Трансгенна кукурудза das-59122-7, стійка до комах, і способи її виявлення
Номер патенту: 97088
Опубліковано: 10.01.2012
Автори: Крессмен Роберт Ф. Джр., Крон Тодд Л., Нарва Кеннет Едвін, Мейер Сандра Е., Хертнетт Лоуук Мері Е., Олсон Пол Д., Хейкімі Салім М., Моелленбек Деніел, Лакрінг Ебігейл К., Хондред Девід, Жанг Джиан, Сандерс Крег Д., Бінг Джеймс Вейн, Ванг Джимей, Гупта Манджу, Жонг Ган-Юан
Формула / Реферат
1. Набір для ідентифікації події DAS-59122-7 у біологічному зразку, що виявляє специфічний регіон DAS-59122-7, який відрізняється тим, що він містить принаймні перший праймер, який упізнає послідовність у SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, і додатково містить принаймні другий праймер, який упізнає нуклеотидну послідовність у послідовності SEQ ID NO: 24.
2. Набір за п. 1, який відрізняється тим, що вказані принаймні перший і другий праймери відповідно містять пару послідовностей, вибраних із групи, що складається з:
а) послідовностей SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 1;
b) послідовностей SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 9;
с) послідовностей SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 17;
d) послідовностей SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 17; та
e) послідовностей SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37.
3. Набір для виявлення ДНК, який відрізняється тим, що він містить принаймні одну молекулу ДНК достатньої довжини суміжних нуклеотидів, гомологічну або комплементарну до SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 22, яка функціонує як ДНК праймер або специфічний зонд для події маїсу DAS-59122-7 та його нащадка.
4. Спосіб ідентифікації події DAS-59122-7 у біологічному зразку, який відрізняється тим, що він має у своєму складі виявлення специфічного регіону DAS-59122-7 ампліфікацією фрагмента ДНК з нуклеїнової кислоти, наявної у вказаному біологічному зразку, із використанням полімеразної ланцюгової реакції принаймні двома праймерами, причому вказаний перший праймер упізнає послідовність у SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, а другий праймер упізнає послідовність у SEQ ID NO: 24.
5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 1 відповідно.
6. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 9 відповідно.
7. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 17 відповідно.
8. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 17відповідно.
9. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37 відповідно.
10. Спосіб виявлення наявності ДНК, що відповідає події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23 , у зразку, який відрізняється тим, що він включає:
(а) контактування зразка, що містить ДНК маїсу, з полінуклеотидним зондом, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з ДНК маїсу події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23, і не гібридизується у вказаних суворих умовах гібридизації із ДНК рослини маїсу, що не є DAS-59122-7;
(b) піддавання зразка та зонда суворим умовам гібридизації; та
(c) виявлення гібридизації зонда із ДНК, в якому виявлення гібридизації вказує на наявність події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що включає виявлення наявності інсерції події DAS-59122-7 у тканині кукурудзи, що складається із:
(а) контактування зразка вказаної тканини кукурудзи з полінуклеотидним зондом, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з однією або більше послідовностями ДНК, вибраними з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та їх комплементами;
(b) піддавання вказаного зразка і зонда суворим умовам гібридизації; та
(c) аналізування щодо гібридизації зонда.
12. Ізольований нуклеотидний праймер ДНК, який відрізняється тим, що він містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 і 37, або її комплемент.
13. Ізольований нуклеотидний праймер ДНК за п. 12, який відрізняється тим, що він містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10, 17 і 18, або її комплемент.
14. Спосіб підтвердження чистоти насіння або скринінгу насіння щодо наявності події DAS-59122-7, який відрізняється тим, що він має у своєму складі виявлення специфічного регіону DAS-59122-7 за допомогою специфічного праймера або зонду, який специфічно упізнає послідовність у SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 22, у зразку насіння.
15. Рослина кукурудзи, стійка до комах, або її частини, яка відрізняється тим, що ДНК, яка містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану із SEQ ID NO: 21, 22, 23, 32, 33, 34 і 35, та її комплементи, становить частину геному рослини, або рослина покоління згаданої рослини кукурудзи, стійкої до комах, і яка відрізняється тим, що ДНК, яка містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та її комплементи, становить частину геному рослини покоління.
16. Насіння рослини за п. 15, яке відрізняється тим, що воно містить вказану ДНК, що містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану із SEQ ID NO: 21, 22, 23, 32, 33, 34 і 35, та її комплементи.
17. Пара ізольованих послідовностей ДНК, яка відрізняється тим, що кожна послідовність містить принаймні десять нуклеотидів, і тим, що при використанні разом у процедурі ампліфікації ДНК вони виробляють амплікон, що є діагностичним для події DAS-59122-7, і тим, що кожну послідовність вибирають із нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 23 або її комплементу.
18. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 17, яка відрізняється тим, що кожну послідовність вибирають із нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з:
а) послідовності SEQ ID NO: 21 або її комплементу; та
b) послідовності SEQ ID NO: 22 або її комплементу.
19. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 18, яка відрізняється тим, що кожна послідовність містить принаймні 10 нуклеотидів із SEQ ID NO: 21 та SEQ ID NO: 22, в якій кожна послідовність знаходиться на протилежних сторонах послідовності, яка є діагностичною для інсерції події DAS-59122-7.
20. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 19, яка відрізняється тим, що вказану пару праймерів вибирають із групи, яка складається із SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 і 37 та їх комплементів.
21. Набір для виявлення ДНК, який відрізняється тим, що він містить полінуклеотидний зонд, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з однією або більше послідовностями ДНК, вибраними з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та їх комплементами.
Текст
1. Набір для ідентифікації події DAS-59122-7 у біологічному зразку, що виявляє специфічний регіон DAS-59122-7, який відрізняється тим, що він містить принаймні перший праймер, який упізнає послідовність у SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, і додатково містить принаймні другий праймер, який упізнає нуклеотидну послідовність у послідовності SEQ ID NO: 24. 2. Набір за п. 1, який відрізняється тим, що вказані принаймні перший і другий праймери відповідно містять пару послідовностей, вибраних із групи, що складається з: а) послідовностей SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 1; b) послідовностей SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 9; с) послідовностей SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 17; d) послідовностей SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 17; та e) послідовностей SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37. 3. Набір для виявлення ДНК, який відрізняється тим, що він містить принаймні одну молекулу ДНК достатньої довжини суміжних нуклеотидів, гомологічну або комплементарну до SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 22, яка функціонує як ДНК праймер або специфічний зонд для події маїсу DAS-591227 та його нащадка. 4. Спосіб ідентифікації події DAS-59122-7 у біологічному зразку, який відрізняється тим, що він має у своєму складі виявлення специфічного регіону DAS-59122-7 ампліфікацією фрагмента ДНК з нуклеїнової кислоти, наявної у вказаному біологічному зразку, із використанням полімеразної ланцюгової реакції принаймні двома праймерами, причому вказаний перший праймер упізнає послідовність у SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20, а другий праймер упізнає послідовність у SEQ ID NO: 24. 5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO: 1 відповідно. 6. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 9 відповідно. 7. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 17 відповідно. UA (21) a200704613 (22) 28.09.2005 (24) 10.01.2012 (86) PCT/US2005/034947, 28.09.2005 (31) 60/614,225 (32) 29.09.2004 (33) US (46) 10.01.2012, Бюл.№ 1, 2012 р. (72) БІНГ ДЖЕЙМС ВЕЙН, US, КРЕССМЕН РОБЕРТ Ф. ДЖР., US, ГУПТА МАНДЖУ, US, ХЕЙКІМІ САЛІМ М., US, ХОНДРЕД ДЕВІД, US, КРОН ТОДД Л., US, ХЕРТНЕТТ ЛОУУК МЕРІ Е., US, ЛАКРІНГ ЕБІГЕЙЛ К., US, МЕЙЕР САНДРА Е., US, МОЕЛЛЕНБЕК ДЕНІЕЛ, US, НАРВА КЕННЕТ ЕДВІН, US, ОЛСОН ПОЛ Д., US, САНДЕРС КРЕГ Д., US, ВАНГ ДЖИМЕЙ, US, ЖАНГ ДЖИАН, US, ЖОНГ ГАНЮАН, US (73) ПІОНЕР ХАЙ-БРЕД ІНТЕРНЕШНЛ, ІНК., US, ДАУ АГРОСАЙНСЕС ЛЛС, US, І. АЙ. ДЮ ПОН ДЕ НЕМУР ЕНД КОМПАНІ, US (56) RICKER KARIN: "Biotechnology consultation note to the file BNF No. 000081" U.S. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, [Online] 28 September 2004 (2004-09-28), pages 1-6 HUNST P. L. AND ROOD T.: "Application for determination of nonregulated status for B. t. Cry34/35Ab1 insect-resistant, glufosinate-tolerant corn: corn line 59122" U.S. DEPARTMENT OF AGRICULTURE, ANIMAL AND PLANT HEALTH INSPECTION SERVICE, - 7 September 2004 (200409-07) pages 1-237 DATABASE EMBL [Online] 28 August 2003 (200308-28), "PUFTW67TB ZM_0.6_1.0_KB Zea mays genomic clone ZMMBTa0732K13, genomic survey sequence." retrieved from EBI accession no. EM_PRO:CG069192 Database accession no. CG069192 ELLIS ET AL: "Novel Bacillus thuringiensis Binary Insecticidal Crystal Proteins Active on Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera vergifera LeConte" APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, WASHINGTON,DC, US, vol. 68, no. 3, March 2002 (2002-03), pages 1137-1145 WO А 8402913, 02.08.1984 WO А 0114417, 01.03.2001 WO А 03052073, 26.06.2003 2 (19) 1 3 97088 4 8. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 17 відповідно. 9. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказані перший і другий праймери містять послідовності SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37 відповідно. 10. Спосіб виявлення наявності ДНК, що відповідає події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23 , у зразку, який відрізняється тим, що він включає: (а) контактування зразка, що містить ДНК маїсу, з полінуклеотидним зондом, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з ДНК маїсу події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23, і не гібридизується у вказаних суворих умовах гібридизації із ДНК рослини маїсу, що не є DAS-59122-7; (b) піддавання зразка та зонда суворим умовам гібридизації; та (c) виявлення гібридизації зонда із ДНК, в якому виявлення гібридизації вказує на наявність події DAS-59122-7, що містить SEQ ID NO: 23. 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що включає виявлення наявності інсерції події DAS59122-7 у тканині кукурудзи, що складається із: (а) контактування зразка вказаної тканини кукурудзи з полінуклеотидним зондом, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з однією або більше послідовностями ДНК, вибраними з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та їх комплементами; (b) піддавання вказаного зразка і зонда суворим умовам гібридизації; та (c) аналізування щодо гібридизації зонда. 12. Ізольований нуклеотидний праймер ДНК, який відрізняється тим, що він містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 і 37, або її комплемент. 13. Ізольований нуклеотидний праймер ДНК за п. 12, який відрізняється тим, що він містить послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 2, 8, 9, 10, 17 і 18, або її комплемент. 14. Спосіб підтвердження чистоти насіння або скринінгу насіння щодо наявності події DAS-591227, який відрізняється тим, що він має у своєму складі виявлення специфічного регіону DAS59122-7 за допомогою специфічного праймера або зонду, який специфічно упізнає послідовність у SEQ ID NO: 21 або SEQ ID NO: 22, у зразку насіння. 15. Рослина кукурудзи, стійка до комах, або її частини, яка відрізняється тим, що ДНК, яка містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану із SEQ ID NO: 21, 22, 23, 32, 33, 34 і 35, та її комплементи, становить частину геному рослини, або рослина покоління згаданої рослини кукурудзи, стійкої до комах, і яка відрізняється тим, що ДНК, яка містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та її комплементи, становить частину геному рослини покоління. 16. Насіння рослини за п. 15, яке відрізняється тим, що воно містить вказану ДНК, що містить принаймні одну нуклеотидну послідовність, вибрану із SEQ ID NO: 21, 22, 23, 32, 33, 34 і 35, та її комплементи. 17. Пара ізольованих послідовностей ДНК, яка відрізняється тим, що кожна послідовність містить принаймні десять нуклеотидів, і тим, що при використанні разом у процедурі ампліфікації ДНК вони виробляють амплікон, що є діагностичним для події DAS-59122-7, і тим, що кожну послідовність вибирають із нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 23 або її комплементу. 18. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 17, яка відрізняється тим, що кожну послідовність вибирають із нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з: а) послідовності SEQ ID NO: 21 або її комплементу; та b) послідовності SEQ ID NO: 22 або її комплементу. 19. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 18, яка відрізняється тим, що кожна послідовність містить принаймні 10 нуклеотидів із SEQ ID NO: 21 та SEQ ID NO: 22, в якій кожна послідовність знаходиться на протилежних сторонах послідовності, яка є діагностичною для інсерції події DAS-591227. 20. Пара ізольованих послідовностей ДНК за п. 19, яка відрізняється тим, що вказану пару праймерів вибирають із групи, яка складається із SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 36 і 37 та їх комплементів. 21. Набір для виявлення ДНК, який відрізняється тим, що він містить полінуклеотидний зонд, який гібридизується у суворих умовах гібридизації з однією або більше послідовностями ДНК, вибраними з групи, яка складається із SEQ ID NO: 32, 33, 34 і 35, та їх комплементами. Галузь техніки, до якої належить винахід Втілення даного винаходу стосуються галузі молекулярної біології рослин, зокрема, втілення винаходу стосується ДНК конструкту для надання рослинам резистентності до комах. Втілення винаходу, конкретніше, стосуються стійкої до комах рослини кукурудзи DAS-59122-7 і випробувань для виявлення наявності ДНК рослини кукурудзи DAS59122-7 в зразку і композиціях. Передумови створення винаходу Втілення цього винаходу стосується стійкої до комах кукурудзи (Zea mays) рослини DAS-59122-7, також стосується лінії маїсу DAS-59122-7 або маїсу DAS-59122-7, а також до експресії ДНК конструкту кукурудзи рослини DAS-59122-7 і виявлення регіону вставки трансгенної/фланкуючої інсерційної ділянки в рослині кукурудзи DAS-59122-7 і його нащадку. Кукурудза - це важлива сільськогосподарська культура і первинне поживне джерело в багатьох регіонах світу. Пошкодження, що викликаються 5 паразитами, якими є комахи, - це головний чинник у втраті зернових урожаїв світу, незважаючи на використовування захисних заходів, як, наприклад, хімічні пестициди. Зважаючи на це, резистентність комахи була генетично сконструйована в урожаї, як, наприклад, зерно для того, щоб управляти пошкодженням комахи і скорочувати потребу для традиційних хімічних пестицидів. Одна група генів, які були використані для продукції трансгенних, стійких до комах урожаїв, - це дельта-ендотоксини Bacillus thuringiensis (B.t.). Дельта-ендотоксини були успішно експресовані в урожаях рослин, таких, як, наприклад, бавовна, картопля, рис, соняшник, кукурудза, також виявилося, що вони забезпечують також чудовий контроль над комахамипаразитами. Perlak, FJ et al (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, FJ. et al. (1993) Plant Mol. Biol 22: 313-321; Fujimoto H. et al (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Тu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; PCT publication number WO 01/13731; та Bing JW et al (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO). Відомо, що експресія чужорідних генів у рослинах, залежить від їх розташування в геномі рослини, можливо завдяки хроматиновій структурі (наприклад, гетерохроматин) або близькості транскрипційних регуляторних елементів (наприклад, енхансерів), що є близькими до сайту інтеграції (Weising et al, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). У той самий час, наявність трансгену в інших ділянках геному вплине на загальний фенотип рослини іншими шляхами. З цієї причини, часто необхідно скринінгувати багато явищ для того, щоб ідентифікувати явище, яке характеризується оптимальною експресією гену, який становить інтерес. Наприклад, спостерігалося в рослинах і в інших організмах, що може бути широка варіація в рівнях експресії введеного гена серед явищ. Можуть також бути відмінності в просторових або тимчасових типах експресії, наприклад відмінності у відносній експресії трансгену в різних тканинах рослини, які можуть не відповідати типам експресії, очікуваним від наявного регуляторного елемента в конструкції гену, що вводять. Для цього, звичайно, виробляють від сотень до тисячі різних явищ, скринінгують такі явища заради єдиного явища, яке має такий рівень та тип експресії трансгену, що є придатним для комерційних цілей. Подія, яка має рівень або тип експресії трансгену, корисна для просування далі трансгену в інші генетичні фони половим ауткросингом шляхом використовування методів стандартного розведення. Нащадки таких схрещувань мають особливості експресії трансгену оригінального трансформанту. Ця стратегія використовується для того, щоб гарантувати надійну експресію гена в низці різновидів, які добре пристосовуються до умов локального росту. Було б вигідно змогти виявити наявність специфічного явища для того, щоб визначити, чи містить нащадок полового перехрещування трансген, що становить інтерес. Крім того, метод виявлення того, чи є специфічне явище корисним для підкорення правилам, які вимагають передринкового схвалення і маркування їжі, отриманої з урожаїв 97088 6 рекомбінантних рослин, наприклад, або для використовування в екологічному контролі, контролі ознак в урожаях у полі, або контролі продукції, отриманої від урожаю, також як і для використовування для гарантування відповідності об'єкта регулярним або договірним умови. Можливо виявити присутність трансгену будьяким методом виявлення нуклеїнової кислоти, відомим у рівні техніки, наприклад, але не обмежуючись, полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) або гібридизацією ДНК з використанням нуклеїнових кислот як зондів. Ці методи виявлення загалом фокусуються на генетичних елементах, що часто використовуються, як, наприклад, промотори, термінатори, маркери генів і т.п., тому що для багатьох ДНК - конструктів кодуючі регіони є взаємозамінними. В результаті такі методи не можуть бути корисні для розрізняння різних явищ, особливо тих, що одержані з використанням того самого ДНК конструкту або дуже подібного конструкту, якщо тільки послідовність фланкуючої ДНК, сусідньої до інсертованого гетеролокусу ДНК не відома. Наприклад, специфічне випробування ПЛР описане в патенті США за номером 6,395,485, для виявлення елітного GAT-ZM1. Відповідно, для ідентифікації DAS-59122-7 було б бажано мати метод простий і такий, що дасть змогу відрізнити. Втілення цього винаходу стосується способів виробництва і селекції, стійкої до комах рослини. Конкретніше, ДНК конструкт існує за умови, коли експресія його в клітинах рослини надає рослині резистентності до комах. Згідно з одним з аспектів винаходу, ДНК конструкт, здатний до введення всередину і реплікації у клітинах-хазяях, так що його експресія в клітинах рослини надає рослині резистентності до комах. ДНК конструкт містить молекулу ДНК, означену як РНІ17662А, що включає три (3) касети експресії трансгену. Перша касета експресії включає молекулу ДНК, що включає промотор, 5' нетрансльований екзон та перший інтрон гену убіквітину маїсу (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689 and Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218), сполучений з молекулою ДНК, що кодує B.t. дельтаендотоксин, ідентифікований, як Cry34Ab1 (U.S. Pat. N.6,127,180, 6,624,145 та 6,340,593), що з'єднано з молекулою ДНК, що включає термінатор транскрипції Pin II, ізольований з картоплі (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1:115-122). Друга касета експресії ДНК-конструкту включає молекулу ДНК, що кодує промотор пероксидази пшениці (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 171174), сполучений з молекулою ДНК, що кодує B.t. дельта-ендотоксин, ідентифікований, як Cry34Ab1 (U.S. Pat. N.6,083,499, 6,548,291 та 6,340,593), що з'єднано з молекулою ДНК, що включає термінатор транскрипції Pin II, ізольований з картоплі (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1: 115-122). Третя касета експресії ДНК-конструкту включає молекулу ДНК промотору 35S вірусу каліфорнійської мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Odell J.T. et al (1985) Nature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59); сполучений з молекулою ДНК, що кодує ген фосфінотрицинацетилтрансферази (PAT), сполучений з молекулою ДНК, що 7 включає 3'-транскрипційний термінатор (CaMV) 35S (дивіться Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59). Також забезпечено клітини, що містять ДНК-конструкт. Згідно з іншим втіленням винаходу, композиції і способи, що забезпечують ідентифікацію нової рослини кукурудзи, позначеної DAS-59122-7, причому способи засновані на праймерах або зондах, які специфічно визнають 5' та/або 3'-фланковані послідовності DAS-59122-7. Молекули ДНК існують за умови, якщо включають послідовності праймера, що використовується у ПЛР реакції, з одержанням амплікону, який є унікальним до трансгену DAS- 59122-7. Ці молекули можуть вибиратися з групи, що складається з: і комплементи цього. Рослина кукурудза і нащадки, що охоплюють ці молекули, є втіленням цього винаходу. Надалі передбачені й комплекти, що використовують ці послідовності праймера для ототожнення DAS- 59122-7. Додаткове втілення винаходу стосується специфічних фланкуючих послідовностей DAS-591227, описаних тут, і які можуть використовуватися для того, щоб розробляти специфічні ідентифікаційні методи для DAS-59122-7 у біологічних зразках. Конкретніше, винахід стосується 5' та/або 3' фланкуючих ділянок DAS-59122-7, SEQ ID NO: 19, 5' фланкерів і SEQ ID NO: 20, 3' фланкерів відповідно, які можуть використовуватися для розробки специфічних праймерів і зондів. Подальше втілення винаходу стосується ідентифікаційних методів щодо наявності DAS-59122-7 у біологічних зразках, заснованих на використовуванні таких специфічних праймерів або зондів. Згідно з іншим втіленням винаходу, забезпечено методи виявлення наявності ДНК, відповідної кукурудзі DAS-59122-7 у зразку. Такі методи охоплюють: (а) контакт зразка, що містить ДНК, з набором праймера ДНК, який, при використанні в реак 97088 8 ції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК, екстрагованої з кукурудзи DAS-59122-7, продукує амплікон, який є діагностичним для кукурудзи DAS-59122-7; (b) виконання реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, таким чином одержуючи амплікон; і (с) виявлення амплікону. Молекули ДНК, які охоплюють новий трансгенний/фланкуючий інсерційний регіон, SEQ ID NO: 21, 5' фланкер плюс 1000 інтернальний і SEQ ID NO: 22, 3' фланкер плюс 1000 інтернальних і відповідні або додаткові до SEQ ID NO: 21 і SEQ ID NO: 22 є втіленням цього винаходу. Послідовності ДНК, які охоплюють новий трансгенний/фланкуючий інсерційний регіон, SEQ ID NO: 21, є об'єктом винаходу. Послідовності ДНК, які містять достатню довжину полінуклеотидної послідовності трансгену, який включає послідовність інсерції трансгену і достатню довжину полінуклеотидної послідовності геному кукурудзи та/або фланкуючу послідовність кукурудзи рослини DAS-59122-7 SEQ ID NO: 21, який може бути корисним як послідовність праймера для продукції ампліконового діагностичного продукту для рослини маїсу DAS-59122-7, включені. Крім того, одержуються послідовності ДНК, які включають новий трансгенний/фланкуючий інсерційний регіон, SEQ ID NO: 22. Включені послідовності ДНК, які містять достатню довжину полінуклеотидної послідовності інсерції трансгену і достатню довжину полінуклеотидної послідовності геному кукурудзи та/або фланкуючу послідовність кукурудзи рослини DAS-59122-7 SEQ ID NO: 21, корисні як послідовності праймера для продукції ампліконового діагностичного продукту для рослини маїсу DAS-59122-7. Згідно з іншим варіантом виконання винаходу, послідовності ДНК, які містять принаймні 11 або більше нуклеотидів частини трансгену послідовності ДНК SEQ ID NO: 21 або комплементарні йому, і подібна довжина 5'-франкованої послідовності SEQ ID NO: 21 ДНК кукурудзи або комплементарні їм використовувані як праймери у методах ампфлікації ДНК. Амплікони, продуковані з використанням даного праймера, використовують для діагностики кукурудзи DAS-59122-7. Таким чином, варіанти виконання винаходу також включають амплікони, продуковані ДНК праймерами, гомологічними або комплементарними SEQ ID NO: 21. Згідно з іншим варіантом виконання винаходу, послідовності ДНК, які містять принаймні 11 або більше нуклеотидів частини трансгену послідовності ДНК SEQ ID NO: 22 або комплементарні йому, і подібна довжина 3'-фланкованої послідовності SEQ ID NO: 22 ДНК кукурудзи або комплементарні їм використовувані як праймери у методах ампфлікації ДНК. Амплікони, продуковані з використанням даного праймера, використовують для діагностики кукурудзи DAS-59122-7. Таким чином, варіанти виконання винаходу також включають амплікони, продуковані ДНК праймерами, гомологічними або комплементарними SEQ ID NO: 22. Конкретніше, пара молекул ДНК, що включають набір праймерів ДНК, де молекули ДНК ідентифіковані як SEQ ID NO: 18 або комплементарні їй і SEQ ID NO: 1 або комплементарні їй; SEQ ID 9 NO: 2 або комплементарні їй і SEQ ID NO: 17 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 10 або комплементарні їй і SEQ ID NO: 9 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 8 або комплементарні їй і SEQ ID NO: 17 або комплементарні їй; і SEQ ID NO: 36 або комплементарні їй і SEQ ID NO: 37 або комплементарні їй є варіантом виконання винаходу. Наступні варіанти виконання винаходу включають амплікон, який включає молекули ДНК SEQ ID NO: 18 і SEQ ID NO:1; амплікон, який включає молекули ДНК SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 17; амплікон, який включає молекули ДНК SEQ ID NO: 10 і SEQ ID NO: 9; амплікон, який включає молекули ДНК SEQ ID NO: 8 і SEQ ID NO: 17; і амплікон, який включає молекули ДНК SEQ ID NO: 36 і SEQ ID NO: 37. Наступні варіанти виконання винаходу включають наступні праймери, що їх використовують у виявленні або характеристиці DAS-59122-7: SEQ ID NO: 11 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 5 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 4 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 7 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 6 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 3 або доповнення її; SEQ ID NO: 18 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 14 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 13 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 15 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 17 або комплементарні їй; SEQ ID NO: 16 або комплементарні їй; і SEQ ID NO: 12 або комплементарні їй. Наступні варіанти виконання також включають амплікони, продуковані за допомогою пари будьякого з праймерів, перерахованих вище. Згідно з іншим варіантом втілення винаходу, методи виявлення наявності молекули ДНК, відповідної DAS-59122-7 у зразку, такі методи включають: (а) контактування зразка, що включає ДНК, яка є екстрагованою з рослини кукурудзи із ДНКзондом, молекулою, яка гібридизується у строгих умовах гібридизації з ДНК, яка є екстрагованою з рослини кукурудзи із зондом ДНК DAS-59122-7, і не гібридизується у строгих умовах гібридизації з контрольною ДНК рослини кукурудзи; (b) піддання зразка і зонда строгим умовам гібридизації; і (с) виявлення гібридизації у зонді ДНК. Детальніше, щодо методу виявлення наявності молекули ДНК, відповідної DAS-59122-7 у зразку: такі методи включають: (а) контактування зразка, що включає ДНК, яка є екстрагованою з рослини кукурудзи із ДНК-зондом, молекулою, яка складається з послідовностей, які унікальні стосовно послідовності ділянки з'єднання, де зазначена молекула ДНКзонду гібридизується у строгих умовах гібридизації з ДНК яка є екстрагованою з рослини кукурудзи із зондом ДНК DAS-59122-7, і не гібридизується у строгих умовах гібридизації з контрольною ДНК рослини кукурудзи; (b) піддання зразка і зонда строгим умовам гібридизації; і (с) виявлення гібридизації у зонді ДНК. Крім того, передбачено комплект та методи для ідентифікації DAS-59122-7 у біологічному зразку, який знаходить DAS-59122-7 за специфічним регіоном у межах SEQ ID, NO: 23. Передбачено молекули ДНК, що включають принаймні одну сполучну послідовність DAS59122-7, вибрану з групи, що складається з SEQ 97088 10 ID, NO: 32, 33, 34, і 35 і комплементарні їм; де сполучна послідовність охоплює з'єднання між гетерологічною ДНК, інсертованою до геному, та ДНК з клітин кукурудзи, фланковану в сайті інсерції, тобто фланковану ДНК, та визначення DAS-59122-7. Згідно з іншим втіленням винаходу, методи одержання стійкої до комах рослини кукурудзи, включають етапи: (а) статевий кросинг першої батьківської лінії рослини, яка містить касети експресії згідно з винаходом, що надає резистентності до комах, і другої батьківської лінії рослини, що не надає резистентності до комах, одержуючи, таким чином, множину нащадків рослини; і (b) селекцію нащадків рослини, що є резистентними до комах. Такі методи можуть, необов'язково, включати подальший етап поворотного схрещування нащадка до другої батьківської лінії рослини до одержання чистої лінії рослини кукурудзи, що є резистентною до комах. Подальше втілення винаходу передбачає спосіб одержання рослини кукурудзи, що є стійкою до комах, що включає трансформацію клітин кукурудзи ДНК-конструктом PHI 7662A (SEQ ID, HI: 24), перетворюючи трансформовану клітину кукурудзи на рослину кукурудзи, вибираючи рослину кукурудзи, що є резистентною до комах, і далі перетворюючи рослину кукурудзи на фертильну рослину кукурудзи. Фертильна рослина кукурудзи може бути обпиленою або схрещеною зі здатними до самоопилювання видами кукурудзи для одержання потомства, стійкого до комах. Інше втілення винаходу, крім того, стосується набору для визначення ДНК для ідентифікації маїсу DAS-59122-7 у біологічних зразках. Набір містить перший праймер, який специфічно визнає 5' або 3' фланковані ділянки DAS-59122-7, і другий праймер, який специфічно визнає послідовність у межах чужорідної ДНК DAS-59122-7, або в межах фланкуючої ДНК, для застосування в протоколі ПЛР. Подальше втілення винаходу стосується набору для ідентифікації події DAS-59122-7 у біологічних зразках, які стосується набору для ідентифікації DAS-59122-7 у біологічних зразках, де набір включає специфічний зонд, що має послідовність, яка відповідає або комплементарна до послідовності, що в межах від 80% до 100% послідовності ідентична специфічному регіону DAS-591227. Послідовність зонда відповідає специфічному регіону, що включає частину 5' або 3' фланкуючого регіону DAS-59122-7. Методи й набори, що є предметом даного винаходу, можуть використовуватися для різних цілей, що включають, але й не обмежені до, як, наприклад, наступних: для ідентифікації DAS-591227 у рослинах, рослинному матеріалі або, наприклад, у продукції, що включає, але не обмежена таким: продукти харчування або корм (свіжі або оброблені), або отримані з рослинного матеріалу; додатково або альтернативно, методи й набори можуть використовуватися для того, щоб ідентифікувати трансгенний рослинний матеріал з метою відділення трансгенного матеріалу від нетрансгенного; додатково або альтернативно, методи й набори можуть використовуватися для того, щоб визначити якість рослинного матеріалу, який міс 11 тить маїс DAS-59122-7. Набори можуть також містити реактиви й матеріали, необхідні для здійснення методу виявлення. Подальше втілення цього винаходу стосується рослини кукурудзи DAS-59122-7 або його частин, які включають, але не обмежені до, пилок, насінні зачатки, вегетативні клітини, ядра клітин пилку і ядра яйцеклітин рослини DAS-59122-7 і нащадків, одержаних від неї. Рослина й насіння DAS-591227, від якого молекули ДНК праймера забезпечують специфічний продукт амплікон, є втіленням винаходу. Для кращого розуміння вищевикладених та інших аспектів винаходу надається наступні детальний опис винаходу й супровідні креслення. Короткий опис фігур Фігура 1. Послідовність ДНК (SEQ ID, № 23), що відображує трансгенну інсерцію РНІ17662А, також як і послідовності, що фланкують трансгенну інсерцію. 5' і 3' граничні регіони, bр 1 до bр 2593 та bр 9937 до bр 11922, відповідно, підкреслені. Дві різні нуклеотидні ділянки (bр 6526 і bр 6562), співставлені трансформуючою плазмідою РНР 17662, позначено жирним шрифтом і підкреслено. Фігура 2. Схематична діаграма регіону інсерції B.t. Cry34/35Abl DAS-59122-7 поділена на три окремі секції; 5'-кінцевий регіон геномної ДНК кукурудзи, інтактна вставка Т-ДНК, і 3'-кінцевий регіон геномної ДНК кукурудзи. Дві стрілки внизу діаграми вказують на крапки початку та кінця послідовності вставки, отриманої від скринінгу з 5' і 3'фрагментів геному. Інші бокси внизу діаграми інсерції зображують фрагменти ПЛР, які були ампліфіковані з геномної ДНК DAS-59122-7 і секвеновані для того, щоб кепувати інтактну вставку ТДНК і регіони точки початку з'єднання і 5' і 3' кінців. Фігура 3. Схематична діаграма регіону інсерції B.t. Cry34/35Abl DAS-59122-7 поділена на три окремі секції; 5'-кінцевий регіон геномної ДНК кукурудзи, інтактна вставка Т-ДНК і 3'-кінцевий регіон геномної ДНК кукурудзи; бокси внизу діаграми інсерції зображають фрагменти ПЛР, локалізовані на кінцях геному, або через 5' і 3' регіони точки початку з'єднання вставки Т-ДНК у геном ну ДНК кукурудзи, яка була ампліфікована від геномної ДНК DAS-59122-7. Детальний опис винаходу Наступні визначення і методи наведені, щоб краще визначити даний винахід і визначити їх з погляду звичайного рівня техніки, використовуваного у практиці даного винаходу. Якщо інше не згадується, то терміни мають бути витлумаченими згідно з обумовленим використанням їх у звичайному релевантному рівні техніки. Визначення загальновживаних термінів у молекулярній біології можуть бути також знайдені в Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag; New York, 1991; and Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. Використовувана номенклатура для ДНК базується на наборі 37 CFR параграф 1.822. Використовуваний тут термін "який включає" означає "включає, але не обмежений до". Використовуваний тут термін "кукурудза" означає Zea mays або маїс і включає всі різновиди 97088 12 рослини, які походять з кукурудзи, включаючи дикі різновиди кукурудзи. Використовуваний тут термін "специфічна DAS-59122-7" означає послідовність нуклеотидів, яка є відповідною для ідентифікації DAS-59122-7 у рослинах, матеріалі рослини, або в продукції, яка включає, але не обмежена цим, як, наприклад, продукти харчування або корм (свіжі або оброблені), або отримані з рослинного матеріалу. Використовуваний тут термін "стійкий до комах" і "видалення комах-паразитів" означає одержання змін на стадії, коли комаха споживає рослину, зростає, та/або поведінці на будь-якій стадії її розвитку, що включає, але не обмежує: вбивство комахи; затримку зростання; запобігання відтвірної здатності; перешкоду здатності комасі споживати рослину та подібні. Використовуваний тут термін "пестицидна активність" та "інсектицидна активність" - це синонімічні за змістом терміни, що використовується для визначення активності організму або субстанції (як наприклад, протеїн), яка може вимірюватися численним включенням параметрів, але не обмежена ними, такими, як смертність паразита, втрата ваги паразита, атрофія паразита, репеленція паразита, й інші динамічні й фізичні зміни паразита після годування на та/або потрапляння до організму або субстанції протягом відповідного часу. Наприклад "протеїни пестицидів" - це протеїни, що виявляють пестицидну активність самі по собі або в комбінації з іншими протеїнами. "Кодуюча послідовність" означає послідовність нукледотидів, що кодують специфічні послідовності амінокислоти. Використовувані тут терміни "що кодують" або "кодовані", які використовується в контексті специфічної нуклеїнової кислоти, включають необхідну інформацію для трансляції послідовності нуклеотидів у вказаний протеїн. Інформація, якою протеїн кодується, є специфічною завдяки використовуванню кодонів. Нуклеїнова кислота, що кодує протеїн, може включати нертанслюючі послідовності (наприклад, інтрони), в межах транслюючих регіонів нуклеїнової кислоти або може не включати таких послідовностей, які є нетранслюючими (наприклад, як в кДНК). "Ген" означає фрагмент нуклеїнової кислоти, який експресує специфічний протеїн, і який включає регуляторні послідовності з боку 5'-кінця (5' некодуючі послідовності) й наступні (3' некодуючі послідовності) кодуючі послідовності. "Нативний ген" означає ген, який знайдено в природі з його власними регулярними послідовностями. "Химерний ген" означає будь-який ген, який не є нативним геном, і включає регулярні й кодуючі послідовності, які не знайдені разом у природі. Відповідно, химерний ген може включати регулярні послідовності й кодуючі послідовності, які отримані з різних джерел, або регулярні послідовності й кодуючі послідовності, отримані з того самого джерела, але організовані таким чином, що є в деякій мірі різним на відміну від гену, що знайдений в природі. "Ендогенний ген" означає нативний ген з того боку, що його природно локалізовано в геномі організму. "Чужорідний" означає матеріал, який не природно знаходиться, локалізується і становить 13 інтерес. Тому "чужорідна ДНК" може включати обидві рекомбінантні ДНК, також як і заново введена ДНК рослини. "Чужорідний ген" означає ген, який неприродно знайдено в рідному організмі, але який уведено в рідний організм трансфікцією гену. Чужорідні гени можуть включати нативні гени, вставлені в неприродній організм, або химерні гени. "Трансген" - це ген, який був уведений у геном шляхом трансформації. Сайт у геномі рослини, де було вставлено рекомбінантну ДНК, означає "сайт інсерції" або "цільовий сайт". Використовувані тут "вставка ДНК" означає гетеролокус ДНК у межах касет експресії, що використовуються для того, щоб трансформувати рослинний матеріал, тоді як "фланкуюча ДНК" може існувати або геномна ДНК, що є природно наявною в організмі, як, наприклад рослина, або чужорідна (гетеролокусна) ДНК, що є введеною завдяки процесу трансформації, який є зовнішнім до оригінальної вставки молекули ДНК, наприклад фрагменти, асоційовані завдяки трансформації. "Фланкуючий регіон" або "Фланкуюча послідовність", які використовуються тут, означають послідовності, що мають від принаймні двадцять (20) пар основ, краще - принаймні п'ятдесят (50) пар основ, і до п'яти тисяч (5000) пар основ, які розміщені або негайно вгору за течією і суміжний з, або негайно за течією і суміжний з оригінальною чужорідною молекулою вставки ДНК. Процедури трансформації, що приводять до випадкової інтеграції чужорідної ДНК, приводять у результаті до трансформації різних фланкуючих регіонів, характерних і унікальних для кожного трансформанту. Коли некомбінантну ДНК введено в рослину через традиційне схрещування, її фланкуючі регіони не будуть взагалі змінені. Трансформанти також будуть містити унікальні з'єднання між частиною гетерологічної вставки ДНК і геномною ДНК, або дві (2) частини геномної ДНК, або частини геретологічної ДНК "Сполучення" - це точка, де два (2) специфічних фрагменти ДНК з'єднуються. Наприклад, сполучення існує, де вставляють ДНК з приєднанням до фланкуючої ДНК. Точка сполучення також існує у трансформованому організмі, де два (2) фрагменти ДНК об'єднують до деякої міри, яка є модифікованою від природного організму. "Сполучна ДНК" означає ДНК, яка включає точку сполучення. Використовувана тут "гетерологічна" означає нуклеїнову кислоту, яка є такою нуклеїновою кислотою, що походить від чужорідних різновидів, або, якщо від тих самих різновидів, то суттєво модифікована в порівнянні з її природною формою в композиції та/або геномному локусі обережним людським втручанням. Наприклад, промотор, який лінкований з послідовністю гетерологічної ДНК, може бути похідним від різновидів, відмінних від того, від якого послідовність нуклеотидів була отримана, або, якщо від тих самих різновидів, промотор у природі не знайдений і лінкований з послідовністю нуклеотидів. Гетерологічний протеїн може походити від чужорідних різновидів, або, якщо від тих самих різновидів, то його суттєво модифіковано в порівнянні з його оригінальною формою обережним людським втручанням. 97088 14 "Регулярні послідовності" означають послідовності нуклеотидів, розміщених з боку 5'-кінця (5' некодуючі послідовності), в межах, або за течією (3' некодуючі послідовності) кодуючої послідовності, і які впливають на транскрипцію, РНК процесинг або стабільність, або трансляцію асоційованої кодуючої послідовності. Регулярні послідовності можуть включати промотори, послідовності трансляції, інтрони, й послідовності розпізнавання поліаденілації. "Промотор" означає нуклеотидну послідовність, здатну до контролювання експресії кодуючої послідовності або функціональної РНК. Взагалі кодуюча послідовність має 3' розташування в послідовності промотора. Послідовність промотора складається з проксимального й дистального елементів, які розташовані вгору стосовно елементів, які є як енхансерами. Відповідно, "енхансер" є послідовністю нуклеотидів, яка може стимулювати активність промотора, і може бути природженим елементом промотора або гетерологічним елементом, уставленим для того, щоб збільшити рівень тканинної специфічності промотора. Промотори можуть походити, в їх розмаїтті, від нативного гена, або бути складені з різних елементів, отриманих від різних промоторів, знайдених у природі, або навіть включати синтетичні сегменти нуклеотидів. Спеціалістам даної галузі зрозуміло, що різні промотори можуть направити експресію гена в різних тканинах або типах клітин, або на різних стадіях розробки, або у відповідь на різні природні умови. Промотори, які примушують фрагмент нуклеїнової кислоти до експресії в більшості типів клітин тривалий час, відомі як "конструктивні промотори". Нові промотори різних типів, корисних у клітинах рослини, постійно відкриваються; численні приклади можуть бути знайдені в Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. Крім того визнають, що оскільки в більшості випадків точні межі регуляторних послідовностей не були визначені цілком, то фрагменти нуклеїнових кислот різних довжин можуть мати ідентичну активність промотора. "Транслююча послідовність" означає послідовність нуклеотидів, розміщену між послідовністю промотора гена і кодуючою послідовністю. Транслююча послідовність представлена у повному процесингу мРНК, який починається з трансляції стартової послідовності. Транслююча послідовність може впливати на включення більшості параметрів, процесинг первинного транскрипту до мРНК, стабільність мРНК та/або ефективність трансляції. Приклади транслюючої послідовності були описані (Turner and Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3:225-236). "3' - некодуючі послідовності" означають нуклеотидні послідовності, розміщені впродовж кодуючої послідовності, і включають послідовності розпізнавання поліаденілації та інші послідовності, що кодують регулярні сигнали, здатні до процесингу мРНК або експресії гена. Сигнал поліаденілації звичайно характеризується за допомогою дії доповнення кислотних поліаденілатних елементів до 3' кінця мРНК прекурсора. Використовування різних 15 3' некодуючих послідовностей наведено у llngelbrecht et at. (1989) Plant Cell 1: 671-680. "Протеїн" або "поліпептид" - це ланцюг амінокислот, розташованих у специфічному порядку, визначеному кодуючою послідовністю в полінуклеотиді, який кодує поліпептид. ДНК конструкт - це набір молекул ДНК, зв'язаних разом, що включають одну або більше касет експресії. ДНК конструкт може бути плазмідою, яка здатна до однорідної реплікації в клітинах бактерій і містить різноманітні ферменти ендонуклеази, котрі обмежують сайти рестрикції, які корисні для введення молекул ДНК, що забезпечують функціональні генетичні елементи, тобто, промотори, інтрони, лідуючі послідовності, кодуючі послідовності, регіони 3'-термінації та інших; або ДНК конструкт може бути лінійним набором молекул ДНК, як, наприклад, касета експресії. Касета експресії, що розташовано в межах ДНК конструкту, охоплюють необхідні генетичні елементи, щоб забезпечити транскрипцію месенджера РНК. Касета експресії може розроблятися, щоб експресуватися у клітинах прокаріотів або клітинах еукаріотів. Касети експресії даного винаходу розробляються таким чином, щоб експресуватися в клітинах рослин. Молекули ДНК втілень винаходу забезпечені в касетах експресії для експресії в організмі, який становить інтерес. Касета включатиме 5' і 3' регулярні послідовності, лінковані з кодуючою послідовністю. "Дійсно зв'язані" означає, що послідовності нуклеїнових кислот, які лінковані або є суміжними та, де необхідно з'єднати два регіони кодування протеїну, суміжні і в тій же рамці зчитування. Дійсно зв'язані означає функціональне з'єднання між промотором і другою послідовністю, там, де послідовність промотора ініціює і медіює транскрипцію послідовності ДНК, що відповідна другій послідовності. Касета може додатково містити принаймні один додатковий ген, який є котрансформованим в організм. Альтернативно, додатковий ген (гени) може забезпечуватися на багаторазових касетах експресії або багаторазовому ДНК конструкті. Касета експресії включатиме у від 5' до 3' напрямку транскрипції: транскрибуючий та транслюючий регіони ініціації, регіон кодування, і транскрибуючий та транслюючий термінальні регіони, що функціонують в організмі, що є хазяїном. Транскрибуючий регіон ініціації (тобто промотор) може бути природним або аналогом, або чужорідним, або гетерологічним до рідного організму. Додатково промотор може бути природною послідовністю або альтернативною штучною послідовністю. Касети експресії можуть додатково містити 5' лідуючі послідовності в касеті експресії конструкту. Такі лідуючі послідовності можуть діяти для того, щоб збільшити трансляцію. Зрозуміло, що використовуваний тут термін "трансгенний" включає будь-яку клітину, лінію клітин, калус, тканину, частину рослини або рослину, генотип яких був змінений присутністю гетерологічної нуклеїнової кислоти, що включає ті трансгени, які змінені, також як і створені статевим кросингом або безстатевим розмноженням від початкового трансгену. Термін "трансгенний", використовува 97088 16 ний тут, не включає змінення геному (хромосомне або екстархромосомне), обумовлений бридингом рослин або природного походження, як, наприклад, випадкове перехресне запліднення, вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. Трансгенна "подія" здійснюється трансформацією клітин рослини за допомогою гетерологічного ДНК-конструкту (конструктів), включаючи касету експресії нуклеїнокої кислоти, яка охоплює трансген, що становить інтерес, регенерацію популяції рослин, що походять від вставки трансгену в геном рослини, і виділення специфічної рослини, що характеризується вставкою у специфічний геномний регіон. Подія характеризується фенотиповою експресією трансгену. На генетичному рівні подія - це частина генетичної структури рослини. Термін "подія" також стосується нащадка, одержуваного статевим оуткросингом між трансформантом та іншими різновидами, що включає гетерологічну ДНК. Навіть після того, як повторюваний зворотній кросинг рекурентному батькові, інсертована ДНК та фланкуюча ДНК від трансформованого батька, наявні в нащадку кросингу в тій самій хромосомній локації. Термін "подія" також стосується ДНК оригінального трансформанта, який включає вставлену ДНК та фланкуючу послідовність, сусідню до вставленої ДНК, що переміщено до нащадка, який одержує вставлену ДНК, включаючи трансген, що становить інтерес, як результат статевого кросингу однієї материнської лінії, яка включає вставлену ДНК (наприклад, оригінальний трансформант і нащадок, що походить від селфінгу) і материнська лінія, яка не містить вставлену ДНК. Стійка до комах рослина DAS-59122-7 може бути породжена від першого статевого кросингу першої материнської рослини кукурудзи, що складається з рослини кукурудзи, вирощеної від трансгенної рослини кукурудзи DAS-59122-7 і нащадка, що отримано трансформацією завдяки касетам експресії, що є втіленням даного винаходу, що надає резистентність до комах, і другу материнську рослину кукурудзи, що не є резистентною до комах, таким чином продукуючи множину перших нащадків рослини; а потім селекцію першого нащадка рослини, який стійкий до комах; і селфінг першого нащадка рослини, таким чином одержуючи множинну других нащадків рослини; а потім селекцію другого нащадка, який є рослиною, стійкою до комах. Ці етапи можуть, крім того, включати зворотній кросинг першого прогену - нащадка рослини, резистентної до комах або другого нащадка рослини, резистентного до комах другої материнської рослини кукурудзи або третьої материнської рослини кукурудзи, таким чином одержують рослину кукурудзи, резистентну до комах. Використовуваний тут термін "рослина" включає цілі рослини, органи рослини, (наприклад, стеблини, стовбури, корені тощо), насіння, клітини рослини, і нащадки вказаного. Частини трансгенних, щоб було зрозуміло в межах контексту винаходу, охоплюють, наприклад, клітини рослин, протопласти, тканини, калуси, ембріони, також, як і квітки, стовбури, плоди, стеблини, й корені, що 17 походять від трансгенних рослин або їх нащадків, наперед трансформованих за допомогою ДНК молекул даного винаходу, і, таким чином, включають принаймні частину трансгенних клітин, що також є втіленням даного винаходу. Використовуваний тут термін "клітина рослини" включає, без обмеження, зерна, суспензійні культури, ембріони, ділянки меристеми, тканини калусу, стеблини, корені, гаметофіти, спорофіти, пилок і мікроспори. Клас рослин, які можуть використовуватися в способах винаходу, є взагалі класом вищих рослин, здатних до способів трансформації, включаючи рослини, як однодольні, так і дводольні. "Трансформація" має на увазі передачу фрагмента нуклеїнової кислоти до геному організму хазяїна, приводячи, таким чином, до генетично стійкого спадкоємства. Організми - хазяїни, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, зазначено як "трансгенні" організми ("transgenic"). Приклади методів трансформації рослин включають трансформацію, опосередковану агробактеріями (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) і прискорену або "gene gun" технологію трансформації (Klein et al. (1987) Nature (London) 327: 70-73; U.S. Patent No. 4,945,050). Додаткові методи трасформації описано нижче. Тому, ізольовані полінуклеотиди за даним винаходом можуть бути уведені в рекомбінантний конструкт, звичайно, ДНК - конструкт, який здатний до введення всередину реплікації у клітині - хазяїні. Такий конструкт може бути вектором, який включає реплікаційну систему та послідовності, які здатні до транскрипції і трансляції поліпептиду, що кодує послідовність в наданій клітині - хазяїні. Цілий ряд векторів, придатних для стійкої трансфекції клітин рослин або для стабілізації рослинних трансгенів, був описаний, наприклад, у Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York); and Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Звичайно, вектори експресії рослини включають, наприклад, один або більше клонованих рослинних генів під контролем транскрипційних 5' і 3' регуляторних послідовностей і обраних домінантним маркером. Такі рослинні вектори експресії також можуть містити промотор регуляторний регіон (наприклад, контролюючий регуляторний регіон, що є індуцибельним або конструктивним, енвіронментально або девелопментально регулюючий, або регулюючий клітинно або тканинноспецифічну експресію), сайт початку ініціації транскрипції, рібосомальний зв'язуючий вузол, сигнал процесингу РНК, сайт терманації транскрипції, та/або сигнал поліаденілації. Також зрозуміло, що дві різні трансгенні рослини можуть бути зроблені таким чином, щоб забезпечити виключення, яке містить два незалежно окремо доданих, екзогенних гени. Селфінг відповідного нащадка може продукувати рослини, які є гомозиготами для обох доданих, екзогенних генів. Зворотній кросинг материнської рослини і прямий кросинг нетрансгенної рослини також можливі, 97088 18 оскільки існує вегетативне розмноження. Описи інших методів розмноження, які загально використовуються для різних цілей, можуть бути знайдені в одній з окремих довідок, наприклад, Fehr, в Методах Породження для Розробки Cultivar, Wilcos J. ed., Американське Суспільство Агрономії, Медісона Wis. (1987). "Зонд" - це ізольована нуклеїнова кислота, до якої приєднано детектор або молекулу репортера, наприклад радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або ензим. Такий зонд комплементарний до цільової нуклеїнової кислоти, в межах даного винаходу, до границі ізольованої ДНК з рослини кукурудзи DAS-59122-7 або з рослини кукурудзи або від зразка, який включає ДНК. Зонди, згідно з даним винаходом, включають не тільки кислоти дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові, але й поліаміди та інші матеріали зонда, які зв'язують, зокрема, послідовність цільової ДНК, і можуть використовуватися, щоб виявити наявність указаної послідовності цільової ДНК. "Праймери" - це ізольовані нуклеїнові кислоти, додані до комплементарної цільової ДНК шляхом гібридизації нуклеїнової кислоти, для того, щоб одержати гібрид між праймером і цільовою ділянкою ДНК, з використанням ДНК - полімерази. Пари праймера згідно з винаходом стосуються їх використання для ампліфікації цільової послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР) або іншими методами ампліфікації, обумовленими нуклеїновими кислотами. "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" - це технологія, що використовується для ампліфікації специфічних сегментів ДНК (див. U.S. 4,683,195 та 4,800,159; вказані тут як посилання). Зонди й праймери є достатньої довжини нуклеотиди, щоб зв'язати цільову ДНК послідовність у специфічних умовах гібридизації або умовах реакції, визначених оператором. Ця довжина може бути будь-якою довжиною, яка є достатньою для використання в методі виявлення. Загалом використовуються одинадцять (11) нуклеотидів, або більша довжина, вісімнадцять (18) нуклеотидів, або більша, двадцять два (22) нуклеотиди або більше. Такі зонди й праймери гібридизуються специфічно з цільовою послідовністю у високо строгих умовах гібридизації. Зонди і праймери, згідно із втіленням даного винаходу, можуть мати повну схожість послідовності ДНК комплементарних нуклеотидів з цільовою послідовністю, хоча зонди, відмінні від цільової ДНК послідовності і які зберігають здатність до гібридизації з послідовністю ДНК, можуть розроблятися вказаними методами. Зонди можуть використовуватися як праймери, але загалом використовуються для того, щоб зв'язатися із ДНК або РНК і не використовуються в процесі ампліфікації. Специфічні праймери можуть використовуватися для того, щоб ампліфікувати фрагмент інтеграції, щоб одержати амплікон, який може використовуватися як "специфічний зонд" для ідентифікації DAS-59122-7 у біологічних зразках. Коли зонд гібридизується з нуклеїновими кислотами біологічного зразка в умовах, які дозволяють приєднати зонд до зразка, цей зв'язок може вияв 19 лятися і тому дозволити виявити наявність DAS59122-7 у біологічному зразку. Таке виявлення зв'язаного зонда було описано в рівні техніки. У втіленні винаходу специфічний зонд - це послідовність, яка, в оптимальних умовах, гібридизується, особливо до регіону в межах 5' або 3' - фланкуючих регіонів, а також включає частину чужорідної ДНК. Специфічний зонд може включати послідовності, принаймні 80%, від 80 і до 85%, від 85 і до 90%, від 90 і до 95%, і від 95 і до 100% ідентичні (або комплементарні) специфічному регіону рослини. Методи для підготовки і використовування зондів і праймерів описані, наприклад, у Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, vol. 1-3, ed. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (далі "Sambrook et al, 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York, 1992 (with periodic updates) (далі - "Ausubel et al, 1992"); та Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Пари ПЛР праймера можуть походити від відомої послідовності, наприклад, за допомогою використовування комп'ютерних програм, що застосовують для мети, як наприклад інструментальний аналіз праймера ПЛР Vector NTI version 6 (Informax Inc., Bethesda MD); PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, Wl); and Primer (Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass). Додатково, послідовність може візуально скануватися і праймери, вручну можуть бути ідентифіковані, використовуючи директиви, відомі для спеціаліста в даній галузі техніки. Використовуваний тут "набір" означає набір реактивів з метою виконання втілень способу винаходу, конкретніше, визначення DAS-59122-7 у біологічних зразках. Набір, згідно з даним винаходом, може бути використаним, і його компоненти можуть бути специфічно укомплектовані, для цілей контролю (наприклад, чистота насіння) якості, виявлення DAS-59122-7 у матеріалі рослини, або матеріалі, що включає або отриманий від рослинного матеріалу, як наприклад, але не обмежуючи, харчові продукти або корми. "Рослинний матеріал", як використано тут, означає матеріал, отриманий від рослини. Праймери й зонди, засновані на фланкуючій послідовності ДНК вставки, що описано тут, можуть використовуватися для того, щоб підтвердити (і, якщо необхідно, для виправлення) описані послідовності конвекціональним методом, наприклад, за допомогою реклонування і секвенування таких послідовностей. Зонди і праймери нуклеїнових кислот, згідно з даним винаходом, гібридизуються в умовах строгої гібридизації до цільової ДНКпослідовності. Будь-яка специфічна гібридизація нуклеїнової кислоти або метод ампліфікації може використовуватися для того, щоб ідентифікувати наявність ДНК трансгену в зразку. Молекули нуклеїнових кислот або фрагменти їх здатні до специфічної гібридизації з іншими молекулами нуклеїнових кислот у певних обставинах. Як 97088 20 використовується тут, дві молекули нуклеїнових кислот, здатні до специфічної гібридизації одна з одною в тому випадку, якщо дві молекули здатні до формування антипаралельної, подвійної структури нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти комплементарна до іншої молекули нуклеїнової кислот, у тому випадку, якщо вони виявляють повну комплементарність. Як використовується тут, молекули виявляють повну комплементарність у тому випадку, коли кожний нуклеотид однієї з молекул комплементарний до нуклеотиду іншої. Дві молекули виявляють повну комплементарність у тому випадку, якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю для того, щоб вони залишилися нелінійними, як мінімум, в умовах низької строгості. Так само, молекули виявляють комплементарність, якщо вони можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю, щоб дозволяє їм залишитися нелінійними принаймні в умовах низької строгості. Вказані умови строгості описуються у Sambrook et al, 1989, and by Haymes et al, In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D. С (1985), відхилення від повної комплементарності, таким чином, дозволені до того випадку, коли такі відхилення цілком не запобігають ємності молекул, щоб сформувати подвійну структуру. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, для цього потрібно тільки бути достатньо комплементарними одна з одною, для того, щоб бути здатними сформувати стійку структуру, що є подвійною, що визначається специфічними концентраціями солей та розчинника, які застосовуються. У реакціях гібридизації, особливо, специфічних пост-постгібридизації, критичними чинниками є іонна сила і температура кінцевого водного розчину. Точка теплового розтоплення (Тm) - це температура (під певною іонною силою і рН), в якій 50% комплементарної цільової послідовності, відмінно гібридизується до відповідного зонда. Для гібридів ДНК - ДНК, Tm може наближатися згідно з Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267284: Tm=81.5°C+16.6 (log M)+0.41 (%GC)-0.61 (% form)-500/L; де Μ - це молярність моновалентних катіонів, %GC - це відсоток нуклеотидів гуанозину і цитозину в ДНК, % form - це відсоток формаміду в розчині гібридизації, і L - це довжина гібрида в базових парах. Tm зменшений близько на 1°С для кожного 1% розходження; тому, Tm, гібридизація, та/або водні умови, можуть бути скоректовані, для того, щоб гібридизуватися до послідовностей бажаної ідентичності. Наприклад, якщо знайдено послідовності з >90% ідентичності, Tm може зменшуватися 10°С. Загалом, строгі умови вибрані, щоб бути приблизно на 5°С нижчі, ніж Tm для специфічної послідовності і комплементарній їй, при певній іонній силі і рН. Проте, строго особливо умови можуть використовувати гібридизацію на 1, 2, 3, або 4°С нижче, ніж Tm; помірно строгі умови можуть використовувати гібридизацію на 6, 7, 8, 9, або 10°С нижче, ніж Tm; низько умови строгості можуть використовувати гібридизацію на 11, 12, 13, 14, 15, або 20°С нижче, ніж Тm. 21 Описано, що при використовуванні вирівнювання, гібридизації вологих композицій, бажані Tm, що зрозуміло для спеціаліста, варіюються в строгості гібридизації та/або у вологих розчинів. Якщо бажаний ступінь розузгодження призводить до Tm менше, ніж 45°С (водний розчин) або 32°С (формамідний розчин), вважають за краще збільшити концентрацію SSC таким чином, що може використовуватися вища температура. Обширне керівництво щодо гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти у Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). See Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Як використовується тут, суттєво гомологічна послідовність - це молекула нуклеїнової кислоти, яка специфічно гібридизується до комплементарної до молекули нуклеїнової кислоти, з якою її порівнюють в умовах високої строгості. Відповідні умови строгості, які забезпечують гібридизацію ДНК, наприклад, 6Х натрій хлорид/натрій цитрат (SSC) при 45°С, завершений миттям 2Х SSC при 50°С, відомі спеціалістам, кваліфікованим у галузі або можуть бути знайдені в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Звичайно, строгі умови - це ті умови, в яких концентрація солі є менша, ніж близько 1,5 Μ іонів Na, звичайно близько концентрації 0.01-1.0 Μ іонів Na (або інших солей) при рН 7.0-8.3 і температурі, як мінімум 30°С для коротких зондів (наприклад, 10-50 нуклеотидів) і принаймні близько 60°С для довгих зондів (наприклад, більше, ніж 50 нуклеотидів). Строгі умови можуть також досягатися шляхом додавання агента дестабілізації, як наприклад, формамід. Зразкові низькі умови строгості включають гібридизацію з буферним розчином 30-35% формаміду, 1М NaCI, 1% SDS (натрій додецил сульфат) при 37°С, і миття від 1Х до 2Х SSC (20X SSC=3.0 Μ NaCI/0.3 Μ тринатрій цитрат) при від 50 до 55°С. Зразкові помірні умови строгості включають гібридизацію у від 40 до 45% формаміді, 1М NaCI, 1% SDS при 37°С, і миття від 0.5Х до 1Х SSC при від 55 до 60°С. Зразкові високі умови строгості включають гібридизацію в 50% формаміді, 1 Μ NaCI, 1% SDS при 37°С, і миття в 0.1X SSC від 60 до 65°С. Нуклеїнова кислота, згідно з даним винаходом, може особливо гібридизуватися з однією або більше молекул нуклеїнових кислот, специфічних щодо DAS-59122-7 або комплементарних щодо нього, або фрагментів або будь-якого з них в помірно строгих умовах. Методи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в рівні техніки. Тому визначення відсоткової ідентичності між будь-якими двома послідовностями може досягатися, використовуючи математичний алгоритм. Необмежуючі приклади таких математичних алгоритмів, як Myers and Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; the local homology algorithm of Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; the homology alignment algorithm of 97088 22 Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 48: 443453; the search-for- similarity-method of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; the algorithm of Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 2264, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 58735877. Комп'ютерні виконання цих математичних алгоритмів можуть використовуватися для порівняння послідовностей, щоб визначити ідентичність послідовності. Такі виконання включають, але не обмежують: CLUSTAL in the PC/Gene program (available from Intelligenetics, Mountain View, California); the ALIGN program (Version 2.0); the ALIGN PLUS program (version 3.0, copyright 1997); and GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Version 10 (available from Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, USA) Вирівнювання, що використовують ці програми, можуть виконуватися, використовуючи параметр, що використовується за умовчанням. Програма CLUSTAL добре описується в Higgins and Sharp, Gene 73: 237-244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang, et al, Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992), and Pearson, et al, Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994). ALING та ALING PLUS програми засновані на алгоритмі Myers and Miller, що вказано вище. Програма BLAST of Altschul et al (1990) J Mol Biol. 215:403 базується на алгоритмі Karlin and Altschul (1990), що вказано вище. Сім'я BLAST - програм, які можуть використовуватися для пошуку схожості бази даних, включає: BLASTN для послідовностей запиту нуклеотидів проти послідовностей бази даних нуклеотидів; BLASTX для послідовностей запиту нуклеотидів проти послідовностей бази даних протеїну; BLASTP для послідовностей запиту протеїну проти послідовностей бази даних протеїну; TBLASTN для послідовностей запиту протеїну проти послідовностей бази даних нуклеотидів; і TBLASTX для послідовностей запиту нуклеотидів проти послідовностей бази даних nucleotide. Дивіться Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 19, Ausubel, et al, Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995). Вирівнювання може також виконуватися уручну візуальною інспекцією. Щоб отримати вирівнювання gapped для цілей порівняння, Gapped BLAST (у BLAST 2.0) можна використовувати, як описано в Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389. Альтернативно, PSIBLAST (in BLAST 2.0), можна використовувати, щоб виконувати повторюваний пошук, який знаходить віддалені взаємини між молекулами, як описано Altschul et al (1997) вище. При використовуванні BLAST, Gapped BLAST, PSI- BLAST, параметр, що використовується за умовчанням відповідних програм (наприклад, BLASTN для послідовностей нуклеотидів, BLASTX для протеїнів) може також використовуватися. Дивіться www.ncbi.hlm.nih.gov. Використовувані тут "ідентичність послідовності" або "ідентичність" у контексті двох нуклеїнових 23 кислот або послідовностей поліпептидів означає залишки у двох послідовностях, які є тими ж, коли їх вирівняно для максимальної відповідності із вказаним порівнянням. Коли відсоток ідентичної послідовності використовується в посиланні на протеїни, то визнають, що положення залишку, які не ідентичні, відрізняються консервативними замінами амінокислот, де залишки амінокислот заміщаються іншими залишками амінокислот з подібними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність) і, таким чином, не змінюють функціональні властивості молекули. Коли послідовності відрізняються в консервативних замінах, відсоткова ідентичність послідовності може бути скоректована вгору, щоб виправити для природної консервативної заміни. Послідовності, які відрізняються такими консервативними замінами, вказані як такі, що мають "схожість послідовності" або "схожість". Засоби для створення цього коректування добре відомі спеціалістам даної галузі. Звичайно це, вказано, як частковий скурінг консервативної заміни, а не повна невідповідність, таким чином збільшують процентну ідентичність послідовності. Тому, наприклад, де ідентична амінокислота одержує відмітку 1 і неконсервативна заміна одержує відмітку нуля, консервативна заміна одержує відмітку між нулем і 1. Скурінг консервативних замін прораховано, наприклад, як здійснюють в program PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). Використовуваний тут "відсоток ідентичності послідовності" означає значення, визначене за допомогою порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей над рівнем порівняння, там, де частина послідовності полінуклеотидів у рівні порівняння може охопити доповнення або делеції (тобто, випадіння) в порівнянні з довідковою послідовністю (яка не охоплює доповнення або делеції), для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток обчислюється за допомогою визначення числа положень, в яких ідентичний базовий залишок нуклеїнової кислоти або амінокислоти є як у послідовності, щоб дати число відповідних положень, розподіл числа відповідних положень на повне число положень у рівні порівняння, так і множення результату на 100, щоб дати відсоток ідентичності послідовності. Щодо ампліфікації цільової послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, ПЛР), що використовує специфічну пару праймерів ампліфікації, "строгі умови" - це умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися тільки з цільовою послідовністю нуклеїнової кислоти, щодо якої праймер, що має послідовність (або комплементарну їй) відповідного дикого типу, зв'язав би і краще провів унікальний продукт ампліфікації, амплікон, у реакції термальної ампліфікації ДНК. Термін "специфічний для (цільова послідовність)" указує, що зонд або праймер схрещується в строгих умовах гібридизації тільки до цільової послідовності в зразку, що охоплює цільову послідовність. Використовувана тут "ампліфікована ДНК" або "амплікон" означає продукту ампліфікації нуклеїнової кислоти цільової послідовності нуклеїнової 97088 24 кислоти, яка є частиною шаблона нуклеїнової кислоти. Наприклад, щоб визначити, чи містить рослина кукурудзи, що походить від статевого кросингу, трансген геномної ДНК рослини кукурудзи, згідно з даним винаходом, ДНК екстрагована тканини рослини кукурудзи, може бути піддана методу ампліфікації нуклеїнової з використанням пари праймерів ДНК, що включає перший праймер, отриманий від фланкуючої послідовності, сусідньої до місцеположення вставки гетерологічної ДНК, і другого праймера, отриманого від вставленої гетерологічної ДНК, для того, щоб одержати амплікон, який є діагностичним для наявності ДНК. Альтернативно, другий праймер може походити від фланкуючої послідовності. Амплікон є довгим і має послідовність, яка є також діагностичною. Амплікон може ранжуватися в довжині від з'єднаної довжини пар праймера плюс одна базова пара нуклеотидів до будь-якої довжини амплікону, одержуваної за протоколом ампліфікації ДНК. Альтернативно, пари праймера можуть походити від того, що лімітує послідовність з обох сторін вставленої ДНК, щоб одержувати амплікон, який включає повну послідовність нуклеотидів вставки експресії РНІ17662А конструкту, також, як і послідовність, що є фланкуючою для трансгену, дивись Фігуру 1 (SEQ ID, NO: 23), приблизно дванадцять (12) Kb в розмірі. Член пари праймера, отриманий від фланкуючої послідовності, може розміщуватися дистанційно від вставленої послідовності ДНК, ця дистанція може ранжуватися від однієї базової пари нуклеотидів аж до границь реакції ампліфікації, або близько двадцяти тисяч базових пар нуклеотидів. Використовуваний термін "амплікон" особливо виключає димери праймеру, які можуть формуватися в реакції термальної ампліфікації ДНК. Ампліфікація нуклеїнової кислоти може досягатися будь-яким з різних методів ампліфікації нуклеїнової кислоти, відомих з рівня техніки, включаючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР). Розмаїття методів ампліфікації, відомих з рівня техніки, описані U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202 and in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al, Academic press, San Diego, 1990. PCR amplification methods have been developed to amplify up to 22 Kb of genomic DNA and up to 42 Kb of bacteriophage DNA (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 91 :5695-5699, 1994). Ці методи, також як і інші методи, відомі в мистецтві ампліфікації ДНК, можуть бути використані для реалізації даного винаходу. Цілий ряд параметрів у специфічному протоколі ПЛР, можливо, повинні бути скоректовані стосовно специфічних лабораторних умов і можуть бути зміненими, що дозволяє колекціонувати подібні результати. Ці коректування будуть очевидні для спеціаліста, кваліфікованого у даній галузі. Амплікон, одержуваний цими методами, може виявлятися множинністю методів, включаючи, але не обмежуючи Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994), де ДНК олігонуклеотиди одержуються як перекриття, сусідня фланкуюча послідовність ДНК, так і вставлена послідовність ДНК. Олігонуклеотиди імобілізують 25 на мікроплатівки. Протікання регіону ПЛР регіону, що становить інтерес, (використовування одного праймера у вставленій послідовності і одного в сусідній фланкуючій послідовності ДНК), продукт ПЛР, що може гібридизуватися до (мобілізованого олігонуклеотиду, і подачі, як шаблон для єдиної базової реакції, що використовує ДНК-полімеразу, і мічену, специфічну для очікуваної наступної основи, ddNTPs. Аналіз може бути флуоресцентним або заснованим на ELISA. Сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності вставки, завдяки успішній ампліфікації, гібридизації, і єдиному базовому продовженню. Інший метод виявлення - це техніка Pyrosequencing як описано Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). В цьому методі синтезується олігонуклеотид, який частково покриває сусідній ДНК і вставку з'єднання ДНК. Олігонуклеотид гібридизується з продуктом ПЛР, з регіоном, що є цікавим (один праймер у вставленій послідовності і один в фланкуючій послідовності) і інкубується на наявність ДНК-полімерази, АТФ, сульфурілази, люциферази, апірази, аденозин-5'фосфосульфату і Ілюциферину. Додані індивідуально DNTPs і об'єднання приводить до легкого сигналу, який виміряють. Легкий сигнал вказує на присутність послідовності вставки фланкуючої послідовносі трансгена, завдяки успішній ампліфікації, гібридизації і єдиному або багато-базовому продовженню. Флуоресцентна поляризація, як описано Chen et al., (Genome Res. 9:492-498, 1999), це також метод, який може використовуватися, для того, щоб детектувати амплікон даного винаходу. Використовуваний у цьому методі олігонуклеотид одержується таким чином, що, частково покритий фланкером та вставкою ДНК. Олігонуклеотид гібридизується з продуктом ПЛР ділянкою, що становить інтерес (один праймер у вставці ДНК і один у фланкуючій послідовності ДНК) і інкубується з ДНК полімеразою та флуоресцентно міченим ddNTP. Єдине базове продовження приводить до інкорпорації ddNTP. Об'єднання може вимірюватися як зміна в поляризації, для чого використовують флюорометр. Зміна в поляризації вказує на присутність послідовності вставки/фланкуючої послідовності трансгену завдяки успішній ампліфікації, гібридизації, і єдиному базовому продовженню. Taqman (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) описаний як метод виявлення і визначення кількісної присутності послідовності ДНК і повністю зрозумілий з інструкцій, що надаються виробником. Стисло, зонд олігонуклеотидів FRET розробляється, таким, який частково покриває фланкуючу ДНК і ДНК вставки. Зонд FRET і праймери (один праймер у послідовності вставки ДНК і один у послідовності фланкуючої ДНК геному) ПЛР проходить цикл розвитку на наявність термостійкої полімерази і dNTPs. Гібридизація зонда FRET призводить до ампліфікації, гібридизації FRET редакції флуоресцентної частини далеко від ділянки гасіння зонду FRET. Флуоресцентний сигнал вказує на присутність фланкуючої послідовності вставки гена завдяки успішній ампліфікації і гібридизації. 97088 26 Відгук реакції гібридизації, що використовує специфіку зонда стосовно послідовності, знайденої в межах амплікону, - це ще інший метод, що використовується, для того, щоб знайти амплікон, одержуваний ПЛР. Втілення даного винаходу, крім того, продемонстровано в наступних прикладах. Потрібно розуміти, що ці приклади надані лише з ілюстративною метою. Завдяки згаданим вище обговоренням і цих прикладів, спеціаліст, кваліфікований у даній галузі техніки, може з'ясувати істотні особливості цього винаходу, і без відхилення від духу винаходу і його контексту, може розробити різні зміни і модифікації втілень винаходу, щоб пристосувати це до різних застосувань і умов. Тому, різні модифікації втілень винаходу, додаткові до вказаних і описаних тут, буде очевидними для кваліфікованих в даному рівні техніки спеціалістів, виходячи з вищевикладеного опису. Такі модифікації також належать контексту вимог формули. Розкриття кожного посилання, описаного тут, включає цей зміст посилання. Приклади Приклад 1. Трансформація маїсу трансформацією Agrobacterium і регенерація трансгенних рослин, що містять гени Cry34Аb1 і Cry35Аb1 (Cry34/35Ab1). Молекула ДНК приблизно 7,4 Кбайт, позначена РНІ17662А (SEQ ID, NO: 24), яка включає першу касету експресії трансгену, що включає молекулу ДНК, яка включає промотор, 5' нетранслюючий екзон, і перший інтрон гена убіквітину кукурудзи (Ubi-1) Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689 and Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218), який діє у сполученні з молекулою ДНК, що кодує B.t. Дельта-ендотоксин, ідентифіковано якCry34Аb1 (U.S. Pat. № 6,127,180, 6,624,145 та 6,340,593) з'єднано з молекулою ДНК, що включає Pin II транскрипційний термінатор, ізольований з картоплі (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1: 115-122). Друга касета експресії трансгену ДНК-конструкту включає молекулу ДНК, що кодує промотор пероксидази пшениці (Hertig et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16: 171-174), який діє у поєднанні з молекулою ДНК, що кодує B.t. Дельта-ендотоксин, ідентифіковано як Cry35Аb1 (U.S. Pat. №. 6,083,499, 6,548,291 та 6,340,593) з'єднано з молекулою ДНК, що включає Pin II транскрипційний термінатор, ізольований з картоплі (Gyheung An et al. (1989) Plant Cell. 1: 115122). Третя касета експресії трансгену ДНКконструкту включає молекулу ДНК 35S промотора вірусу каліфорнійської мозаїки цвітної капусти (CaMV) (Odell J.T. et al. (1985) Nature 313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59) 35S, який діє у поєднанні з молекулою ДНК, що кодує ген фосфінотрицин ацетилтрансферази (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37), який діє у поєднанні з молекулою ДНК, що охоплює 3' - термінатор транскрипції (CaMV) 35S (дивіться Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol. 37: 49-59), використано для того, щоб трансформувати тканину ембріона кукурудзи. B.t. Cry34Аb1 рослини маїсу були отримані трансформацією агробактерії, з використанням 27 методу Zhao (U.S. Patent No. 5,981,840, та публікація заявки РСТ WO 98/32326; які поміщені тут як посилання). Стисло, незрілі ембріони були ізольовані з маїсу, і ембріони, було піддано контактуванню з суспензією агробактрії, де бактерії були здатні до переміщення РНІ17662 ДНК (SEQ ID, NO: 24), у принаймні одну клітину принаймні одного незрілого ембріону (етап 1: етап інфекції). Конкретніше, на цьому етапі незрілі ембріони були поміщені у суспензію агробактерії для ініціації інокуляції. Ембріони були кокультивовані на певний час з агробактерією (етап 2: етап кокультивування). Детальніше, незрілі ембріони були культивовані на твердому середовищі, наступному за етапом зараження. Після проходження цього періоду кокультивації, був забезпечений етап "відпочивання". На цьому етапі ристингу ембріони інкубовано з принаймні одним антибіотиком, відомим як інгібітор росту Agrobacterium без додавання селективного агента для трансформантів рослини (етап 3: етап ристингу). Зокрема, незрілі ембріони культивовано на твердому середовищі з антибіотиком, але без селективного агента, для елімінації агробактерії і для фази ристингу інфікованих клітин. Потім, інокульовані ембріони були культивовані на середовищі, що містить селективний агент і були відновлені вирощування трансформованого каллусу (етап 4: етап селекції). Детальніше, незрілі ембріони були культивовані на твердому середовищі з селективним агентом, що призвело до приросту трансформованих клітин. Калус був потім відновлений у клітини (етап 5: крок регенерації), і, особливо, з відновленого калусу на твердому середовищі були культивовані відроджені рослини. Індивідуальних ембріонів тримали фізично окремо під час культури, і більшість експлантів померли на селективному середовищі. Тим ембріонам, що вижили і були здоровими, тканина калусу, глюфосинат-резистентна, було призначено унікальні ідентифікаційні коди, що вказують на трансформацію, та швидко було їх переміщено у свіже селекційне середовище. Регенеровані з тканини рослини, отримані від кожної унікальної трансформації, було переміщено в теплицю. Листові зразки надійшли для молекулярного аналізу, щоб перевірити присутність трансгену ПЛР і підтвердити експресію протеїну Cry34/35Аb1 ELISA. Рослини були потім доставлені на використовування західним комахам кукурудзи рутворм. Позитивні рослини були схрещені з інбредними лініями, для того, щоб отримати зерно від рослин, ініційованих трансформацією. Цілий ряд ліній рослин був оцінений в полі. DAS-59122-7 була вибрана з популяції незалежних трансгенів, заснованих на вищій комбінації особливостей, включаючи резистентність до комах і агрономічну роботу. Приклад 2. Ідентифікація лінії маїсу DAS59122-7 Cry34/35Ab1 Bacillus thuringiensis Зерно DAS-59122-7 було оцінено. T1S2 зображає трансформацію на фон Ні-ІІ, завершену кросингом з імбредною лінією РН09В і двома повтореннями прямого кросингу. Все описано Pioneer Hi-Bred (Johnston, ΙΑ). Первинна характеристика проводилася на тканині листа рослини шляхом вивчення та підтвердження діяльності 97088 28 фосфінотрицин ацетилтрансферази (PAT) через листову активність гербіциду і експресію Cry34/35Аb1 з використанням латеральних пристроїв. Контрольні субстанції для цьому вивченні були визначені, як немодифіковані представники зерна на фоні тестової субстанції. Контрольні зерна Ні-ІІ і РН09В використовувалися як негативні контролі. Ці немодифіковані зерна не містять одиниці транскрипції рослини cry34Аb1, cry35Аb1 ген рат гени. Всі зерна були отримані від Pioneer Hi-Bred (Johnston, ΙΑ). Зразки ДНК від двох додаткових B.t. Cry34/35Ab1, DAS-45214-4 і DAS-45216-6, використовувалися як негативні засоби контролю для специфічного аналізу ПЛР. Дві події одержували через трансформацію агробактерії, для чого використовували той же вектор, що використовується, для того, щоб трансформувати DAS-59122-7 і таким чином, вміщували одиниці транскрипції рослини для cry34Аb1, cry35АbІ, і pat ген. Проте місцеположення інсерцій Т_ДНК в DAS-45214-4 і DAS45216-6, включаючи граничні регіони геномної ДНК, були відмінні від таких у DAS-59122-7. Зразки ДНК DAS-45214-4 і DAS-45216-6 були ізольовані й характеризовані аналізом Southern blot. (Дані не подано). Зерна кукурудзи для DAS-59122-7 і незміненого контрольного зерна (Ні-ІІ і РН09В) були висаджені в камерах росту в DuPont Experimental Station (Wilmington, DE), щоб одержувати достатню кількість рослин для аналізу ДНК. Для характеристики DAS-59122-7, десять (10) зерен T1S2 було висаджено. Десять (10) зерен було також висаджено для кожної незміненої контрольної лінії. Одне (1) зерно було висаджено на горщик, і горщик був окремо ідентифікований. Умови висадження і вирощування були такими, що сприяли здоровому приросту рослин, що включало регульоване світло і вологу. Листові зразки були зібрані для кожного з контролю DAS-59122-7. Для кожного зразка, достатній листовий матеріал, що мав вищу точку росту, було зібрано і розміщено в наперед міченому зразковому несесері. Зразки були розміщені на сухому льоді й були переміщені в морозилку в колекцію. Всі зразки підтримувалися замерзлими поки їх обробляли. Всі листові зразки були унікально поміченими для ідентифікації рослини і дати урожаю. Щоб підтвердити експресію протеїну Cry34Ab1 DAS-59122-7 і відсутності експресії у контролі, листові зразки були зібрані зі всієї DAS-59122-7 і контрольних рослин, і скринінговані для трансгенного протеїну Cry34Аb1 шляхом використанням спеціального пристрою (Strategic Diagnostics, Inc., Newark, DE). Листові пунші було взято від кожної рослини у та вміщено у забуферений фосфатом соляний розчин з твіном 20, для грубої екстракції протеїну. Пристрій був занурений у екстракт, щоб визначити присутність або відсутність протеїну Cry34Аb1. Результати імунного аналізу використовувалися, щоб підтвердити ідентичність рослин тестової субстанції у молекулярного аналізі, як показано в Таблиці 1. 29 97088 30 Щоб підтвердити експресію фосфінортицин ацетилтрансферази (PAT) у рослинах DAS-591227, було проведено листовий пейнтинг гербіциду. У всіх рослин, що використовувалися в цьому експерименті, було розмальовано листя, щоб підтвердити ідентичність рослини. Рослини були випробувані на стадії зростання RI. Випробування проводилися, відповідно до стандартної процедури, відомої в даній галузі, для листового пейнтингу гербіциду для ідентифікації РАТ-експресуючих трансгенів. Особливо, порцію одного листа кожної рослини обробили приблизно 2% розчином гербіциду глюфосинату, Basta (Bayer CropScience) у воді, і візуально перевірили на коричневу або некротичну тканину за пофарбованим листям через 412 днів області після обробки. Результати для кожної рослини були записані й використані, щоб визначити експресію PAT в кожній тестовій рослині, як показано в Таблиці 1. Як показано в Таблиці 1, десять (10) рослин, тестованих для генерації DAS-59122-7 T1S2, шість (6) рослин, експресовані, як Cry34Аbl, так і, PAT, тоді як чотири (4) рослини не експресували жодного протеїну. Всі незмінені контрольні тести негативні для CryAb1 та PAT (не показані дані). 1. Позитивна експресія Cry34АbІ означає виявлення експресії протеїну як було визначено заснованим на імунній специфіці пристроєм для виявлення протеїну Cry34АbІ. Негативна означає невиявлення протеїну Cry34АbІ. Позитивна PAT експресія означає експресію рослини, які були толерантні до гербіциду і негативна - означає експресію рослин, які були чутливі до гербіциду. 2 + означає сигнал гібридизації у соузернблотингу; - означає відсутність сигналу гібридизації у соузерн-блотингу. Зонд гена cry34Аb1, що схрещується з експектованим інтернальним фрагментом Т-ДНК 1,915 кб, зонда гена cry35Аb1, що схрещується з експектованим інтернальним фрагментом Т-ДНК 2,607 кб, і відповідний зонда гена, що гібридизує до 3,4 кб кінцевих фрагменти, об'єднаних однією непошкодженою вставкою ТДНК було визначено аналізом соузерн-блотингу. Приклад 3. Соузерн-блотинг аналіз Bacillus thuringiensis Cry34/35Abl маїсу лінії DAS-59122-7. Листові зразки величиною один грам були піддані атмосфері рідкого азоту, і геномна ДНК була ізольована, використовуючи DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) або використовуючи стандартну процедуру екстракції буфером сечовини. Проходження екстракції, ДНК було візуалізовано на гелі агарози, щоб визначити якість ДНК, і визначено кількість, використовуючи реагент Pico Green (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) і аналізовано спектрофторометрією. 1 Кб ДНК Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) використовувався, щоб оцінити розміри фрагмента ДНК на гелі агарози. Геномна ДНК, ізольована з рослин DAS59122-7 була переправлена у Nco І і сепарована електрофорезом, переміщена в нейлонові мембрани, і гібридизована з cry34Ab1, cry35Ab1 і pat зонду гена, з використанням стандартних процедур, відомих у даній галузі техніки. Плями були піддані впливу рентгенівських променів один або більше періодів часу з метою детекції фрагментів гібридизації і візуалізовані за молекулярною стандартною вагою. Зображення були потім піддані цифровому перетворенню за допомогою фотографування рентгенівських променів та/або виявлення за допомогою Lumi-lmager інструменту (Roche, Indianapolis, IN). Розміри знайдених груп було задокументовано для кожного зонда. Соузерн-блотинг аналіз використовувався як засіб перевірки присутності вставки в тестових рослинах і засіб підтвердження того, що всі рослини вiд DAS-59122-7 містили ту ж вставку, як показано в Таблиці 1. (Соузерн-блотинг не показано). Згідно із соузерн-блотинг аналізом рослина DAS-59122 31 7 містила єдину інсерцію, що складається з інтактної копії регіону Т-ДНК плазміди РНР 17662, відсутні сегреганти, як визначилося аналізом експресії протеїну, не було гібридизації до зондів гена. Надалі, рослини DAS-59122-7, що експресують два протеїни, демонстрували ідентичні зразки гібридизації у соузерн-блотингу (дані не представлені). Особливо, зонд гена cry34Аb1, що схрещується з очікуваним внутрішнім фрагментом Т-ДНК 1,915 кб, зонд гена cry35А1, що схрещується з очікуваним внутрішнім фрагментом ТДНК 2,607 кб, і відповідний зонд гена, що схрещується із 3,4 кб фрагментом, об'єднаних єдиною інтактною інсерцією Т_ДНК, як визначилося Соузерн-блотингом. Приклад 4. Вставка Т_ДНК і фланкуюча послідовність кінцевого регіону Bacillus thuringiensis Cry34/35A1 маїсу лінії DAS-59122-7 Інсерція T-DNA і фланкуючі послідовності кінцевого регіону були клоновані з B.t. Cry34/35A1I DAS 59122-7 з використовуванням методів, заснованих на ПЛР, як на діаграмі з Фігур 2 та 3. Особливо, послідовності, що є 5' і 3' кінцями вставки DAS-59122-7, були одержані, використовуючи методи двох переміщуваних геномів. Перший метод був по суті методом, як описано Universal Genome Walker Kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), і другий метод проводився згідно з сплінкереттним протоколом, описаним у Devon et at., (1995) Nucleic Acids Research 23 (9): 1644- 1645, з модифікаціями, як описано у Stover (2001), U. С. Irvine (personal communication). Стисло, геномна ДНК контактує з різними ензимами рестриктазами (Dra I, EcoR V, Pvu II, Sma І і Stu І для Universal Genome Walker method і BamH I, EcoR I, Hind III, і Xba І для методу splinkerette) а потім лігує до кінцевих адаптерів за методом Genome Walker і до адаптора, специфічного для ензимів рестриктаз обмеження, з використанням методу splinkerette. Адаптери для генному, що застосовують Walker-метод, розробляють таким чином, щоб запобігти продовженню 3' кінця адаптера у ПЛР, тому скорочують або виключають неспецифічну ампліфікацію. Фрагменти адаптер-лігатор геномної ДНК були потім представлені як Walker - бібліотеки геному або splinkerette - бібліотеки, одна бібліотека для кожного ензиму рестриктази. Бібліотеки були приготовані з геномної ДНК, ізольованої з трьох індивідуальних T1S2 рослин B.t. Cry34/35Ab1 DAS-59122-7 T1S2; DAS-59122-7 T1S2 2 та DAS59122-7 T1S2 10, і від одної Ні-ІІ і одної контрольної рослини РН09В. Наступне конструювання бібліотек було завершено ампліфікацією ПЛР, щоб збільшити цільову послідовність, використовуючи AdvantageGC Genomic ПЛР набір (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Первинна ампліфікація ПЛР використовувала один праймер з ідентичністю до адаптера і одного праймера специфічного гена. Праймер адаптера не ампліфікує продукт у першому циклі первинної ПЛР і відбувається тільки продукція праймера специфічного гена. Лінійність і ампліфікація праймера адаптера відбувається 97088 32 тільки після того, як додатковий кінець був одержаний від праймера специфічного гена. Наступна первинна ампліфікація ПЛР, повторний відгук ПЛР використовувався для того, щоб збільшити специфічність відгуків геномної ПЛР. Вкладені праймери, що складаються зі специфічних до гена і специфічних до адаптера послідовностей, інтернальних до відповідних праймерів, що використовуються в первинній ПЛР. Для клонування 5'-фланкуючої послідовності, за допомогою ПЛР, був ініційований, з використанням праймерів, специфічних стосовно 5' кінця вставки, Т-ДНК, разом з праймерами, додатковими до послідовності адаптера, що ліговано з ДНК, що перероблюється. Так само, клонування 3'фланкуючої граничної послідовності, стартованої зі специфічним для 3' кінця праймера для вставленої Т-ДНК, і праймера, додаткового до послідовності адаптера. Послідовності ДНК, інтернальні щодо правої межі Т-ДНК і послідовності лівої межі в межах регіону Т-ДНК, використовувалися як початкові пункти для "вихідної" геномної послідовності маїсу, тому що вони відображають унікальну послідовність (не відповідну до ендогенних послідовностей геномної ДНК маїсу), від якої закріплено мігруючі праймери геному. Продукція, вироблювана ПЛР, була проаналізована електрофоретично в гелі агарози (не показані дані). Фрагменти, видимі в бібліотеках, готових від одного або більше зразків ДНК DAS59122-7 відсутні в бібліотеках, а виготовлені від зразків Ні-ІІ і РН09В геномної ДНК, були ідентифіковані для подальшої характеристики. Збільшені фрагменти ПЛР ампліфікацією і ідентифіковані ПЛР, були попередньо відокремлені електрофоретично у гелі, використовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen), і направлені безпосередньо для секвенування або клонування за рахунок pGEM-T плазмідного вектору з використанням pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp., Madison, Wl) до ДНК. Реакції секвенування здійснювалися з праймерами, що використовуються для ампліфікцаії ПЛР або зі специфічними праймерами для використовування з pGEM-T Easy Vector. Отримана послідовність використовувалася для того, щоб одержувати додаткові специфічні праймери гена, щоб продовжувати геномну послідовність. Численні круги повторювання геному виконувалися, поки, як мінімум, 500 bр кінцевої послідовності вставки Т-ДНК не були отримані. Щоб гарантувати валідацію фланкуючих кінцевих послідовностей, виконувалися додаткові специфічні ампліфікації ПЛР геномної ДНК DAS59122-7. Ампліфіковані фрагменти були секвеновані для того, щоб посприяти розширенню регіону перекриття послідовності з регіоном вставки ТДНК 5' і 3' кінцевих геномних ДНК. Праймери, показані в Таблиці 2, були засновані на послідовності, отриманій від геному, щоб збільшити фрагмент, що охоплює унікальне з'єднання Т-ДНК із геномною ДНК кукурудзи. Набір праймера 03-О506/02-О-476 (SEQ ID, NO: 10/SEQ ID, NO: 9) охопив 5' з'єднання і ампліфікував 313 bp фрагмент (від bр 2427 до bр 2739, дивіться Фігуру 1), і 33 97088 набір праймера 02-О-447/03-О-577 (SEQ ID, NO:8/SEQ ID. NO: 17) охопив 3' з'єднання і амп 34 ліфікував 754 фрагмент bр (від bр 9623 до bр 10376, дивіться Фігуру 1). 1 Розташування DAS-59122-7 у послідовності (див. Фігуру 1). Основи 1-2593 = 5' кінці, основи 2594-9936 = інсерція Т-ДНК, основи 9937-1922 = 3' кінці. Для перевірки послідовності ДНК, вставленої в геном маїсу, ПЛР виконували для ампліфікації, клонування, і секвенування послідовність інсерції Т-ДНК DAS-59122-7. Набори праймера ПЛР (SEQ ID, NO: 11/SEQ ID, NO: 5); (SEQ ID, NO: 4/SEQ ID, NO: 7); і (SEQ ID, NO: 6/SEQ ID, NO: 3) показані в Таблиці 3, використовувалися, для того, щоб ампліфікувати три частково покритих фрагменти, мічених 221-1 (SEQ ID, NO: 25), 221-2 (SEQ ID, NO: 26), і 221-3 (SEQ ID, NO: 27) зображених у послідовності від 5' регіону Т-ДНК, що розташовано у 3' регіоні інсерції Т-ДНК від bр 2687 до bр 9846 DAS-59122-7 (дивіться Фігуру 1). Інформація щодо ПЛР амплікону подано в Таблиці 3 і послідовності праймера зазначено в Таблиці 2. 35 97088 36 1. Розташування одна за одною DAS-59122-7 (дивіться Фігуру 1). Основи 1-2593 = 5' кінці, основи 2594-9936 = вставка Т-ДНК, основи 9937-11922 = 3' кінці. Набір ПЛР GC2 Advantage Polymerase (BD Biosciences Clontech, Inc.) використовувався згідно з інструкціями виробника, щоб ампліфікувати фрагменти інсерції (221-1 (SEQ ID, NO: 25), 221-2 (SEQ ID, NO: 26), і 221-3 (SEQ ID, NO: 27)). Стисло, 50 мл реакції містили 5' і 3' праймери в кінцевій концентрації 0.2 мкМ і 40нг геномної ДНК. Відгуки ПЛР були встановлені у подвійно підготовленій геномній ДНК, використовування від рослин DAS-59122-7 T1S2 1 і DAS-59122-7 T1S2 2. Умови ПЛР були такими: початкова денатурація при 95°С протягом 1 хв., завершення 35 циклами при 94795°С протягом 30 сек., 55°С протягом 30 сек., 68°С для 5 хв., і заключним продовженням у 68°С протягом 6 хв. Продукти ампліфікації ПЛР була візуалізовані у УФ світлі, піддані наступному електрофорезу у 1% гелі агарози у IX ТВЕ (89 mМ трісборату, 2 mM EDTA, рН 8,3) фарбованого бромідом етидію. ПЛР фрагменти 221-1 (SEQ ID, NO: 25), 221-2 (SEQ ID, NO: 26), і 221-3 (SEQ ID, NO: 27) очис тили за допомогою стягування фрагментів у 0,8% гелі агарози в IX ТВЕ фарбованого бромідом етидію, і для очищення фрагмента від агарози використовували набір QIAquick Gel Extraction (Qiagen). Фрагменти ПЛР були клоновані у плазмідний вектор pGEM-T Easy з використання pGEM-T Easy Vector System I (Promega Corp.). Клоновані фрагменти були пверифіковані мініпрепарацією плазміди ДНК (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen) і рестириковані Not І. Плазмідні клони та/або фрагменти вставки ПЛР що очищали, були потім піддані секвенуванню повної вставки. Відгуки послідовностей були вставлені у праймери, що було розроблено для того, щоб бути специфічним щодо відомих послідовностей Т-ДНК або у специфічні праймери з використанням вектору pGEM-T Easy. Sigma-Genosys, Inc. (The Woodlands, TX), синтезовано всі праймери ПЛР, які використовувалися для заключної концентрації 0,2-0,4 мМ у реакціях ПЛР. 37 Відгуки ПЛР з геномною ДНК, ізольовані від B.t. Cry34/35A1I DAS-59122-7, DAS-45214-4, і DAS-45216-6, і немодифіковані контрольні лінії Ні-ІІ і РН09В використовувалися для того, щоб підтвердити (1) присутність геномної ДНК маїсу в кінцевих регіонах послідовності DAS-59122-7, і (2) специфічну ампліфікацію завдяки з'єднанню вставки Т-ДНК у межі геномної ДНК DAS-59122-7. Праймери ПЛР, що розроблялися для того, щоб ампліфікувати кінцеву фланкуючу послідовність DAS-59122-7, використовувалися для того, щоб підтвердити присутність тих регіонів у немодифікованих контрольних лініях, також як і в DAS59122-7. Були перевірені два (2) набори праймерів, кожний, для 5' і 3' кінців (чотири (4) набори усумі). Набори праймера 03-О-784/03-О-564 (SEQ ID, NO: 18/SEQ ID, NO: 14) і 03-О-784/03-О543 (SEQ ID, NO: 18/SEQ ID, NO: 13) використовувалися для того, щоб ампліфікувати 136 bр і 263 фрагменти bр, відповідно, 5' - кінцевої послідовності до вставки Т-ДНК DAS-59122-7 (Фігури 2 і 3). Так само, праймери 03-О-569/03-О-577 (SEQ ID, NO: 15/SEQ ID, NO: 17) і 03-О-570/03-О-542 (SEQ ID, NO: 16/SEQ ID, NO: 12) використовувалися для того, щоб ампліфікувати 227 bр і 492 фрагменти bр, відповідно, 5' - кінцевої геномної послідовності (Фігури 2 і 3). Праймери, що розроблялися для того, щоб ампліфікувати фрагменти через з'єднання кінцевої послідовності та вставки T-DNA, використовувалися для того, щоб встановити специфічні фрагменти ПЛР DAS-59122-7. Один набір праймера був вибраний для кожного з двох з'єднань. Праймер О-784/02-О-215 (SEQ ID, NO: 18/SEQ ID, NO: 1) розробляли для того, щоб ампліфікувати 555 bр фрагмент через 5' з'єднання, і набір праймерів 02-О-219/03-О-577 (SEQ ID, NO: 2/SEQ ID, NO: 17) розроблявся для ампліфікації 547 фрагмента bр у 3 з'єднаннях. Набір праймерів, IVRI (0197) (SEQ ID, NO: 39) 5'CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC-3' та IVR2 (O198) (SEQ ID, NO: 40) 5'GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC-3', заснований на ендогенному гені інвертази маїсу (Hurst et al., (1999) Molecular Breeding 5 (6):579-586) використовувався для того, щоб генерувати 226 продукт ампліфікації bр як внутрішній позитивний контроль для всіх зразків геномної ДНК маїсу. Усі праймери ПОР, синтезовані SigmaGenosys, Inc. і використовуєвані в заключній концентрації 0,2-0,4 мМ у відгуках ПЛР. Послідовності праймера ПЛР перелічені в Таблиці 2. Для ПЛР ампліфікації було використано набір Advantage-GC 2 PCR (BD Biosciences) згідно із інструкцією. Приблизно 10-100 нг шаблона геномної ДНК використовувано за 50 мл відгуку ПЛР. Умови ПЛР були такими, як указано нижче: початкова денатурація шаблона при 94°С протягом 5 хвилин, завершення 35 циклами 95°С протягом 1 хвилини, 60°С протягом 2 хвилин, і 72°С протягом 3 хвилин, із заключним продовженням у 72°С протягом 7 хв. Продукт ампліфікації ПЛР було візуалізовано у УФ-світлі з наступним електрофорезом у 1% гелі агарози скрашеним IX ТВЕ бромідом етидію. 97088 38 Дані щодо послідовності, отриманої для ТДНК, вставки і кінцевих регіонів DAS-59122-7 було переглянуто, використовуючи Seqman ll(TM) software Version 4.0.5 (DNA Star, Inc., Madison, Wl). 5' і 3' кінцеві послідовності, фланкуючі послідовності вставки, присутні в DAS-59122-7, використовувалися для пошук гомології бази даних GenBank для того, щоб охарактеризувати місцеположення вставки в геномі маїсу. Аналіз, щоб ідентифікує відкриті рамки зчитування в регіонах з'єднання між кінцевими фланкуючими послідовностями і вставкою Т-ДНК DAS-59122-7 проводився, використовуючи Vector NTI 8.0 (InforMax(TM), Inc., Frederick, MD). Як підсумок, 11922 bp послідовності геномної ДНК DAS-59122-7 було підтверджено (дивіться Фігуру 1). На 5' кінці вставки Т-ДНК, 2593 bр граничні фланкуючі послідовності було ідентифіковано, і 1986 bр граничні фланкуючі послідовності було отримано на 3' кінці фрагментів, в результаті експериментів геному. Як підсумок, 7160 bр вставки Т-ДНК був клонований і секвенований з використовуванням наборів праймерів ПЛР, що розроблялися для того, щоб збільшити три частково покритих фрагменти, відмічених як 221-1 (2501 bp) (SEQ ID NO: 25), 221-2 (3027 bp) (SEQ ID, NO: 26), і 221-3 (2830 bp) (SEQ ID, NO: 27) зображення послідовності від 5' регіону Т-ДНК, що включає аж до 3' регіону вставки Т-ДНК DAS59122-7 від bр 2687 до bр 9846 (дивіться Фігуру 1). Залишок регіону вставки Т-ДНК був секвенований від двох фрагментів ПЛР, 0506/0476 (SEQ ID, NO: 10/SEQ ID, NO: 9) та 0447/0577 (SEQ ID, NO: 8/SEQ ID, NO: 17), який включає 5' і 3' з'єднання, відповідно, вставки Т-ДНК із геномною ДНК кукурудзи. Праймери, що використовуються, розроблено, виходячи з послідовності, отриманої від експериментального геному, для того, щоб ампліфікувати набор праймерів 03-О- 506/03-O476 (SEQ ID, NO: 10/SEQ ID, NO: 9); 5' з'єднання і ампліфікувати 313 bp фрагмент (від bp 2427 до bp 2739) та праймери 03-О-447/03-О-577 (SEQ ID, NO: 8/SEQ ID, NO: 17) включає 3' з'єднання і ампліфікує 754 bp фрагмента. Комбінована, тотальна 7343 bp вставка Т-ДНК DAS-59122-7 була клонована та секвенована (від bp 2594 до bp 9936, дивиться Фігуру 1) та порівняна з послідовністю трансформуючої плазміди, РНР 17662. Дві відмінності нуклеотидів в bp 6526 і bp 6562 спостерігалися у нетрансльованому регіоні промотора пероксидази пшениці Т-ДНК вставки (дивіться Фігуру 1). Жодна із спостережуваних базових змін не впливала на відкриту рамку зчитування композиції вставки Т-ДНК. Як 3', так і 5' кінцеві регіони вставки Т-ДНК, були знайдені інтактними, за винятком делеції останнього 22 bp в 5' кінці і 25 bp в 3' кінці, що оточує правий і лівий регіони границі Т-ДНК, відповідно. Тоді, як послідовності границі Т-ДНК, відомо, грати критичну роль у вставці ТДНК в геном, цей результат не є непередбаченим, оскільки вставки є часто недосконалими, особливо в лівий кінець Т-ДНК. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) аналіз граничних регіонів геному DAS-59122-7 обмежений гомологією з доступними послідовно 39 стями (Release 138.0 GenBank, Oct 25, 2003). Аналіз 5' знайдених послідовностей двох областей граничного регіону істотно гомологічний маїсу і EST (Expressed Sequence Tag). Перша область оточує 179 bp (bp 477 до bp 655 граничної послідовності) і показує схожість до окремих молекулярних маркерів, хромосомних послідовностей, і збіжних послідовностей, отриманих вирівнюванням різних EST. Друга область спостерігається в bp 1080 до bp 1153 (74 bp) 5' граничної послідовності, і показує схожість цілого ряду різних послідовностей геному маїсу та EST. 3' граничний регіон також має два малі несуміжні регіони схожості щодо послідовностей рослинної ДНК. Внутрішній 3' регіону 162 bp (bp 9954 до bp 10115) схожої щодо 3' нетрансльованого кінця та двох генів алкогольдегідрогенази Zea mays (adh 1), так, як і до деякої кількості послідовності EST. Менший регіон (57 bp) посеред 3' кінця (bp 10593 до bp 10649) показав схожість до некодуючих регіонів мультипоетних послідовностей геному маїсу. Немає гомологічних регіонів, більш ніж 179 базових пар, як було ідентифіковано в будь-якій кінцевій послідовності геному, не був більш ніж одного гомологічного регіону раніше відомої знайденої послідовності. Розглядалися індивідуальні прирости, що показують схожість граничних послідовностей DAS-59122-7 для того, щоб визначити, чи характеризується послідовність кодування протеїну вставкою DAS-59122-7 . Жоден з регіонів схожості не спостерігався в межах будьяких відомих послідовностей кодування протеїну. Локальне вирівнювання повної послідовності трансформуючої плазміди, РНР17662, з граничними послідовностями DAS-59122-7 не показував нічого істотно гомологічного, вказуючи, що граничні фланкуючі регіони Т-ДНК, не містили фрагменти трансофрмуючої плазміди. Таким чином, ототожнення і характеристику послідовності геному, що має фланкування у сайті інсерції, DAS-591227, було обмежено завдяки відсутності істотно гомологічних до відомих послідовностей регіонів регіонів. 5' і 3' сполучні регіони між кінцевою послідовністю геному маїсу і вставки Т-ДНК DAS-59122-7 були проаналізовані для виявлення присутності нових відкритих рамок зчитування. Жодні відкриті рамки зчитування суттєвого розміру (>100 амінокислот) не були ідентифіковані у 5' або 3' кінцевих сполучних регіонах, що вказує на те, що жодні нові відкриті рамки зчитування не генерувалися в результаті вставки T-DNA. Додатково, пошуки гомології не указували на присутність відкритих рамок зчитування кінцевих регіонів ендогенного маїсу, які можуть бути перервані вставкою Т-ДНК в B.t. Cry34/35Abl DAS-59122-7. Приклад 5. Праймери ПЛР ДНК специфічні праймери використовувалися, щоб продукувати амплікон, що є діагностичним щодо DAS-59122-7. Ці пари праймера включають, але не обмежуються, SEQ ID, NO: 18 і SEQ ID, NO: 1; SEQ ID, NO: 2 і SEQ ID, NO: 17; SEQ ID, NO: 10 і SEQ ID, NO: 9; і SEQ ID, NO: 8 і SEQ ID, NO: 17; і SEQ ID, NO: 36 і SEQ ID, NO: 97088 40 37. Додатково до цих пар праймера, будь-яка пари праймера, отриманої з SEQ ID, NO: 21 і SEQ ID, NO: 22, що використовується в реакції ампліфікації ДНК амплікону, що є діагностичним щодо DAS-59122-7 - це втілення даного винаходу. Будь-яка модифікація цих методів, які використовують праймери ДНК або комплементарні їм, для продукції молекули ДНК амплікону, що є діагностичним щодо DAS-59122-7, є очевидним для галузі. Крім того, пари контрольного праймера, які включають IVR1(O197)/IVR2(O198) (SEQ ID, NO: 39/SEQ ID, NO: 40) для ампліфікації ендогенного гену кукурудзи, включаються інтернальні стандарти для умов реакції. Аналіз екстрактів ДНК тканини рослини для того, щоб перевірити наявність DAS-59122-7, має включати позитивний контроль екстрактів ДНК тканини рослини (зразок ДНК, відомий як такий, що містить трансгенну послідовність). Успішна ампліфікація позитивного контролю демонструє, що ПЛР було проведено в умовах, які дозволяють ампліфікацію цільових послідовностей. Потрібно також включати негативний, або дикий тип, контрольний екстракт ДНК, у якому представлена ДНК є або готовою геномною, одержаною від нетрансгенної рослини DAS- 59122-7, або, є трансгенною, але не є походженням від рослини DAS-59122-7. Додатковий негативний контроль, який не містить ніякого екстракту ДНК кукурудзи, це корисно для умов, що використовуються в протоколі ПЛР. Додаткові молекули праймера ДНК достатньої довжини можуть вибиратися від SEQ ID, NO: 21 і SEQ ID, NO: 22 методами ампліфікації ДНК, відомими у даній галузі, в умовах, оптимальних для продукції амплікону що є діагностичним щодо DAS-59122-7. Використовування цих послідовностей праймера ДНК з модифікаціями відповідно до методів у контексті даного винаходу, показаних в цих прикладах, є у правомочності цього винаходу. Такий амплікон, де, як мінімум одна молекула праймера ДНК достатньої довжини, отриманої від SEQ ID, NO: 21 і SEQ ID, NO: 22, який є діагностичним щодо DAS-59122-7 - це втілення винаходу. Такий амплікон, де як мінімум один праймер ДНК достатньої довжини, отриманої з будь-якого генетичного елементу РНІ17662А, є діагностичним щодо події DAS59122-7, - це втілення винаходу. Випробування DAS-59122-7 амплікону може виконуватися за допомогою використовування Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, або Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler, або методами і апаратурою, відомою фахівцям у галузі. Описані принципи даного винаходу є лише його ілюстрацією, і, це має бути очевидним фахівцям, кваліфікованим у даній галузі, винахід може змінюватися в деталях, без відхилення від принципів винаходу. Ми претендуємо на всі модифікації, які лежать в межах формули винаходу. Всі публікації і публіковані патентні документи, цитовані в цьому описі, вказані тут за допомогою посилання, таким чином, що зміст кожної 41 вказаної індивідуальної публікації або патенту 97088 42 описано повністю. 43 97088 44 45 97088 46 47 97088 48 49 97088 50 51 97088 52 53 97088 54 55 97088 56 57 97088 58 59 97088 60
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюTransgenic insect resistant maize das-59122-7 and methods for detection thereof
Автори англійськоюBing James Wayny, Cressman Robert F. Jr., Hupta Manju, Hakimi Salim M., Hondred David, Krone Todd L., Hartnett Locke Mary E., Luckring Abigail K., MeyerSandra E., Moellenbeck Daniel, Narva Kenneth Edwin, Olson Paul D., Sanders Craig D., Wang Jimei, Zhang Jian, Zhong Gan-yuan
Назва патенту російськоюТрансгенная кукуруза das-59122-7, стойкая к насекомым, и способы его обнаружения
Автори російськоюБинг Джеймс Вейн, Крессмен Роберт Ф. Джр., Гупта Манджу, Хейкими Салим М., Хондред Дэвид, Крон Тодд Л., Хертнетт Лоуук Мери Э., Лакринг Эбигейл К., Мейер Сандра Э., Моелленбек Дэниел, Нарва Кеннет Эдвин, Олсон Пол Д., Сандерс Крег Д., Ванг Джимей, Жанг Джиан, Жонг Ган-Юан
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/82, A01H 5/00
Мітки: кукурудза, стійка, das-59122-7, способи, виявлення, трансгенна, комах
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/46-97088-transgenna-kukurudza-das-59122-7-stijjka-do-komakh-i-sposobi-viyavlennya.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна кукурудза das-59122-7, стійка до комах, і способи її виявлення</a>
Спосіб індукування стійкості до вірусу, що містить послідовність потрійного блока генів 3, за умови, що це не х вірус картоплі, у клітині рослини або рослині, трансгенна рослина, стійка до вірусу
Номер патенту: 70915
Опубліковано: 15.11.2004
Автори: Бузубаа Салах, Річардс Кен, Вейєн Гю, Блейкастен-Гроссханс Клодін, Гюйіє Убер, Лефебвр Марк, Жонар Жерар
МПК: C12N 15/82, C07K 14/08
Мітки: містить, вірусу, індукування, клітині, вірус, генів, блока, потрійного, послідовність, стійкості, спосіб, умови, трансгенна, стійка, рослина, рослини, картоплі
Формула / Реферат:
1. Спосіб індукування стійкості до вірусу, що містить послідовність потрійного блока генів 3, за умови, що це не X вірус картоплі, у клітині рослини або рослині, який включає стадії:- одержання конструкції нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає щонайменше на 70% послідовності нуклеїнової кислоти потрійного блока генів 3 зазначеного вірусу або його відповідної кДНК, функціонально злиту з однією...
Зернові рослини pv-zmir13 (mon863) та композиції і способи їх виявлення
Номер патенту: 87808
Опубліковано: 25.08.2009
Автори: Кумб Тімоті Р., Джонсон Скотт К., Кават Трейсі А.
МПК: C12N 5/10, A01H 5/00, C12N 15/11
Мітки: виявлення, способи, pv-zmir13, рослини, mon863, композиції, зернові
Формула / Реферат:
1. Молекула ДНК, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 або комплементарні їм послідовності.2. Молекула ДНК за п. 1, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NО:3, SEQ ID NО:4 або комплементарні їм послідовності.3. Молекула ДНК за п. 2, яка по суті складається з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:5, SEQ ID NО:7, SEQ ID NО:20,...
Кукурудза цукрова у качанах консервована (варіанти)
Номер патенту: 43818
Опубліковано: 17.12.2001
Автори: Славинський Леонтій Франкович, Бабенко Станіслав Григорович, Дараган Людмила Феодосіївна, Томенко Інна Георгіївна, Пшенична Тетяна Марківна
МПК: A23B 7/00
Мітки: варіанти, консервована, цукрова, качанах, кукурудза
Формула / Реферат:
1. Кукурудза цукрова у качанах консервована, яка містить кукурудзу цукрову в качанах і заливку, що складається з цукру, солі та води, який відрізняється тим, що додатково містить нарізані овочі: перець солодкий, моркву, цибулю ріпчасту, зелень петрушки, причому качани кукурудзи використовують в стадії ранньої молочної зрілості, а заливка містить також оцтову кислоту при такому співвідношенні компонентів (мас. %): Кукурудза ...
Виділений полінуклеотид, що кодує злитий протеїн з пестицидною активністю, та трансгенна клітина-хазяїн
Номер патенту: 84666
Опубліковано: 25.11.2008
Автори: Херман Род А., Стамп Лайза, Діель Паула, Поллард Майкл Р., Доджіллоу Джоанна, Кнут Марк, Шваб Джордж Е., Нарва Кеннет Е., Майкаелс Трейсі Елліс, Шнепф Х.Ернст, Фінстад Лі Стейсі, Кардіно Гай А.
МПК: C12N 5/10, C12N 15/82, C12N 1/21, A01N 63/02, C12N 1/15, C12R 1/07, C12N 15/09, C07K 14/235, C12N 15/32
Мітки: кодує, протеїн, виділений, злитий, клітина-хазяїн, полінуклеотид, активністю, трансгенна, пестицидною
Формула / Реферат:
1. Виділений полінуклеотид, що кодує злитий протеїн, що включає першу амінокислотну послідовність і другу амінокислотну послідовність, де згадана перша амінокислотна послідовність є амінокислотною послідовністю поліпептиду, що має молекулярну вагу 45 kDa, і згадана друга амінокислотна послідовність є амінокислотною послідовністю поліпептиду, що має молекулярну вагу 15 kDa, де згадані поліпептиди є токсичними по відношенню до кореневого черва...
Системи і способи виявлення наявності передавального сигналу у каналі безпровідного зв’язку
Номер патенту: 93115
Опубліковано: 10.01.2011
Автор: Шеллхаммер Стефен Дж.
МПК: H04B 1/00, H04B 1/06, H04B 1/44
Мітки: безпровідного, каналі, виявлення, сигналу, способи, передавального, наявності, системі, зв'язку
Формула / Реферат:
1. Спосіб виявлення наявності передавального сигналу у каналі діапазону безпровідного зв'язку, що містить:перетворення частоти сигналу з першої частоти у другу частоту;фільтрацію сигналу другої частоти для видалення сигналів, що не попадають у смугу пропускання другої частоти;перетворення сигналу другої частоти у комплексний модулюючий сигнал;обчислення усередненої періодограми комплексного модулюючого...
Попередній патент: Пристрій для охолоджування картера турбіни турбомашини, турбіна турбомашини і вхідний розподільний механізм турбіни
Наступний патент: Спосіб приймання високочастотних сигналів
Випадковий патент: Вантажозахоплювальний пристрій