97, SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100 і SEQ ID NO 101; де малі букви означають азотисті основи залишку ДНК, а великі букви означають азотисті основи залишку LNA, і де цитозини LNA є, але необов'язково, метильованими, або його кон‟югату. Даний винахід також стосується олігонуклеотиду, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 102, SEQ ID NO 103, SEQ ID NO 104 і SEQ ID NO 105; де малі букви означають азотисті основи залишку ДНК, а великі букви означають азотисті основи залишку LNA, і де цитозини LNA є, але необов'язково, метильованими, або його кон‟югату. Даний винахід також стосується олігонуклеотиду, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48, SEQ ID NO 49, SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ IDNO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO 106, SEQ ID NO 107, SEQ ID NO 108 і SEQ ID NO 109; де малі букви означають азотисті основи залишку ДНК, а великі букви означають азотисті основи залишку LNA, і де цитозини LNA є, але необов'язково, метильованими, або його кон‟югату. Даний винахід також стосується олігонуклеотиду, який містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 66, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 68, і SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 43, SEQ ID NO 44, SEQ ID NO 45 і SEQ ID NO 46, де малі букви означають азотисті основи залишку ДНК, а великі букви означають азотисті основи залишку LNA, і де цитозини LNA є, але необов'язково, метильованими, або його кон‟югату. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид може мати нуклеотидну послідовність з 1-17 нуклеотидних основ, наприклад, з 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 нуклеотидних основ, і у 7 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такому варіанті винаходу олігонуклеотидні основи можуть складати безперервну підпослідовність в описаних тут олігонуклеотидах. Авторами даного винаходу було несподівано виявлено, що антисмислові олігонуклеотиди визначеної довжини, що містять конкретну корову ДНК-послідовність і блоковані нуклеїнові кислоти (LNA) у вказаній коровій послідовності, мають чудові мікроРНК-інгібуючі властивості. Короткий опис графічного матеріалу Фіг. 1. Вплив обробки різними LNA-олігонуклеотидами, направленими проти miR, на експресію нуклеїнової кислоти-мішені в miR-122a-експресуючій клітинній лінії Huh-7. Вказані також кількості miR-122a (в умовних одиницях), одержані внаслідок проведення miR-122aспецифічної кількісної ЗТ-ПЛР, у порівнянні з необробленими клітинами (контроль). LNAолігонуклеотиди, направлені проти miR, були використані у двох концентраціях, 1 і 100 нМ, відповідно. Був також включений контроль з невідповідностями (SPC3350) у порівнянні з SPC3349 (також позначений тут SPC3549). Фіг. 2. Оцінка дозозалежного інгібування нуклеїновою кислотою LNA проти miR122a, SPC3548 і SPC3549, у порівнянні з SPC3372, де вказану оцінку проводили in vivo у мишачій печінці за допомогою miR-122a-специфічної ЗТ-ПЛР у режимі реального часу. Фіг. 2b. Рівні miR-122 у мишачій печінці після обробки різними LNA, направленими проти miR (LNA-antimiR). Молекули LNA-antimiR, SPC3372 і SPC3649, вводили здоровим мишам за допомогою трьох i.p.-ін'єкцій через день протягом шести днів у вказаних дозах, і мишей умертвляли через 48 годин після введення останньої дози. Повнорозмірну РНК екстрагували з мишачої печінки, а рівні miR-122 визначали за допомогою miR-122-специфічної кількісної ПЛР. Фіг. 3. Оцінка рівнів холестерину у плазмі у мишей, оброблених LNA проти miR-122a, у порівнянні з рівнями холестерину у контрольних мишей, яким вводили фізіологічний розчин. Фіг. 4a. Оцінка відносних рівнів мРНК Bckdk у мишей, оброблених LNA проти miR-122a, у порівнянні з рівнями у контрольних мишей, яким вводили фізіологічний розчин, де вказану оцінку проводили за допомогою кількісної ЗТ-ПЛР у реальному часі. Фіг. 4b. Оцінка відносних рівнів мРНК альдолази А у мишей, оброблених LNA проти miR122a, у порівнянні з рівнями у контрольних мишей, яким вводили фізіологічний розчин, де вказану оцінку проводили за допомогою кількісної ЗТ-ПЛР у реальному часі. Фіг 4c. Оцінка відносних рівнів мРНК GAPDH у мишей, оброблених LNA проти miR-122a (тварини 4-30), у порівнянні з рівнями у контрольних мишей, яким вводили фізіологічний розчин (тварини 1-3), де вказану оцінку проводили за допомогою кількісної ЗТ-ПЛР у реальному часі. ТМ Фіг. 5. Оцінка дозозалежного інгібування miR -122a нуклеїновою кислотою LNA, що проводиться in vivo у мишачій печінці за допомогою miR-122a-специфічної ЗТ-ПЛР у режимі реального часу. Шість груп тварин (5 мишей на групу) обробляли наступним чином. Тваринам групи 1 вводили i.v. 0,2 мл фізіологічного розчину кожного дня протягом 3 днів, тваринам групи 2 вводили 2,5 мг/кг SPC3372, тваринам групи 3 вводили 6,25 мг/кг SPC3372, тваринам групи 4 вводили 12,5 мг/кг SPC3372, тваринам групи 5 вводили 25 мг/кг SPC3372, а тваринам групи 6 вводили 25 мг/кг SPC3373 (олігонуклеотиду LNA проти miR™ з невідповідними основами), де кожну ін'єкцію вводили одним і тим же способом. Цей експеримент повторювали (n=10) і результати об'єднували. Фіг. 6. Проводили порівняння нозерн-блотів SPC3649 і SPC3372. Повнорозмірну РНК від однієї миші у кожній групі піддавали miR-122-специфічному нозерн-блотингу. Показані зрілий miR-122 і дуплекс (блокованої мікроРНК), утворений між LNA-antimiR і miR-122. Фіг. 7. Мишей обробляли 25 мг/кг/день LNA-antimiR або фізіологічним розчином кожного дня протягом трьох днів і умертвляли через 1, 2 або 3 тижні після введення останньої дози. Включені також значення, одержані для тварин, яких умертвили через 24 години після введення останньої дози (приклад 11, «стара конструкція»). Рівні miR-122 оцінювали за допомогою кількісної ПЛР і нормалізували за середнім значенням, одержаним для групи мишей, яким вводили фізіологічний розчин у кожний вибраний момент часу. Включені також значення, одержані для тварин, яких умертвили через 24 години після введення останньої дози (вказано середнє і середньоквадратична помилка, n=7, 24 год., n=10). Умертвіння на дні 9, 16 або 23 відповідає умертвінню через 1, 2 або 3 тижні після введення останньої дози. Фіг. 8. Мишей обробляли 25 мг/кг/день LNA-antimiR або фізіологічним розчином кожного дня протягом трьох днів і умертвляли через 1, 2 або 3 тижні після введення останньої дози. Включені також значення, одержані для тварин, яких умертвили через 24 години після введення останньої дози (приклад 11, «стара конструкція»). Вимірювали рівень холестерину у плазмі і нормалізували за значенням, одержаним для групи мишей, яким вводили фізіологічний розчин у кожний вибраний момент часу (вказано середнє і середньоквадратична помилка, n=7, 24 год., n=10). 8 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 9. Дозозалежне індукування мРНК, що є мішенню для miR-122a, шляхом інгібування miR-122a під дією SPC3372. Мишей обробляли різними дозами SPC3372 кожного дня протягом трьох днів, як описано вище, і умертвляли через 24 години після введення останньої дози. Повнорозмірну РНК, екстраговану з печінки, піддавали кількісній ПЛР. Гени, які мали передбачений сайт-мішень для miR-122 і активувалися, як спостерігалося в аналізі, що проводиться на мікромасивах, оцінювали за допомогою кількісної ПЛР на дозозалежне індукування шляхом збільшення доз SPC3372. Повнорозмірну РНК печінки, взяту від 2-3 мишей на групу, яких умертвили через 24 години після введення останньої дози, піддавали кількісній ПЛР для вказаних генів. На фіг. 9 показані рівні мРНК у порівнянні з рівнями мРНК у тварин у групі, якій вводили фізіологічний розчин, n=2-3 (2,5-12,5 мг/кг/день: n=2, без середньоквадратичної помилки). Показаний також контроль з невідповідностями (mm, SPC3373). Фіг. 10. Тимчасове індукування мРНК-мішеней для miR-122a-мішені після обробки молекулою SPC3372. Самок мишей NMRI обробляли 25 мг/кг/день SPC3372, а контрольним тваринам вводили фізіологічний розчин кожного дня протягом трьох днів, і умертвляли через 1, 2 або 3 тижні після введення останньої дози, відповідно. РНК екстрагували з печінки, і рівні передбачених мРНК, які є мішенню для miR-122a, і які були відібрані, виходячи з даних аналізу на мікромасивах, оцінювали за допомогою кількісної ПЛР. Було проаналізовано по три тварини від кожної групи. Фіг. 11. Індукування Vldlr у печінці шляхом SPC3372-обробки. Ті ж самі зразки РНК печінки, які були використані у попередньому прикладі (Фіг. 10), оцінювали на індукування Vldlr. Фіг. 12. Стабільність дуплексу miR-122a/SPC3372 у плазмі мишей. Стабільність SPC3372 і дуплексу SPC3372/miR-122a аналізували у плазмі мишей при 37°С протягом 96 годин. На фіг. 12 проілюстрований електрофорез у ПААГ, забарвленому SYBR-золотом. Фіг. 13. Секвестрація зрілої miR-122a під дією SPC3372 приводить до утворення дуплексу. На фіг. 13 показана мембрана, зондована miR-122a-специфічним зондом (верхня панель) і повторно зондована Let-7-специфічним зондом (нижня панель). З використанням miR-122специфічного зонду було детектовано дві смуги, де одна смуга відповідала зрілій miR-122, а інша смуга відповідала дуплексу, утвореному між SPC3372 і miR-122. Фіг. 14. Секвестрацію miR-122a під дією SPC3372, а також розподіл SPC3372 оцінювали за допомогою in situ гібридизації зрізів печінки. На фігурі наведені кріозрізи печінки оброблених тварин. Фіг. 15. Експресія генів печінки у мишей, оброблених LNA проти miR-122. Мишей, оброблених фізіологічним розчином і LNA-antimiR, порівнювали за профілем експресії всього геному за допомогою програм типу масивів Affymetrix Mouse Genome 430 2.0. (a,1) Показаний ряд зондів, які відображають диференціальну експресію у зразках печінки мишей, оброблених LNA проти miR-122 і фізіологічним розчином, через 24 години після обробки. (b,2) Показана присутність унікальної послідовності (послідовності-“зерна” або seed-послідовності) miR-122 у генах, що диференціально експресуються. На графіку вказаний процентний вміст транскриптів, щонайменше, з однією унікальною послідовністю розпізнавання miR-122 в їх 3'UTR. Рандомізація: були генеровані довільні послідовності, які були досліджені на присутність унікальних послідовностей розпізнавання miR-122. Представлені профілі тимчасової експресії генів у печінці у мишей, оброблених LNA-antimiR. Мишей обробляли 25 мг/кг/день LNA-antimiR, а контрольним тваринам протягом трьох днів вводили фізіологічний розчин кожного дня, і через 1, 2 або 3 тижні після введення останньої дози умертвляли. Включені також величини, одержані від тварин, яких умертвили через 24 години після введення останньої дози. (с,3) РНКзразки, одержані у різні проміжки часу, також аналізували на профілі експресії. Ієрархічний кластерний аналіз профілів експресії генів, ідентифікованих як диференціально експресовані гени, проводили у мишей, оброблених LNA проти miR, і у мишей, оброблених фізіологічним розчином, через 24 години, через один тиждень або через три тижні після обробки. (d,4) Під час всього експерименту, у мишей, оброблених LNA-antimiR, і у мишей, оброблених фізіологічним розчином, проводили моніторинг профілів експресії генів, ідентифікованих як гени, що диференціально експресуються. Під час всього експерименту, співвідношення рівнів експресії генів, що активуються та інгібуються, у мишей, оброблених LNA-antimiR, становило приблизно 1, що вказувало на оборотний ефект обробки LNA-antimiR. Фіг. 16. Вплив обробки молекулами SPC3372 і 3595 на рівні miR-122 у мишачій печінці. Фіг. 17. Вплив обробки молекулами SPC3372 і 3595 на рівні альдолази А у мишачій печінці. Фіг. 18. Вплив обробки молекулами SPC3372 і 3595 на рівні Bckdk у мишачій печінці. Фіг. 19. Вплив обробки молекулами SPC3372 і 3595 на рівні CD320 у мишачій печінці. Фіг. 20. Вплив обробки молекулами SPC3372 і 3595 на рівні Ndrg3 у мишачій печінці. 9 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 21. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на загальний рівень холестерину у плазмі у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Проби плазми крові брали щотижня у мишей, оброблених молекулою SPC3649, і у контрольних мишей, оброблених фізіологічним розчином, а потім проводили оцінку загального рівня холестерину у плазмі. Мишей обробляли 5 мг/кг SPC3649, SPC3744 або фізіологічного розчину два рази на тиждень. Одночасно проводили обробку нормальних мишей. Фіг. 22. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на рівні miR-122 у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Фіг. 23. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на рівні альдолази А у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Фіг. 24. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на рівні Bckdk у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Фіг. 25. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на рівні AST у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Фіг. 26. Вплив тривалої обробки молекулою SPC3649 на рівні ALT у мишей з гіперхолестеринемією і у нормальних мишей. Фіг. 27. Модуляція реплікації HCV під дією SPC3649 у клітинній моделі Huh-7. Нозерн-блотаналіз РНК HCV у клітинах Huh-7 після трансфекції різними молекулами LNA проти miR (SPC3648, SPC3649 і SPC3550) і 2'-OMe-молекулами-антагоністами miR-122 (верхня панель). Інтенсивність сигналів гібридизації кількісно оцінювали і нормалізували за сигналами мРНК спектрину на кожній доріжці (нижня панель). Фіг. 28. Функціональна дерепресія репресованої люциферази корала (Renilla) під дією miR19b-блокуючих олігонуклеотидів у клітинній лінії Hela, що ендогенно експресує miR-19b. «miR19b-мішень» являє собою плазміду, що містить miR-19b-мішень, але не ко-трансфіковану олігонуклеотидом, що блокує miR-19b, а тому вона представляє miR-19b, яка повністю придушує експресію люциферази Renilla. Фіг. 29. Функціональна дерепресія репресованої люциферази корала (Renilla) під дією miR122-блокуючих олігонуклеотидів у клітинній лінії Huh-7, що ендогенно експресує miR-122. «miR122-мішень» являє собою відповідну плазміду, що містить miR-122-мішень, але не котрансфіковану олігонуклеотидом, що блокує miR-122, а тому вона представляє miR-122, яка повністю придушує експресію люциферази Renilla. Фіг. 30. Діаграма, що ілюструє вирівнювання олігонуклеотиду відповідно до винаходу і мікроРНК-мішені. Докладний опис винаходу Олігонуклеотид відповідно до винаходу звичайно є одноланцюжковим. Тому, потрібно зазначити, що відповідно до даного винаходу, термін «олігонуклеотид» може бути синонімом терміну «одноланцюжковий олігонуклеотид». В одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується фармацевтичних композицій, що містять короткі (одноланцюжкові) олігонуклеотиди довжиною у 8-17 нуклеотидних основ, наприклад, 10-17 нуклеотидних основ, комплементарних людським мікроРНК. Короткі олігонуклеотиди особливо ефективно сприяють придушенню міРНК in vivo. Було виявлено, що включення високоафінних нуклеотидних аналогів в олігонуклеотиди приводить до утворення високоефективних молекул, які придушують мікроРНК і, очевидно, діють за допомогою утворення майже необоротних дуплексів з міРНК-мішенню, а не за допомогою механізмів на основі розщеплення РНК, таких як механізми, асоційовані з дією РНКази Н або RISC. При цьому, особливо переважно, щоб одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу містив область з послідовності суміжних нуклеотидних основ, яка на 100% комплементарна людській унікальній області мікроРНК. Переважно, щоб одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу був комплементарним зрілій людській послідовності мікроРНК. Переважні олігонуклеотиди відповідно до винаходу комплементарні послідовності мікроРНК, вибраній з групи, що складається з hsa-miR19b, hsa-miR21, hsa-miR122, hsa-miR142 a7b, hsa-miR155, hsa-miR375. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить нуклеотидної основи біля 3'-кінця, що відповідає першому 5'-кінцевому нуклеотиду мікроРНКмішені. В одному з варіантів винаходу, першою нуклеотидною основою одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. 10 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів винаходу, другою нуклеотидною основою одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, дев'ятим і/або десятим нуклеотидом одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, дев'ятою нуклеотидною основою одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, десятою нуклеотидною основою одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, дев'ятою і десятою нуклеотидною основою одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу, якщо рахувати від 3'-кінця, є нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 5 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 6 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 7 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 8 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 3 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 2 суміжних нуклеотидних залишків ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид містить, щонайменше, область, що складається, щонайменше, з двох суміжних залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, двох суміжних залишків LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид містить, щонайменше, область, що складається, щонайменше, з трьох суміжних залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, трьох суміжних залишків LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 7 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 6 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 5 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 4 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 3 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не містить область з більш ніж 2 суміжних залишків нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA. В одному з варіантів винаходу, перша або друга 3'-нуклеотидна основа одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідає другому 5'-нуклеотиду послідовності мікроРНК. В одному з варіантів винаходу, залишки нуклеотидних основ 1-6 (включно) одноланцюжкового олігонуклеотиду від 3'-кінця області одноланцюжкового олігонуклеотиду комплементарні послідовності унікальної області мікроРНК. В одному з варіантів винаходу, залишки нуклеотидних основ 1-7 (включно) одноланцюжкового олігонуклеотиду від 3'-кінця області одноланцюжкового олігонуклеотиду комплементарні послідовності унікальної області мікроРНК. В одному з варіантів винаходу, залишки нуклеотидних основ 2-7 (включно) одноланцюжкового олігонуклеотиду від 3'-кінця області одноланцюжкового олігонуклеотиду комплементарні послідовності унікальної області мікроРНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, один залишок нуклеотидного аналога, такий як, щонайменше, один залишок LNA, у положенні, яке знаходиться в області, комплементарній унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид може включати 1-6 або 1-7 залишків 11 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеотидних аналогів, наприклад, 1-6 і 1-7 залишків LNA у положенні, яке знаходиться в області, комплементарній унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з (X)Xxxxxx, (X)xXxxxx, (X)xxXxxx, (X)xxxXxx, (X)xxxxXx і (X)xxxxxX, розташованих у напрямі 3'-5', де «X» означає нуклеотидний аналог, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, два залишки нуклеотидного аналога, такі як, щонайменше, два залишки LNA, у положеннях, комплементарних унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з (X)XXxxxx, (X)XxXxxx, (X)XxxXxx, (X)XxxxXx, (X)XxxxxX, (X)xXXxxx, (X)xXxXxx, (X)xXxxXx, (X)xXxxxX, (X)xxXXxx, (X)xxXxXx, (X)xxXxxX, (X)xxxXXx, (X)xxxXxX і (X)xxxxXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, три залишки нуклеотидного аналога, такі як, щонайменше, три залишки LNA, у положеннях, комплементарних унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з (X)XXXxxx, (X)xXXXxx, (X)xxXXXx, (X)xxxXXX, (X)XXxXxx, (X)XXxxXx, (X)XXxxxX, (X)xXXxXx, (X)xXXxxX, (X)xxXXxX, (X)XxXXxx, (X)XxxXXx, (X)XxxxXX, (X)xXxXXx, (X)xXxxXX, (X)xxXxXX, (X)xXxXxX і (X)XxXxXx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, чотири залишки нуклеотидного аналога, такі як, щонайменше, чотири залишки LNA, у положеннях, комплементарних унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з (X)xxXXX, (X)xXxXXX, (X)xXXxXX, (X)xXXXxX, (X)xXXXXx, (X)XxxXXXX, (X)XxXxXX, (X)XxXXxX, (X)XxXXx, (X)XXxxXX, (X)XXxXxX, (X)XXxXXx, (X)XXXxxX, (X)XXXxXx, і (X)XXXXxx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, п'ять залишків нуклеотидного аналога, такі як, щонайменше, п'ять залишків LNA, у положеннях, комплементарних унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX і (X)XXXXXx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає шість або сім залишків нуклеотидного аналога, такі як, шість або сім залишків LNA, у положеннях, комплементарних унікальній області міРНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидна послідовність одноланцюжкового олігонуклеотиду, яка є комплементарною послідовності унікальної області мікроРНК, вибрана з групи, що складається з XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX і XXXXXXx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, мотив з двох нуклеотидних основ у положеннях 7-8, якщо рахувати від 3'-кінця одноланцюжкового олігонуклеотиду, вибраний з групи, що складається з xx, XX, xX і Xx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. 12 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному з варіантів винаходу, мотив з двох нуклеотидних основ у положеннях 7-8, якщо рахувати від 3'-кінця одноланцюжкового олігонуклеотиду, вибраний з групи, що складається з XX, xX і Xx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 12 нуклеотидних основ, де мотив з двох нуклеотидних основ у положеннях 11-12, якщо рахувати від 3'-кінця, одноланцюжкового олігонуклеотиду, вибраний з групи, що складається з xx, XX, xX і Xx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 12 нуклеотидних основ, де мотив з двох нуклеотидних основ у положеннях 11-12, якщо рахувати від 3'-кінця, одноланцюжкового олігонуклеотиду, вибраний з групи, що складається з XX, xX і Xx, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 13 нуклеотидних основ, де мотив з трьох нуклеотидних основ у положеннях 11-13, якщо рахувати від 3'-кінця, вибраний з групи, що складається з xxx, Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX і XXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, мотив з трьох нуклеотидних основ у положеннях 11-13, якщо рахувати від 3'-кінця, одноланцюжкового олігонуклеотиду, вибраний з групи, що складається з Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX і XXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 14 нуклеотидних основ, де мотив з чотирьох нуклеотидних основ у положеннях 11-14, якщо рахувати від 3'-кінця, вибраний з групи, що складається з xxxx, Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX і XXXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, мотив з чотирьох нуклеотидних основ у положеннях 11-14 одноланцюжкового олігонуклеотиду, якщо рахувати від 3'-кінця, вибраний з групи, що складається з Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX, xxXX, XXXx, XxXX, xXXX, XXxX і XXXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає 15 нуклеотидних основ, де мотив з п'яти нуклеотидних основ у положеннях 11-15, якщо рахувати від 3'-кінця, вибраний з групи, що складається з Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX, XXXxx, XXxxX, XxxXX, xXXXx, xxXXX, XXxXX, XxXxX, XXXXx, XXXxX, XXxXX, XxXXXX, xXXXX і XXXXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає 16 нуклеотидних основ, а мотив з шести нуклеотидних основ у положеннях 11-16, якщо рахувати від 3'-кінця, вибраний з групи, що складається з Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX, xxxXXX, XXXXxx, XXXxxX, XXxxXX, XxxXXX, xxXXXX, xXxXXX, XxXxXX, XXxXxX, XXXxXx, xXXxXX, XxXXxX, XXxXXx, xXXXxX, XxXXXx, xXXXXx, xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX, XXXXXx і XXXXXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, мотив з шести нуклеотидних основ у положеннях 11-16 одноланцюжкового олігонуклеотиду, якщо рахувати від 3'-кінця, являє собою xxXxxX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, три крайніх 5'-кінцевих нуклеотидних основи вибрані з групи, що складається з Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX і XXX, де «X» означає нуклеотидний аналог, такий як залишок LNA, а «х» означає нуклеотидний залишок ДНК або РНК. В одному з варіантів винаходу, «х» означає залишок ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, біля 5'-кінця, залишок нуклеотидного аналога, такий як залишок LNA. 13 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному з варіантів винаходу, залишки нуклеотидних аналогів, такі як X, незалежно вибрані з групи, що складається з залишку 2'-O-алкіл-РНК, залишку 2'-OMe-РНК, залишку 2'аміно-ДНК, залишку 2'-фтор-ДНК, залишку LNA, залишку PNA, залишку HNA, залишку INA. В одному з варіантів винаходу, всі нуклеотидні основи одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу являють собою залишки нуклеотидних аналогів. В одному з варіантів винаходу, залишки нуклеотидних аналогів, такі як X, незалежно вибрані з групи, що складається із залишків 2'-OMe-РНК, залишків 2'-фтор-ДНК і залишків LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає вказаний, щонайменше, один залишок аналога LNA, і, щонайменше, один додатковий залишок нуклеотидного аналога, що не є залишком LNA. В одному з варіантів винаходу, залишок або залишки нуклеотидних аналогів, що не є LNA, незалежно вибрані із залишків 2'-OMe-РНК і залишків 2'-фтор-ДНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид складається, щонайменше, з однієї послідовності XYX або YXY, де X являє собою LNA, а Y являє собою залишок 2'-OMe-РНК і залишок 2'-фтор-ДНК. В одному з варіантів винаходу, послідовність нуклеотидних основ одноланцюжкового олігонуклеотиду складається із залишків, що чергуються, X і Y. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає залишки, що чергуються, LNA і ДНК (Xx) або (xX). В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає мотив із залишків, що чергуються, LNA, за якими йдуть 2 залишки ДНК (Xxx), xXx або xxX. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, один із залишків нуклеотидних аналогів ДНК або залишків нуклеотидного аналога, що не є LNA, замінений нуклеотидною основою LNA у положенні, вибраному з положень, ідентифікованих як залишки нуклеотидних основ LNA відповідно до будь-якого зі згаданих вище варіантів. В одному з варіантів винаходу, «X» означає залишок LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 2 залишки нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 3 залишки нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 4 залишки нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 5 залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 6 залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 7 залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 8 залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 9 залишків нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше, 10 залишків нуклеотидних аналогів. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, 2 залишки LNA, наприклад, щонайменше, 3 залишки LNA, наприклад, щонайменше, 4 залишки LNA, наприклад, щонайменше, 5 залишків LNA, наприклад, щонайменше, 6 залишків LNA, наприклад, щонайменше, 7 залишків LNA, наприклад, щонайменше, 8 залишків LNA, наприклад, щонайменше, 9 залишків LNA, наприклад, щонайменше, 10 залишків LNA. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, один залишок нуклеотидного аналога, такий як залишок LNA, наприклад, залишок у положеннях 1-10 нуклеотидного аналога, такий як залишок LNA, а зокрема, залишок у положенні 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 нуклеотидних аналогів, таких як залишки LNA, являє собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, два залишки нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, три залишки нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, чотири залишки нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, п'ять залишків нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, шість залишків нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, сім залишків нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. В одному з варіантів винаходу, щонайменше, вісім залишків нуклеотидних аналогів, такі як залишки LNA, являють собою цитозин або гуанін. У переважному варіанті винаходу, нуклеотидні аналоги утворюють дуплекс з комплементарним нуклеотидом РНК, який має більш високу термостабільність, ніж дуплекс, в якому еквівалентний нуклеотид ДНК афінно зв'язаний з вказаним комплементарним нуклеотидом РНК. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидні аналоги надають одноланцюжковому олігонуклеотиду більш високу стабільність у сироватці. 14 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид утворює А-спіральну конформацію з комплементарною одноланцюжковою молекулою РНК. Дуплекс, утворений між двома молекулами РНК, звичайно присутній в А-конформації, а дуплекс, утворений між двома молекулами ДНК, звичайно присутній у В-конформації. Дуплекс, утворений між молекулами ДНК і РНК, звичайно присутній у проміжній конформації (в А/Вформі). Нуклеотидні аналоги, такі як бета-D-окси-LNA, можуть бути використані для стимуляції утворення конформації, найбільш близької до А-конформації. Для визначення форми дуплексів між олігонуклеотидами відповідно до винаходу і комплементарними молекулами РНК застосовують стандартний метод кільцевого дихроїзму (КD) або ЯМР-аналіз. Оскільки вважається, що рекрутинг під дією RISC-комплексу залежить від конкретної структурної конформації міРНК/мРНК-мішені, то в одному з варіантів винаходу, олігонуклеотиди відповідно до винаходу можуть утворювати дуплекс в А/В-конформації з комплементарною молекулою РНК. Однак, авторами даного винаходу було також визначено, що використання нуклеотидних аналогів, таких як альфа-L-ізомер LNA, може також виявитися ефективним для стимуляції утворення А-конформаційної структури. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид утворює А/Вконформацію з комплементарною одноланцюжковою молекулою РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид утворює А-конформацію з комплементарною одноланцюжковою молекулою РНК. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу не опосередковує розщеплення комплементарної одноланцюжкової молекули РНК під дією РНКази Н. Звичайно, для ефективного рекрутингу РНКази Н під дією олігонуклеотиду, необхідно, щоб олігонуклеотидний фрагмент складався, щонайменше, з 5 (звичайно він не є ефективним для рекрутингу РНКази Н), більш переважно, щонайменше, з 6, а ще більш переважно, щонайменше, приблизно з 7 або 8 суміжних нуклеотидних основ ДНК (або альтернативних нуклеотидних основ, які здатні здійснювати рекрутинг РНКази Н, таких як альфа-L-аміно LNA). В EP 1222309 описані методи in vitro визначення активності РНКази Н, які можуть бути застосовані для визначення здатності олігонуклеотиду до рекрутингу РНКази Н. Вважається, що сполука здатна здійснювати рекрутинг РНКази Н, якщо, у випадку використання комплементарної РНК-мішені, початковий рівень РНКази Н, що вимірюється у пмоль/л/хв., становить, щонайменше, 1%, наприклад, щонайменше, 5%, наприклад, щонайменше, 10% або менш ніж 20% від вихідного рівня, що визначається з використанням тільки евівалентних ДНКолігонуклеотидів, які не мають 2'-заміщень і мають фосфортіоатні зв'язки між всіма нуклеотидами у даному олігонуклеотиді, як було визначено із застосуванням методики, описаної у прикладах 91-95 EP 1222309. При цьому, вважається, що сполука, в основному, не здатна здійснювати рекрутинг РНКази Н, якщо, у випадку використання комплементарної РНК-мішені, вихідний рівень РНКази Н, що вимірюється у пмоль/л/хв., складає менше, ніж 1%, наприклад, менше, ніж 5%, наприклад, менше, ніж 10% або менше, ніж 20% від вихідного рівня, що визначається з використанням тільки еквівалентних ДНК-олігонуклеотидів, які не мають 2'-заміщень і мають фосфортіоатні зв'язувальні групи між всіма нуклеотидами у даному олігонуклеотиді, як було визначено із застосуванням методики, описаної у прикладах 91-95 EP 1222309. В особливо переважному варіанті винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу має здатність утворювати дуплекс з комплементарною одноланцюжковою молекулою нуклеїнової кислоти РНК (звичайно приблизно такої ж довжини, як і вказаний одноланцюжковий олігонуклеотид), що має фосфодіефірні міжнуклеозидні зв'язки, де вказаний дуплекс має Tm, щонайменше, приблизно 60°С, при цьому, переважно, щоб одноланцюжковий олігонуклеотид мав здатність утворювати дуплекс з комплементарною одноланцюжковою молекулою нуклеїнової кислоти РНК, що має фосфодіефірні міжнуклеозидні зв'язки, де вказаний дуплекс має Tm приблизно 70°С-95°С, наприклад, Tm приблизно 70°С-90°С, наприклад, приблизно 70°С-85°С. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид відповідно до винаходу має здатність утворювати дуплекс з комплементарною одноланцюжковою молекулою нуклеїнової кислоти ДНК, що має фосфодіефірні міжнуклеозидні зв'язки, де вказаний дуплекс має Tm приблизно 50°С-95°С, наприклад, приблизно 50°С-90°С, наприклад, щонайменше, приблизно 55°С, наприклад, щонайменше, приблизно 60°С, або не більше, ніж приблизно 95°С. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид може мати довжину у 1416 нуклеотидних основ, включаючи 15 нуклеотидних основ. 15 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів винаходу, залишок або залишки LNA незалежно вибрані з групи, що складається з окси-LNA, тіо-LNA і аміно-LNA, у будь-якій з D-β- і L-α-конфігурацій або їх комбінацій. В одному з конкретних варіантів винаходу, залишками LNA можуть бути нуклеотидні основи ENA. В одному з варіантів винаходу, залишки LNA складають бета-D-окси-LNA. В одному з варіантів винаходу, залишки LNA складають альфа-L-аміно-LNA. У переважному варіанті винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає 3-17 залишків LNA. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, одну міжнуклеозидну зв'язувальну групу, яка не є фосфатом. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, один фосфортіоатний міжнуклеозидний зв'язок. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає фосфодіефірний і фосфортіоатний зв'язки. В одному з варіантів винаходу, всі міжнуклеозидні зв'язки являють собою фосфортіоатні зв'язки. В одному з варіантів винаходу, одноланцюжковий олігонуклеотид включає, щонайменше, один фосфодіефірний міжнуклеозидний зв'язок. В одному з варіантів винаходу, всі міжнуклеозидні зв'язки одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу являють собою фосфодіефірні зв'язки. В одному з варіантів винаходу, фармацевтична композиція відповідно до винаходу включає носій, такий як фізіологічний розчин або забуферений фізіологічний розчин. В одному з варіантів винаходу, синтез одноланцюжкового олігонуклеотиду, направленого проти людської мікроРНК, здійснюють у напрямі 3'-5' a-f. Такий спосіб синтезу одноланцюжкового олігонуклеотиду відповідно до винаходу може бути здійснений із застосуванням стандартного твердофазового олігонуклеотидного синтезу. Інші варіанти винаходу, які можуть бути об'єднані з описаними вище варіантами, наводяться у формулі винаходу і у розділі, озаглавленому «Інші варіанти винаходу». Визначення Термін «нуклеотидна основа» означає нуклеотиди, такі як нуклеотиди ДНК і РНК, і нуклеотидні аналоги. Термін «олігонуклеотид» (або просто «оліго»), у контексті даного опису, означає молекулу, утворену за допомогою ковалентного зв'язку двох або більше нуклеотидних основ. В одному з варіантів винаходу, «олігонуклеотид», що використовується у даному винаході (який також називають одноланцюжковим олігонуклеотидом), може мати довжину, наприклад, у 8-26 нуклеотидів, наприклад, 10-26 нуклеотидів, наприклад, 12-26 нуклеотидів. У переважному варіанті винаходу, детально описаному у даній заявці, олігонуклеотид відповідно до винаходу має довжину у 8-17 нуклеотидів, наприклад, 20-27 нуклеотидів, наприклад, 8-16 нуклеотидів, наприклад, 12-15 нуклеотидів. У такому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу може мати довжину у 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 або 26 нуклеотидів. Слід зазначити, що у випадку використання більш коротких олігонуклеотидів може виявитися необхідним збільшення числа (високоафінних) нуклеотидних аналогів, таких як LNA. Тому, в одному з варіантів винаходу, щонайменше, приблизно 30% нуклеотидів, наприклад, щонайменше, приблизно 33%, наприклад, щонайменше, приблизно 40%, або, щонайменше, приблизно 50% або, щонайменше, приблизно 60%, наприклад, щонайменше, приблизно 66%, наприклад, щонайменше, приблизно 70%, наприклад, щонайменше, приблизно 80%, або, щонайменше, приблизно 90% нуклеотидів являють собою нуклеотидні аналоги. Також очевидно, що вказаний олігонуклеотид може складатися з нуклеотидної послідовності, яка складається тільки з послідовностей нуклеотидних аналогів. Використовуваний тут термін «азотиста основа» включає пурини і піримідини, такі як нуклеотидні основи ДНК А, С, Т і G, нуклеотидні основи РНК А, С, U і G, а також нуклеотидні Me основи, які не є основами ДНК/РНК, такі як 5-метилцитозин ( C), ізоцитозин, псевдоізоцитозин, 5-бромурацил, 5-пропінілурацил, 5-пропініл-6-фторурацил, 5-метилтіазолурацил, 6-амінопурин, 2-амінопурин, інозин, 2,6-діамінопурин, 7-пропін-7-деазааденін, 7-пропін-7-деазагуанін і 2-хлорMe 6-амінопурин, а зокрема, C. При цьому, слід зазначити, що, практично, вибір нуклеотидної основи, яка не є основою ДНК/РНК, залежить від відповідного (або такого, що спарюється) нуклеотиду, присутнього у ланцюгу мікроРНК, тобто, олігонуклеотиду, який, за припущенням, є мішенню. Так, наприклад, у випадку, якщо відповідним нуклеотидом є G, то звичайно необхідно 16 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 вибрати таку нуклеотидну основу, яка не є основою ДНК/РНК, що буде мати здатність утворювати водневі зв'язки з G. У цьому конкретному випадку, якщо відповідним нуклеотидом є Me G, то типовим прикладом переважної не-ДНК/РНК нуклеотидної основи є C. Термін «міжнуклеозидна зв'язувальна група» означає групу, здатну утворювати ковалентні зв'язку між двома нуклеотидами, наприклад, між залишками ДНК, між залишками ДНК і нуклеотидними аналогами, між двома не-LNA-залишками, між не-LNA-залишком і залишком LNA і між двома залишками LNA і т.п. Переважними прикладами є фосфатні, фосфодіефірні і фосфортіоатні групи. Міжнуклеозидний зв'язок може бути вибраний з групи, що складається з: -O-P(О)2-O-, -OP(О,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(О)2-O-, -S-P(О,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(О)2-S-, -O-P(О,S)-S-, -S-P(О)2H H S-, -O-PO(R )-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR )-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -OH H H H H H PO(NHR )-O-, -O-P(О)2-NR -, -NR -P(О)2-O-, -NR -CO-O-, -NR -CO-NR -, і/або міжнуклеозидний H H зв'язок може бути вибраний з групи, що складається з: -O-CO-O-, -O-CO-NR -, -NR -CO-CH2-, H H H H O-CH2-CO-NR -, -O-CH2-CH2-NR -, -CO-NR -CH2-, -CH2-NR -CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, H H H -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NR -, -O-CH2-CH2-NR -CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, де R вибраний з водню і C1-4-алкілу. У деяких варіантах винаходу можуть виявитися переважними міжнуклеозидні зв'язки, що містять сірку (S), як описано вище. Терміни «відповідний...» і «відповідає...», що стосуються олігонуклеотидів, використовуються тут для порівняння нуклеотидних послідовностей сполук відповідно до винаходу і їх зворотних комплементів або, в одному з варіантів винаходу, для порівняння нуклеотидних послідовностей і еквівалентних (ідентичних) нуклеотидних послідовностей, які можуть, наприклад, містити інші нуклеотидні основи, але, при цьому, зберігати ту саму послідовність основ, або їх комплементів. Нуклеотидні аналоги безпосередньо порівнюють з їх еквівалентними або відповідними природними нуклеотидами. Послідовності, що утворюють зворотний комплемент даної послідовності, називаються тут послідовностями, комплементарними даній послідовності. Що стосується довжини описаної тут нуклеотидної молекули, то вона відповідає числу мономерних залишків, тобто, нуклеотидних основ, незалежно від того, є такі мономерні залишки нуклеотидами або нуклеотидними аналогами. Що стосується нуклеотидних основ, то терміни «мономер» і «залишок» є тут взаємозамінними. Потрібно зазначити, що якщо при визначенні конкретних величин або інтервалів величин використовується слово «приблизно», то при цьому мається на увазі, що дані величини включають конкретно вказану величину або вказаний інтервал величин. Переважними аналогами ДНК є аналоги ДНК, в яких група 2'-H заміщена групою, що не є OH (РНК), наприклад, групами -O-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2CH2-OH або -F. Переважними аналогами РНК є аналоги РНК, які були модифіковані в їх 2'-ОН-групі, наприклад, шляхом заміщення групою, що не є -Н (ДНК), наприклад, групами -O-CH3, -O-CH2-CH2O-CH3, -O-CH2-CH2-CH2-NH2, -O-CH2-CH2-CH2-OH або -F. В одному з варіантів винаходу, нуклеотидним аналогом є «ENA». Використовувані тут терміни «структурна одиниця LNA», «мономер LNA», «залишок LNA», «структурна одиниця блокованої нуклеїнової кислоти», «мономер блокованої нуклеїнової кислоти» або «залишок блокованої нуклеїнової кислоти» означають біциклічний нуклеозидний аналог. Структурні одиниці LNA описані inter alia у заявках WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 і WO 03/095467. Структурна одиниця LNA може бути також визначена за її хімічною формулою. Так, наприклад, використовувана тут «структурна одиниця LNA» має хімічну структуру, представлену нижче на схемі 1: Схема 1 , H H де: X вибраний з групи, що складається з О, S і NR , де R являє собою Н або C1-4-алкіл; Y являє собою (-CH2)r, де r являє собою ціле число 1-4; і В являє собою азотисту основу. 17 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Якщо відповідно до даного винаходу, залишок ДНК замінений відповідним залишком LNA, то термін «відповідний залишок LNA» означає, що залишок ДНК був замінений залишком LNA, що містить таку ж азотисту основу, як і замінений залишок ДНК, наприклад, залишок LNA, що відповідає залишку ДНК, що містить азотисту основу А, також містить азотисту основу А. Виключенням є той випадок, коли залишок ДНК містить основу С, і у цьому випадку відповідний Me Me залишок LNA може містити основу С або основу C, а переважно, C. Використовуваний тут термін «не-LNA-залишок» означає нуклеозид, відмінний від LNAзалишку, тобто, термін «не-LNA-залишок» включає залишок ДНК, а також залишок РНК. Переважним не-LNA-залишком є залишок ДНК. Використовувані тут терміни «структурна одиниця», «залишок» і «мономер» є синонімами. Використовуваний тут термін «кон‟югат» означає гетерогенну молекулу, утворену за допомогою ковалентного зв‟язування описаного тут олігонуклеотиду з однією або декількома не-нуклеотидними або не-полінуклеотидними молекулами. Прикладами не-нуклеотидних або не-полінуклеотидних молекул є макромолекулярні агенти, такі як білки, ланцюги жирних кислот, цукрові залишки, глікопротеїни, полімери або їх комбінації. Типовими білками можуть бути антитіла для білка-мішені. Типовими полімерами можуть бути поліетиленгліколі. Термін «щонайменше, один» охоплює ціле число, що дорівнює або перевищує 1, таке як 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 і т.д. Використання однини або множини зі словами «нуклеотид», «агент», «залишок LNA» і т.п. має на увазі, що вказані об'єкти можуть бути в однині або у множині. Зокрема, вираз «компонент (такий як нуклеотид, агент, залишок LNA або т.п.), вибраний з групи, що складається з …», означає, що можуть бути вибрані один або декілька з вказаних компонентів. Так, наприклад, вирази, подібні до виразу «компонент, вибраний з групи, що складається з А, В і С», означають всі комбінації А, В і С, тобто, А, В, С, А+В, А+С, В+С і А+В+С. Термін «залишок тіо-LNA» означає залишок LNA, в якому X на схемі 1 являє собою S. Залишок тіо-LNA може бути присутнім у бета-D-формі і альфа-L-формі. Звичайно, переважною є бета-D-форма залишку тіо-LNA. Бета-D-форма і альфа-L-форма залишку тіо-LNA представлені на схемі 3 як сполуки 3A і 3B, відповідно. Термін «залишок аміно-LNA» означає залишок LNA, в якому X на схемі 1 являє собою NH H H або NR , де R являє собою водень або C1-4-алкіл. Залишок аміно-LNA може бути присутнім у бета-D-формі і альфа-L-формі. Звичайно, переважною є бета-D-форма залишку аміно-LNA. Бета-D-форма і альфа-L-форма залишку аміно-LNA представлені на схемі 4 як сполуки 4A і 4B, відповідно. Термін «залишок окси-LNA» означає залишок LNA, в якому X на схемі 1 являє собою О. Залишок тіо-LNA може бути присутнім у бета-D-формі і альфа-L-формі. Звичайно, переважною є бета-D-форма залишку окси-LNA. Бета-D-форма і альфа-L-форма залишку окси-LNA представлені на схемі 5 як сполуки 5A і 5B, відповідно. Використовуваний тут термін «C1-6-алкіл» означає прямий або розгалужений насичений вуглеводневий ланцюг, де найдовші ланцюги мають від одного до шести атомів вуглецю, наприклад, метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, ізопентил, неопентил і гексил. Розгалужений вуглеводневий ланцюг являє собою C1-6-алкіл, заміщений біля будь-якого атома вуглецю вуглеводневим ланцюгом. Використовуваний тут термін «C1-4-алкіл» означає прямий або розгалужений насичений вуглеводневий ланцюг, де найдовші ланцюги мають від одного до чотирьох атомів вуглецю, наприклад, метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил і трет-бутил. Розгалужений вуглеводневий ланцюг являє собою C 1-4-алкіл, заміщений біля будь-якого атома вуглецю вуглеводневим ланцюгом. Використовуваний тут термін «C1-6алкокси» означає C1-6-алкіл-окси, такий як метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, ізобутокси, втор-бутокси, трет-бутокси, пентокси, ізопентокси, неопентокси і гексокси. Використовуваний тут термін «C2-6-алкеніл» означає пряму або розгалужену вуглеводневу групу, яка має від двох до шести атомів вуглецю і містить один або декілька подвійних зв'язків. Репрезентативними прикладами C2-6-алкенільних груп є аліл, гомоаліл, вініл, кротил, бутеніл, бутадієніл, пентеніл, пентадієніл, гексеніл і гексидієніл. Положенням ненасиченого зв'язку (подвійного зв'язку) може бути будь-яке положення у вуглецевому ланцюгу. Використовуваний тут термін «C2-6-алкініл» означає пряму або розгалужену вуглеводневу групу, яка має від двох до шести атомів вуглецю і містить один або декілька потрійних зв'язків. Репрезентативними прикладами C2-6-алкінільних груп є ацетилен, пропініл, бутиніл, пентиніл і гексиніл. Положенням ненасиченого зв'язку (потрійного зв'язку) може бути будь-яке положення 18 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у вуглецевому ланцюгу. Більш ніж один зв'язок може бути ненасиченим, а тому «C2-6-алкініл» являє собою ді-їн або енді-їн, відомі фахівцям. Використовуваний тут термін «гібридизація» означає водневі зв'язки, якими можуть бути водневі зв'язки Уотсона-Кріка, Хугстена, реверсивні водневі зв'язки Хугстена і т.п. між комплементарними нуклеозидними або нуклеотидними основами. Чотирма нуклеотидними основами, звичайно присутніми у ДНК, є G, А, Т і С, з яких G спарюється з С, а А спарюється з T. У РНК, Т замінений урацилом (U), який спарюється з A. Хімічні групи у нуклеотидних основах, які беруть участь в утворенні стандартного дуплексу, складають основи Уотсона-Кріка. За останні два роки, Хугстеном було показано, що пуринові нуклеотидні основи (G і А), крім основ Уотсона-Кріка, включають основи Хугстена, які можуть розпізнаватися із зовнішньої сторони дуплексу і використовуються для зв‟язування з піримідиновими олігонуклеотидами за допомогою водневих зв'язків, утворюючи, тим самим, потрійну спіральну структуру. У контексті даного винаходу, термін «комплементарний» стосується здатності двох нуклеотидних послідовностей точно спарюватися одна з одною. Так, наприклад, якщо нуклеотид у визначеному положенні олігонуклеотиду здатний утворювати водневий зв'язок з нуклеотидом у відповідному положенні молекули ДНК або РНК, то вважається, що такий олігонуклеотид і ДНК або РНК є комплементарними один одному у цьому положенні. Вважається, що ланцюги ДНК або РНК комплементарні один одному у тому випадку, якщо достатнє число нуклеотидів в олігонуклеотиді можуть утворювати водневі зв'язки з відповідними нуклеотидами у ДНК- або РНК-мішені, і тим самим утворювати стабільний комплекс. При цьому, для надання стабільності послідовності олігонуклеотидів in vitro або in vivo, ці послідовності необов'язково повинні бути на 100% комплементарні їх мікроРНКмішеням. Так, наприклад, терміни «комплементарний» і «такий, що специфічно гібридизується» означають, що олігонуклеотид досить сильно і специфічно зв'язується з молекулою-мішенню, що забезпечує необхідне придушення нормальної функції мішені, але, при цьому, функція РНК, яка не є мішенню, залишається незмінною. У переважному прикладі, олігонуклеотид відповідно до винаходу на 100% комплементарний людській послідовності мікроРНК, такій як одна з описаних тут послідовностей мікроРНК. У переважному прикладі, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить безперервну послідовність, яка на 100% комплементарна унікальній області людської послідовності мікроРНК. МікроРНК являють собою короткі не-кодуючі РНК, що походять від ендогенних генів, які діють як пост-транскрипційні регулятори експресії генів. Вони процесуються з більш довгих (приблизно 70-80 нуклеотидів) шпилько-подібних попередників, яких називають пре-міРНК, під дією ферменту РНКази III Dicer. МікроРНК утворюють рибонуклеопротеїнові комплекси, які називають міРНП, і розпізнають їх сайти-мішені завдяки антисмисловій комплементарності, опосередковуючи, тим самим, інгібування їх генів-мішеней. Майже повна або повна комплементарність між міРНК і її сайтом-мішенню приводить до розщеплення мРНК-мішені, тоді як обмежена комплементарність між мікроРНК і сайтом-мішенню приводить до інгібування трансляції гена-мішені. У контексті даного винаходу, термін «мікроРНК» або «міРНК» означає олігонуклеотид РНК, що складається з 18-25 нуклеотидів. За своїми функціями, міРНК являють собою типові регуляторні ендогенні молекули РНК. Терміни «цільова мікроРНК» або «цільова міРНК», або «міРНК-мішень» означають мікроРНК, яка грає визначену біологічну роль у розвитку захворювання у людини, наприклад, міРНК може стимулювати онкогенез або придушувати розвиток пухлини при раку, а тому вона є мішенню для терапевтичного впливу на захворювання, що розглядається. Терміни «ген-мішень» або «мРНК-мішень» означають регуляторні мРНК-мішені для мікроРНК, де вказаний «ген-мішень» або «мРНК-мішень» піддаються посттранскрипційній регуляції під дією мікроРНК, що обумовлено повною або майже повною комплементарністю між міРНК і її сайтом-мішенню, і приводить до розщеплення мРНК-мішені; або обмеженою комплементарністю, що часто визначається як комплементарність між так званою «унікальною» послідовністю (нуклеотидами 2-7 міРНК) і сайтом-мішенню, яка приводить до інгібування трансляції мРНК-мішені. У контексті даного винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу є одноланцюжковим, а це означає, що олігонуклеотид не має комплементарного олігонуклеотиду, тобто він не може бути двохланцюжковим олігонуклеотидним комплексом, таким як кіРНК. В одному з варіантів винаходу, композиція відповідно до винаходу не містить іншого олігонуклеотиду, який має область, комплементарну одноланцюжковому олігонуклеотиду з п'яти або більше суміжних 19 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидних основ, наприклад, з восьми або більше, або з 12 або більше суміжних нуклеотидних основ. Вважається, що такий інший олігонуклеотид не зв'язаний ковалентним зв'язком з одноланцюжковим олігонуклеотидом. LNA-вмісні олігонуклеотиди відповідно до винаходу Хоча LNA-залишки і не-LNA-залишки можуть бути об'єднані різними методами з утворенням олігонуклеотидів, однак, авторами даного винаходу було несподівано виявлено, що присутність визначеної корової послідовності ДНК і присутність визначених залишків LNА у вказаній послідовності ДНК приводить до особливо сильного інгібування мікроРНК. Така присутність залишків LNA у вказаній коровій послідовності олігонуклеотидів відповідно до винаходу надає вказаним олігонуклеотидам високий рівень резистентності до нуклеази. Нуклеотидами, розташованими за межами корової послідовності, можуть бути LNA-залишки і/або не-LNA-залишки. В одному з варіантів винаходу, не-LNA-залишками, розташованими за межами корової послідовності, є залишки ДНК. Корова послідовність Для більш ефективного, за можливістю, інгібування мікроРНК-мішеней антисмисловими олігонуклеотидами відповідно до винаходу необхідний визначений ступінь комплементарності між антисмисловим олігонуклеотидом відповідно до винаходу і відповідною мікроРНК-мішенню. При цьому особливо важливо, щоб олігонуклеотиди відповідно до винаходу були комплементарні відповідній мікроРНК-мішені у положеннях 3-8 від 5'-кінця. У деяких мікроРНКмішенях, нуклеотид 1, якщо рахувати від 5'-кінця, являє собою основу, що не спарюється, яка, ймовірно, прихована у зв'язувальному кармані білка Ago 2. Згідно з цим, олігонуклеотид відповідно до винаходу може мати, а може і не мати нуклеотид у положенні 1 від 3'-кінця, що відповідає нуклеотиду 1 від 5'-кінця відповідної мікроРНК-мішені. У деяких випадках, перші два нуклеотиди від 5'-кінця відповідної мікроРНК-мішені можуть залишатися неспареними. Тому коровою послідовністю олігонуклеотидів відповідно до винаходу є послідовність ДНК в 1-6-положеннях, 2-7-положеннях або 3-8-положеннях, якщо рахувати від 3'-кінця, що відповідає 3-8-положенням, якщо рахувати від 5'-кінця, відповідної мікроРНК-мішені. miR-19b Одна з конкретних мікроРНК-мішеней позначена miR-19b. Послідовність miR-19b у 3-8положеннях, якщо рахувати від 5'-кінця, являє собою ugcaaa (див. GenBank AJ421740 і AJ421739). Відповідна ДНК-послідовність являє собою acgttt. Крім того, авторами даного винаходу було виявлено, що для максимального інгібування мікроРНК-мішеней, олігонуклеотиди відповідно до винаходу повинні містити у своїй коровій послідовності, щонайменше, один залишок LNA. Згідно з цим, у своєму першому аспекті, даний винахід стосується олігонуклеотиду відповідно до винаходу, такого як олігонуклеотид довжиною 12-26 нуклеотидів, в якому у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'-кінця, є наведена нижче послідовність ДНК: acgttt (SEQ ID NO 6), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два або три залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. Комплементарність з іншими нуклеотидами мікроРНК-мішені може підвищувати рівень інгібування вказаної мікро-РНК-мішені. Тому, в одному з варіантів винаходу, описаний вище олігонуклеотид у положеннях 1-7, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acgttta (SEQ ID NO 70), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В іншому варіанті винаходу олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-8, 2-9 або 3-10, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acgtttag (SEQ ID NO 71), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. У ще одному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-9, 210 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acgtttagg (SEQ ID NO 72), 20 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три, а ще більш переважно, щонайменше чотири, наприклад, чотири або п'ять залишків ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. miR-122a Іншою мікроРНК-мішенню, що представляє інтерес, є miR-122a. Послідовність miR-122a у положеннях 3-8, рахуючи від 5'-кінця, являє собою gagugu (див. miRBase, ім'я файла HGNC:MIRN122A). Відповідна послідовність ДНК являє собою ctcaca. Відповідно до цього, у другому своєму аспекті даний винахід стосується олігонуклеотиду відповідно до винаходу, такого як олігонуклеотид довжиною 12-26 нуклеотидів, що має у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'-кінця, наведену нижче послідовність ДНК: ctcaca (SEQ ID NO 7), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два або три залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується олігонуклеотиду-антагоніста miR122a, який у положеннях 1-7, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ctcacac (SEQ ID NO 73), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В іншому варіанті винаходу олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-8, 2-9 або 3-10, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ctcacact (SEQ ID NO 74), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. У ще одному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-9, 210 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ctcacactg (SEQ ID NO 75), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три, а ще більш переважно, щонайменше чотири, наприклад, чотири або п'ять залишків ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. miR-155 Іншою мікроРНК-мішенню, що представляє інтерес, є miR-155. Послідовність miR-155 у положеннях 3-8, рахуючи від 5'-кінця, являє собою aaugcu (див. miRBase, ім'я файла HGNC:MIRN155). Відповідна послідовність ДНК являє собою ttacga. Згідно з цим, у своєму третьому аспекті, даний винахід стосується олігонуклеотиду відповідно до винаходу, такого як олігонуклеотид довжиною 12-26 нуклеотидів, що має у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'-кінця, наведену нижче послідовність ДНК: ttacga (SEQ ID NO 8), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два або три залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид проти miR-155 у положеннях 1-7, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ttacgat (SEQ ID NO 76), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-8, 2-9 або 3-10, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ttacgatt (SEQ ID NO 77), 21 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. У ще одному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-9, 210 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: ttacgatta (SEQ ID NO 78), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три, а ще більш переважно, щонайменше чотири, наприклад, чотири або п'ять залишків ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. miR-375 Іншою мікроРНК-мішенню, що представляє інтерес, є miR-375. Послідовність miR-375 у положеннях 3-8, рахуючи від 5'-кінця, являє собою uguucg (див. miRBase, ім'я файла HGNC:MIRN375). Відповідна послідовність ДНК являє собою acaagc. Згідно з цим, у своєму четвертому аспекті, даний винахід стосується олігонуклеотиду відповідно до винаходу, такого як олігонуклеотид довжиною 12-26 нуклеотидів, що має у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'-кінця, наведену нижче послідовність ДНК: acaagc (SEQ ID NO 9), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два або три залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В одному з варіантів винаходу, описаний вище олігонуклеотид проти miR-375 у положеннях 1-7, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acaagca (SEQ ID NO 79), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-8, 2-9 або 3-10, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acaagcaa (SEQ ID NO 80), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три або чотири залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. У ще одному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу у положеннях 1-9, 210 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, має наведену нижче послідовність ДНК: acaagcaag (SEQ ID NO 81), де щонайменше один, наприклад, один, а переважно, щонайменше два, наприклад, два, а більш переважно, щонайменше три, наприклад, три, а ще більш переважно, щонайменше чотири, наприклад, чотири або п'ять залишків ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. Модифікація нуклеотидів у коровій послідовності Як згадувалося вище, у коровій послідовності олігонуклеотидів відповідно до винаходу, щонайменше, один, наприклад, один, а переважно, щонайменше, два, наприклад, два або три залишки ДНК у вказаній послідовності були замінені відповідним залишком LNA. Авторами даного винаходу було також виявлено, що інгібування мікроРНК-мішеней може бути ще більше посилено, якщо два залишки LNA у вказаній коровій послідовності будуть розділені, щонайменше, одним залишком ДНК. Відповідно до цього, в одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, в якому, щонайменше два, наприклад, два або три залишки ДНК у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'-кінця, були замінені відповідним залишком LNA, і в якому залишки LNA розділені, щонайменше, одним залишком ДНК. Авторами даного винаходу було також виявлено, що інгібування мікроРНК-мішеней може бути ще більше посилено, якщо два залишки LNA у вказаній коровій послідовності будуть розділені, максимум, двома залишками ДНК. Відповідно до цього, в одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, в якому число суміжних залишків 22 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ДНК у положеннях 1-6, 2-7 або 3-8, а переважно, у положеннях 2-7 або 3-8, рахуючи від 3'кінця, складає максимум два. Вказані дані стосуються корової послідовності per se, тобто вони стосуються положень олігонуклеотидів відповідно до винаходу, відповідних коровій послідовності. Отже, в іншому своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де щонайменше два, наприклад, два, три або чотири залишки ДНК у положеннях 1-7, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9 від 3'-кінця були замінені відповідним залишком LNA, і де, залишки LNA розділені, щонайменше, одним залишком ДНК. В іншому своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де число суміжних залишків ДНК у положеннях 17, 2-8 або 3-9, а переважно, у положеннях 2-8 або 3-9 від 3'-кінця складає максимум два. У ще одному своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де щонайменше два, наприклад, два, три або чотири залишки ДНК у положеннях 1-8, 2-9 або 310, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10 від 3'-кінця були замінені відповідним залишком LNA, і де, залишки LNA розділені, щонайменше, одним залишком ДНК. В іншому своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де число суміжних залишків ДНК у положеннях 1-8, 2-9 або 3-10, а переважно, у положеннях 2-9 або 3-10, рахуючи від 3'-кінця, складає максимум два. У ще одному своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де щонайменше два, наприклад, два, три, чотири або п'ять залишків ДНК у положеннях 1-9, 210 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, були замінені відповідним залишком LNA, і де залишки LNA розділені, щонайменше, одним залишком ДНК. В іншому своєму варіанті, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де число суміжних залишків ДНК у положеннях 1-9, 2-10 або 3-11, а переважно, у положеннях 2-10 або 3-11, рахуючи від 3'-кінця, складає максимум два. Модифікація нуклеотидів, розташованих за межами корової послідовності Як згадувалося вище, нуклеотидами, що знаходяться за межами корової послідовності, можуть бути залишки LNA і/або не-LNA-залишки. В одному зі своїх варіантів, даний винахід стосується описаного вище олігонуклеотиду, де число залишків LNA, що знаходяться за межами корової послідовності, складає, щонайменше один, наприклад, один, два, три або чотири, і де вказані залишки LNA розділені, щонайменше, одним не-LNA-залишком. В іншому варіанті винаходу, заміну за межами корової послідовності здійснюють таким чином, щоб число суміжних не-LNA-залишків, що знаходяться за межами корової послідовності, складало максимум два. Модифікація нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця У наведених нижче варіантах, які стосуються модифікації нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця, залишки LNA можуть бути замінені іншими нуклеотидними аналогами, такими як аналоги, описані у даній заявці. Тому, «X» може бути вибраний з групи, що складається з 2'-Oалкіл-РНК-залишку, 2'-OMe-РНК-залишку, 2'-аміно-ДНК-залишку, 2'-фтор-ДНК-залишку, LNAзалишку, PNA-залишку, HNA-залишку, INA-залишку. «х», переважно, означає ДНК або РНК, а найбільш переважно, ДНК. У варіанті винаходу, що представляє інтерес, олігонуклеотиди відповідно до винаходу модифіковані у положеннях 3-8 від 3'-кінця. Конструкція цієї послідовності може визначатися числом не-LNA-залишків або числом LNA-залишків, присутніх у даній послідовності. У переважному варіанті першого аспекту, щонайменше один, наприклад, один нуклеотид у положеннях 3-9 від 3'-кінця являє собою не-LNA-залишок. В іншому варіанті винаходу, щонайменше два, наприклад, два нуклеотиди у положеннях 3-8 від 3'-кінця являють собою неLNA-залишки. У ще одному варіанті винаходу, щонайменше три, наприклад, три нуклеотиди у положеннях 3-8 від 3'-кінця являють собою не-LNA-залишки. У ще одному варіанті винаходу, щонайменше чотири, наприклад, чотири нуклеотиди у положеннях 3-8 від 3'-кінця являють собою не-LNA-залишки. В іншому варіанті винаходу, щонайменше п'ять, наприклад, п'ять нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця являють собою не-LNA-залишки. У ще одному варіанті винаходу, всі шість нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця являють собою не-LNAзалишки. У переважному варіанті винаходу, вказаним не-LNA-залишком є залишок ДНК. Альтернативно, у своєму переважному варіанті, даний винахід стосується олігонуклеотиду відповідно до винаходу, який містить, щонайменше, один залишок LNA у положеннях 3-8 від 3'кінця. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить один залишок LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. Тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'кінця може бути вибраний з групи, що складається з Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx і xxxxxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. 23 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше два залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить два залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. Тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX і xxxxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX і xxxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXxXx, xxXxxX і xxxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з xXxXxx, xXxxXx і xxXxXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У найбільш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця являє собою xXxXxx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше три залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить три залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. Тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX і XxXxXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX і XxXxXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця вибраний з групи, що складається з xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX і xXxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця являє собою xXxXxX або XxXxXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У найбільш переважному варіанті винаходу, тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця являє собою xXxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше чотири залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить чотири залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'кінця. Тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx і XXXXxx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше п'ять залишків LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить п'ять залишків LNA у положеннях 3-8 від 3'кінця. Тип заміни нуклеотидів у положеннях 3-8 від 3'-кінця може бути вибраний з групи, що складається з xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX і XXXXXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. При цьому переважно, щоб олігонуклеотид відповідно до винаходу містив один або два залишки LNA у положеннях 3-8 від 3'-кінця. Така конструкція розглядається як переважна з точки зору стабільності А-спіралі, утвореної дуплексом олігонуклеотид:мікроРНК, тобто дуплексом, який за своєю структурою нагадує дуплекс РНК:РНК. У переважному варіанті винаходу, вказаним не-LNA-залишком є залишок ДНК. Зміна довжин олігонуклеотидів Довжина олігонуклеотидів відповідно до винаходу необов'язково повинна точно відповідати довжині мікроРНК-мішеней. Фактично, більш переважно використовувати короткі олігонуклеотиди, такі як олігонуклеотиди довжиною 10-17 або 10-16 нуклеотидів. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу має довжину 8-24 нуклеотиди, наприклад, 10-24 нуклеотиди, 12-24 нуклеотиди, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 або 24 нуклеотиди, переважно, 10-22, наприклад, 12-22 нуклеотиди, а саме 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 нуклеотиди, більш 24 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, 10-20, наприклад, 12-20 нуклеотидів, а саме, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 або 20 нуклеотидів, ще більш переважно, 10-19, наприклад, 12-19 нуклеотидів, а саме, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 або 19 нуклеотидів, наприклад, 10-18, а саме, 12-18 нуклеотидів, наприклад, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 або 18 нуклеотидів, більш переважно, 10-17, наприклад, 12-17 нуклеотидів, а саме, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 або 17 нуклеотидів, а найбільш переважно, 10-16, наприклад, 12-16 нуклеотидів, а саме, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 нуклеотидів. Модифікація нуклеотидів від положення 11 у напрямі від 3'-кінця до 5'-кінця Тип заміни нуклеотидів від положення 11 у напрямі від 3'-кінця до 5'-кінця може включати, а може і не включати залишки нуклеотидних аналогів (такі як LNA). У переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше один залишок нуклеотидного аналога (такого як LNA), наприклад, один залишок нуклеотидного аналога від положення 11 у напрямі від 3'-кінця до 5'-кінця. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить щонайменше два залишки нуклеотидного аналога, таких як LNA, наприклад, два залишки нуклеотидного аналога від положення 11 до 5'кінця у напрямі від 3'-5'. У наведених нижче варіантах, які стосуються модифікації нуклеотидів від положення 11 до 5'-кінця даного олігонуклеотиду, залишки LNA можуть бути замінені іншими нуклеотидними аналогами, такими як аналоги, описані у даній заявці. Тому, «X» може бути вибраний з групи, що складається з 2'-O-алкіл-РНК-залишку, 2'-OMe-РНК-залишку, 2'-аміно-ДНК-залишку, 2'-фторДНК-залишку, LNA-залишку, PNA-залишку, HNA-залишку, INA-залишку. «х», переважно, означає ДНК або РНК, а найбільш переважно, ДНК. В одному з варіантів винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу має наведений нижче тип заміни, який повторюється від нуклеотиду 11 до 5'-кінця, у напрямі від 3'-5': xXxX або XxXx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. В іншому варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу має наведений нижче тип заміни, який повторюється від нуклеотиду 11 до 5'-кінця, у напрямі від 3'-5': XxxXxx, xXxxXx або xxXxxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще одному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу має наведений нижче тип заміни, який повторюється від нуклеотиду 11 до 5'-кінця, у напрямі від 3'-5': XxxxXxxx, xXxxxXxx, xxXxxxXx або xxxXxxxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Характер специфічної заміни для нуклеотидів від положення 11 до 5'-кінця у напрямі від 3'5' залежить від числа нуклеотидів в олігонуклеотидах відповідно до винаходу. У переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 12 нуклеотидів, і таку заміну для положень 11-12 від 3'-кінця вибирають з групи, що складається з xX і Xx, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-12 від 3'-кінця має характер xX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає неLNA-залишок. Альтернативно, залишки LNA відсутні у положеннях 11-12 від 3'-кінця, тобто заміна має характер xx. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 13 нуклеотидів, і заміну для положень 11-13 від 3'-кінця вибирають з групи, що складається з Xxx, xXx, xxX, XXx, XxX, xXX і XXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-13 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з xXx, xxX і xXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-13 від 3'-кінця має характер xxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Альтернативно, залишки LNA відсутні у положеннях 11-12 від 3'-кінця, тобто заміна має характер ххх. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 14 нуклеотидів, і заміну для положень 11-14 від 3'-кінця вибирають з групи, що складається з Xxxx, xXxx, xxXx, xxxX, XXxx, XxXx, XxxX, xXXx, xXxX і xxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-14 від 3'кінця вибрана з групи, що складається з xXxx, xxXx, xxxX, xXxX і xxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-14 від 3'-кінця має характер xXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Альтернативно, залишки LNA відсутні у положеннях 11-14 від 3'-кінця, тобто заміна має характер хххх. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 15 нуклеотидів, і таку заміну для положень 11-15 від 3'-кінця вибирають з групи, що складається з Xxxxx, xXxxx, xxXxx, xxxXx, xxxxX, XXxxx, XxXxx, XxxXx, XxxxX, xXXxx, xXxXx, xXxxX, xxXXx, xxXxX, xxxXX і XxXxX де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-15 від 3'-кінця вибрана з групи, що 25 UA 100112 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 складається з xxXxx, XxXxx, XxxXx, xXxXx, xXxxX і xxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-15 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з xxXxx, xXxXx, xXxxX і xxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-15 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з xXxxX і xxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-15 від 3'-кінця має характер xxXхХ, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Альтернативно, залишки LNA відсутні у положеннях 11-15 від 3'-кінця, тобто заміна має характер ххххх. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 16 нуклеотидів, і таку заміну для положень 11-16 від 3'-кінця вибирають з групи, що складається з Xxxxxx, xXxxxx, xxXxxx, xxxXxx, xxxxXx, xxxxxX, XXxxxx, XxXxxx, XxxXxx, XxxxXx, XxxxxX, xXXxxx, xXxXxx, xXxxXx, xXxxxX, xxXXxx, xxXxXx, xxXxxX, xxxXXx, xxxXxX, xxxxXX, XXXxxx, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, XxXXxx, XxXxXx, XxXxxX, XxxXXx, XxxXxX, XxxxXX, xXXXxx, xXXxXx, xXXxxX, xXxXXx, xXxXxX, xXxxXX, xxXXXx, xxXXxX, xxXxXX і xxxXXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-16 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з XxxXxx, xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, XxXxXx, XxXxxX, XxxXxX, xXxXxX, xXxxXX і xxXxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-16 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з xXxXxx, xXxxXx, xxXxXx, xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX і xxXxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-16 від 3'-кінця вибрана з групи, що складається з xxXxxX, xXxXxX, xXxxXX і xxXxXX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У ще більш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 11-16 від 3'кінця вибрана з групи, що складається з xxXxxX і xXxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. У найбільш переважному варіанті винаходу, заміна у положеннях 1116 від 3'-кінця має характер xxXxxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNAзалишок. Альтернативно, залишки LNA відсутні у положеннях 11-16 від 3'-кінця, тобто заміна має характер xxxxxx. У переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить залишок LNA біля 5'-кінця. В іншому переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить залишок LNA у перших двох положеннях від 5'-кінця. В особливо переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 13 нуклеотидів, і заміна від 3'-кінця має характер XXxXxXxxXXxxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Переважною послідовністю цього варіанту від 3'-кінця є послідовність CCtCaCacTGttA, де великі букви означають азотисті основи в LNA-залишку, а малі букви означають азотисті основи в не-LNA-залишку. В іншому особливо переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить 15 нуклеотидів, і заміна від 3'-кінця має характер XXxXxXxxXXxxXxX, де «X» означає залишок LNA, а «х» означає не-LNA-залишок. Переважною послідовністю цього варіанту від 3'кінця є послідовність CCtCaCacTGttAcC, де великі букви означають азотисті основи в LNAзалишку, а малі букви означають азотисті основи в не-LNA-залишку. Модифікація міжнуклеозидної зв'язувальної групи Типовими міжнуклеозидними зв'язувальними групами в олігонуклеотидах є фосфатні групи, але ці групи можуть бути замінені міжнуклеозидними зв'язувальними групами, які не є фосфатом. В іншому варіанті винаходу, що представляє інтерес, олігонуклеотид відповідно до винаходу має модифіковану структуру міжнуклеозидних зв'язувальних груп, тобто, модифікований олігонуклеотид містить міжнуклеозидну зв'язувальну групу, яка не є фосфатом. Згідно з цим, у переважному варіанті винаходу, олігонуклеотид відповідно до винаходу містить, щонайменше, одну групу. Конкретні приклади міжнуклеозидних зв'язувальних груп, за винятком фосфату (-O-P(О)2-O), включають O-P(О,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(О)2-O-, -S-P(О,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(О)2-S-, -OH H P(О,S)-S-, -S-P(О)2-S-, -O-PO(R )-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR )-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, H H H H H H O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHR )-O-, -O-P(О)2-NR -, -NR -P(О)2-O-, -NR -CO-O-, -NR -CO-NR -, -OH H H H H CO-O-, -O-CO-NR -, -NR -CO-CH2-, -O-CH2-CO-NR -, -O-CH2-CH2-NR -, -CO-NR -CH2-, -CH2H H NR -CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NR -, -O-CH2H H CH2-NR -CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, де R являє собою водень або C1-4-алкіл. Якщо міжнуклеозидна зв'язувальна група є модифікованою, то вказана міжнуклеозидна зв'язувальна група, переважно, являє собою фосфортіоатну групу (-O-P(О,S)-О-). У 26 UA 100112 C2 5 переважному варіанті винаходу, всі міжнуклеозидні зв'язувальні групи олігонуклеотидів відповідно до винаходу являють собою фосфортіоат. Конструкції специфічних мікроРНК У наведеній нижче таблиці наводяться приклади олігонуклеотидів відповідно до винаходу, а саме, олігонуклеотидів, що використовуються у фармацевтичних композиціях і, для порівняння, відомих молекул. мішень: hsa-miR-122a MIMAT0000421 uggagugugacaaugguguuugu скринований у клітинній лінії HUH-7, що експресує miR-122 Оліго #, мікроРНК-мішень, олігонуклеотидна послідовність 3962:miR-122 5'-ACAAacaccattgtcacacTCCA-3' 3965:miR-122 5'-acaaacACCATTGTcacactcca-3' 3972:miR-122 5'-acAaaCacCatTgtCacActCca-3' 3549 (3649):miR-122 5'-CcAttGTcaCaCtCC-3' 3975:miR-122 5'-CcAtTGTcaCACtCC-3' 3975':miR-122 5'-ATTGTcACACtCC-3' 3975'':miR-122 5'-TGTcACACtCC-3' 3549' (3649):miR-122 5' M M M M M M M CC AT T GTC A CA CT CC-3' F F F F F F F 3549'' (3649):miR-122 5' CC AT T GTC A CA CT CC3' мішень: hsa-miR-19b MIMAT0000074 ugugcaaauccaugcaaaacuga скринований у клітинній лінії HeLa, що експресує miR-19b Оліго #, мікроРНК-мішень, олігонуклеотидна послідовність 3963:miR-19b 5'-TCAGttttgcatggatttgCACA-3' 3967:miR-19b 5'-tcagttTTGCATGGatttgcaca-3' 3973:miR-19b 5'-tcAgtTttGcaTggAttTgcAca-3' 3560:miR-19b 5'-TgCatGGatTtGcAC-3' 3976:miR-19b 5'-TgCaTGGatTTGcAC-3' 3976':miR-19b 5'-CaTGGaTTTGcAC-3' 3976'':miR-19b 5'-TGGaTTTGcAC-3' M M M M M F F F F F M M 3560':miR-19b 5' TG CA T GGA T TT GC AC-3' F F 3560'':miR-19b 5'-TG CA T GGA T TT GC AC-3' Мішень: hsa-miR-155 MIMAT0000646 uuaaugcuaaucgugauagggg скринований у клітинній лінії 518А2, що експресує miR-155 Оліго #, мікроРНК-мішень, олігонуклеотидна послідовність SEQ ID SEQ ID NO 1 Конструкція Повний комплемент, геп Повний комплемент, блок Повний комплемент, LNA_3 Нова конструкція Поліпшена нова конструкція ED - 13-мер ED - 11-мер Нова конструкція 2'MOE Нова конструкція - 2'фтор 27 SEQ ID NO 12 SEQ ID NO 13 SEQ ID NO 14 SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 16 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 2 Конструкція Повний комплемент, геп Повний комплемент, блок Повний комплемент, LNA_3 Нова конструкція Поліпшена нова конструкція ED - 13-мер ED - 11-мер Нова конструкція 2'MOE Нова конструкція 2'MOE SEQ ID NO 20 SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 22 SEQ ID NO 23 SEQ ID NO 24 SEQ ID NO 25 SEQ ID NO 26 SEQ ID NO 27 SEQ ID NO 28 SEQ ID NO 3 Конструкція Повний комплемент, геп 3964:miR-155 5'-CCCCtatcacgattagcaTTAA-3' SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 29 UA 100112 C2 3968:miR-155 5'-cccctaTCACGATTagcattaa-3' 3974:miR-155 5'-cCccTatCacGatTagCatTaa-3' 3758: miR-155 5'-TcAcgATtaGcAtTA-3' 3818: miR-155 5'-TcAcGATtaGCAtTA-3' 3818': miR-155 5'-ACGATtAGCAtTA-3' 3818'': miR-155 5'-GATtAGCaTTA-3' M M M F F M F M M F F F 3758': miR-155 5'-TC AC G ATTA GC AT TA-3' F 3758'': miR-155 5'-TC AC G ATT A GC AT TA-3' Повний комплемент, блок Повний комплемент, LNA_3 Нова конструкція Поліпшена нова конструкція ED - 13-мер ED - 11-мер Нова конструкція 2'MOE Нова конструкція - 2'фтор мішень: hsa-miR-21 MIMAT0000076 uagcuuaucagacugauguuga miR-21 5'- tcaacaTCAGTCTGataagcta -3' miR-21 5'- tcAtcAtcAgtCtgAtaAGcTt -3' miR-21 5'-TcAgtCTgaTaAgCT -3' miR-21 5'-TcAgTCTgaTAAgCT -3'miR-21 5'-AGTCTgATAAgCT -3'miR-21 5'-TCTgAtAAGCT -3'M M F M F F M M M miR-21 5'-TC AG T CTG A TA AG CT-3' F F F F miR-21 5'-TC AG T CTG A TA AG CT-3' мішень: hsa-miR-375 MIMAT0000728 uuuguucguucggcucgcguga miR-375 5'- tctcgcGTGCCGTTcgttcttt -3' miR-375 5'-tcTcgCgtGccGttCgtTctTt -3' miR-375 5'-GtGccGTtcGtTcTT 3' miR-375 5'-GtGcCGTtcGTTcTT 3' miR-375 5'-GCCGTtCgTTCTT 3' miR-375 5'-CGTTcGTTCTT 3' M F F M M M M M miR-375 5'-GT GC C GTT C GT TC TT 3' F F F F F miR-375 5'-GT GC C GTT C GT TC TT 3' 5 SEQ ID NO 32 SEQ ID NO 33 SEQ ID NO 34 SEQ ID NO 35 SEQ ID NO 36 SEQ ID NO 37 SEQ ID NO 38 SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 40 SEQ ID NO 41 SEQ ID NO 42 SEQ ID NO 43 SEQ ID NO 44 SEQ ID NO 45 SEQ ID NO 46 SEQ ID NO 5 Повний комплемент, геп Повний комплемент, блок Повний комплемент, LNA_3 Нова конструкція Поліпшена нова конструкція ED - 13-мер ED - 11-мер Нова конструкція 2'MOE Нова конструкція - 2'фтор miR-375 5'-TCTCgcgtgccgttcgttCTTT -3' M SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 4 Повний комплемент, геп Повний комплемент, блок Повний комплемент, LNA_3 Нова конструкція Поліпшена нова конструкція ED - 13-мер ED - 11-мер Нова конструкція 2'MOE Нова конструкція - 2'фтор miR-21 5'- TCAAcatcagtctgataaGCTA -3' M SEQ ID NO 30 SEQ ID NO 47 SEQ ID NO 48 SEQ ID NO 49 SEQ ID NO 50 SEQ ID NO 51 SEQ ID NO 52 SEQ ID NO 53 SEQ ID NO 54 SEQ ID NO 55 Великі букви без надрядкового індексу M або F означають залишки LNA. Малі букви означають ДНК, за винятком малих букв, виділених жирним шрифтом, які означають РНК. Цитозини LNA можуть бути, але необов'язково, метильованими. Великі букви з надрядковим індексом M означають залишки 2'OME РНК, великі букви з надрядковим індексом F означають залишки 2'-фтор-ДНК, а малі букви означають ДНК. В одному з варіантів винаходу, описані вище олігонуклеотиди можуть мати тільки фосфортіоатні зв'язки, але можуть бути використані олігонуклеотиди з іншими нуклеотидними зв'язками. В одному з варіантів винаходу, всі нуклеотиди мають фосфодіефірні зв'язки. Вважається, що для введення у головний/спинний 28