Імуногенна композиція для дітей молодшого віку

1. Імуногенна композиція для дітей молодшого віку, яка включає мультивалентну вакцину Streptococcus pneumoniae, що містить 2 або більше (наприклад, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) капсулярних сахаридних кон'югатів з різних серотипів, де композиція включає серотип 22F сахаридного кон'югату для застосування у лікуванні або запобіганні захворюванням, спричиненим Streptococcus pneumoniae, де захворювання являє собою менінгіт, бактеріємію, пневмонію та/або кон'юнктивіт у дітей молодшого віку. 2. Імуногенна композиція за п. 1, яка додатково включає кон'югати капсулярних сахаридів 4, 6В, 9V, 14, 18С та 23F S. pneumoniae. UA (21) a200807749 (22) 20.12.2006 (24) 26.12.2011 (86) PCT/EP2006/069979, 20.12.2006 (31) 0526232.4 0607087.4 0609902.2 0620336.8 0620337.6 0620815.1 0620816.9 PCT/GB2006/004634 0607088.2 (32) 22.12.2005 07.04.2006 18.05.2006 12.10.2006 12.10.2006 19.10.2006 19.10.2006 12.12.2006 07.04.2006 (33) GB GB GB GB GB GB GB GB GB (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) БІМАНС РАЛЬФ ЛЕОН, BE, ҐАРСОН НАТАЛІ МАРІ-ДЖОЗЕФ, BE, ГЕРМАН ФІЛІПП ВІНСЕНТ, BE, ПОЛМАН ЯН, BE, ВАН МЕХЕЛЕН МАРСЕЛЛЬ ПОЛЕТТ, BE (73) ҐЛАКСОСМІТКЛАЙН БАЙОЛОДЖІКАЛЗ С.А., BE (56) LEXAU C.A. ET AL: "Changing epidemiology of invasive pneumococcal disease among older adults in the era of pediatric pneumococcal conjugate vaccine." JAMA : THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION 26 OCT 2005, vol. 294, no. 16, 26 October 2005 (2005-10-26), pages 2043-2051. MOORE M. R.: "Epidemiology of invasive pneumococcal disease in adults" INTERNET ARTICLE, [Online] 17 November 2005 (2005-11-17), 2 (19) 1 3 96934 4 3. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1, 2, в якій 2 різні білки-носії є окремо кон'югованими принаймні з 2 різними серотипами капсулярного сахариду S. pneumoniae. 4. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-3, яка включає 22F капсулярний сахарид, кон'югований з білком-носієм через лінкер. 5. Імуногенна композиція за п. 4, де лінкер являє собою ADH. 6. Імуногенна композиція за п. 4 або 5, де лінкер є приєднаним до білка-носія за допомогою карбодіімідного зв'язку, переважно з використанням EDAC. 7. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 4-6, де сахарид 22F є кон'югованим з білком-носієм або з лінкером при використанні методу CDAP. 8. Імуногенна композиція за будь-яким з пп. 1-7, яка включає сахаридний кон'югат 22F, де співвідношення білка-носія та сахариду 22F знаходиться в межах від 5:1 до 1:5, від 4:1 до 1:1 або від 2:1 до 1:1 (ваг./ваг.). 9. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка містить 22F сахаридний кон'югат, де середній розмір (Mw) сахариду 22F складає більше 100 кДа. 10. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка додатково включає один або більше некон'югованих або кон'югованих білків S. pneumoniae. 11. Імуногенна композиція за п. 10, яка містить згаданий один або більше білків S. pneumoniae, вибраних із родини полігістидинової тріади (PhtX), родини холінзв'язувальних білків (СbрХ), вкорочених версій СbрХ, родини LytX, вкорочених версій LytX, химерних білків вкорочений СbрХ - вкорочений LytX, детоксикованого пневмолізину (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 тa Sp133. 12. Імуногенна композиція за будь-яким з попередніх пунктів, яка додатково включає ад'ювант. 13. Вакцина, яка включає імуногенну композицію за будь-яким з пп. 1-12 та фармацевтично прийнятний наповнювач. 14. Спосіб приготування вакцини за п. 13, що включає етап змішування імуногенної композиції за будь-яким з пп. 1-12 з фармацевтично прийнятним наповнювачем. Галузь винаходу Даний винахід відноситься до вдосконаленої вакцини проти Стрептококової пневмонії (Sreptococcus pneumoniae). Обґрунтування винаходу Діти віком молодше 2 років не мають закріпленого імунного відгуку до більшості полісахаридних вакцин, таким чином необхідно компенсувати полісахариди алергенні (антигенні) хімічною кон'югацією до протеїнових носіїв. Поєднання полісахариду, Т-незалежного антигену, з протеїном, Тзалежний антиген, надає полісахариду властивості Τ залежності, включаючи ізотип комутації, розвиток афінності та індукціювання пам'яті. Однак, можуть існувати результати з повторним використанням полісахарид-протеїнових кон'югатів або поєднанням полісахарид-протеїнових кон'югатів для утворення мультивалентної вакцини. Наприклад, повідомлялось, що Haemophilus influenzae типу b полісахаридну (PRP) вакцину, використовуючи анатоксин правцю (ТТ) як протеїн носій, тестували в діапазоні доз з одночасною імунізацією з (без) ТТ та кон'югатом пневмококовий полісахарид - ТТ вакциною наступною стандартною дитячою програмою. Зі зростанням дози пневмококової вакцини імунний відгук до PRP полісахаридної долі Hib кон'югату вакцини зменшувався, показуючи імунний вплив полісахариду, можливо через використання такого ж носія протеїну (Dagan et al., Infect Immun. (1998); 66: 2093-2098). Також доведено, щоб багаторазово покращити, ефект дози носія-протеїну на гуморальний відгук до самого протеїну. Повідомлялось, що у дітей людини зростання дози чотирьохвалентного кон'югату анатоксину правцю в результаті призводить до зниження відгуку на носій правцю (Dagan et al. supra). Класичний аналіз цих ефектів поєднання вакцин був описаний як носій викликаний епітоп ним пригніченням, яке повністю не зрозуміле, але вважався результатом надлишкової кількості носію-протеїну (Fattom, Vaccine 17: 126 (1999)). Це виникає в результаті конкуренції для Th-клітин, Вклітинами до носію-протеїну, та В-клітин до полісахариду. Якщо В-клітини до носію-протеїну домінують, то не існує достатньо Th-клітин здатних надавати необхідну допомогу В-клітинам специфічним до полісахариду. Однак, імунологічні ефекти, що спостерігаються, несумісні з загальною кількістю носіїв протеїнів в деякій окремих прикладах зростання імунного відгуку, та в інших випадках зниження імунного відгуку. Тому, залишаються технічні труднощі в поєднанні полісахаридних кон'югатів зі складною структурою в одинарні ефективні формулювання вакцини. Sreptococcus pneumoniae - це Грам-позитивні бактерії, що відповідають за значну хворобливість та смертність (особливо в юному та похилому віці), спричинену інвазивними захворюваннями, такими як пневмонія, бактериємія та менінгіт, та захворюваннями, пов'язаними з іннідіацією, такими як гострий середній отит. Ступінь пневмококової пневмонії в США серед людей віком старше 60 років складає від 3 до 8 на 100000. В 20% випадків це призводить до бактериємії та інших проявів, таких як менінгіт з долею смертельних завершень до 30% навіть при лікуванні антибіотиками. Пневмокок інкапсульований з хімічно зв'язаним полісахаридам, який надає серотипу специфічності. Існує 90 відомих серотипів пневмококів, а капсула - це принципова вірулентність детермінанти для пневмококів, так як капсула не тільки захищає внутрішню поверхню бактерії від комплементу, але й сама є трохи імуногенною. Полісахариди - це Т-незалежні антигени і не можуть приймати участь в процесі чи бути присутні 5 ми на МНС (головний комплекс гістосумісності) молекулах, що взаємодіють з Т-клітинами. Однак, вони можуть стимулювати імунну систему за альтернативним механізмом, який включає перехресне зв'язування рецепторів поверхні на В-клітинах. В декількох експериментах показано, що при захистi проти інвазивних пневмококів хвороба найбільш строго корелює з антитілами специфічними для капсули й захист є серотипно специфічним. Sreptococcus pneumoniae - це найбільш загальний випадок інвазивної бактеріальної хвороби та середнього отиту у немовлят та молодших дітей. Більш того, у людей похилого віку встановлюється слабкі відгуки на пневмококову вакцину [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], тому спостерігається зростання випадків бактеріальної пневмонії в цій версті населення [Verghese and Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285]. Основні клінічні синдроми, що мали місце при S. Pneumoniae, широко визнані та обговорювалися в усіх стандартних медичних підручниках (Fedson DS, Muscher DM. In: Plotkin SA, Orenstein WA, editors. Vaccines. 4rth edition. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588). Наприклад, інвазивне пневмококове захворювання (IPD) визначається як будь-яка інфекція, в якій S. Pneumoniae ізолюється від крові чи іншого стерильного місця (Musher DM Sreptococcus pneumoniae. In Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice th of Infectious disease (5 ed). New York, Churchill Livingstone, 2001, p. 2128-2147). Хронічне обструктивне пульмонологічне захворювання (COPD) визнається як охоплююче декілька умов (обструкція потоку повітря, хронічні бронхіти, бронхіоліти чи захворювання малих дихальних шляхів та емфізема), що часто співіснують. Пацієнти страждають від загострення їх стану, що зазвичай супроводжується порушенням дихання й часто наростає кашель, що може виробляти слиз чи гнійне мокротиння (Wilson, Eur Respir J 2001 17:995-1007). COPD визначається наявністю фізіологічно необоротної або частково оборотної обструкції дихальних шляхів у пацієнтів з хронічним бронхітом чи емфіземою (Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov; 152(5 Pt 2):S77-121). Загострення COPD часто відбувається через бактеріальну (таку як пневмококову) інфекцію (Sethi S, Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000: a state-of-the-art review. Clin Microbiol Rev. 2001 Apr; 14(2):336-63). Таким чином, об'єктом даного винаходу є розробка покращеного формулювання складного серотипу Sreptococcus pneumoniae полісахарид кон'югованої вакцини. Короткі підписи до Рисунків. Фігура 1 Гістограма, що показує імуногенність 11 валентних кон'югатів у Rhesus мавп похилого віку. Світліший стовпчик представляє GMC після двох щеплень з 11 валентним кон'югатом в алюміній фосфатному ад'юванті. Темніший стовпчик представляє GMC після двох щеплень з 11 валентним кон'югатом в ад'юванті С. 96934 6 Фігура 2 Гістограма, що показує пам'ять Вклітин для PS3 після щеплення з 11 валентним кон'югатом з ад'ювантом С або з алюміній фосфатним ад'ювантом. Фігура 3 Гістограма, що показує анти полісахаридну 19F імуногенность в Balb/C мишах для 4 валентних простих полісахаридів та 4 валентних dPIy кон'югатів. Фігура 4 Гістограма, що показує анти полісахаридну 22F імуногенность в Balb/C мишах для 4 валентних чистих полісахаридів та 4 валентних PhtD кон'югатів. Фігура 5 Гістограма, що показує анти-22F IgG відгук у мишей Balb/c. Фігура 6 Гістограма, що показує анти-22Р опсонофагоцитозні титри у мишей Balb/c. Фігура 7 Гістограма, що порівнює IgG відгук, індукований в молодих С57В1 мишах після імунізації вакциною 13 валентного кон'югату, формульованою ρ різними ад'ювантами. Фігура 8 Гістограма, що показує захисну ефективність різних комбінацій вакцин в моделі пневмонії у мавп. Фігура 9 Гістограма, що показує анти PhtD IgG відгук в Balb/C мишах після імунізації 22F-PhtD або 22F-AH-PhtD кон'югатами. Фігура 10 Захист проти пневмококового зараження 4 типу у мишей після імунізації 22F-PhtD або 22F-AH-PhtD. Опис винаходу Даний винахід обумовлює імуногенну композицію для немовлят (дітей до 7 років), що включає мультивалентну Sreptococcus pneumoniae вакцину, що містить 2 або більше (наприклад, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) капсульних сахарид кон'югатів від різних серотипів, де композиція включає 22F сахарид кон'югат. Хоча дитячі інфекції пневмококового серотипу 22F не є дуже загальними, заявники вважають, що присутність 22F в пневмококовій вакцині для дітей буде корисною в вироблені групового імунітету в версті населення так, що напад серйозного більш раннього захворювання викликаного цим серотипом (таким як пневмонія та/або інвазивне пневмококове захворювання (IPD) та/або загострення хронічного обструктивного пульмонального захворювання (COPD)) може бути попередженим або послабленим в тяжкості. В цілях даного винаходу, «імунізація сукупності людей проти загострення COPD» чи «лікування або попередження загострення COPD» чи «послаблення в тяжкості перебігу загострень COPD» стосується зниження випадків чи ступеню загострень COPD (наприклад, зниження в ступені 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20% чи більше) чи полегшення в тяжкості загострень COPD, як визначено вище, наприклад, в групі пацієнтів, імунізованих композиціями або вакцинами винаходу. Таким чином, в одному втіленні метод попередження людей похилого віку, від надбання пневмококового захворювання, викликаного Sreptococcus pneumoniae серотипом 22F інфекції (чи полегшення тяжкості його перебігу) обумовлюється вмістом введення групі дітей віком до 7 років (або верстві дітей віком до 7 років) імунозахисної дози імуногенної композиції чи вакцини винаходу. 7 Використання імуногенної композиції чи вакцини винаходу в виробництві медикаментів для попередження чи полегшення перебігу захворювання, викликаного серотипом 22F Sreptococcus pneumoniae інфекції, у пацієнтів похилого віку, де імунозахисна доза композиції чи вакцини вводиться дитині віком до 7 років (чи верстві дітей віком до 7 років). Втілення імуногенної композиції включає Sreptococcus pneumoniae капсульовані сахарид кон'югати від серогруп 19А та 19F, необов'язково де 19А кон'югована до першого бактеріального анатоксину, a 19F кон'югована до другого бактеріального анатоксину. Термін капсульований сахарид включає капсульовані полісахариди та олігосахариди виведені з капсульованого полісахариду. Олігосахарид містить щонайменше 4 цукрових залишки. Термін бактеріальний анатоксин включає бактеріальні токсини, які інактивовані або генетичною мутацією, або хімічною обробкою, або кон'югацією. Придатні бактеріальні анатоксини включають анатоксин правця, анатоксин дифтерії, анатоксин кашлюку, бактеріальні цитолізини чи пневмолізин. Були описані мутації пневмолізину (Ply), які зменшують токсичність пневмолізину (WO 90/06951, WO 99/03884). Також відомі генетичні мутації токсину дифтерії, які зменшують його токсичність (дивись нижче). Генетично детоксоковані аналоги токсину дифтерії включають CRM197 та інші мутанти описані в US 4,709,017, US 5,843,711, US 5,601,827 та US 5,917,017. CRM197 - це нетоксична форма токсину дифтерії, але є імунологічно еквівалентною токсину дифтерії. CRM197 виробляється С. diphtheriae, що інфікована нетоксигенною фазою 197токс- викликаною мутагенезісом нітрозогуанідину карінефага b (Uchida et al. Nature New Biology (1971) 233; 8-11). CRM197 протеїн має таку ж саму молекулярну масу, що й токсин дифтерії але відрізняється від неї однією основною варіацією в структурному гені. Це призводить до гліцин глютамінової варіації амінокислоти в положенні 52, що робить фрагмент А нездатний до зв'язування NAD а значить до не токсичності (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 p. 560-564). Перший та другий бактеріальні анатоксини можуть бути однаковими або різними. У випадку, коли перший та другий бактеріальні анатоксини є різними, це означає, що вони мають різну амінокислотну послідовність. Наприклад, 19А та 19F можуть бути кон'югованими до анатоксину правця та анатоксину правця; анатоксину дифтерії та анатоксину дифтерії; Crm197 та CRM197, пневмолізину та пневмолізину, анатоксину правця та анатоксину дифтерії; анатоксину правця та CRM197; анатоксину правця та пневмолізину; анатоксину дифтерії та анатоксину правця; анатоксину дифтерії та CRM197; анатоксину дифтерії та пневмолізину; CRM197 та анатоксину правця; CRM197 та анатоксину дифтерії; CRM197 та пневмолізину; пневмолізину та анатоксину правця; пневмолізину та анатоксину 96934 8 дифтерії; або пневмолізину та CRM197, відповідно. У втіленні, в додатку до S. pneumoniae сахарид кон'югату 22F (та необов'язково 19А та 19F), імуногенна композиція надалі містить кон'югати S. pneumoniae капсульованих сахаридів 4, 6В, 9V, 14, 18С та 23F. У втіленні, в додатку до S. pneumoniae сахарид кон'югату 22F (та необов'язково 19А та 19F), імуногенна композиція надалі містить кон'югати S. pneumoniae капсульованих сахаридів 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С та 23F. У втіленні, в додатку до S. pneumoniae сахарид кон'югату 22F (та необов'язково 19А та 19F), імуногенна композиція надалі містить кон'югати S. pneumoniae капсульованих сахаридів 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 22F та 23F. У втіленні, в додатку до S. pneumoniae сахарид кон'югату 22F (та необов'язково 19А та 19F), імуногенна композиція надалі містить кон'югати S. pneumoniae капсульованих сахаридів 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 22F та 23F. У втіленні, в додатку до S. pneumoniae сахарид кон'югату 22F (та необов'язково 19А та 19F), імуногенна композиція надалі містить кон'югати S. pneumoniae капсульованих сахаридів 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 22F та 23F. Типово, Sreptococcus pneumoniae вакцина даного винаходу буде містити капсульовані сахаридні антигени (переважно кон'юговані), де сахариди є похідними від щонайменш десяти серотипів S. pneumoniae. Кількість S. pneumoniae капсульований сахаридів може варіювати від 10 різних серотипів (або "V", валентності) до 23 різних серотипів (23V). В одному втілені існує 10, 11, 12, 13, 14 чи 15 різних серотипів. В іншому втілені винаходу, вакцина може містити кон'юговані S. pneumoniae сахариди та некон'юговані S. pneumoniae сахариди. Переважно загальна кількість сахаридних серотипів менша чи дорівнює 23. Наприклад, винахід може містити 10 кон'югованих серотипів та 13 некон'югованих сахаридів. В подібному способі вакцина може містити 11, 12, 13, 14 чи 16 кон'югованих сахаридів та 12, 11, 10, 9 чи 7, відповідно, некон'юговані сахариди. В одному втіленні мультивалентна пневмококова вакцина винаходу може бути відібрана з наступних серотипів 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11A, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F, хоча приймається до уваги, що один або два інших серотипи могли б бути заміщеними в залежності від віку пацієнту, що отримує вакцину та географічному розташуванні, де вакцина буде введена. Наприклад, 10-валентна вакцина може містити полісахариди від серотипів 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, та 23F. 11-валентна вакцина може також включати сахариди від серотипу 3. 12 чи 13-валентна педіатрична (дитяча) вакцина може також включати 10 чи 11 валентне формулювання доповнене серотипами 6А та 19А, чи 6А та 22F, 19А та 22F, чи 6А та 15В, чи 19А та 15В, чи 22F та 15В, де 13-валентна вакцина для осіб похилого віку може включати 11 валентне формулювання доповнене серотипами 19А та 22F, чи 8 та 12F, чи 8 та 15В, чи 8 та 19А, чи 8 та 22F, чи 12F та 15B, 9 чи 12F та 19A, чи 12F та 22F, чи 15В та 19А, чи 15В та 22F. 14-валентна педіатрична вакцина може включати 10 валентне формулювання, описане вище, доповнене серотипами 3, 6А, 19А та 22F, серотипами 6А, 8, 19А та 22F, серотипами 6А, 12F, 19А та 22F, серотипами 6А, 15В, 19А та 22F, серотипами 3, 8, 19А та 22F, серотипами 3, 12F, 19А та 22F, серотипами 3, 15В, 19А та 22F, серотипами 3, 6А, 8 та 22F, серотипами 3, 6А, 12F та 22F, серотипами 3, 6А, 15В та 22F. Композиція в одному втіленні включає капсульовані сахариди похідні від серотипів 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F та 23F (переважно кон'югованих). В подальшому втіленні винаходу включено щонайменш 11 сахаридних антигенів (переважно кон'югованих), наприклад, капсульовані сахариди похідні від серотипів 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F та 23F. В подальшому втіленні винаходу включено щонайменш 12 або 13 сахаридних антигенів, наприклад, вакцина може містити капсульовані сахариди похідні від серотипів 1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19А, 19F, 22F та 23F, хоча надалі сахаридні антигени, наприклад 23-валентні (такі як 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F та 33F) також розглядаються винаходом. Вакцина даного винаходу може містити протеїн D (PD) з Haemophilus influenzae (дивись також ЕР 0594610). Haemophilus influen zae є ключовим хвороботворним організмом середнього отиту, й даний винахід показав, що, включаючи цей протеїн в Sreptococcus pneumoniae, вакцина буде забезпечувати рівень захисту проти Haemophilus influenzae пов'язаний з середнім отитом (посилання на POET публікацію). В одному втіленні композиція вакцини містить протеїн D. В одному варіанті PD присутній як носій-протеїн для одного чи більше сахаридів. В іншому втіленні протеїн D міг би бути присутнім в композиції вакцини як вільний протеїн. В наступних втіленнях протеїн D присутній і як носій-протеїн і як вільний протеїн. Протеїн D може використовуватися як протеїн повної довжини або як фрагмент (WO 0056360). В наступних втіленнях протеїн D присутній як носій-протеїн для більшості сахаридів, наприклад, 6, 7, 8, 9 чи більше сахаридів можуть бути кон'югованими до протеїну D. В цьому втіленні протеїн D також може бути присутнім як вільний протеїн. Вакцина даного винаходу містить один, два чи більше різних типів носіїв-протеїнів. Кожен тип носіїв-протеїнів може виступати як носій для більше ніж одного сахариду, де сахариди можуть бути однаковими або різними. Наприклад, серотипи 3 та 4 можуть бути кон'югованими до однакових носіїв-протеїнів, або однакових молекул носіївпротеїнів, або до різних молекул однакових носіївпротеїнів. В одному втіленні два або більше різних сахаридів можуть бути кон'югованими до однакових носіїв-протеїнів, або однакових молекул носіївпротеїнів, або до різних молекул однакових носіївпротеїнів. Будь-які Sreptococcus pneumoniae капсульовані сахариди, присутні в імуногенній композиції винаходу, можуть бути кон'югованими до носіївпротеїнів незалежно відібраних з групи, що містить 96934 10 ТТ, DT, CRM197, фрагмент С з ТТ, PhtD, PhtDE злить (особливо тих, що описані в WO 01/98334 та WO 03/54007), детоксифікованого пневмолізину та протеїну D. Більш повний список протеїнів-носіїв, що можуть використовуватись в кон'югатах винаходу, представлений нижче. Носій-протеїн кон'югований до одного чи більше S pneumoniae капсульованих сахаридів в кон'югатах присутніх в імуногенних композиціях винаходу - це необов'язково член полігістидинової тріади сімейства (Pht) протеїнів, фрагментів чи злиттів цих протеїнів. PhtA, PhtB, PhtD чи PhtE протеїни можуть мати амінокислотну послідовність, що розподіляються 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% чи 100% ідентичності з послідовністю, виявлених в WO 00/37105 чи WO 00/39299 (наприклад, з амінокислотною послідовністю 1-838 чи 21838 SEQ ID NO: 4 WO 00/37105 для PhtD). Наприклад, злиті протеїни складаються з повної довжини або фрагментів 2, 3 або 4 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Прикладами злитих протеїнів є PhtA/B, PhtA/D, PhtA/E, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/E. PhtD/A, PhtD/B, PhtD/E, PhtE/A, PhtE/B та PhtE/D, де протеїни зв'язані з вперше згаданим в N- терміналі (дивись, наприклад, WO 01/98334). В тих випадках коли фрагменти Pht протеїнів використовуються (окремо або як частина злитого протеїну), кожен фрагмент необов'язково містить одну або більше гістидинового(их) фрагменту(ів) тріад та/або областей подвійної спіралі таких поліпептидів. Гістидиновий фрагмент тріади - це частина поліпептиду, що має послідовність НххНхН, де Η - гістидин та x - амінокислота інша ніж гістидин. Область подвійної спіралі - це область прогнозована алгоритмом "спіралі" (Lupus, A et al. (1991) Science 252; 1162-1164). У втіленні винаходу кожен фрагмент включає один або більше гістидиновий фрагмент тріади а також щонайменш одну область подвійної спіралі. У втіленні винаходу кожен фрагмент включає саме або щонайменш 2, 3, 4 або 5 гістидинових фрагментів тріади (необов'язково з природною Pht послідовністю між 2 чи більше тріадами, або внутрішньо-тріадною послідовністю, що є більшою за 50, 60, 70, 80, 90 чи 100% ідентичною до природної пневмококової внутрішньо-тріадною Pht послідовністю - наприклад, внутрішньо-тріадна послідовність показана в SEQ ID NO: 4 з WO 00/37105 для PhtD). У втіленні винаходу кожен фрагмент включає саме або щонайменш 2, 3 або 4 області подвійної спіралі. У втіленні винаходу Pht протеїн, розкритий тут, включає протеїн повної довжини з приєднаною сигнальною послідовністю, зрілий протеїн повної довжини з відщепленим сигнальним пептидом (наприклад, 20 амінокислот на N-терміналі), природні варіанти Pht протеїну та імуногенні фрагменти Pht протеїну (наприклад, фрагменти, описані вище, або поліпептиди, що містять щонайменш 15 чи 20 суміжних амінокислот з амінокислотної послідовності описані в WO 00/37105 або WO 00/39299, де згаданий поліпептид - здатний до викликання специфічного імунного відгуку для амінокислотної послідовності згаданої в WO 00/37105 або WO 00/39299). 11 Зокрема термін "PhtD" як використано тут включає протеїн повної довжини з приєднаною сигнальною послідовністю, зрілий повної довжини протеїн з відщепленим сигнальним пептидом (наприклад, 20 амінокислот на N-терміналі), природні варіанти PhtD та імуногенні фрагменти PhtD (наприклад, фрагменти, описані вище, або поліпептиди, що містять щонайменш 15 чи 20 суміжних амінокислот з PhtD амінокислотної послідовності описані в WO 00/37105 або WO 00/39299, де згаданий поліпептид - здатний до викликання специфічного імунного відгуку для PhtD амінокислотної послідовності згаданої в WO 00/37105 або WO 00/39299 (наприклад SEQ ID NO: 4 з WO 00/37105 для PhtD). Якщо протеїн-носій є однаковим для 2 чи більше сахаридів в композиції, сахариди могли б бути кон'югованими до такої ж молекули протеїну-носію (молекули носію мають 2 більш різних сахаридів, кон'югованих до неї) [дивись приклади WO 04/083251]. Альтернативно сахариди можуть кожен окремо бути кон'югованим до різних молекул протеїну-носію (кожна молекула протеїнуносію має тільки один тип сахариду, кон'югованого до неї). Приклади носіїв-протеїнів, які можуть бути використаними в даному винаході є DT (анатоксин дифтерії), ТТ (анатоксин правця) або фрагмент С з ТТ, DT CRM197 (мутант DT), іншi точкові мутанти, такі як CRM 176, CRM 228, CRM 45 (Uchida et ai J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM 102, CRM 103 та CRM 107 та інших мутацій описаних Nicholls та Youle в Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekkerlnc, 1992; делеція або мутація Glu-148 до Asp, Gln чи Ser та/або Ala 158 до GІу та інші мутації розкриті в US 4709017 або US 4950740; мутації щонайменш одного чи більше залишків Lys 516, Lys 526, Phe 530 та/або Lys 534 та інші мутації розкриті в US 5917017 чи US 6455673; або фрагмент розкритий в US 5843711, пневмококовий пневмолізину (Kuo et al. (1995) Infect Immun 63; 2706-13) включаючи виток детоксифікований в деякій формі наприклад, dPLY-GMBS (WO 04081515, РСТ/ЕР2005/010258) або dPLY-формальдегід, PhtX, включаючи PhtA, PhtB, PhtD, PhtE та злиті Pht протеїни, наприклад PhtDE злиті, PhtBE злиті (WO 01/98334 та WO 03/54007), (Pht A-E описані більш детально нижче) ОМРС (менінгококова зовнішня протеїнова мембрана - зазвичай екстрагована з N. meningitidis серогрупи В - ЕР 0372501), Ро9rВ (з N. meningitidis), PD (протеїн D Haemophilus influenzae - дивись, наприклад, ЕР 0594610В), чи його імунологічно функціональні еквіваленти, синтетичні пептиди (ЕР 0378881, ЕР 04727347), протеїни температурного шоку (WO 93/17712, WO 94/03208), протеїни коклюшу (WO 98/58668, ЕР 0471177), цитокіни, лімфокіни, фактори росту або гормони (WO 91/01146), штучні протеїни, що містять багатократні людські CD4+ Τ клітинні епітопи з різних патогенних похідних антигенів (Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824) такі як N19 протеїн (Baraldoi et al. (2004) Infect Immun 72; 4884-7) пневмококовий поверхневий протеїн PspA (WO 02/091998), залізо поглинаючи протеїни (WO 96934 12 01/72337), токсин А чи В з С. difficile (WO 00/61761). Nurkka et al. Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11):1008-14, 2004 Nov. описували 11валентну пневмококову вакцину з всіма серотипами кон'югованими до PD. Однак, даний винахід показав, що опсонофагоцитозна активність вдосконалена для антитіл викликаних кон'югатами, що мають 19F кон'югований до DT порівняно з 19F кон'югованим до PD. На додаток, даний винахід показав, що більшу перехресну реактивність до 19А спостерігається з 19F кон'югованим до DT. Тому, особливість композиції даного винаходу полягає в тому, що серотип 19F є кон'югованим до бактеріального анатоксину, наприклад ТТ, пневмолізину, DT чи CRM 197. В одному втіленні серотип 19F кон'югований до DT. Також особливістю винаходу є те, що серотип 19А кон'югований до бактеріального анатоксину, наприклад ТТ, пневмолізину, DT чи CRM 197. Залишкові сахаридні серотипи імуногенної композиції можуть повністю бути кон'югованими до одного чи більше носіївпротеїнів, що не є DT (тобто тільки 19F кон'югований до DT), або можуть розщеплюватися між одним чи більше носіями-протеїнами, що не є DT чи DT по суті. В одному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а всі залишкові серотипи кон'юговані до PD. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, та ТТ чи DT чи CRM 197. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а не більше ніж один сахарид кон'югований до ТТ. В одному аспекті цього втілення згаданим одним сахарином є 18С або 12F. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а не більше ніж два сахариди кон'юговані до ТТ. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, ТТ та DT чи CRM 197. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, ТТ та пневмолізином. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, ТТ та CRM 197. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, ТТ, пневмолізином та необов'язково PhtD чи PhtD/E злитим протеїном. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, 19А кон'югований до пневмолізину чи ТТ, а залишкові серотипи розщеплюються між PD, ТТ, пневмолізином та необов'язково PhtD чи PhtD/E злитим протеїном. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, 19А кон'югований до пневмолізину чи ТТ, один додатковий сахарид кон'югований до ТТ, один додатковий сахарид кон'югований до PhtD чи PhtD/E та всі додаткові сахариди кон'юговані до PD. В наступному втіленні 19F кон'югований до DT чи CRM 197, 19А кон'югований до пневмолізину, один додатковий сахарид кон'югований до ТТ, один додатковий сахарид кон'югований до пневмолізину, 2 додаткових сахариди кон'юговані до PhtD чи PhtD/E та всі додаткові сахариди кон'юговані до PD. 13 В одному втіленні імуногенна композиція винаходу містить протеїн D з Haemophilus influenzae. В цьому винаході, якщо PD є не одним з протеїнівносіїв, використаних для кон'югації будь-яких сахаридів інших за 19F, наприклад 19F кон'югований до DT доки інші серотипи кон'юговані до одного чи більше носіїв-протеїнів, які є не PD, то PD буде присутнім в композиції вакцини як вільний протеїн. Якщо PD є одним з носіїв-протеїнів, використаних для кон'югації сахаридів інших за 19F, то може необов'язково бути присутнім в композиції вакцини як вільний протеїн. Термін "сахарид" у всіх відношеннях специфікації можуть коротко позначати полісахариди або олігосахариди та включає обидва. Полісахариди виділені з бактерій та можуть бути підігнаними до певного ступеню відомими методами (дивись наприклад ЕР 497524 та ЕР 497525) й переважно мікрофлюідизацією. Полісахариди можуть бути сортованими з метою зниження в'язкості в полісахаридних зразках та/або покращення здатності до фільтрування для кон'югованих продуктів. Олігосахариди мають низьке число одиниць, що повторюються (типово 5-30 одиниць, що повторюються) і є типово гідролізованими полісахаридами. Капсульовані полісахариди Sreptococcus pneumoniae містять олігосахаридні одиниці, що повторюються, які включають до 8 цукрових залишків. Для огляду олігосахаридних одиниць для ключа Sreptococcus pneumoniae серотипів дивись JONES, Christopher. Вакцини, що ґрунтуються на клітинних поверхневих карбогідратах патогенних бактерій. An. Acad. Bras. Cienc, June 2005, vol.77, p. 293-324. ISSN 0001-3765. В одному втіленні капсульований сахаридний антиген може бути полісахаридом повної довжини, однак, в інших він може бути однією олігосахаридною одиницею, або коротшою за довжину природного сахаридного ланцюгу олігосахаридних одиниць, що повторюються. В одному втіленні всі сахариди присутні у винаході є полісахаридами. Полісахариди повної довжини можуть бути "сортованими" тобто їх розмір може бути зменшеним різними методами, такими як кисла гідролізна обробка, гідроген пероксидна обробка, сортування emulsiflex з наступною гідроген пероксидною обробкою до утворення олігосахаридних фрагментів або мікрофлюідизація. Заявники також відмічають, що суть способу полягає у використанні олігосахаридів для полегшення отримання кон'югатів. Заявники знайшли, що використання природних або трохи сортованих полісахаридних кон'югатів, одна чи більше наступних переваг, може бути реалізовано: 1) кон'югат, що має високу імуногенність, який є здатним до фільтрування, 2) відношення полісахариду до протеїну в кон'югаті може бути змінене так що відношення полісахариду до протеїну (w/w) в кон'югаті може зростати (який може мати вплив на ефект супрессії носія), 3) імуногенні кон'югати, що піддаються гідролізу, можуть бути стабілізованими використанням більших сахаридів для кон'югації. Використання більших полісахаридів може мати наслідком більше перехресне зв'язування з кон'югатним носієм та може зменшувати виділення у вільному стані сахариду з кон'югату. Кон'юговані 96934 14 вакцини, описані в прототипі, містять в собі елементи до деполімерізації полісахаридів, що передує кон'югації з метою покращення кон'югації. Заявники винайшли, що сахаридні кон'юговані вакцини, що утримують сахариди більших розмірів, можуть забезпечити гарний імунний відгук проти пневмококового захворювання. Імуногенна композиція винаходу може таким чином містити один або більше сахаридних кон'югатів, в яких середній розмір (наприклад, вагасередня молекулярна маса Mw) кожного сахариду до кон'югації є понад 80 кДа, 100 кДа, 200 кДа, 300 кДа, 400 кДа, 500 кДа чи 1000 кДа. В одному з втілень один чи більше сахаридних кон'югатів винаходу мали б середній розмір сахариду до кон'югації 50-1600, 80-1400, 100-1000, 150-500, чи 200-400 кДа (відмічено, що середній розмір є Mw, "кДа" 3 одиниці, що заміщували б тут "х10 "). В одному втіленні кон'югат після кон'югації був би здатним легко фільтруватися через фільтр 0.2 мікрона так, щоб отримувати вихід після фільтрації більший за 50, 60, 70, 80, 90 або 95% порівняно зі зразком до фільтрації. Для цілей винаходу "природний полісахарид" відноситься до сахариду, що не піддавався до процесу (наприклад, після очищення), мета з якою є зменшення розміру сахариду. Полісахарид стає трохи меншим за розміром підчас звичайних процедур очищення. Такий сахарид залишається природним. Тільки якщо полісахарид піддавався до методів сортування, то полісахариди не вважається природним. Для цілей винаходу "сортований за фактором аж до х2" означає, що сахарид піддається до процесу, призначеного для зменшення розміру сахариду, але утримується розмір більший ніж половина розміру природного полісахариду. Х3, х4 і т.д. інтерпретується таким же чином, тобто сахарид піддається до процесу, призначеного для зменшення розміру сахариду, але утримується розмір більший ніж третя, четверта і т.д. частина розміру природного полісахариду. У втіленні винаходу імуногенна композиція містить Sreptococcus pneumoniae сахариди від щонайменш 10 серотипів кон'югованих до носіюпротеїну, де щонайменш 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або кожен S. pneumoniae сахарид є природним полісахаридом. У втіленні винаходу імуногенна композиція містить Sreptococcus pneumoniae сахариди від щонайменш 10 серотипів кон'югованих до носіюпротеїну, де щонайменш 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або кожен S. pneumoniae сахарид є сортованим за фактором аж до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 чи х10. В одному втіленні цього аспекту більшість сахаридів, наприклад 6, 7, 8 чи більше сахаридів, сортовані за фактором аж до х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9 чи х10. Молекулярна маса або середня молекулярна маса (або розмір) сахариду тут приписується середньо-ваговій молекулярній масі (Mw) сахариду, виміряній до кон'югації та вимірюється згідно MALLS. Метод MALLS добре відомий в способі й типово виконується як описано в прикладі 2. Для 15 MALLS аналізу пневмококових сахаридів, дві колонки (TSKG6000 та 5000PWxl) можуть використовуватись в комбінації та сахариди елюїрують водою. Сахариди детектують, використовуючи детектор світло розсіювання (наприклад Wyatt Dawn DSP устаткований аргоновим лазером потужністю 100мВт з довжиною хвилі 488 нм) та інферометричний рефрактометр (наприклад Wyatt Otilab DSP устаткований Р100 ячейкою та червоним фільтром 498 нм). У втіленні винаходу S. pneumoniae сахариди це природні полісахариди чи природні полісахариди, які зменшені в розмірі підчас нормального процесу екстракції. У втіленні винаходу S. pneumoniae сахариди сортовані механічним розщепленням, наприклад, мікрофлюїдизацією чи сонацією. Мікрофлюїдизація та сонація мають достатню перевагу зниження розміру більших природних полісахаридів, щоб забезпечити здатність кон'югату до фільтрування. Сортування відбувається за фактором не більшим за х20, х10, х8, x6, х5, х4, х3 або х2. У втіленні винаходу імуногенна композиція містить S. pneumoniae кон'югати, що виробляють з суміші природних полісахаридів та сахаридів, що сортовані за фактором не більшим за х20. В одному способі даного втілення більшість сахаридів, наприклад 6, 7, 8 чи більше сахаридів сортовані за фактором до х2, х3, х4, х5 або x6. У втіленні винаходу Sreptococcus pneumoniae сахарид кон'югований до носію-протеїну через лінкер, наприклад біфункціональний лінкер. Лінкер необов'язково гетеро біфункціональний чи гомо біфункціональний, маючи, наприклад, реакційноздатну аміно групу та реакційноздатну карбоксильну групу, 2 реакційноздатних аміно групи чи дві реакційноздатних карбоксильних групи. Лінкер має, наприклад, між 4 та 20, 4 та 12, 5 та 10 атоми вуглецю. Можливим лінкером є ADH. Інші лінкери включають В-пропіонамідо (WO 00/10599), нітрофенол-етиламін (Gever et al. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), галоалкилгаліди (US 4057685), глікозидний зв'язки (US 4673574, US 4808700), гексан діамін та 6-амінокапронова кислота (US 4459286). У втіленні винаходу ADH використовується як лінкер для кон'югування сахариду з серотипу 18С. У втіленні винаходу ADH використовується як лінкер для кон'югування сахариду з серотипу 22F. Сахаридні кон'югати присутні в імуногенних композиціях винаходу можуть бути приготовлені будь-якою відомою парою методик. Метод кон'югації може припускати активацію сахариду 1циано-4-диметиламіно піридином тетрафторборатом (CDAP) до утворення цианатного естеру. Активований сахарид може, таким чином, бути сполученим напряму або через спейсерну (лінкерну) групу з аміно групою на носії-протеїні. Наприклад, спейсером може бути цистамін або цистеамін, щоб атакувати тіольований полісахарид, який міг би сполучитися з носієм через тіоефірний зв'язок, отриманий після реакції з малеімід- активованим носієм-протеїном (наприклад, використовуючи GMBS) або галоацетильованим носієм-протеїном (наприклад, використовуючи йодоацетімід [напри 96934 16 клад, етил йодоацетімід НСІ] або N-сукцинімідил бромацетата чи SIAB, SIA, чи SBAP). Переважно, цианатний естер (необов'язково виготовлений за CDAP хімією) сполучають з гексан діаміном або ADH, та аміно похідну сахариду кон'югують до носію-протеїну, використовуючи карбодиімідну (наприклад, EDAC чи EDC) хімію через карбоксильну групи протеїну-носію. Такі кон'югати описані в РСТ опублікованій заявці WO 93/15760 Uniformed Services University та WO 95/08348 та WO 96/29094. Інші придатні методики використовують карбодиіміди, гідразиди, активні естери, норборан, пнітробензойну кислоту, N-гідроксисукцинімід, SNHS, EDC, TSTU. Багато описано в WO 98/42721. Кон'югація може включати карбонільний лінкер, який може бути утворений за реакцією вільної гідроксильної групи сахариду з CDI (Bethell et al. J. Boil. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al. J. Chromatogr. 1981, 218; 509-18) з наступною реакцією з протеїном до утворення карбаматного зв'язку. Це може включати відновлення аномерного кінця до первинної гідроксильної групи, необов'язкова захисна/незахисна первинної гідроксильної групи реакція первинної гідроксильної групи з CDI до утворення CDI карбаматного інтермедіату та сполучення CDI карбаматного інтермедіату з аміно групою на протеїні. Кон'югати можуть також бути приготовленими прямими методами амінування як описано в US 4365170 (Jennings) та US 4673574 (Anderson). Інші методи описані в ЕР-0-161-188, ЕР-208375 та ЕР0-477508. Надалі метод включає сполучення цианоген броміду (чи CDAP) активованої похідної сахариду гідразидом адипінової кислоти (ADH) з протеїномносієм Карбодиімідною конденсацією (Сhu С et al. Infect. Immunity, 1983 245 256), наприклад, використовуючи EDAC. У втіленні винаходу, гідроксильна група (переважно активована гідроксильна група, наприклад, гідроксильна група активована для отримання цианатного естеру [наприклад з CDAP]) на сахариді є або напряму або не напряму зв'язаною з аміно або карбоксильною групою на протеїні (через лінкер). У випадку, коли лінкер присутній, гідроксильна група на сахариді переважно пов'язана з аміно групою на лінкері, наприклад, використовуючи CDAP кон'югацію. Надалі аміно група в лінкері (наприклад, ADH) може бути кон'югована до карбоксильної групи на протеїні, наприклад, використовуючи карбодиімідну хімію, наприклад, використовуючи EDAC. У втіленні винаходу, пневмококовий(і) капсульований(і) сахарид(и) спочатку кон'югований(і) з лінкером до кон'югації лінкера з носієм-протеїном. Альтернативно лінкер може бути кон'югованим з носієм до кон'югації з сахаридом. Також може бути використана комбінація методів, з деякими сахарид-протеїновими кон'югатами, що готувалися з CDAP, а деякі відновлюючим амінуванням. В основному наступні типи хімічних груп на протеїнах-носіях можуть бути використані для сполучення/кон'югації: 17 A) Карбоксильна (наприклад, через аспарагінову кислоту чи глутамінову кислоту). В одному втіленні ця група зв'язана з аміно групами на сахаридах напряму або з аміно групою на лінкері використовуючи карбодиімідну хімію тобто використовуючи EDAC. B) Аміно група (наприклад, через лізин). В одному втіленні ця група зв'язана з карбоксильними групами на сахаридах напряму або з карбоксильною групою на лінкері використовуючи карбодиімідний хімічний метод тобто використовуючи EDAC. В іншому втіленні ця група зв'язана з гідроксильними групами активованими CDAP чи CNBr на сахаридах напряму або з такими групами на лінкері; з сахаридами чи лінкерами, що містять альдегідну групу; з сахаридами чи лінкерами, що мають сукцинімідну естерну групу. C) Сульфогідрил (наприклад, через цистеїн). В одному втіленні ця група зв'язана з бром або хлор ацетильованим сахарином чи зв'язана використовуючи малеімідний хімічний метод. В одному втіленні ця група активована/модифікована використовуючи біс-діазобензидин. D) Гідроксильна група (наприклад, через тирозин). В одному втіленні ця група активована/модифікована використовуючи бісдіазобензидин. E) Імідазолільна група (наприклад, через гістідин). В одному втіленні ця група активована/модифікована використовуючи бісдіазобензидин. F) Гуанідильна група (наприклад, через аргінін). G) Індолільна група (наприклад, через триптофан). В основному на сахаридах присутні наступні групи, що можуть використовуватися для сполучення: ОН, СООН чи NH2. Альдегідні групи можуть генеруватися після різноманітних обробок відомим фахівцям, такими як: перйодат, кислотний гідроліз, перекис водню, та інш. Підходи прямого сполучення: Сахарид-ОН + CNBr чи CDAP—>цианатний естер + NH2-Prot—>кон'югат Сахарид-альдегід + NH2-Prot—>Основа Шифа + NaCNBH3—>кон'югат Сахарид-СООН + NH2-Prot + EDAC—>кон'югат Сахарид-NH2 + COOH-Prot + EDAC—>кон'югат Підходи непрямого сполучення через спейсер (лінкер): Сахарид-ОН + CNBr чи CDAP—>цианатний естер + NH2----NH2—>сахарид----NH2 + COOHProt + EDAC—>кон'югат Сахарид-ОН + CNBr чи CDAP—>цианатний естер + NH2----SH—>сахарид----SH 5 + SH-Prot (природний Протеїн з незахищеним цистеїном або отриманим після модифікації аміно груп протеїну, наприклад, SPDP) —>сахарид -S-S-Prot Сахарид-ОН + CNBr чи CDAP—>цианатний естер + NH2----SH----->сахарид----SH + малеімід Prot (модифікація аміно груп)—>кон'югат Сахарид -ОН + CNBr чи CDAP—>цианатний естер + NH2----SH—>Сахарид-SH + галогенацильований-Prot—>кон'югат 96934 18 Сахарид-СООН + EDAC + NH2-------------NH2— >сахарид------NH2 + EDAC + COOH-Prot— >кон'югат Сахарид-СООН + EDAC+ NH2—SH— >сахарид----SH + SH-Prot (природний Протеїн з незахищеним цистеїном або отриманим після модифікації аміно груп протеїну, наприклад, SPDP)— >сахарид-S-S-Prot Сахарид-СООН + EDAC+ NH2----SH— >сахарид----SH + малеімід-Prot (модифікація аміно груп)—>кон'югат Сахарид-СООН + EDAC + NH2----SH— >Сахарид-SH + галогенацильований-Prot— >кон'югат Сахарид-Альдегід + NH2----NH2—>сахарид---NH2 + EDAC + COOH-Prot—>кон'югат Примітка: замість EDAC, зазначеного вище, може використовуватись прийнятний карбодиімід. Підсумовуючи, типи хімічних груп протеїнівносіїв, що можуть бути в основному використані для сполучення з сахарином є аміно групи (наприклад, на залишках лізину), СООН групи (наприклад, на залишках аспарагінової та глутамінової кислот) та SH групи (якщо доступні) (наприклад, на залишках цистеїну). Переважно вагове співвідношення носіюпротеїну до S. Pneumoniae знаходиться в межах від 1:5 до 5:1; наприклад, між 1:0.5-4:1, 1:1-3.5:1, 1.2:1-3:1, 1.5:1-2.5:1; наприклад, між 1:2 та 2.5:1; 1:1 та 2:1. У втіленні винаходу більшість кон'югатів, наприклад, 6, 7, 8, 9 чи більше кон'югатів мають співвідношення носію-протеїну до сахариду, що більше за 1:1, наприклад, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1 чи 1.6:1. У втіленні винаходу, щонайменше один S. Pneumoniae сахарид кон'югований до носіюпротеїну через лінкер, використовуючи CDAP чи EDAC. Наприклад, 18С або 22F можуть бути кон'югованими до протеїну через лінкер (наприклад ті, що з двома гідразиновими групами на кінцях, такі як ADH) використовуючи CDAP чи EDAC як описано вище. Коли використовується лінкер, CDAP можуть використовувати для кон'югації сахариду до лінкеру, a EDAC може використовуватись потім для кон'югації лінкеру до протеїну, або альтернативно EDAC може використовуватись спочатку для кон'югації лінкеру до протеїну, після чого CDAP можуть використовувати для кон'югації лінкеру до сахариду. В основному імуногенна композиція винаходу може містити дозу кожного сахаридного кон'югату в межах від 0.1 до 20 мкг, від 1 до 10 мкг або від 1 до 3 мкг сахариду. У втіленні, імуногенна композиція винаходу містить кожен S. Pneumoniae капсульований сахарид дозою в межах 0.1-20 мкг, 0.5-10мкг, 0.5-5 мкг або 1-3 мкг сахариду. У втіленні винаходу, капсульовані сахариди можуть знаходитись в різних дозах, наприклад, деякі капсульовані сахариди можуть знаходитись дозою точно 1 мкг або деякі капсульовані сахариди можуть знаходитись дозою точно 3 мкг. У втіленні винаходу сахариди від серотипів 3, 18С та 19F (чи 4, 18С та 19F) присутні в більш високій дозі ніж інші сахариди. В одному аспекті цього втілення серотипи 3, 18С та 19F (чи 19 4, 18С та 19F) присутні в дозі близькій або точно 3 мкг, в той час коли інші сахариди імуногенної композиції присутні в дозі близькій або точно 1 мкг. "Близько" або "наближено" визначено як в межах 10% більше або менше наведеного числа для цілей винаходу. У втіленні винаходу, щонайменше один S. Pneumoniae капсульований сахарид є напряму кон'югованим до носію-протеїну (наприклад, використовуючи один з хімічних методів, що описані вище). Переважно щонайменше один S. Pneumoniae капсульований сахарид є напряму кон'югованим CDAP. У втіленні винаходу більшість капсульованих сахаридів, наприклад, 5, 6, 7, 8, 9 чи більше напряму зв'язані з носієм-протеїном через CDAP (дивись WO 95/08348 та WO 96/29094). Імуногенна композиція може містити Streptococcus pneumoniae протеїни, тут позначені Streptococcus pneumoniae протеїни винаходу. Такі протеїни можуть використовуватись як носіїпротеїни, або можуть бути присутніми як вільні протеїни, або можуть бути присутніми і як носіїпротеїни і як вільні протеїни. Streptococcus pneumoniae протеїни винаходу є або поверхнево незахищеними, щонайменше протягом частини життєвого циклу пневмококів, або є протеїнами, які виділені чи роз'єднані пневмококами. Переважно протеїни винаходу відібрані з наступних категорій, такі як протеїни, що мають фрагмент Типу II Сигнальної послідовності LXXC (де X - будь-яка амінокислота, наприклад, сімейство полігістидинової тріади (PhtX)), холін зв'язані протеїни (СbрХ), протеїни, що мають фрагмент Типу І Сигнальної послідовності (наприклад, Sp101), протеїни, що мають LPXTG фрагмент (де X - будь-яка амінокислота, наприклад, Sp128, Sp130), та токсини (наприклад, Ply). Більш прийнятні приклади з цих категорій (чи фрагментів) - це наступні протеїни, або їх імунологічно функціональні еквіваленти. В одному втіленні, імуногенна композиція винаходу містить щонайменше 1 протеїн відібраний з групи, що складається з сімейства Полі Гістидинової Тріади (PhtX), сімейства Холін Зв'язаного Протеїна (СbрХ), СbрХ укорочених, сімейства LytX, LytX укорочених, СbрХ укорочений-LytX укорочених химерних протеїнів (злитих), пневмолізин (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 та Sp133. В наступному втіленні, імуногенна композиція містить 2 чи більше протеїнів відібраних з групи, що складається з сімейства Полі Гістидинової Тріади (PhtX), сімейства Холін Зв'язаного Протеїна (СbрХ), СbрХ укорочених, сімейства LytX, LytX укорочених, СbрХ укорочений-LytX укорочених химерних протеїнів (злитих), пневмолізин (Ply), PspA, PsaA, та Sp128. В одному більш втіленні, імуногенна композиція містить 2 чи більше протеїнів відібраних з групи, що складається з сімейства Полі Гістидинової Тріади (PhtX), сімейства Холін Зв'язаного Протеїна (СbрХ), СbрХ укорочених, сімейства LytX, LytX укорочених, СbрХ укорочений-LytX укорочених химерних протеїнів (злитих), пневмолізин (Ply) та Sp128. Сімейство Pht (Полі Гістидинова Тріада) містить протеїни PhtA, PhtB, PhtD та PhtE. Сімейство 96934 20 характеризується ліпідаційною послідовністю, двох доменів відділених багатим на пролін регіоном та декількома гістидиновими триадами, можливо включеними в метал чи нуклеозид зв'язуючий чи ензиматичної активності, (3-5) областями подвійної спіралі, збереженими N-кінцем та гетерогенним С кінцем. Присутні в усіх штамах пневмококи тестовані. Гомологічні протеїни також виявлені в інших Streptococci та Neisseria. В одному втіленні винаходу, Pht протеїн винаходу є PhtD. Зрозуміло, однак, що терміни Pht А, В, D та Ε посилаються до протеїнів, що мають послідовності розкриті в цитатах нижче, а також, що природно зустрічаються (та створені людиною) їх варіанти, що мають гомологічну послідовність, яка щонайменш на 90% ідентична до реферованих протеїнів. Переважно існує щонайменше 95% ідентичного та найбільш переважно - 97% ідентичного. Що стосується PhtX протеїнів, PhtA розкрито в WO 98/18930, та також посилаються до Sp36. Як зазначалося вище, існує протеїн з сімейства полігістидинової тріади та має сигнальний фрагмент типу II LXXC. PhtD розкрито в WO 00/37105, та також посилаються до SpO36D. Як зазначалося вище, також існує протеїн з сімейства полігістидинової тріади та має сигнальний фрагмент типу II LXXC. PhtB розкрито в WO 00/37105, та також посилається до SpO36B. Інший член сімейства PhtB це С3-поліпептид, що розпадається, як розкрито в WO 00/17370. Це протеїн є також з сімейства полігістидинової тріади та має сигнальний фрагмент типу II LXXC. Переважний імунологічно функціональний еквівалент - це протеїн Sp42 розкритий в WO 98/18930. PhtB укорочений (близько 79kD) розкрито в WO99/15675, який також вважається членом сімейства PhtX. PhtE розкрито в WO00/30299, та посилаються до як BVH-3. Де будь-який Pht протеїн є згаданим тут, мається на увазі, що можуть використовуватися імуногенні фрагменти чи їх злиття Pht протеїну. Наприклад, посилання до PhtX включає імуногенні фрагменти чи їх злиття з будь-яким Pht протеїном. Посилання до PhtD чи PhtB є також посиланням до PhtDE чи PhtBE злиттів як знайдено, наприклад, в WO0198334. Пневмолізин - це мультифункціональний токсин з відмінним цитолітичним (гемолітичним) та комплементною активаційною активністю (Rubins et al., Am . Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996)). Токсин не виділяється пневмококами, але вивільняється на стадії лізису пневмококів під впливом аутолізину. їх ефекти включають, наприклад, стимуляцію вироблення запальних цитокінів моноцитами людини, інгібування пульсуючих вій на респіраторному епітелії людини, та зниження бактеріальної активності та міграцію нейтрофіл. Найбільш очевидний ефект пневмолізину є в лізисі червоних кров'яних клітин, що включає зв'язування холестерину. Так як він є токсином, то він потребує бути детоксикованим (тобто, нетоксичним до людини, коли забезпечена прийнятна доза для захисту) до того, як може вводитися in vivo. Експресія та клонування дикого (немутованого) типу чи природного пневмолізину відомі фахівцям. Дивись, наприклад, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184 21 1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) and Mitchell et al. (NAR, 18:4010 (1990)). Детоксикація Ply може бути проведена хімічними способами, наприклад, піддавати обробці формаліном чи глутаровим альдегідом або комбінацією обох (WO 04081515, РСТ/ЕР2005/010258). Такі методи добре відомі фахівцям для різних токсинів. Альтернативно, ply може бути генетично детоксикованим. Таким чином, винахід охоплює похідні пневмококовихпротеїнів, які можуть бути, наприклад, мутованими протеїнами. Термін "мутований" використовується тут в значенні молекула, яка піддавалася делеції, додавання або заміщення однієї чи більше амінокислот використовуючи добре відомі методики для сайту направленого мутагенезісу або будь-які інший традиційний метод. Наприклад, як описано вище, мутований ply протеїн може бути змінений таким чином, що він стає біологічно неактивним в поки придушені підтримуючі його імуногенні епітопи, дивись, наприклад, WO90/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) та WO99/03884. Як використано тут, мається на увазі, що термін "Ply" вказує на мутований чи детоксикований пневмолізину прийнятний для медичного використання (тобто нетоксичний). Стосовно сімейства Холін Зв'язаного Протеїну (СbрХ), члени того сімейства першочергово визначалися як пневмококові протеїни, що могли б бути очищені холін-афінною хроматографією. Всі з холін зв'язаних протеїнів нековалентно зв'язані з фосфорилхоліновими половинами тейхоївої кислоти перегородки клітини та мембранасоційованої ліпотейхоївої кислоти. Структурно, вони мають декілька областей в загальному над повним сімейством, хоча, точна природа протеїнів (амінокислотна послідовність, довжина, і т.д.) може змінюватись. Взагалі, холін зв'язані протеїни містять N кінцеву область (N), збережені області повторення (R1 та/чи R2), пролін збагачену область (Р) та збережену холін зв'язану область (С), приготовлені багаторазовими повторюваннями, що містить наближено половину протеїну. Як використано в цій заявці, термін "сімейство Холін Зв'язаного Протеїну (СbрХ)" відібрано з групи, що складається з Холін Зв'язаних Протеїнів як встановлено в WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, та CbpG. CbpA розкрито в WO97/41151. CbpD та CbpG розкриті в WO00/29434. PspC розкрито в WO97/09994. PbcA розкрито в WO98/21337. SpsA - це Холін зв'язаний протеїн розкритий в WO 98/39450. Переважно Холін Зв'язані Протеїни відібрані з групи, що складається з CbpA, PbcA, SpsA та PspC. Іншим прийнятним втіленням є СbрХ укорочені, де "СbрХ" визначено вище та "укорочення" посилається до СbрХ протеїнів, в яких Холін зв'язана область (С) відсутня на 50% чи більше. Переважно такі протеїни не мають повної холін зв'язаної області. Більш прийнятно, такі протеїни укорочень потерпають від нестачі (і) холін зв'язаної області та (іі) частини N-кінцевої половини протеїну а також, ще утримує щонайменше одну область повторення (R1 чи R2). Більш прийнятно все ще, укорочення має 2 області повторення (R1 та R2). 96934 22 Прикладами таких прийнятних втілень є NR1xR2 та R1xR2 як проілюстровано в WO99/51266 чи WO99/51188, однак, інші холін зв'язані протеїни, що мають нестачу подібних холін зв'язаних областей також розглядаються в рамках цього винаходу. Сімейство LytX - це мембран асоційовані протеїни пов'язані з лізісом клітини. N-кінцевий домен містить холін зв'язаний домен(и), однак сімейство LytX не має всіх можливостей, знайдених в сімействі CbpA, зазначених вище, й таким чином для даного винаходу, сімейство LytX окремим від сімейства СbрХ. На відміну від сімейства СbрХ, Скінцевий домен містить каталітичний домен сімейства LytX протеїну. Сімейство містить LytA, В та С. По відношенню до сімейства LytX, LytA розкрито в Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB розкрито в WO 98/18930, та також посилаються до Sp46. LytC також розкрито в WO 98/18930, та також посилаються до Sp91. Прийнятним членом такого сімейства є LytC. Іншим прийнятним втіленням є LytX укорочення, де "LytX" визначено вище та "укорочення" посилається до LytX протеїнів, в яких Холін зв'язана область відсутня 50% чи більше. Переважно такі протеїни не мають повної холін зв'язаної області. Ще іншим прийнятним втіленням цього винаходу є СbрХ укорочення-LytX укорочення химерних протеїнів (злитих). Переважно містить NR1xR2 (або R1xR2) СbрХ та С-кінцеву частину (Cterm, тобто, нестача холін зв'язаних доменів) LytX (наприклад, LytCCterm або Sp91Cterm). Більш прийнятний СbрХ відбирається з групи, що складається з CbpA, PbcA, SpsA та PspC. Більш прийнятним все ще, є CbpA. Переважно, LytX є LytC (також посилання до Sp91). Іншим втіленням даного винаходу є PspA чи PsaA укорочення, мають недостачу холін зв'язаного домену (С) та експресований як злитий протеїн з LytX. Переважно, LytX є LytC. Що стосується PsaA та PspA, то обидва є відомими фахівцям. Наприклад, PsaA та його варіанти трансмембранної делеції описані Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64(12):5255-62. PspA та його варіанти трансмембранної розкриті, наприклад, в US 5804193, WO 92/14488, та WO 99/53940. Sp128 та Sp130 розкриті в WO00/76540. Sp125 є прикладом пневмококового поверхневого протеїну з закріпленим на стінці клітини мотивом LPXTG (де X - будь-яка амінокислота). Будь-який протеїн з цього класу пневмококового поверхневого протеїну з цим фрагментом є знайденим, щоб бути використаним в контексті цього винаходу, а тому надалі вважається протеїном винаходу. Сам Sp125 розкрито в WO 98/18930, а також відомий як ZmpB - цинк металопротеїназа. Sp101 розкрито в WO 98/06734 (де є посилання # у85993). Він характеризується сигнальною послідовністю Типу І. Sp133 розкрито в WO 98/06734 (де є посилання # у85992). Він також характеризується сигнальною послідовністю Типу І. Прикладами виділених Moraxella catarrhalis протеїнових антигенів, які можуть бути включеними до комбінованої вакцини (особливо для попередження середнього отиту) є: ОМР106 [WO 97/41731 (Antex) & WO 96/34960 (PMC)]; OMP21 чи 23 їх фрагменти (WO 0018910); LbpA та/або LbpB [WO 98/55606 (PMC)]; TbpA та/або TbpB [WO 97/13785 & WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 та/або UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); Ііро06 (GB 9917977.2); Ііро10 (GB 9918208.1); Iipo11 (GB 9918302.2); Iipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplAI (PCT/EP99/06781); НІу3 (РСТ/ЕР99/03257); та OmpE. Приклади нетипових Haemophilus influenzae антигенів чи їх фрагментів, які можуть входити до комбінованої вакцини (особливо для попередження середнього отиту) включають: Fimbrin протеїн [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] та злиття, що містять пептиди звідти [наприклад, LB1(f) пептидні злиття; US 5843464 (OSU) або WO 99/64067]; ОМР26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [ЕР 281673 (State University of New York)]; TbpA та/або TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); P2; та Р5 (WO 94/26304). Протеїни винаходу можуть також бути корисно скомбіновані. Під комбінованими розуміється, що імуногенна композиція всіх протеїнів з наступних комбінацій, чи як носіїв-протеїнів, чи як вільних протеїнів чи суміші з двох. Наприклад, в комбінації двох протеїнів, як викладається надалі, обидва протеїни можуть використовуватися як носіїпротеїни, чи обидва протеїни можуть бути присутніми як вільні протеїни, чи обидва можуть бути присутніми як носій та як вільний протеїн, чи один може бути присутнім як носій-протеїн та вільний протеїн доки інший присутній тільки як носійпротеїн або тільки як вільний протеїн, чи один може бути присутнім як носій-протеїн, а інший як вільний протеїн. Існують подібні можливості, де наводиться комбінація з трьох протеїнів. Виділені комбінації включають, але не обмежуються, PhtD + NR1xR2, PhtD + NR1xR2-Sp91Cterm химерні або злиті протеїни, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NR1xR2, PhtA + NR1xR2-Sp91Cterm химерні або злиті протеїни, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA, R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Переважно, NR1xR2 (чи R1xR2) є з CbpA або PspC. Більш прийнятно є з CbpA. Інші комбінації включають комбінації 3 протеїнів, такі як PhtD + NR1xR2 + Ply, та PhtA + NR1xR2 + PhtD. В одному втіленні, композиція вакцини містить детоксикований пневмолізин та PhtD або PhtDE як носії-протеїни. В наступному втіленні, композиція вакцини містить детоксикований пневмолізин та PhtD або PhtDE як вільні протеїни. В незалежному пункті, даний винахід забезпечує імуногенну композицію, що містить що найменше чотири S. Pneumoniae капсульовані сахаридні кон'югати, які містять сахариди з різних S. Pneumoniae серотипів, де щонайменше один сахарид є кон'югованим до PhtD чи його злитого про 96934 24 теїну та імуногенна композиція припускає виявлення ефективного імунного відгуку проти PhtD. Ефективний імунний відгук проти PhtD чи його злитого протеїну вимірюється, наприклад, оцінюванням захисту, так як це описано в прикладі 15. Ефективний імунний відгук забезпечує щонайменше 40%, 50%, 60%, 70%, 80% або 90% виживання протягом 7 днів після дії гетерологічним штамом. Встановлено, що дія штаму є гетерологічною, наданий захист є завдяки імунному відгуку проти PhtD чи його злитого протеїну. Альтернативно, ефективний імунний відгук проти PhtD вимірюється методом ELISA як описано в прикладі 14. Ефективний імунний відгук дає анти-PhtD IgG відгук щонайменше 250, 300, 350, 400, 500, 550 чи 600 мкг/мл GMC. Наприклад, імуногенна композиція містить щонайменш 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 чи 10 S. pneumoniae капсульованих сахаридів з різних серотипів, кон'югованих до PhtD чи його злитого протеїну. Наприклад, серотипи 22F та 1, 2, 3, 4, 5, 6 чи 7 надалі відбираються з серотипів 1, 2, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 23F та 33F кон'югованих до PhtD. У втіленні винаходу два чи три серотипи 3, 6А та 22F кон'юговані до PhtD чи його злитого протеїну. У втіленні, імуногенна композиція винаходу містить щонайменш один S. pneumoniae капсульований сахарид кон'югований до PhtD чи його злитого протеїну, де співвідношення PhtD до сахариду в кон'югаті знаходиться між 6:1 та 1:5, 6:1 та 2:1, 6:1 та 2.5:1, 6:1 та 3:1, 6:1 та 3.5:1 (м/м), чи більше ніж (тобто містить більшу долю PhtD) 2.0:1, 2.5:1, 3.0:1, 3.5:1 чи 4.0:1 (м/м). У втіленні, імуногенна композиція винаходу містить пневмолізин. Даний винахід надалі забезпечує вакцину, що містить імуногенні композиції винаходу та фармацевтично прийнятний ексціпієнт. Вакцина даного винаходу може бути активізована, особливо коли малося на увазі для використання серед населення похилого віку, але також для використання серед населення дитячого віку. Прийнятні ад'юванти включають солі алюмінію, такі як гель гідроксиду алюмінію, чи алюміній фосфат, чи квасці, але також можуть бути солі інших металів, таких як кальцію, магнію, заліза та цинку, або можуть бути нерозчинна суспензія ацильованого тирозину, чи ацильованих цукрів, катіонно чи аніонно модифікованих сахаридів, чи поліфосфазенів. Виділено, що ад'ювант відділений є прийнятним індусером типу Th1 відгуку. Такі високі рівні цитокінів типу Th1 мають тенденцію до дозволу індуціювання проміжних імунних відгуків клітин до надавання антигену, доки високі рівні цитокінів типу Th2 мають тенденцію до дозволу індуціювання гуморальних імунних відгуків до антигену. Відмінність Th1 та Th2 імунного відгуку не є абсолютною. Фактично індивід буде підтримувати імунний відгук, який описаний як той, що є предомінантно Th1 чи предомінантно Th2. Однак, часто зручні для розгляду сімейства цитокіназ в термінах, що описані на CD4 +ve Τ клонах клітин мишей Mosmann та Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, 25 R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties). (Annual Review of Immunology, 7, p145173). Традиційно, відгуки типу Th1 асоціюються з виробленням INF- та IL-2 цитокін Т-лімфоцитами. Інші цитокіни часто напряму асоційовані з виробленням імунних відгуків типу Th1, не є виробленими Т-клітинами, такими як IL-12. На відміну, відгуки типу Th2 асоціюються з секрецією IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Прийнятні ад'ювантні системи, які сприяють предомінантно Th1 відгуку, включають: Монофосфорил ліпід А чи його похідні (або детоксикований ліпід А в основному - дивись наприклад WO2005107798), особливо 3-де-О-ацильований монофосфорил ліпід A (3D-MPL) (для його приготування дивись GB 2220211 А); та комбінація монофосфорил ліпіду А, краще 3-де-О-ацильований монофосфорил ліпід А, разом чи з соллю алюмінію (наприклад, фосфат алюмінію чи гідроксид алюмінію) чи з емульсією олія-в-воді. В таких комбінаціях антиген та 3D-MPL містяться в одинакових макрочастинкових структурах, дозволяючи більш ефективне постачання антигенних та імуностимуляторних сигналів. Дослідження показали, що 3D-MPL може надалі підвищувати імуногенність квасці-адсорбованого антигену [Thoelen er al. Vaccine (1998) 16:708-14; ЕР 689454-В1]. Розширена система включає комбінацію монофосфорил ліпіду А та сапонін похідну, особливо комбінацію QS21 та 3D-MPL як розкрито в WO 94/00153, або меншу реактогенну композицію, де QS21 подавляється холестерином як розкрито в WO 96/33739. Особливо сильне ад'ювантне формулювання, що включає QS21, 3D-MPL та токоферол в емульсії олія-в-воді, описані в WO 25 95/17210. В одному втіленні винаходу, імуногенна композиція додатково містить сапонін, який може бути QS21. Формулювання може також містити емульсію олія-в-воді та токоферол (WO 95/17210). Неметильований CpG, що містить олігонуклеотиди (WO 96/02555) та інші імуномодуляторні олігонуклеотиди (WO0226757 та WO03507822) є також переважними індукторами відгуку ТН1 та є прийнятними для використання в даному винаході. Особливі ад'юванти відібрані з групи солей металів, емульсій олії в воді, Toll-подібних агоністів рецепторів, (зокрема Toll-подібний агоніст рецептору 2, Toll подібний агоніст рецептору 3, Toll подібний агоніст рецептору 4, Toll подібний агоніст рецептору 7, Toll подібний агоніст рецептору 8 та Toll подібний агоніст рецептору 9), сапонінів чи їх комбінацій. Ад'ювант, що може бути використаним в композиціях вакцин винаходу, є приготування пухиря чи зовнішньої мембрани везикули з Грам негативних бактеріальних штамів, таких як ті, що вивчені в WO02/09746 особливо N. meningitidis пухирців. Властивості ад'юванту пухирців можуть бути покращеними утримуванням LOS (ліпоолігосахарид) на своїй поверхні (наприклад, шляхом екстракції з низькими концентраціями детергенту [наприклад 0-0.1% деоксихолату]). LOS може бути детоксикованим шляхом msbB(-) чи htrB(-) мутацій, обговорених в WO 02/09746. Властивості ад'юванту можуть також бути покращеними утримуванням PorВ 96934 26 (та необов'язково заміщенням PorА) з менінгококових пухерців. Властивості ад'юванту можуть також бути покращеними укороченням структури зовнішнього основного сахариду LOS на менінгококовому пухерці - наприклад, через IgtB(-) мутацію, обговорену в WO 2004/014417. Альтернативно, вищезгаданий LOS (наприклад, виділений з msbB(-) та/або IgtB(-) штаму) може бути очищеним та використаним як ад'ювант в композиціях винаходу. Наступний ад'ювант, який може використовуватися з композиціями винаходу можуть бути відібраними з групи: сапонін, ліпід А чи його похідні, олігонуклеотид імуностимулятору, алкил глюкозамінід фосфат, емульсія олії в воді чи їх комбінації. Наступний виділений ад'ювант - це сіль металу в комбінації з іншим ад'ювантом. Перевагою є те, що ад'ювант - це Toll подібний агоніст рецептору, зокрема агоніст Toll подібного рецептору 2, 3, 4, 7, 8 чи 9, чи сапоніну, зокрема Qs21. Наступною перевагою є те, що ад'ювантна система містить два чи більше ад'ювантів зі списку, наведеного вище. Зокрема комбінації переважно містять сапонін (зокрема Qs21) ад'ювант та/або агоніст Toll подібного рецептору 9, такий як CpG, що містить олігонуклеотид імуностимулятору. Інші прийнятні комбінації містять сапонін (зокрема Qs21) та агоніст Toll подібного рецептору 4, такий як монофосфорил ліпід А чи його 3 деацильовані похідні, 3DMPL, або містять сапонін (зокрема Qs21) та ліганд Toll подібного рецептору 4, такий як, алкил глюкозамінід фосфат. Особливо прийнятними ад'ювантами є комбінації 3D-MPL та QS21 (ЕР 0671948 В1), емульсії олія в воді, що містить 3D-MPL та QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), чи 3D-MPL, формульований з іншими носіями (ЕР 0689454 В1). Інші прийнятні ад'ювантні системи містять комбінацію 3DMPL, QS21 та CpG олігонуклеотид як описано в US6558670, US6544518. У втіленні ад'ювант є (або містить) лігандом Toll подібного рецептору (TLR) 4, переважно агоністом, таким як ліпід А похідна зокрема монофосфорил ліпід А чи особливо 3 Деацильований монофосфорил ліпід А (3D-MPL). 3D-MPL є доступним від GlaxoSmithKline Biologicals North America та спочатку сприяє відгукам CD4+ Τ клітини з IFN-g (Th1) фенотипу. Він може бути виготовленим згідно до методів розкритих в GB 2220211 А. Хімічно це є суміш 3деацельованого монофосфорил ліпід А з 3, 4, 5 чи 6 ацильованими ланцюгами. Переважно в композиціях даного винаходу використовують малу частинку 3D-MPL. Мала частинка 3D-MPL має розмір частинки, такий що вона може бути стерильно фільтрована черех фільтр з розміром пор 0,22 мкм. Такі процедури приготування описані в Міжнародній Патентній Заявці No. WO 94/21292. Синтетичні похідні ліпіду А відомі та мається на увазі, що існують агоністи TLR 4, що включають, але не обмежуються цим: ОМ 174 (2-деокси-6-о-[2-деокси-2-[(R)-3додеканоїл окситетра-деканоїл аміно]-4-офосфоно-п-D-глюкопиранозил]-2-[(R)-3гідрокситетрадеканоїламіно]--D 27 глюкопиранозилдигідрогенфосфат), (WO 95/14026) ОМ 294 DP (3S,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-4-оксо-5-аза9(R)-[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10діол,1,10-біс(дигідрогенфосфат) (WO99 /64301 та WO 00/0462 ) ОМ 197 МР-Ас DP (3S-,9R)-3-[(R)додеканоїлокситетрадеканоїламіно]-оксо-5-аза-9[(R)-3-гідрокситетрадеканоїламіно]декан-1,10-діол, 1-дигідрогенфосфат 10-(6-аміногексаноат) (WO 01/46127) Інші TLR4 ліганди, які можуть використовуватись, - це алкіл Глюкозамінід фосфати (AGPs), такі як ті, що розкриті в WO9850399 чи US6303347 (процеси для приготування AGPs також розкриті), чи фармацевтично прийнятні солі AGPs як розкрито в US6764840. Деякі AGPs є TLR4 агоністами, а деякі є TLR4 антагоністами. Вважається, що обидва є корисними як ад'юванти. Іншим прийнятним для використання імуностимулятором в даному винаході є Quil А та його похідні. Quil A - це приготування сапоніну виділенням з Південно Американського дерева Quilaja Saponaria Molina та вперше був описаним як маючий ад'ювантну активність Dalsgaard та інш. в 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p. 243-254). Очищені фрагменти Quil A виділені методом ВЕРХ, який зберігає активність ад'юванту без токсичності, асоційованої з Quil А (ЕР 0362278), наприклад QS7 та QS21 (також відомими як QA7 та QA21). QS-21 - це природний сапонін, виділений з кори Quillaja saponaria Molina, що виробляє CD8+ цитотоксичні Τ клітини (CTLs), Th1 клітини та предомінантний lgG2a відгук антитіл та є прийнятним сапоніном в контексті даного винаходу. Особливі формулювання QS21 описані, які зокрема прийнятніші формулювання надалі містять стерин (WO 96/33739). Сапоніни, що формують частину даного винаходу можуть бути виділені в формі міцел, суміші міцел (переважно, але не виключно з солей жовчі) чи можуть бути в формі ISCOM матриць (ЕР 0109942 В1), ліпосом або колоїдних структур, таких як хробакоподібні чи кільцеподібні multimeric комплекси або ліпідні/шарові структури та пластинки, які утворені холестерином та ліпідом, чи в формі емульсії олія в воді (наприклад, як в WO 95/17210). Сапоніни переважно можуть бути асоційованими з сіллю металу, такою як гідроксид алюмінію чи фосфат алюмінію (WO 98/15287). Переважно сапонін присутній в формі ліпосоми, ISCOM або емульсії олії у воді. Розширена система включає комбінацію монофосфорил ліпіду А (або детоксикований ліпід А) та похідну сапоніну, зазвичай комбінація QS21 та 3D-MPL як розкрито в WO 94/00153, чи менш реакційногенна композиція, де QS21 пригнічують холестерином як розкрито в WO 96/33739. Зазвичайкомпозиція ефективного ад'юванту, включаюча токоферол з або без QS21 та/або 3D-MPL в емульсії олії у воді описані в WO 95/17210. В одному 96934 28 втіленні імуногенна композиція додатково містить сапонін, який може бути QS21. Також використовують олігонуклеотиди імуностимулятору чи будь-якого іншого агоністу Tollподібного рецептору (TLR) 9. Прийнятними для використання олігонуклеотидами в ад'ювантах чи вакцинах даного винаходу є CpG, що містить олігонуклеотиди, переважно ті, що включають два або більше фрагменти динуклеотиду CpG, виділені щонайменш трьома, більш переважно щонайменш шістьома чи більше нуклеотидами. Фрагментом CpG є Цитозин нуклеотид наступного Гуанін нуклеотидом. CpG олдігонуклеотиди даного винаходу тиново є деоксинуклеотидами. В представленому втіленні винаходу інтернуклеотид в олігонуклеотиді є фосфородітіоатом, чи більш переважно зв'язаним фосфоротіоатом, хоча фосфородіестер та інші зв'язки інтернуклеотиду знаходяться в межах винаходу. Також в межі винаходу включені олігонуклеотиді зі змішаними інтернуклеотидними зв'язками. Методи для вироблення фосфоротіоатних олігонуклеотидів чи фосфородітіоатів описані в US5,666,153, US5,278,302 та WO 95/26204. Приклади прийнятних олігонуклеотидів мають наступні послідовності. Послідовності переважно містять інтернуклеотидні зв'язки модифікованого фосфоротіоату. OLIGO 1 (SEQ ID NO:1): ТСС ATG ACG ТТС CTG ACG ТТ (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): ТСТ ССС AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Альтернативні CpG олігонуклеотиди можуть містити прийнятні послідовності наведені вище, в яких вони мають непослідовні делеції або їх додавання. CpG олігонуклеотиди використані в даному винаході можуть бути синтезовані будь-яким відомим фахівцям методом (наприклад диіись ЕР 468520). Просто такі нуклеотиди можуть бути синтезовані використовуючи автоматичний синтезатор. Ад'ювант може бути емульсією олії в воді чи може містити емульсією олії в воді в комбінації з іншими ад'ювантами. Олійна фаза емульсійної системи переважно містить метаболізовану олію. Мається на увазі, що термін метаболізована олія добре відома фахівцям. Метаболізована може визначатися як "здатна до трансформування метаболізмом" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, th W.B. Sanders Company, 25 edition (1974)). Олія може бути будь-якою рослинною олією, риб'ячим жиром, тваринним чи синтетичним жиром, який не є токсичним до рецепієнту та здатний до трансформування метаболізмом. Горіхи, насіння та зерно є 29 загальними джерелами рослинних олій. Синтетичні олії є також частиною цього винаходу та можуть включати комерційно прийнятні олії, такі як NEOBEE та інші. Сквален (2,6,10,15,19,23Гесаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) - це ненасичена олія, яка знайдена у великій кількості в жирі печінки акули, та в меншій кількості в олії оливи, олії зародишів пшениці, олії висівок рису та дріжжах, та є зазвичай прийнятною олією для використання в цьому винаході. Сквален є метаболізованою олією гарної якості по факту, що вона є інтермедіатом в біосинтезі холестерину (Merck th index, 10 Edition, entry no.8619). Токоли (наприклад, вітамін Е) також часто використовують в олійних емульсіях ад'ювантів (ЕР 0382271 В1; US5667784; WO 95/17210). Токоли використані в олійних емульсіях (переважно емульсіях олії у воді) винаходу можуть бути зфоррмульовані як описано в ЕР 0382271 В1, в якому токоли можуть бути дисперсіями краплинок токолу, що необов'язково містять емульгатор, переважно менше за 1 мікрон в діаметрі. Альтернативно, токоли можуть використовувати в комбінації з іншими оліями, для формування олійної фази олійних емульсій. Приклади олійних емульсій, які можуть використовуватися в комбінації з токолом описані тут, такі як метаболізовані олії описані вище. Вважається, що ад'юванти емульсії олії у воді використовують як ад'ювантні композиції (ЕР 0399843 В), композиції емульсій олії у воді та інші активні агенти, що описані як ад'юванти для вакцин (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Також описані інші олійні емульсії, такі як емульсії води в олії (US 5,422,109; ЕР 0480982 В2) емульсії води в олії у воді (US 5,424,067; EP 0480981 В). Всі, з яких утворюють прийнятні системи олійних емульсій (зокрема, коли вкючають токоли) для формування ад'ювантів та композицій даного винаходу. Найбільш прийнятні олійні емульсії (наприклад емульсії олії у воді) надалі міститимуть емульгатор такий як TWEEN 80 та/або стерин такий як холестерин. Прийнятні олійні емульсії (переважно емульсія олії у воді) містить метаболізовану, нетоксичну олію, такі як сквален, скваієн чи токоферол, такий як альфа токоферол (та переважно обидва скваієн та альфа токоферол) та необов'язково емульгатор (сурфактант ПАР), такий як TWEEN 80. Також може входити до складу стерин (переважно холестерин). Метод приготування емульсій олії у воді добре відомий фахівцям даної галузі. Взаголом метод включає змішування олійних фаз, що містять токоли, з сурфактантом (ПАР), таким як розчин PBS/TWEEN80, наступну гомогенізацію з використанням гомогенізеру, фахівцям даної галузі було б зрозуміло, що метод, який включає проходження подвійної суміші через голку шприця, був би прийнятним для гомогенізації малих об'ємів рідини. В рівній мірі, процес емульсифікації в мікрофлюідизері (M110S Microfluidics machine, максимум 50 переходів, для періоду 2 хвилини при максимальному тиску на вході 6 бар (тиск на виході близько 850 бар)) міг би бути адаптованим фахівцями даної галузі для приготування менших чи 96934 30 більших об'ємів емульсії. Адаптація може бути досягнена шляхом експерементування, включаючи виміри емульсії, що утворюється в результаті, доки приготування буде досягнуте краплинами олії необхідного діаметру. В емульсії олія у воді, олія та емульгатор повині бути у водному носієві. Водним носієм може бути, наприклад, фосфатний буфер саліну. Розмір краплин олії, виявлений в стабільній емульсії олії у воді переважно менше за 1 мікрон, може знаходитись в діапазоні в основному 30-600 нм, переважно близько 30-500 нм в діаметрі, та зокрема близько 150 нм в діаметрі, як виміряно методом фотонної кореляційної спектроскопії. В такому сенсі, 80% крапель олії за кількістю були б з прийнятними межами, більш прийнятно більше за 90% та найбільш прийнятно більше за 95% крапель олії за кількістю є з визначеними критеріями розміру. Кількості компонентів присутніх в олійних емульсіях даного винаходу умовні в межах від 0,520% чи 2 до 10% олії (від загальної дози об'єму), такої як сквален; та коли присутні від 2 до 10% альфа токоферолу; від 0,3 до 3% сурфактанту (ПАР), такого як поліоксиетилен сорбітан моно олеат. Переважно співвідношення олія (переважно сквален):токол (переважно -токоферол) дорівнює або менше за 1, так як це забезпечує більшу стабільність емульсії. Емульгатор, такий як TWEEN 80 чи Span 85 може також бути присутнім на рівні близько 1%. В деяких випадках можливо вигідно, щоб вакцини даного винаходу надалі містили стабілізатор. Приклади прийнятних емульсійних систем описані в WO 95/17210, WO 99/11241 та WO 99/12565, які розкривають ад'юванти емульсії, що ґрунтуються на сквалені, -токоферолі та TWEEN 80, необов'язково сформульованими з імуностимуляторами QS21 та/або 3D-MPL. Таким чином, зокрема в прийнятних втіленнях даного винаходу, ад'ювант винаходу може додатково містити наступні імуностимулятори, такі як LPS чи його похідні, та/або сапоніни. Приклади наступних імуностимуляторів описані тут та в "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M.F., and Newman, M.J., Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X. У втіленні, якому надається перевага, ад'ювант та імуногенні композиції згідно з винаходом містять сапонін (переважно QS21) та/або LPS похідні (переважно 3D-MPL) в олійній емульсії, описаній вище, необов'язково зі стерином (переважно холестерин). До того ж олійна емульсія (переважно емульсія олії у воді) може включати спан 85 та/або лецитин та/або трикаприлін. Ад'юванти, що містять емульсію олія у воді, стерин та сапонін описані в WO 99/12565. Типово для введення людині сапонін (переважно QS21) та/або LPS похідні (переважно 3D-MPL) будуть присутні в дозі для людини імуногенної композиції в межах 1мкг-200 мкг, такій як 10 мкг100 мкг, переважно 10 мкг-50 мкг на дозу.Типово олійна емульсія (переважно емульсія олії у воді) міститиме від 2 до 10% метаболізованої олії. Переважно вона міститиме від 2 до 10% сквалену, 31 від 2 до 10% сс-токоферолу та від 0,3 до 3% (переважно 0,4-2%) емульгатору (переважно TWEEN 80 [поліоксиетилен сорбітан моноолеат]). У випадку, коли присутні як сквален так і альфа токоферол, прийнятне співвідношення сквален:альфа токоферол дорівнює або менше за 1, так як це забезпечує більшу стабільність емульсії. Спан 85 (Сорбітан триолеат) також може бути присутнім в емульсії, що використовується у винаході, на рівні від 0.5 до 1%. В деяких випадках, можливо корисно, щоб імуногенні композиції та вакцини даного винаходу надалі містили стабілізатор, наприклад, інші емульгатори/сурфактанти (ПАР), включаючи th каприлову кислоту (merck index 10 Edition, entry no. 1739), з яких особливо прийнятний Трикаприлін. У випадку, коли сквален та сапонін (переважно QS21) входять до складу, корисно, щоб і стерин (переважно холестерин) також включався у композицію, це сприяє зниженню загального рівня олії в емульсії. Це призводить до зниження вартості виробництва, покращення загальної зручності вакцини, а також якісного та кількісного покращення результуючого імунного відгуку, такого як вдосконаленого IFN- вироблення. Відповідно ад'ювантна система даного винаходу зазвичай містить співвідношення метаболізована олія:сапонін (м/м) в межах від 200:1 до 300:1, також даний винахід може бути використаним в «низько олійній» формі прийнятний діапазон якої становить від 1:1 до 200:1, переважно від 20:1 до 100:1, найбільш переважно по суті 48:1, ця вакцина зберігає корисні ад'ювантні властивості всіх компонентів, з набагато зниженим реакційногенним профілем. Згідно втілень, які мають особливі переваги, співвідношення сквален:QS21 (м/м) знаходиться в межах від 1:1 до 250:1, також прийнятні межі становліть від 20:1 до 200:1, переважно від 20:1 до 100:1, найбільш переважно по суті 48:1. Переважно стерин (найбільш прийнятно холестерин), також включений до складу, присутній у співвідношенні сапонін:стерин, як описано тут. Емульсійні системи даного винаходу переважно мають невеликий об'єм олійних крапель в субмікронному діапазоні. Найбільш прийнятними розмірами олійних крапель будуть в межах від 120 до 750 нм, а найбільш прийнятний 120-600 нм в діаметрі. Особливо ефективна ад'ювантна композиція (для первинної комбінації АІРО4 в імуногенній композиції винаходу) включає сапонін (переважно QS21), LPS похідні (переважно 3D-MPL) та олійна емульсія (переважно сквален та альфа токоферол в емульсії олія у воді) як описано в WO 95/17210 та в WO 99/12565 (зокрема ад'ювантна композиція 11 в Прикладі 2, Таблиця 1). Приклади TLR 2 агоністу включають пептидоглікан чи ліпопротеїн. Імідазохіноліни, такі як Іміквімод та Резіквімод відомі TLR 7 агоністи. Одинарний ланцюг РНК також відомий TLR агоніст (TLR 8 у людини та TLR 7 у мишей), тоді як подвійний ланцюг РНК та полі IС (поліінозинополіцитидилова кислота - комерційний синтетичний міметик вірусної РНК) є типовими TLR 3 агоні 96934 32 стами. 3D-MPL є прикладом TLR 4 агоністу доки CPG є прикладом TLR 9 агоністу. Імуногенна композиція може містити антиген та імуностимулятор адсорбований на солі металу. Композиції вакцини, що ґрунтуються на алюмінію, де антиген та імуностимулятор 3-де-Оацильований монофосфорил ліпід A (3D-MPL), адсорбовані на одинакових частках описаних в ЕР 0576478 В1, ЕР 0689454 В1, та ЕР 0633784 В1. В цих випадках надалі антиген адсорбується першим на сіль алюмінію, з наступною адсорбцією імуностимулятору 3D-MPL на ту ж сіль алюмінію. Такі процеси, по-перше, включають суспензування 3D-MPL під дією ультра звуку в водяній бані до утворення часток розміром від 80 до 500 нм. Зазвичай антиген адсорбується на солі алюмінію протягом однієї години при кімнатній температурі та перемішуванні. Після чого 3D-MPL суспензія додається до адсорбованого антигену, та композиція інкубується протягом 1 години, а потім зберігається до використання при 4°С. В іншому процесі, імуностимулятор та антиген знаходяться на окремих частинках металу як описано в ЕР 1126876. Вдосконалений процес містить адсорбцію імуностимулятору на частину солі металу, наступну адсорбцію антигену на іншу частину солі металу, з наступним змішуванням окремих частин металу до утворення вакцини. Ад'ювант для використання в даному винаході може бути ад'ювантом композиції, що містить імуностимулятор, адсорбованим на частині солі металу, що характеризується тим, що частина солі металу є в значній мірі вільною від іншого антигену. До того ж, вакцина забезпечується даним винаходом та характеризується тим, що імуностимулятор адсорбується на частинках солі металу, які в основному вільні від інших антигенів, та тим, що частинки солі металу, яка адсорбована антигеном в значній мірі вільна від іншого імуностимулятору. Відповідно, даний винахід забезпечує ад'ювантну композицію, що містить імуностимулятор, який адсорбований на частині солі металу, що характеризується в композиції в основному відсутністю іншого антигену. Більш того, ад'ювантна композиція може бути інтермедіатом, якщо такий ад'ювант використовується, який є необхідним для виробництва вакцини. Відповідно, забезпечується процес виробництва вакцини, який включає змішування ад'ювантної композиції, що являє собою один або більше імуностимуляторів, адсорбованих на частині металу з антигеном. Переважно, антиген пре-адсорбується на солі металу. Згадана сіль металу може бути ідентичною або подібною до солі металу, яка адсорбується на імуностимуляторі. Переважно соллю металу є сіль алімінію, наприклад, Алюміній фосфат чи Алюміній гідроксид. Даний винахід надалі забезпечує для вакцини композицію, що містить імуностимулятор адсорбований на першій частині солі металу, та антиген адсорбований на солі металу, що характеризується тим, що перша та друга частини солі металу є окремими частинами. LPS або LOS похідні, чи мутації, чи похідні ліпіду А описані тут розроблені, щоб проявляти меншу токсичність (наприклад, 3D-MPL) ніж природні 33 ліпополісахариди та є взаємо замінними еквівалентами, що стосується будь-якого використання цих компонентів, описаних тут. Вони можуть бути TLR4 лігандами як описано вище. Інші такі похідні описані в WO020786737, WO9850399, WO0134617, WO0212258, WO03065806. В одному втіленні ад'ювант, використаний для композицій винаходу, містить носій ліпосом (виготовлений за відомими методиками з фосфоліпідів (таких як диолеоїлфосфатидил холін [DOPC]) та необов'язково стерин [такий як холестерин]). Такі носії ліпосом можуть транспортувати похідні ліпіду А[такий як 3D-MPL - дивись вище) та/або сапоніни (такі як QS21 - дивись вище). В одному втілені ад'ювант містить (0.5 мл на дозу) 0.1-10 мг, 0.2-7, 0.3-5, 0.4-2, чи 0.5-1 мг (наприклад, 0.4-0.6, 0.9-1.1, 0.5 або 1 мг) фосфоліпіду (наприклад, DOPC), 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, чи 0.1250.25 мг (наприклад, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 чи 0.125 мг) стерину (наприклад, холестерин), 5-60, 10-50, чи 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) ліпіду А похідного (наприклад, 3D-MPL), та 5-60, 10-50, чи 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 4050, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) сапоніну (наприклад, QS21). Цей ад'ювант є особливо прийнятним для композицій вакцин для людей похилого віку. В одному втіленні винаходу, вакцинна композиція, що включає цей ад'ювант, містить сахаридні кон'югати, похідні щонайменш зі всіх наступних серотипів: 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (а також можуть містити один або більше з серотипів 3, 6А, 19А, та 22F), де титр GMC антитіла викликаний проти одного чи більше (або всіх) компонентів вакцини 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F та 23F не є значно нижчим за той, що викликаний Prevnar вакциною в вакцинах для людей. В одному втіленні, ад'ювант, використаний для композицій винаходу містить емульсію олії у воді, виготовлену з метаболізованої олії (такої як сквален), емульгатору (такого як TWEEN 80) та необов'язково токолу (такого як альфа токоферол). В одному втіленні винаходу, ад'ювант містить (на 0,5 мл дози) 0.5-15, 1-13, 2-11,4-8, чи 5-6 мг (наприклад, 2-3, 5-6, чи 10-11 мг) метаболізованої олії (такої як сквален), 0.1-10, 0.3-8, 0.6-6, 0.9-5, 1-4, чи 2-3 мг (наприклад, 0.9-1.1, 2-3 чи 4-5 мг) емульгатору (такого як TWEEN 80) та необов'язково 0.520, 1-15, 2-12, 4-10, 5-7 мг (наприклад, 11-13, 5-6, чи 2-3 мг) токолу (такого як альфа токоферол). Цей ад'ювант надалі необов'язково може містити 5-60, 10-50, чи 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 4050, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3D-MPL). Ці ад'юванти особливо прийнятні для композицій вакцини для дітей (до 7 років) та людей похилого віку. В одному втіленні, вакцинна композиція, що містить цей ад'ювант, включає сахаридні кон'югати, похідні від щонайменш всіх наступних серотипів 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (та можуть також містити один чи більше з серотипів 3, 6А, 19А, та 22F), де титр GMC антитіла викликаний проти одного чи більше (або всіх) компонентів вакцини 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F та 23F не є значно 96934 34 нижчим за той, що викликаний Prevnar вакциною в вакцинах для людей. Цей ад'ювант може необов'язково містити 0.025-2.5, 0.05-1.5, 0.075-0.75, 0.1-0.3, чи 0.1250.25 мг (наприклад, 0.2-0.3, 0.1-0.15, 0.25 чи 0.125 мг) стерину (наприклад, холестерину), 5-60, 30 1050, чи 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) похідної ліпіду А (наприклад, 3DMPL), та 5-60, 10-50, чи 20-30 мкг (наприклад, 515, 40-50, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) сапоніну (наприклад, QS21). Цей ад'ювант є особливо прийнятним для композицій вакцин для людей похилого віку. В одному втіленні винаходу, вакцинна композиція, що включає цей ад'ювант, містить сахаридні кон'югати, похідні з щонайменш всіх наступних серотипів: 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (а також можуть містити один або більше з серотипів 3, 6А, 19А, та 22F), де титр GMC антитіла викликаний проти одного чи більше (або всіх) компонентів вакцини 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F та 23F не є значно нижчим за той, що викликаний вакциною Prevnar в вакцинах для людей. В одному втіленні, ад'ювант, використаний для композицій винаходу, містить фосфат алюмінію та похідну ліпіду А (таку як 3D-MPL). Цей ад'ювант може містити (на дозу 0,5 мл) 100-750, 200-500, чи 300-400 мкг АІ як фосфату алюмінію, та 5-60, 1050, чи 20-30 мкг (наприклад, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 чи 50 мкг) похідну ліпіду А (наприклад, 3DMPL). Цей ад'ювант є особливо прийнятним для композицій вакцин для людей похилого віку та дітей (до 7 років). В одному втіленні винаходу, вакцинна композиція, що включає цей ад'ювант, містить сахаридні кон'югати, похідні з щонайменш всіх наступних серотипів: 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F, 23F, 1, 5, 7F (а також можуть містити один або більше з серотипів 3, 6А, 19А, та 22F), детитр GMC антитіла викликаний проти одного чи більше (або всіх) компонентів вакцини 4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F та 23F не є значно нижчим за той, що викликаний вакциною Prevnar в вакцинах для людей. Приготування вакцини, що включає імуногенні композиції даного винаходу, можуть бути використані для захисту або лікування ссавців чутливих до інфекції способом введення згаданої вакцини соматичним шляхом чи крізь слизову оболонку. Ці введення можуть включати ін'єкції внутрішньомишечні, інтраперітонеальні, інтрадермальні чи підшкірні; або введення крізь слизову оболонку до орально/травного, дихального, сечостатеві тракти. Для лікування пневмонії чи середнього отиту надається перевага інтраназальному введенню вакцини (так як може більш ефективно запобігати назофаренгальному проникненню пневмококів, таким чином послаблення інфекції на ранніх стадіях). Хоча вакцина винаходу може вводитися як одноразова доза, її компоненти також можуть співвводитися в один і той же час або в різні періоди часу (наприклад, пневмококові сахаридні кон'югати могли б вводитися окремо, в один і той же час або через 1-2 тижні після введення будь-якої компоненти бактеріального протеїну вакцини для оптимальної координації імунного відгуку по відношенню 35 до кожного іншого). Для співведення необов'язковий Th1 ад'ювант може бути присутнім в будь-якій або всіх різних введеннях. На додаток до одноразового шляху введення, 2 різні шляхи введення можуть використовуватись. Наприклад, сахариди чи сахаридні кон'югати можуть бути введенні IM (або ID) та бактеріальні протеїни можуть бути введенні IN (або ID). До того ж вакцини винаходу можуть вводитися IM для первинних доз та IN для ревакцинуючих доз. Вміст протеїнових антигенів у вакцині, як правило, знаходитиметься в межах 1-100 мкг, переважно 5-50 мкг, найбільш типово в межах 5-25 мкг. Після первинного вакцинування, люди можуть отримувати одну або декілька імунізацій в задовільний проміжок часу. Приготування вакцини в основному описане в Vaccine Design ("The subunit and adjuvant 10 approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Інкапсуляція з ліпосомами описана Fullerton в US Patent 4,235,877. Вакцини даного винаходу можуть зберігатися в розчинах або ліофілізованими. Переважно розчин ліофілізують в присутності цукру, такого як цукроза або лактоза. Надалі все ще надається перевага, коли вони ліофілізуються та відновлюються безпосередньо перед використанням. Ліофілізат може бути результатом в більш стабільній композиції (вакцині) та можливо може призводити до більш високих титрів антитіл в присутності 3DMPL та відсутності алюміній основного ад'юванту. В одному втіленні винаходу забезпечується кіт вакцини, що містить флакон, який містить імуногенну композицію за винаходом, необов'язково в ліофілізованій формі, та додатково включає флакон, який містить ад'ювант як описано тут. Передбачено, що в цьому втіленні винаходу, ад'ювант буде використаним для відновлення ліофілізованої імуногенної композиції. Хоча вакцини даного винаходу можуть вводитись будь-яким способом, введення описаних вакцин в шкіру (ID) формує окреме втілення даного винаходу. Шкіра в людини містить зовнішню "грубу" кутікулу, названу ороговілим шаром, яка вкриває епідерміс. Внизу цього епідермісу є шар, названий дермісом, який по черзі вкриває підшкірові тканини. Дослідники показали, що ін'єкція вакцини в шкіру, зокрема в дерміс, стимулює імунний відгук, який може також бути асоційованим з рядом додаткових переваг. Інтрадермальна вакцинація з вакцинами, описаними тут, формує характерну ознаку даного патенту. Традиційно методика інтрадермальної ін'єкції, "реакція Манту", містить стадії очищення шкіри, а потім витягнення однієї руки, та зі скосом вузького калібру голки (26-31 калібр) стоячи лицем до пацієнта вводиться голка знизу вверх під кутом близько 10-15°. Скос голки вводиться, розширена частина опускається та надалі під невеликим тиском вакцина вводиться під шкіру. Рідина потім введена дуже повільно утворює пухирець чи бульбашку на поверхні шкіри, з наступним повільним витягуванням голки. Недавно описані винаходи, що розроблені особливо для введення рідини в або перехресно 96934 36 шкіру, наприклад, винаходи описані в WO 99/34850 та ЕР 1092444, також описані винаходи вприскування ін'єкції, наприклад в WO 01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 та WO 97/13537. Альтернативні методи інтрадермального введення препаратів вакцини можуть включати традиційні шприці та голки, чи винаходи, розробленідля балістичної доставки твердих вакцин (WO 99/27961), чи трансдермальні "петчі" (WO 97/48440; WO 98/28037); чи використаний до поверхні шкіри (трансдермальна або підшкірна доставка WO 98/20734 ; WO 98/28037). Коли вакцини даного винаходу вводиться черезшкірно, чи більш точніше в дерміс, то вакцина є в невеликому об'ємі рідини, зокрема об'єм близько від 0,05 мл до 0,2 мл. Вміст антигенів в шкірних чи інтрадермальних вакцинах даного винаходу може бути подібним до традиційних доз як визначено у внутрішньомишечних вакцинах (дивись вище). Однак є характерна особливість шкірних чи інтрадермальних вакцин, що композиції можуть бути "низькою дозою". Відповідно протеїнові антигени в „низьких дозах" вакцин переважно присутні в таких малих кількостях як від 0,1 до 10мкг, переважно від 0,1 до 5 мкг на дозу; та сахаридні (переважно кон'юговані) антитіла можуть бути присутніми в межах 0,01-1 мкг, та переважно від 0,01 до 0,5 мкг сахариду на дозу. Як використано тут, термін "інтрадермальна доставка" означає доставку вакцини в область дермісу в шкірі. Однак, вакцина необов'язково знаходиться виключно в дермісі. Дерміс - це шар шкіри, розташований між близько 1.0 та близько 2.0 мм від поверхні шкіри людини, але існують варіації точної кількості між індивидумами та в різних частинах тіла. Дерміс розташований між ороговілим шаром та епідермісом при поверхні та підшкірним шаром нижче. В залежності від способу доставки, вакцина може в кінці кінців розташовуватися виключно чи першочергово в дермісі, або вона може в кінці кінців розподілятися в епідермісі та дермісі. Даний винахід надалі забезпечує вдосконалену вакцину для попередження чи покращення стану у випадках середнього Отиту Haemophilus influenzae додаванням протеїнів Haemophilus influenzae, наприклад, протеїн D у вільній чи кон'югованій формі. Крім того, даний винахід надалі забезпечує вдосконалену вакцину для попередження чи покращення стану при пневмококовій інфекції у дітей (наприклад, середній Отит), сподіваючись на додавання одного чи двох пневмококових протеїнів як вільного чи кон'югованого протеїну до S. pneumoniae кон'югатної композиції винаходу. Згадані пневмококові вільні протеїни можуть бути подібними або відмінними до будьяких S. pneumoniae протеїнів, використаних як носії-протеїнів. Один чи більше Moraxella catarrhalis протеїнові антигени можуть також бути 37 включеними в комбінацію вакцини у вільній чи кон'югованій формі. Таким чином, даний винахід є покращеним методом викликання (захисного) імунного відгуку проти середнього Отиту у дітей. В іншому втіленні, даний винахід є покращеним методом викликання (захисного) імунного відгуку проти середнього Отиту у дітей (визначеним як віком 0-2 роки в контексті даного винаходу) введенням безпечної та ефективної кількості вакцини винаходу [педіатрична вакцина]. Наступні втілення даного винаходу включають забезпечення композицій антигенного S. pneumoniae кон'югату винаходу для використання в медицині та використання S. pneumoniae кон'югатів винаходу у виробництві медикаментів для запобігання (чи лікування) пневмококових захворювагь. В ще іншому втіленні, даний винахід є покращеним методом викликання (захисного) імунного відгуку середнаселення похилого віку (в контексті даного винаходу, пцієнти вважаються похилого віку, якщо їх вік становить 50 років чи старше, як правило понад 55 років, а більш точно понад 60 років) введенням безпечної та ефективної кількості вакцини винаходу, переважно в кон'югації з одним або двома S. pneumoniae протеїнами, присутніми як вільний чи кон'югований протеїн, де вільні S. pneumoniae протеїни можуть бути подібними чи відмінними як будь-які S. pneumoniae протеїни, використані як носії-протеїни. Наступним аспектом винаходу є спосіб імунізації людини господаря проти захворювання викликаного S. pneumoniae та необов'язково Haemophilus influenzae інфекціями, що містять введення до господаря імунозахисної дози імуногенної композиції чи вакцини чи кіта винаходу. Наступним аспектом винаходу є імуногенна композиція винаходу для використання в лікуванні чи попередженні захворювання, викликаного S. pneumoniae та необов'язково Haemophilus influenzae інфекцією. Наступним аспектом винаходу є використання імуногенної композиції чи вакцини чи кіта винаходу в виробництві медикаментів для лікування чи попередження захворювань, викликаних S. pneumoniae та необов'язково Haemophilus influenzae інфекцією. Терміни "що містить", "містить" та "містять", тут маються на увазі заявниками, що необов'язково можуть бути заміненими на терміни "що складається з", "складається з" та "складаються з" відповідно в кожному випадку. Втілення тут, що відносяться до "вакцинних композицій" винаходу є також придатними до застосування втіленнями, що відносяться до "імуногенних композицій" винаходу, та навпаки. Всі посилання чи патентні заявки цитовані в описі винаходу цього патенту включаються посиланнями тут. З метою кращого розуміння цього винаходу, натупні приклади наведені далі. Ці приклади наводяться з метою ілюстрації тільки, а не конструктивного обмеження об'єму винаходу будь-яким чином. Приклади Приклад 1: Експресія протеїну D 96934 38 Haemophilus influenzae protein D 35 Генетична будова для експресії протеїну D Вихідні матеріали Протеїн D кодується ДНК Протеїн D добре зберігається серед Н. influenzae зі всіх серотипів та нетипових штамів. Вектор рНІС348, що містить ДНК послідовність, яка кодує цілий ген протеїну D, був отриманий Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmb General Hospital, Malmo, Sweden. The DNA sequence of protein D has been published by Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59: 119-125. Вектор експресії pMG1 Вектор експресії pMG1 - це похідна від pBR322 (Gross et al., 1985), в яку був введений виведений бактеріофаг , що контролює елементи для транскрипції та трансляції чужерідних внесених генів (Shatzman et al., 1983). Крім того, стійкий до Ампіциліну ген був замінений на ген стійкий до Канаміцину. Е. coli штам AR58 Е. coli штам AR58 був згенерований трансдукцією N99 з Р1 фагом лінії попередньо вирощеної на SA500 похідній (galE::TN10, lambdaKil сІ857 Н1). N99 та SA500 - це Е. coli K12 штами, виведені в лабораторії Dr. Martin Rosenberg при National Institute of Health. Вектор експресії pMG 1 Для виробництва протеїну D, ДНК, що кодуює протеїн, був клонований, вектором експресії pMG 1. Цей плазмід використовує сигнали від лямбдафагу ДНК, щоб керувати транскрипцією та трансляцією внесених чужерідних генів. Вектор включає промотор PL, оператор OL та два сайти використання (NutL та NutR), щоб допомогти ефектам транскрипційної полярності, коли забезпечується N протеїн (Gross et al., 1985). Вектори, що включають РL промотор, вводяться до Е. coli лізогенного господаря для стабілізації плазмідну ДНК. Штами лізогенного господаря містить реплікаційнодефектний лямбдафаг ДНК інтегрований в геном (Shatzman et al., 1983). Хромосомний лямбдафаг ДНК керує синтезом сl протеїну репрессора, який зв'язується з OL репрессором вектору та запобігає зв'язуванню РНК полімерази до PL промотору та таким чином здійснюється транскрипція введеного гену. Ген cl штаму експресії AR58 містить чутливі до температури мутанти, такі що PL направлена транскрипція може регулюватись зміною температури, тобто підвищення температури в культурі дезактивує гепрессор та ініціюється синтез чужерідного протеїну. Ця система експресії дозволяє контролювати синтези чужерідних протеїнів особливо тих, що можуть бути токсичними до клітини (Shimataka & Rosenberg, 1981). Ε. coli штам AR58 AR58 лізогенний штам Е. coli, використаний для виробництва протеїну D носію, - це похідна стандартного NIH Е. coli K12 штаму N99 (F su galK2, lacZ thr). Він включає дефектний лізогенний лямбафаг (gaE::TN10, lambdaKil cl857 Η1). Kil фенотип запобігає ізолюванню синтезу макромолекули господаря. Мутація cl857 надає температурно чутливе пошкодження cl репресору. Η1 39 делеція видаляє правий оперон лямбафагу та господаря bio, uvr3, та chIA loci. AR58 штам згенерований трансдукцією N99 з Р1 фаговою лінією попередньо вирощеної на SA500 похідній (galE::TN10, lambdaKil cl857 Н1). Введення дефектного лізогену в N99 було відібрано з тетрацикліну завдяки присутності TN10 транспозону, що кодує стійкість до тетрацикліну в сусідньому gale гені. Будова вектору pMGMDPPrD Вектор pMG1, який включає ген, що кодує неструктурний S1 протеїн вірусу грипу (pMGNSI), був використаний для будови pMGMDPPrD. Ген D протеїну був розширений PCR з рНІС348 вектору (Janson et at. 1991 Infect. Immun. 59:119-125) з PCR праймерами, що містять Ncol та Xbal сайти рестрикції на 5' та 3' кінцях, відповідно. Фрагменти Ncol/Xbal потім вводилися в pMGNSI між Ncol та Xbal, таким чином утворюючи злитий протеїн, що включає N-термінальні 81 амінокислоти NS1 протеїну з наступним PD протеїном. Цей вектор vector маркується pMGNSI PrD. Ґрунтуючись на будові описаній вище, генерується кінцева будова для експресії протеїну D. BamHI/BamHI фрагменти видаляються з pMGNSI PrD. Цей гідроліз ДНК видаляє NS1 кодуючу область, за виключенням перших трьох Nтермінальних залишків. На регуляції вектору був згенерований ген, що кодує злитий протеїн з наступною N-термінальною амінокислотною послідовністю: Протеїн D не містить лідерного пептиду або Nтермінального цистеїну до яких нормально приєднані ліпідні ланцюги. Тому протеїн не є ні виділеним в періплазм ні ліпідованим та залишається в цитоплазмі в розчинній формі. Завершена будова pMG-MDPPrD вводиться в AR58 штам господаря різким нагріванням до 37°C. Плазмід, що містить бактерії, був відібраним в присутності канаміцину. Присутність протеїну D, що кодується введенням ДНК, було продемонстровано розщеплянням ізольованого плазміду ДНК з відібраних ендонуклеаз. Рекомбінант Е. coli штаму відомий як ECD4. Експресія протеїну D знаходиться під контролем лямбда PL промотора/OL 10 оператора. Господар штаму AR58 включає температурно чутливий cl ген в геномі, який блокує експресію від лямбда PL при низькій температурі зв'язуванням з OL. Одноразово температура підвищується, cl виділяється з OL та протеїн Рекспресується. Маломасштабне приготування В кінці ферментації клітини концентруються і заморожуються. Екстракція з зібраних клітин та очищення протеїну D була виконана наступним чином. Таблетка замороженої культури клітин відтаюється та пересуспензується в клітинно розривному розчині (цитратний буфер рН 6.0) до кінцевого OD6so=60. Суспензія двічі пропускається через гомогенізатор високого тиску при Ρ=1000 бар. Гомогенізована клітинна культура очищається центрифугуванням 96934 40 та залишки клітин видаляються фільтрацією. На першій стадії очищення фільтрований лізат застосовується до катіонно обмінної хроматографічної колонки (SP Sepharose Fast Flow). PD зв'язується з гелевою матрицею іонною взаємодією та ілююється на стадії зростання іонної сили ілююючого буферу, яким ілюють. На другій стадії очищення домішки залишаються на аніон обмінній матриці (Q Sepharose Fast Flow). PD не зв'язується з гелем, та може збиратися в тоці через неї. На обох стадіях колоночної хроматографії зібрані фракції контролюються методом OD. Поток, пропущений крізь аніон обмінну хроматографічну колонку, що містить, очищенний протеїн D концентрується методом ультрафільтрації. Протеїн D, що має обмежену здатність до утримання ультрафільтрацією, назавершення пропускається через мембрану з розміром пор 0,2 мкм. Крупномасштабне приготування Екстракція із зібраних клітин та очистка протеїну D виконували наступним чином. Зібраний бульон охолоджується й прямо двічі пропускається через гомогенізатор високого тиску при тиску близько 800 бар. На першій стадії очищення гомогенізована клітинна культура розбавляється та застосовується до катіонно обмінної хроматографічної колонки (SP Sepharose Big beads). PD зв'язується з гелевою матрицею іонною взаємодією та ілююється на стадії зростання іонної сили ілююючого буферу, яким ілюють та фільтрують. На другій стадії очищення домішки залишаються на аніон обмінній матриці (Q Sepharose Fast Flow). PD не зв'язується з гелем, та може збиратися з потоку, що проходить через неї. На обох стадіях колоночної хроматографії зібрані фракції контролюються методом OD. Поток, пропущений крізь аніон обмінну хроматографічну колонку, що містить, очищенний протеїн D концентрується та діафільтрується методом ультрафільтрації. Протеїн D, що має обмежену здатність до утримання ультрафільтрацією, назавершення пропускається через мембрану з розміром пор 0,2 мкм. Приклад 1b: Експресія PhtD PhtD протеїн - це мембрана сімейства протеїнів гістидин-тріади, що характеризується присутністю гістидин-тріад (НХХНХН фрагменту). PhtD є 838 аа-молекулою та несе 5 гістидинових тріад (дивись Medlmmune WO00/37105 SEQ ID NO: 4 для амінокислотної послідовності та SEQ ED NO: 5 для ДНК послідовності). PhtD також включає апролін збагачену область в середині (позиції амінокислот 348-380). PhtD містить 20 aa-N-термінальну сигнальну послідовність з LXXC фрагментом. Генетична будова Генна послідовність зрілого Medlmmune PhtD протеїну (від аа 21 до аа 838) була рекомбінантно трансплантована до Е. coli, використовуючи власний рТСМР14 вектор, що несе рпромотор. Е. coli штам господар - це AR58, який несе cl857 термо 41 чутливий репрессор, що дозволяє термо-індукцію промотора. Ланцюгова реакція полімерази виконувалась для збільшення phtD гену з Medlmmune плазміду (що несе phtD ген з Streptococcus pneumoniae штаму Norway 4 (серотип 4) - SEQ ID NO: 5 як описано в WO 00/37105). Праймери, специфічні тільки для phtD гену, використовують для збільшення phtD гена на два фрагменти. Праймери несуть або Ndel та Kрnl або Kрnl та Хbаl сайти рескрипції. Ці праймери не гібридизують з будь-яким нуклеотидом з вектору, але тільки з phtD специфічними генними послідовностями. Штучний ATG ініціюючий кодон вводили використовуючи перший праймер, що несе Ndel сайт рескрипції. Згенеровані PCR продути потім вводили до pGEM-T клонуючого вектору (Promega), та підтверджували ДНК послідовність. Субклонування фрагментів в ТСМР14 векторі експресії потім проводили використовуючи стандартні методики та вектор трансформували в AR58 Е. coli. Очищення PhtD Очищення РhtD здійснювали наступним чином: - Ріст Е. coli клітин в присутностіканаміцину: ріст 30 годин при 30°C потім індукція протягом 18 годин при 39.5°C - Розрив Е. coli клітин з цілої культури при OD +115 в присутності EDTA 5 мМ та PMSF 2 мМ як інгібіторів протеази: Rannie, 2 пассирування, 1000 бар. - Захват антигену та відщеплення осколків клітин, що витрачався, настилали методом Ламінарної Q XL хроматографії при кімнатній температурі (20°С); колонку промивали 150 мМ розчином NaCI+Empigen 0.25% рН 6.5 та елюювали 400 мМ NaCI+Empigen 0.25% в 25 мМ буфері фосфату калію рН 7.4. - Фільтрували на Sartobran 150 картріджі (0.45+0.2мкм) ++ - Антиген зв'язуючий на Zn хелатуючій Сефарозі методом FF ІМАС хроматографії при рН 7.4 в присутності 5 мМ розчину імідазолу при 4°С; колонку промивали 5 мМ розчином імідазолу та Empigen 1% та елюювали 50 мМ розчином імідазолу, обидва в 25 мМ буфері фосфату калію рН 8.0. - Слабка аніонно обмінна хроматографія в позитивному методі на Фрактогелі EMD DEAE при рН 8.0 (25 мМ буфер фосфату калію) при 4°С; колонку промивали 140 мМ розчином NaCI та елюювали 200 мМ NaCI, в той час як забруднюючи речовини (протеїни та ДНК) залишилися адсорбованими на обміннику. - Концентрація та ультрафільтрація з 2мМ Na/K фосфату рН 7.15 на мембрані 50 кДа. - Стерилізуюча фільтрація очищеного основного об'єму проводили на картріджі фільтру Millipak-20 0.2 рm. Приклад 1с: Експресія пневмолізину Пневмококовий пневмолізин готували та детоксикували як описано в WO2004/081515 та WO2006/032499. Приклад 2: Приготування кон'югатів 96934 42 Фахівцям добре відомо як виробляти очищені пневмококові полісахариди. Метою цих прикладів полісахаридів, головним чином, було зробити так, як описано в ЕР072513 чи близькими методами. Перед кон'югацією полісахариди можуть сортуватися за методом мікрофлюідизації як описано нижче. Активація та поєднання умов є специфічними для кожного полісахариду. Це наведенов Таблиці 1. Сортовані полісахариди (за виключенням PS5, 6В та 23F) розчиняли в 2М NaCI, 0.2M NaCI або у воді для ін'єкцій (WFI). Оптимальну концентрацію полісахариду визначали для кожного серотипу. Всі серотипи за виключенням серотипу 18C були кон'юговані безпосередньо до носію-протеїну як детально описано нижче. Два альтернативних кон'югата серотипу 22F були зроблені; один кон'югований безпосередньо, один через ADH лінкер. Зі стокового розчину концентрацією 100 мг/мл в ацетонітрилі чи розчині ацетонітрил/вода 50%/50%, CDAP (CDAP/PS відношення 0.5-1.5 мг/мг PS) додавали до розчину полісахариду. 1.5 хвилини пізніше, добавили 0.2М-0.3М NaOH для отримання специфічної активації рН. Активація полісахариду виконували при цій рН протягом 3 хвилин при 25°C. Очищений протеїн (протеїн D, PhtD, пневмолізин чи DT) (кількість залежить від початкового PS/носій-протеїн співвідношення) додавали до активованого полісахариду та проводили реакцію сполучення при специфічних рН протягом аж до 2 годин (в залежності від серотипу) при регулюванні рН. З метою блокування цианатних естерних груп, що не прореагували, додавали до суміші 2М розчин гліцину. рН регулювали стримуючи рН (рН 9.0). Розчин струшували протягом 30 хвилин при 25°C та потім всю ніч при 2-8°C продовжуючи слабке струшування. Приготування 18С: 18С приєднаний до носію-протеїну через лінкер - гідразид адипінової кислоти (ADH). Полісахаридний серотип 18С мікрофлюїдизують перед кон'югацією. Модифікування токсоїду правцю EDAC Для модифікування токсоїду правцю, очищений ТТ розбавляли 25 мг/мл в 0.2М NaCI та додавали ADH спейсер з метою досягти кінцеву концентрацію 0.2М. Коли розчинення спейсеру завершилось, рН регулювали до 6.2. Потім додавали EDAC (1-етил-3-(3-діметиламіноргопіл)карбодиімід) для доведення кінцевої концентрації до 0.02М та струшували суміш протягом 1 години регулюючи рН. Реакцію конденсації зупиняли підвищенням рН аж до 9.0 протягом щонайменш 30 хвилин при 25°С. Модифікований ТТ потім діафільтрували (10 кДа CO мембрана) з метою видалення залишкових ADH та EDAC реагенту. ТТAH об'єм в кінці стерильно фільтрували до стадії сполучення та зберігали при -70°С. Хімічне сполучення ТТАН до PS 18C Деталі параметрів кон'югації наведені в Таблиці 1. 2 грами мікрофлюідизованого PS розбавляли до певної концентрації у воді та доводили до 2М NaCI додаванням порошку NaCI. 43 96934 CDAP розчин (100 мг/мл свіже приготовлений в 50/50 о/о ацетонітрил/WFI) додавали до досягнення прийнятного співвідношення CDAP/PS. рН підвищували аж до активації рН 9,0 додаванням 0.3М NaOH та стабілізували при цьому рН до додавання ТТАН. Після 3 хвилин, модифікований ТТАН (20 мг/мл в 0.2 Μ NaCI) додавали для досягнення співвідношення ТТАН/PS 2; рН регулювали до рН 9.0. Розчин залишали на одну годину при регульованому рН. Для блокування, 2М розчин гліцину додавали до суміші PS/TTAH/CDAP. рН регулювали стримуванням рН (рН 9.0). Розчин струшували протягом 30 хвилин при 25°C, та потім залишали на всю ніч при 2-8°С продовжуючи слабке струшування. PS22FAH-PhtD кон'югат В другому методі кон'югації для цього сахариду (перший безпосередній метод кон'югації PS22PhtD представлений в Таблиці 1), 22F приєднували до носію-протеїну через лінкер - гідразид адипінової кислоти (ADH). Полісахаридний серотип 22F мікрофлюїдували перед кон'югацією. PS 22F модифікування Активацію та сполучення виконували при 25°С при постійному струшуванні в температурно контрольованій водяній бані. Мікрофлюїдизований PS22F розбавляли до отримання кінцевої PS концентрації 6 мг/мл в 0.2М NaCI та розчин вивіряли до рН 6.05 ±0.2 розчином 0.1N НСІ. CDAP розчин (100 мг/мл свіже приготовлений в суміші ацетонітрил/WFI, 50/50) додавали до досягнення прийнятного співвідношення CDAP/PS (1.5/1мм). рН підвищували аж до активації рН 9.00±0.05 додаванням 0.5М NaOH та стабілізували при цьому рН до додавання ADH. Через 3 хвилини, ADH додавали до досягнення прийнятного співвідношення ADH/PS (8.9/1 м/м); рН регулювали до сполучення рН 9.0. Розчин залишали на 1 годину при регулюванні рН. PSah похідна була концентрована та діафільтрована. Сполучення. 44 PhtD 10 мг/мл в 0.2М NaCI додавали до PS22FAH похідної з метою досягнення співвідношення PhtD/PS22FAH 4/1 (м/м). рН доводили до 5.0±0.05 використовуючи НСІ. Розчин EDAC (20 мг/мл в 0.1 Μ Tris-HCI pH 7.5) додавали вручну через 10 хвилин (250 мкл/хв) для досягнення 1 мг EDAC/мг PS22FAН. Кінцевий розчин інкубують протягом 150 хвилин (хоча 60 хвилин також використовують) при 25°С при струшуванні та регулюванні рН. Розчин нейтралізують додаванням 1М Tris-HCI рН 7.5 (1/10 від кінцевого об'єму) та залишили на 30 хвилин при 25°С. Перед еліюванням на Сефакрилі S400HR, кон'югат освітлюють використовуючи 5 мкм Minisart фільтр. Кон'югат, отриманий в результаті, має кінцеве співвідношення PhtD/PS 4.1 (м/м), вміст вільного PS нижче 1% та антигенність (a-PS/ct-PS) 36.3% та анти-PhtD антигенність 7.4%. Очищення кон'югатів: Кон'югати очищували гель фільтрацією використовуючи Сефакрил S400HR гель фільтраційну колонку урівноважену 0.15М NaCI (S500HR для 18С) для видалення малих молекул (включаючи DMAP) та некон'югованого PS та протеїну. Ґрунтуючись на різних розмірах молекул реакційних компонентів, PS-PD, PS-TT, PS-PhtD, PSпневмолізину чи PS-DT кон'югатів першими еліюють наступні вільний PS, потім вільний PD чи вільний DT та в кінці DMAP та інші солі (NaCI, гліцин). Фракції, що містять кон'югати детектують UV280нм. Фракції об'єднують відповідно до їх Kd, стерильно фільтрують (0.22 мкм) та зберігають при +2-8°С. Визначають співвідношення PS/Протеїн в приготовлениях кон'югатів. Специфічні активація/сполучення/блокування умов PS S. Pneumoniae-Протеїну D/TT/DT/PhtD/Ply кон'югатів Де "мікрофлюїд" виникає в ряду головної частини, він виявляє, що сахариди сортували методом мікрофлюїдизації перед кон'югацією. Розміри сахаридів після мікрофлюїдизації наведені в Таблиці 2. Таблиця 1 Специфічні умови активаціїя/сполучення/блокування PS S. Pneumoniae-Протеїну D/TT/DT/PhtD/Ply кон'югатів Серотип Ps конц., (мг/мл) PS розчин PD конц., (мг/мл) Почат. Співвід. PD/PS (м/м) CDAP конц., (мг/мл PS) pHa=pHc=pHq 1 4 мікрофлюїд мікрофлюїд 2.5 2.5 WFI WFI 10.0 10.0 1.5/1 1.5/1 0.50 0.50 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 5 6А 6В 7.1 WFI 5.0 1/1 0.79 9.0/9.0/9.0 5.0 NaCI 2M 5.0 1/1 0.83 9.5/9.5/9.0 5.0 NaCI 2M 5.0 1.1/1 0.83 9.5/9.5/9.0 7F мікрофлюїд 5.0 NaCI 2M 10.0 1.2/1 0.75 9.5/9.5/9.0 45 96934 46 Продовження таблиці 1 Серотип 9V 14 18С 19А 19F 22F мікрофлюїд мікрофлюїд мікрофлюїд мікрофлюїд мікрофлюїд мікрофлюїд 5.0 5.0 4.5 15.0 9.0 6.0 NaCI 2M NaCI 2M NaCI 2M NaCI 2M NaCI 2M NaCI 0.2М PS конц., (мг/мл) PS розчин Носій-протеїн 10.0 конц., (мг/мл) Початкове Носійпротеїн/PS Співвід. 1.2/1 (м/м) CDAP конц., (мг/мл 0.50 PS) pHa=pHc=pHq 9.5/9.5/9.0 23F 2.38 NaCI 2M 10.0 20.0 (ТТ) 10.0 (Ply) 20.0 (DT) 10.0 (PhtD) 5.0 1.2/1 2/1 2.5/1 1.5/1 3/1 1/1 0.75 0.75 1.5 1.5 1.5 0.79 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 Примітка: рНа, c, q відповідає рН активації, сполучення та блокування, відповідно. Характеристика: Кожен кон'югат був охарактеризованим та задовільняв вимогам, описаним в Таблиці 2. Вміст полісахариду (мг/мл) вимірювали резорциновим тестом, вміст протеїну вимірювали тестом Лоурі. Кінцеве PS/PD співвідношення (м/м) визначали співвідношенням концентрацій. Вміст вільного полісахариду (%): Вміст вільного полісахариду кон'югату, що зберігався при 4°С чи хранився 7 днів при 37°С, визначали на супернатанті, отриманого після інкубації з антитілами -носію-протеїну та насичення сульфатом амонію, з наступним центрифугуванням. -PS/-PS ELISA використовували для кількісного визначення вільного сахарину в супернатанті. Відсутність кон'югату також контролювали методом -носію-протеїну/-PS ELISA. Антигенність: Антигенність одинакових кон'югатів аналізують в ELISA сендвіч-типу, де захват та детекція антитіл були -PS та -Протеїн, відповідно. Вміст вільного протеїну (%): Некон'югований носій-протеїн може бути відділеним з кон'югату під час стадії очистки. Вміст вільного залишкового протеїну визначали використовуючи розмір виключаючу хроматографію (TSK 5000-PWXL) з наступним UV детектуванням (214нм). Умови елюювання дозволили відділити вільний носій-протеїн від кон'югату. Вміст вільного протеїну в об'ємах кон'югату потім визначали в порівнянні з калібровочною кривою (від 0 до 50 мкг/мл носію-протеїну). Вільний носій-протеїн у % був отриманий наступним чином: % вільний носій=(вільний носій (мкг/мл)/(загальна концентрація відповідного носію-протеїну виміряного за методом Лоурі (мкг/мл)*100%). Стабільність: Розподілення молекулярних мас (Kav) та стабільність вимірювали HPLC-SEC гель фільтрацією (TSK 5000-PWXL) для кон'югатів, що зберігалися при 4°С та складувалися протягом 7 днів при 37°С. 10/11/13/14-валентна характеристика надана в Таблиці 2 (дивись коментарі нижче). Протеїнові кон'югати можуть бути адсорбованими на фосфаті алюмінію та об'єднаними для утворення кінцевої вакцини. Висновок: Виготовлені імуногенні кон'югати, як показано, можуть входити до складу перспективних вакцин. Таблиця 2 Характеристики кон'югатів Кон'югати PS1-PD PS4-PD PS5-PD*** PS6A-PD PS6B- PD*** PS7F-PD PS9V-PD PS14-PD PS18C-TF PS19A-PIV* Розмір PS 3 (Да х10 ) 349-382* 93-100* 367-443 1100-1540 1069-1391 255-264* 258-280* 232-241* 89-97* 151 Співвід. носій/PS 1.5-1.6 1.5-1.6 0.80 0.61 0.7-0.8 1.1-1.2 1.3-1.5 1.4 2.2-2.4 3.2 Вільний PS (Elisa) 1.0%-1.2% 4.7-6.5% 8.7-11.2% 4.5% 1.3-1.6%