Спосіб стимуляції імунної системи за допомогою димеру лізоциму

1 Способ стимуляции иммунной системы путем повышения в организме человека или животного по меньшей мере одного из параметров, выбираемого из группы, состоящей из уровня церулоплазмина, респираторной окислительной активности, уровня иммуноглобулина, активности лизоцима и регуляции уровня свободных радикалов кислорода в сыворотке, отличающийся тем, что такую стимуляцию производят введением димера лизоцима со степенью очистки не менее 90% 2 Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный димер используют в качестве профилактического или лечебного средства в случае заболевания человека или животного, выбранного из группы, включающей лейкемию, нарушение роста волос, заболеваний рыб и болезней пчел 3 Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный димер используют для предупреждения или лечения эффекта иммунного угнетения 4 Способ по пункту 2, отличающийся тем, что указанный димер используют в случае лейкемии, вызванной действием вируса 5 Способ по пункту 4, отличающийся тем, что указанный димер используют в случае лейкемии, вызванной ретровирусом 6 Способ по пункту 2, отличающийся тем, что указанный димер используют при нарушении роста волос в случае очаговой алопеции у людей 7 Способ по пункту 2, отличающийся тем, что указанный димер используют в случае фурункулеза или инфекции, вызываемой ВИНПЖ, у рыб 8 Способ по пункту 7, отличающийся тем, что указанный димер используют для рыб из семейства лососевых, в частности радужной форели 9 Способ по пункту 3, отличающийся тем, что указанный димер используют в случае иммунного угнетения, вызванного микробной инфекцией 10 Способ по любому из пунктов 1-9, отличающийся тем, что указанный димер лизоцима является продуктом димеризации мономеров лизоцима, получаемых из природных источников, включающих человека, животных, яйца, растения и микроорганизмы, или путем синтеза с помощью химических методов или методов генной инженерии 11 Способ по любому из пунктов 1-10, отличающийся тем, что указанный димер лизоцима используют путем введения в организм человека или животного в виде однократной или повторной дозы от около 0,005 до 0,5 мг/кг веса тела 12 Способ по пункту 11, отличающийся тем, что указанный димер используют в количестве от около 0,01 до 0,1 мг/кг веса тела 13 Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный димер используют в форме геля, мази или жидкой композиции для местного, перорального или парентерального введения, причем указанная композиция дополнительно содержит по крайней мере один фармацевтически приемлемый растворитель, носитель или консервант 14 Способ по пункту 13, отличающийся тем, что указанная композиция содержит от 0,01 до 10 мг/мл димера лизоцима 15 Способ по пункту 14, отличающийся тем, что указанная композиция содержит от 0,01 до 1 мг/мл димера лизоцима 16 Способ по пункту 13, отличающийся тем, что указанную композицию используют в виде твердой формы для перорального введения, причем указанная форма дополнительно содержит по крайней мере один подходящий носитель или консервант 17 Способ по пункту 16, отличающийся тем, что указанная композиция в виде твердой формы содержит от 0,01 до 10 мг/г димера лизоцима 18 Способ по пункту 9, отличающийся тем, что О 00 1 о ю 50728 указанный димер используют для введения по меньшей мере разовой дозы указанной композиции с профилактической целью 19 Способ по пункту 9, отличающийся тем, что указанный димер используют для введения по меньшей мере трех доз указанной композиции с Данное изобретение относится к новому способу применения димера лизоцима и к композициям, содержащим такой димер Новое применение основано на общем принципе неспецифичной стимуляции иммунной системы и, в частности, полезно для предотвращения и/или лечения симптомов заболевания в связи с нарушенной функцией природных защитной и регенеративной систем человеческого организма и организма животных В конце восьмидесятых было обнаружено, что димерные формы некоторых ферментов, при сохранении в основном полезных свойств соответствующих мономеров, становятся гораздо менее токсичными, чем мономеры, и в некоторых случаях даже совсем не проявляют отрицательных побочных эффектов, когда используются в терапевтических дозах Противовирусные и антибактериальные композиции, содержащие в качестве активного ингредиента димер лизоцима или другие димерные ферменты были описаны в WO 89/11294 В нем сообщается, что лизоцимный димер способен к подавлению пролиферации ряда штаммов бактерий, культивированных из образцов, взятых от больных, при применении в концентрациях, равных 1,25 - 20мг/мл культуры Также сообщается, что димер эффективен при лечении парвови-русных инфекций собак (ПВС), при пероральном введении дважды в сутки в дозе 1 - 2мг/кг веса тела Позднее были обнаружены дополнительные привлекательные свойства димеров лизоцима и были разработаны дополнительные способы терапевтического применения этого лекарственного препарата, в частности, для лечения бактериальных и вирусных инфекций, что раскрыто, например, в WO 94/01127 В WO 94/01127 представлена модель теории, которая может помочь понять различные эффекты, наблюдаемые для димера лизоцима Хотя собственный механизм действия димера лизоцима еще полностью неясен, по-видимому существует дополнительные лечебные свойства, которые нельзя объяснить бактериолитическим действием соответствующего мономера Заявители наблюдали определенные иммуностимулирующие воздействия димеризованного лизоцима, особенно в отношении модуляции уровней цитокинов Кроме того, на основании своих экспериментов они заключили, что димер лизоцима, повидимому, предупреждает проникновение вирусов в бактериальную клетку, преимущественно путем блокирования некоторых областей наружной поверхности клеток и возможно включающих белки вирусных рецепторов 4 равным интервалом с профилактической целью 20 Способ по пункту 9, отличающийся тем, что указанный димер используют после идентификации микробной инфекции в виде по меньшей мере разовой дозы указанной композиции В прототипе раскрываются дополнительные результаты, полученные in vitro для димера лизоцима В частности, Bartholeyns and Zenebergh (Europ J Cancer, Vol 15, 1979, 85-91) испытывали димеризованный лизоцим на цито-статическую активность в отношении клеток рака печени (КРП) in vitro Они наблюдали подавление 73 ± 15% размножения клеток рака в клеточной культуре (ibid , стр 89, таблица 2) Удивительно, что до сих пор, за исключением того, что касается WO 94/01127, не сообщалось об экспериментах in vivo с димером лизоцима Очень странно и удивительно и до сих пор ожидает объяснения, почему ни Bartholeyns и Zeneberg, ни ктото из других исследователей не вернулись к этому вопросу, чтобы активизировать дальнейшую разработку перспективной находки для борьбы с раком Сравнительная демонстрация (фиг1) чистоты димера лизоцима, получаемого по методу Sorrentmo et al , Eur J Biochem 124, 183 - 189 (1982) и димера лизоцима, предпочтительно используемого в данном изобретении выявила по крайней мере одну возможную причину в препарате, получаемом по Sorrentmo et al обнаружены высокие концентрации побочных продуктов, таких как мономер лизоцима, тример и тетрамер лизоцима, тогда как продукт, предпочтительно используемый в данном изобретении, является высоко очищенным, т е содержит желаемый димер лизоцима в количествах до 90% по весу от общей фракции лизоцима в препарате Процесс производства такого высоко очищенного димера лизоцима был описан B W O 91/10731 Это служит весомым подтверждением предположения о том, что чистота прототипного димера лизоцима была недостаточно хороша для экспериментов и применения in vivo, так как было известно уже 15 лет назад, что мономерная форма лизоцима, несмотря на благоприятную антибактериальную активность, довольно токсична и может вызвать воспаление и тяжелые аллергические реакции и даже симптомы токсического шока В свете таких обстоятельств кажется более понятным, почему ни один компетентный исследователь, включая Bartholeyns и Zeneberg, хотя и рекомендующих димер лизоцима в качестве обещающего кандидата для дальнейших исследований, не провели дальнейших экспериментов в течение последних десяти - пятнадцати лет с целью разработки применения димера лизоцима in vivo Несмотря на такое отсутствие исследовательских работ в научном мире, возможно связанное с предубеждением профессионалов в отношении использования димера лизоцима in vivo, данные исследователи провели дальнейшие исследова 50728 ния и разработку по усовершенствованию метода продукции и очистки димеризованного лизоцима и по поиску применения in vivo для людей и животных продукта, который приведет, например, к применению в качестве антивирусного и антибактериального средства, раскрываемых в WO 94/01127 Кроме того, основываясь на своем знании низкой токсичности димеризованного лизоцима по сравнению с мономером и на способности нового высоко очищенного препарата димера лизоцима данные исследователи предприняли попытку и начали испытания по противораковому действию препаратов димера лизоцима in vivo, хотя предшествующий опыт не наводил на мысль о его применении для лечения других заболеваний, а не бактериальных и вирусных инфекций Одно из наибольших преимуществ данного изобретения состоит в обеспечении использования высоко очищенного димера лизоцима для производства фармацевтической композиции для дополнения или замены чрезвычайно токсичных противораковых лекарственных средств, обычно применяемых при общепринятой терапии Фиг 1 представляет сравнительную демонстрацию чистоты препаратов димера лизоцима, произведенных по двум разным предшествующим методам Высоко очищенный димер лизоцима по данному изобретению может использоваться для производства фармацевтических композиции непосредственно применимых для лечения животных и людей, благодаря низкому количеству в нем токсичного мономера Как показано выше, такой очищенный димер лизоцима содержит примерно 10% по весу или менее нежелательных побочных продуктов и может быть получен путем димеризации мономеров лизоцима любого происхождения, например, мономеров лизоцима человеческого происхождения, от животных, яичного, из растений, микроорганизмов, причем мономеры выделяются из природных источников в природном виде, или производимых химическим методом или методом генной инженерии с получением мономеров лизоцима той же самой или по существу той же самой химической и биологической природы, что и естественного происхождения В испытания на клеточных культурах in vitro и на моделях для исследования in vivo, предпочтительно на моделях на мышах и крысах, заявители данного изобретения смогли успешно продемонстрировать, что заявляемые композиции димера лизоцима проявляют значительную активность по подавлению или даже полному предотвращению пролиферации клеток раковой ткани in vitro и in vivo Такое лечебное действие могло быть подтверждено для различных типов рака, включая, но не ограничиваясь теми, которые, как известно, вызываются вирусами, или на возникновение которых влияют вирусы Эти вирусы включают, в частности, человеческий папилломный вирус, вирус Эпштейна-Барра, вирус гепатита В и ретровирусы, такие как HTLV-I (вирус Т-клеточной лейкемии взрослых), HTLV-II (вирус лимфомы) и ВИЧ-1 (вирус иммунодефицита человека), включая под виды Типы рака, вызываемые этими вирусами, или которые затрагиваются действием этих вирусов, включают, например, рак шейки матки, рак мочеполового тракта, саркому Капоши, первичную карциному клеток печени, лейкемию, Т-клеточную лимфому, СПИД или любой его подтип Объект данного изобретения состоит в получении фармацевтической композиции и способа предотвращения и/или лечения рака у животных и людей Другое ценное применение высоко очищенного димера лизоцима было неожиданно обнаружено при клинических испытаниях, когда композиции димера лизоцима вводили больным с более или менее инфицированными послеоперационными ранами, например, после ампутации нижней конечности Оказалось, что местное применение димера не только успешно устраняло раневую инфекцию, но также стимулировало рост волос и обновление волос в месте лечения Это неожиданное открытие привело к дальнейшим исследованиям и, наконец, к производству фармацевтических композиций, применимых в случае нарушения роста волос, в частности, нарушения роста волос на основе нарушения функций иммунной системы или ее дисфункций, таких как, например, в случае очаговой алопеции Такие композиции могут, по крайней мере частично, удовлетворять требованию желаемого длительного действия композиции в качестве стимулятора роста Принцип, лежащий в основе этого полностью неожиданного эффекта, как полагают, включает, среди прочего, стимуляцию и улучшение механизмов иммунной защиты, улучшение циркуляции крови в поверхностных слоях ткани и в коже, общее неспецифическое улучшение иммунных функций и, возможно, еще несколько еще не идентифицированных эффектов Другое неожиданное и коммерчески очень интересное применение для фармацевтической композиции, содержащей димер лизоцима, было обнаружено при разведении рыб и уходе за пчелами, когда в отборочном эксперименте общепринятые антибиотики были заменены различными неспецифическими иммуностимуляторами, включая также и димер лизоцима Использование иммуностимуляторов при разведении рыб для профилактики и/или терапии заболеваний рыб является новой перспективной разработкой (Siwicki and Anderson 1990, Siwicki et al , 1994) В настоящее время вещества для лечения заболеваний рыб включают антибиотики, лекарственные препараты и химические препараты, используемые для стерилизации прудов для содержания рыб (Stoskopf, 1993) Поскольку каждая обработка является по крайней мере частично эффективной при лечении конкретного заболевания, возникают проблемы в связи с накоплением этих веществ в окружающей среде и в мясе рыбы, а также с появлением патогенных штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибиотикам В случае сохранения пчел широко распространенной практикой является убивать колонии пчел, если существует доказательство того, что пчелы поражены микробной, например, бактери 50728 альной и/или вирусной инфекциями Такая практика исключает распространение инфекций на другие рои и тем самым сводит к минимуму потери Поэтому существует необходимость обеспечить альтернативный и надежный метод для профилактической и/или терапевтической обработки медоносных пчел, который объединяет как преимущества антибиотика, дополнительно усиливающего иммунную систему пчел, так и антибиотик, который не приведет к возникновению антибиотико-резистентных микробных штаммов Данное изобретение представляет способ для удовлетворения такой потребности Кроме того, даже если димер лизоцима присутствует в конечном медовом продукте в определяемых концентрациях, это должно, вероятно, рассматриваться как повышение качества, а не изменение к худшему, благодаря преимуществу неспецифичного ммуно-стимулирующего эффекта димера лизоцима В основном, иммуностимуляторы включают группу биологических и синтетических соединений, которые усиливают неспецифические клеточные и гуморальные механизмы защиты у животных и людей Иммуностимуляторы, такие как бетаглюкан, хитозан, левамизол, следы минералов и комбинации минералов и различные продукты, происходящие из многих растительных и животных источников, эффективны при профилактике заболеваний Несколько типов бетаглюканов, по-видимому, являются особенно перспективными для стимуляции клеточного и гуморального неспецифичного иммунного ответа у рыб Неспецифические механизмы защиты, которые включают фагоцитоз и продукцию окислительных радикалов, быстро активируются иммуностимуляторами и быстро готовятся защитить рыбу от патогенных микроорганизмов, таких как, например, вирусы, бактерии, микоплазмы и грибы, и/или от паразитов или других патогенных возбудителей Таким образом эти механизмы превосходят специфический иммунный ответ, который требует более длительного периода времени для развития конкретного направленного иммунного ответа, включающего выработку антител и специфичную клеточную активацию Очень обнадеживающие результаты, полученные в первых испытаниях in vivo, демонстрирующие значительное улучшение иммунологических защитных механизмов, привели к началу детализированной исследовательской программы по действию димера лизоцима на специфичные и неспецифичные клеточные и гуморальные механизмы защиты рыб, в частности у форели и лосося, и пчел Поэтому, объект данного изобретения состоит в представлении новых способов применения димера лизоцима, включающих его использование для производства фармацевтической композиции для стимуляции неспецифичного клеточного и гуморального иммунного ответа у рыб и медоносных пчел Другой объект данного изобретения состоит в получении способа применения фармацевтических композиций, содержащих указанный димер 8 лизоцима, для того, чтобы вызвать неспецифическую стимуляцию иммунной системы единственным или повторным применением композиции для профилактики и/или терапии естественно возникающих заболеваний рыб и пчел Эксперименты in vivo показали, что в некоторых случаях, например, когда рыба легко поражается некоторыми химикатами или биологически активными веществами, такими как побочные продукты фармацевтических препаратов, применяемых в отношении них, могло бы быть предпочтительно лечить рыб высоко очищенным димером лизоцима, о котором сообщалось в WO 91/10731, который содержит примерно 10% по весу или менее нежелательных побочных продуктов, и который в значительной степени освобожден от мономерной формы лизоцима Чтобы снизить стоимость выкармливания при разведении рыб и/или содержании пчел, могло бы быть приемлемо вводить препарат димера лизоцима более низкой чистоты, поскольку он применяется в дозе, которая не вызывает побочных эффектов, связанных с наличием токсичных побочных продуктов, в частности мономера лизоцима Димер лизоцима, о котором говорится здесь, может или непосредственно применяться у больных, нуждающихся в этом, или может использоваться для производства фармацевтических композиций, чтобы применяться в виде обычных галеновых форм Гели, мази или жидкие композиции содержат димер лизоцима предпочтительно в концентрации, равной примерно 0,01 -10мг/мл и часто в концентрации, равной примерно 0,1 1,0мг/мл Их обычно готовят в виде стерильных апирогенных композиций и они произвольно дополнительно включают по крайней мере один физиологически приемлемый растворитель и/или носитель и/или по крайней мере один подходящий консервант Фармацевтические композиции, содержащие димер лизоцима, применимы и предназначены непосредственно для местного и/или парентерального применения, включая локальную инъекцию, например, вблизи плотной опухоли, или наружное применение на поверхности тела, включая подкожную инъекцию Внутривенные инъекции могут заменять или дополнительно содействовать местному применению при курсе терапии Однако, было также доказано, что очень эффективно наносить композиции димера лизоцима на слизистые оболочки, предпочтительно путем ингаляции (слизистая носа, рта и глотки) жидких композиций или местного применения (например, слизистая влагалища, шейки матки) жидких или кремообразных композиций или тампонов, пропитанных материалом димера лизоцима В некоторых случаях предпочтительно принимать димер лизоцима перорально, предпочтительно в обычных галеновых формах, таких как например, таблетки, капсулы или драже, или в форме пилюль, гранул, хлопьев или в виде порошка Эти твердые композиции часто содержат активное лекарственное вещество в количестве примерно 0,01 - 10мг, предпочтительно примерно 0,01 - 1,0мг на г композиции в целом Также предпочтительно, чтобы они дополнительно включали 50728 по крайней мере один подходящий носитель и/или консервант и/или другие обычные добавки, такие как, например, вещество, улучшающее вкус и запах, и подкрашивающее вещество В случае лечения рыб твердые композиции могут добавляться в пишу Альтернативно или дополнительно димер лизоцима может быть растворен в воде пруда для содержания рыбы, так как считается, что активное лекарственное вещество может также всасываться через жабры рыб В случае пчеловодства композиции димера лизоцима могут применяться путем растворения твердых композиций в питьевой воде, чае, растворах сахара или других обычных жидкостях, приготавливаемых для пчел, например в качестве пищевого субстрата Его можно было бы, однако, готовить в виде, предпочтительно концентрированного, водного раствора и смешивать с медом, чтобы гарантировать - прием лекарственного препарата пчелами Композиция для перорального использования, однако, может быть также в виде осмотической системе В некоторых случаях, таких как, например, в целях профилактики и/или лечения рака мочеполового тракта, может быть полезно и благоприятно местное применение антисептических повязок или тампонов, пропитанных эффективной дозой высоко очищенного димера лизоцима Различные типы вышеупомянутых композиций димера лизоцима предпочтительно вводятся в одноразовой дозе, равной примерно от 0,005 до 0,5мг/кг веса тела, в частности, в дозе, равной примерно от 0,01 до 0,1мг/кг веса тела Само собой разумеется, что необходимая концентрация активного димера лизоцима в конечной фармацевтической композиции зависит непосредственно от размеров больного человека и животного и вида терапевтического или профилактического лечения, намеченного для соответствующего больного В большинстве случаев, однако, вышеупомянутые интервалы концентраций достаточны для соответствующего лечения Тем не менее может стать необходимым, особенно в ветеринарной практике, повысить действующие концентрации димера лизоцима в композиции до значения свыше 10мг/мл и ниже растворимости продукта димера в соответственном растворителе, т е до примерно 20мг/мл жидкости или мази При этом объем композиции, который нужно ввести, может оставаться достаточно минимальным для легкости манипуляции Если возможно, метод совместного назначения вышеупомянутых композиций предпочтительнее монотерапии путем перорального, парентерального введения или местного применения Благодаря по существу нетоксичному характеру высоко очищенного димера лизоцима, композиции, содержащие такой димер, можно вводить в течение длительного срока, т е на протяжении месяцев и даже лет, без возникновения опасных побочных эффектов Интервалы времени между введениями для профилактического или терапевтического применения этого лекарственного препарата могут обычно находиться в пределах от одного до более раз в сутки до еженедельного или ежемесячного введения доз препарата и могут также состоять из более длительных интервалов, 10 в зависимости от соответствующего пациента и остроты необходимости лечения, а также от эффективности иммуностимуляции димером лизоцима Как показано выше, данное изобретение стало, по крайней мере частично, возможным благодаря наличию димера лизоцима димера лизоцима высокого качества Поразительное отличие качества продукта и, в частности, доля нежелательного мономера лизоцима, демонстрируется фиг 1 полоса 1 представляет предварительно окрашенные стандарты белков с низким молекулярным весом фосфорилазы В 142000 дальтон, БСА 97000, овальбумина 50000, карбоангидразы 35100, ингибитора трипсина соевых бобов 29700, лизоцима 21900 (Biorad, USA), полосы 2 и 3 показывают очищенный димер лизоцима LYDIUM KLP® 602 (KLP® 602), сер 506449, лабораторный контроль, полоса 2 нагружена 6,6мкг, а полоса 3 - 19,8мкг, полосы 4 и 5 показывают другую серию KLP602, полоса 4 нагружена 6,6мкг, а полоса 5 19,8мкг, полосы 6 и 7 показывают препарат димера лизоцима (KIW-607), произведенному по Sorrentmoetal.Eur J Bioch 124, 183-189 (1982), полоса 6 нагружена 6,6мкг, а полоса 7 - 19,8мкг Очищенный препарат димера лизоцима KLP602 содержит в четыре раза больше димера, чем сравниваемый продукт KIW-607, тогда как сравниваемый продукт KJW-607 содержит в шесть раз больше мономера, чем KLP-602 Для того, чтобы это изобретение, описанное здесь, можно было понять полнее, представлены следующие примеры Должно быть понятно, что эти примеры представлены только с иллюстративными целями и не должны интерпретироваться как ограничивающие это изобретение в какомлибо отношении Пример 1 Димер лизоцима (KLP-602) при лечении лимфолейкемии у мышей AKR Материалы и методы В эксперименте использовали семимесячных мышей обоих полов лейкозной линии AKR, зараженных вирусом Graffi, из Центра инбридинговых животных Института иммунологии и экспериментальной терапии Польской академии наук, Вроцлав У мышей AKR происходит ранняя активация эндогенного лейкозного вируса, что приводит к клиническим проявлениям лимфолейкемии в возрасте семи - девяти месяцев Мышей делили на три группы из 30 животных каждая Группа I (экспериментальная) животным подкожно вводили KLP-602 один раз в дозе 20мкг/кг в 0,3см3 ФБР, Группа II (экспериментальная) животные получали KLP-602 дважды в той же дозе, что и выше, Группа Ш (контрольная) животные получали 0,3см3 ФБР дважды Мышей забивали путем обескровливания через три и шесть недель после последней инъекции KLP-602 (10 мышей из каждой группы) Десять мышей из каждой группы оставляли живыми Выполняли следующие исследования 1 Определение общего веса тела и массы внутренних органов, таких как печень, селезенка, 12 11 50728 тимус и наружные шейные лимфатические узлы, с контрольных мышей составляла К = 18 х 10 чеопределением отношения массы органа к весу рез три недели от начала исследования В группе тела Степень терапевтического действия оцениII активность свободных радикалов была ниже (К = 3 вали с использованием формулы L/K х 100%, где 10 х 10 ) Через шесть недель уровень свободных 3 L является средним временем выживания мышей, радикалов составлял К = 10 х 10 у контрольных 3 которых лечили KLP-602, а К является средним животных, ниже в группе II (К = 16 х 10 ) и немно3 временем выживания контрольных животных го выше в группе I (К = 1,5 х 10 ) Заметное повышение фагоцитной активности ГЦ было отмечено 2 Ги сто патологи чес кие исследования биов обоих экспериментальных группах по сравнению псийного материала из печени, селезенки, тимуса с контрольной группой через три недели и состави лимфатических узлов Срезы окрашивали Г + Э ляло 4688 Хл (группа I), 3485 Хл (группа II) и (Н + Е) по методу Гомори (Gomon) для ретикуляртолько 2052 Хл для контрольной группы Через ных волокон шесть недель фагоцитарная активность в группе II 3 Уровень свободных радикалов в сыворотке была в равной степени высокой (3264 Хл) и была оценивали с использованием хемилюминесценниже в группе I (2477 Хл) Значительное увеличецентного (Хл) метода, который дает возможность ние фагоцитарной активности, определяемой по определения очень слабой фотонной люминестесту с нитросиним тетразолием (ТНТ) отмечали ценции сыворотки через три недели в обеих лечившихся группах и 4 Фагоцитарное действие гранулоцитов (ГЦ) составляло 0,27 и 0,26 в группах I и II, соответстоценивали, используя тест с нитросиним тетразовенно Через шесть недель повышение фагоцилием и хемилюминесцентное (Хл) исследование тарной активности было ниже и происходило Результаты только в группе П Фагоцитарная активность в конОднократное (группа I) и двукратное (группа II) трольной группе составляла 0,22 подкожное введение KLP-602 мышам высоколейкозной линии AKR в дозе 20мкг/кг вызывало стаИндекс терапевтической эффективности KLPтистически значимое увеличение веса тела и сни602 составил 128% и 150% в группах I и II, соотжение массы внутренних органов, таких как ветственно, являясь выше минимального 125% селезенка, тимус, лимфатические узлы и печень Это демонстрирует заметные иммуностимули(последнее было статистически не значимым) по рующие свойства KLP-602 и дает право на его сравнению с контрольными животными (группа III) дальнейшее изучение с определением через три недели от начала эксЛейкозные инфильтраты значительно меньше перимента (таблица 1) в обеих экспериментальных группах, чем в конУвеличение общего веса тела в обоих лечивтрольной группе, и даже отсутствуют у некоторых шихся группах, снижение массы селезенки, тимуса мышей Лейкозные инфильтраты присутствовали и лимфатических узлов в группе I и увеличение в тимусе, селезенке и в лимфатических узлах печени и тимуса в группе II по сравнению с конКроме того, они были обнаружены в печени контрольными животными (группа III) происходило трольных животных Результаты исследования через шесть недель от начала исследования (табпоказывают, что KLP-602 может частично подавлица 1) лять или задерживать развитие лейкемии у мыВ таблице 2 показано отношение веса внутшей AKR И наоборот, быстрое увеличение лимренних органов в общему весу тала Через три фатических органов с морфологическими недели увеличение массы тимуса наблюдалось в изменениями, типичными для хорошо дифференгруппе III (контрольная) по сравнению с обоими цированной лимфоидной лейкемии, происходило экспериментальными группами (I и II) Через у животных, получавших плацебо шесть недель происходило увеличение массы Кроме того, KLP-602 подавляет увеличение селезенки, тимуса и лимфатических узлов в групсвободных радикалов в сыворотке мышей Он пах II и III, по сравнению с группой I подавляет процессы с участием свободных радиГи сто патологи чес кие исследования, проводикалов подобно действию антиоксидантне в, таких мые через три и шесть недель выявили умеренкак витамин Е, С или селен Возможно, что подавную (в экспериментальных группах) и чрезмерную ление пролиферации лейкозных клеток у мышей (в контрольной группе) колонизацию шейных AKR, лечившихся KLP-602, зависит от подавления лимфатических узлов, тимуса и селезенки лимпроцессов, вызванных свободными радикалами У фоидными клетками Однако лейкозные инфильтконтрольных мышей (без введения KLP-602) урораты в печени были обнаружены только в контровень свободных радикалов был выше и коррелиле Лимфоидные клетки имели овальные или ровал с тяжестью заболевания круглые гиперхроматические ядра с многочисленKLP-602 также стимулирует фагоцитарную акными ядрышками и атипичными фигурами митоза тивность мононуклеар-ной фагоцитарной системы Эти клетки сопровождались немногочисленными (МФС), определенную двумя независимыми, ТНТ слабодифференцированными центробластными и Хл, и таким образом стимулирует клеточноклетками, ретикулярными клетками и островками опосредованный иммунитет Он также может мопролиферирующих мегакариоцитов в селезенке дулировать синтез TNF (фактора некроза опухоСтрома лимфатических органов, таких как селелевых клеток) Кроме того, присутствующие на зенка, лимфатические узлы и тимус, содержала поверхности лейкемических клеток "антигены отнедостаточное количество тонких ретикулярных торжения опухолей" могут распознаваться Тволокон клетками, действующими совместно с макрофаХемилюминесцентные исследования гально-фагоцитарной системой (МФС) Среди этих Т-клеток находятся опухолеинфильтрующие лимАктивность свободных радикалов в сыворотке 14 13 50728 фоциты (ОИЛ), на 50 - 100% более эффективные, торы класса II, а также пектиновых, трансферричем лимфокиноаісгивированньїе киллерные клетки новых, урокиназных, инсули-новых и пятидесяти (ЛАК) Они имеют фенотип CD4 или CDs или смедругих менее известных рецепторов Любые изшанный и экспрессируют рецептор EL-2 на своей менения их экспрессии и сродства указывают на поверхности Пока еще неизвестно, почему они активацию этих клеток Клетки МФС могут фагоципарализуются опухолевыми клетками тировать чувствительные к N0 клетки, так как они могут синтезировать это вещество АктивированРетикулоэндотелиальная система вместе со ные фагоциты называются "макрофагами воспастимуляцией клеток МФС является основным имления" или "кровожадными" клетками Клетки мунологическим и противовирусным механизмом МФС могут разрушать вирусы посредством своих Стимуляция этих клеток приводит к продукции цитотоксических и цитоли-тических свойств, проинтерферона и опосредованно активирует специдукции дефектных вирионов и синтеза интерфефические и неспецифические иммунные процесрона сы, зависимые от В-клеток, Т-клеток или NKклеток Обещающие результаты предварительного исследования на мышах AKR показывают, что Клетки МФС участвуют в иммунологических KLP-602 может успешно использоваться при лепроцессах посредством своих рецепторов, таких чении лейкемии у мышей AKR как Fc рецепторы, СЗ рецепторы или HLA рецепТаблица 1 Общая масса тела (г) и масса внутренних органов (мг) у контрольных и экспериментальных мышей (х ± S, верхние значения показывают S, нижние значения показывают х) Группа Общая масса тела Селезенка Тимус Лимфатические узлы Печень I 25 27 2 22 0 07 0 00 0 06 0 01 0 04 0 00 1 38 015 Три недели II 26 20 1 67 0 08 0 02 0 07 0 02 0 04 0 00 1 36 0 38 III 23 96 1 23 0 09 0 01 0 08 0 02 0 05 0 01 1 43 0 05 I 26 77 1 10 0 07 0 00 0 08 0 01 0 04 0 00 1 61 018 Шесть недель II 27 30 2 34 0 23 0 01 0 21 0 03 0 07 0 04 1 89 0 42 III 25 57 1 68 0 22 0 00 015 0 07 0 08 0 04 1 67 015 Таблица 2 Отношение масс внутренних органов к общей массе тела в контроле и у экспериментальных животных (%) Группа Селезенка Тимус Лимф узлы Печень I 0 30 0 23 018 5 49 Три недели II 0 31 0 26 018 5 25 Пример 2 Эффект высоко очищенного препарата димера лизоцима (KLP-602) на рост волос при очаговой алопеции Было проведено исследование для определения того, действует ли бальзам, содержащий KLP-602, на рост волос при очаговой алопеции Кроме того, устанавливали переносимость этого бальзама при нанесении на кожу Материалы и методы Изучение представляло собой сравнительное клиническое испытание с контролем В исследование было включено двенадцать лиц (два больных мужчины и десять больных женщин) с очаговой алопецией в стадии "телогена" в хорошем состоянии здоровья Они были в возрасте от 19 до 50 лет Двенадцать лиц (три больных мужчины и девять больных женщин) с очаговой III 0 37 0 33 0 21 5 81 I 0 29 0 33 015 6 02 Шесть недель II 0 84 1 06 0 26 6 35 III 0 87 0,61 0 26 6 40 алопецией, лечившиеся МИНОКСИДИЛОМ , считались контрольной группой Их возраст находился в интервале от 19 до 49 лет Распределение субъектов по полу и возрасту в группах двух видов лечения было сходным для двух групп Критерии отбора больных Критерии включения 1 Очаговая алопеция в стадии "телогена", 2 Возраст 18 - 50 лет Критерии исключения 1 Очаговая алопеция в стадии "дистрофии", 2 Другой тип алопеции, 3 Любое другое кожное заболевание Сопутствующее медикаментозное лечение Сопутствующее медикаментозное лечение не разрешалось, тем не менее оно было необхо 50728 16 15 димо для лечения по общему состоянию здороинформацию по течению и тяжести заболевания, вья а также эффективности терапевтических мероприятий Распределение по номерам для лечения Во время исследования лица, которые удовПри каждом визите волосистую часть головы летворяли критериям отбора, получали номера в оценивали на признаки роста волос, которые испытуемых группах в следующем порядке Исклассифицировались как следователь помещал соответствующий номер в никакого соответствующем месте на каждой форме истолегкий - видимое восстановление роста рии болезни (ФИБ) (пеньки или несколько разбросанных одиночных концов волос) Медикаментозное лечение при испытании Бальзам для волос, произведенный NIKA по умеренный - неполный (частичный) по оригинальной прописи, был получен в 100 мл полный одинаковых пластиковых бутылочках с калибро"косметически приемлемый" рост волос опванным небольшим наконечником-капельницей ределялся как достаточный для того, чтобы приЛосьон KLP-602, 0,05%-ый, наносили на волосикрыть волосистую часть головы и терминальные стую часть головы три раза в день по инструкции области остаточной потери волос присутствующего дерматолога Лечение начинаРезультаты лось непосредственно после постановки диагноВсе субъекты, включенные в исследование за очаговой алопеции дерматологом (12 лечившихся 0,05% KLP-602 и 12 из контрольной группы, лечившихся 2% раствором минокси2%-ый раствор миноксидила111 наносили двадила) завершили 4-месячный срок терапии и 2жды в день на пораженные области кожи месячный период наблюдения Продолжительность лечения составила 16 недель После лечения больных наблюдали в Эффективность течение 2-месячного периода наблюдения Наиболее применимой мерой эффективности была оценка исследователями в конце изуОценка безопасности чения Кроме того, у восьми из двенадцати субъСубъектам обеих испытуемых групп провоектов (66%) в группе KLP-602 и шести из дили обследование путем полного анамнеза и двенадцати субъектов (50%) в группе миноксимедицинских исследований в начале и конце дила показали усиленный рост волос во время изучения Образцы крови и мочи для обычных исследования Из этих больных у четырех субълабораторных исследований брали до и после ектов в группе KLP-602 (33%) и трех в группе лечения Лабораторные исследования включали миноксидила (25%) рост волос считали полным и следующие анализы косметически приемлемым Частичный рост воГематология лос был видимым у трех из двенадцати оцениГемоглобин, гематокрит, общий и диффеваемых субъектов в группе KLP-602 (25%) и трех ренцированный подсчет белых кровяных клеток в группе миноксидила (25%), соответственно У Биохимический анализ сыворотки одного субъекта в группе KLP-602 (9%) наблюАлАТ (ГИТ), ACT (ГОТ), щелочная фосфатадался минимальный рост волос Не было роста за, билирубин волос у четырех из двенадцати (33%) в группе Моча KLP-602 и у шести из двенадцати (50%) в группе Анализ мочи с помощью погружаемого тестминоксидила стержня на белок, кровь и глюкозу Пациентов осматривали ежемесячно на проВ группе KLP-602 с алопецией в пределах тяжении 4 месяцев терапии и 2 месяцев периода менее 25% волосистой части головы рост волос наблюдения При каждом посещении субъектов был получен у восьми из восьми субъектов и у опрашивали о наличии общих и местных побочшести из семи в группе миноксидила, соответстных проявлений, таких как раздражение, жжение, венно Не наблюдалось возобновления роста у зуд, области лечения исследовали на эритему субъектов с алопецией в пределах более 25% или другие местные побочные эффекты волосистой части головы в обеих лечившихся группах Оценка эффективности Параметры эффективности Среднее время реакции роста волос в связи с продолжительностью лечения, изменявшейся в 1 Первостепенным параметром эффективпределах от одного до трех месяцев в обеих ности был рост волос группах Три субъекта в группе KLP-602 дали 2 Вторым параметром эффективности было ответную реакцию после одного месяца лечения время излечивания измененной волосистой часУ одной женщины рост волос после одного месяти головы ца был с концами волос, равными примерно 5 мм 3 При исследовании делалась фото докупо длине и облысевшие области волосистой часментация в следующие моменты ти головы были покрыты густым возобновившимперед нанесением бальзама для волос с ся ростом волос KLP-602 во время роста волос При контрольном визите после второго месяца у этой женщины появилась тотальная алов конце срока применения бальзама для вопеция (эмоциональный стресс - развод), и у нее лос с KLP-602 не было ответа на дальнейшее лечение, и испыПроизводилась оценка с помощью микроскотание завершилось с отрицательным результапа (трихограмма) Стандартизованные трихотом У одного субъекта в группе миноксидила граммы на волосах, взятых с границы очага повозобновление роста волос наблюдалось после ражения алопеции дают наиболее полезную 50728 18 17 одного месяца терапии У четырех пациентов в 2 Местное применение 0,05% KLP-602 легко группе KLP-602 рост волос был получен после и безопасно двух месяцев лечения После трех месяцев изу3 Никаких местных и общих побочных эфчения возобновление роста волос наблюдалось фектов и никаких последствий по лабораторным у двух субъектов в группе KLP-602 и у трех из показателям не наблюдалось во время исследогруппы миноксидила, соответственно вания Безопасность 4 Из-за короткого срока терапии (4 месяца) и Во время терапии и периода наблюдения не 2-хмесячного наблюдения полная оценка резульнаблюдалось общих побочных эффектов Не татов и завершение лечения было невозможно, отмечено аномалий в лабораторных анализах хотя этот период был достаточно длительным, крови и мочи на исходном уровне и в конце изучтобы наблюдать обнадеживающую эффективчения в обеих лечившихся группах ность лечения Во время исследования наблюдались мест5 Результаты, полученные при испытании, ные побочные реакции одна женщина в группе показали, что 0,05% лосьон KLP-602 сравним с KLP-602 жаловалась на жжение и зуд волосистой 2% раствором миноксидила и даже более эфчасти головы на втором месяце лечения Она фективен при лечении очаговой алопеции связывала эти симптомы с ношением нового па6 Доклинические исследования и результарика Эти ощущения исчезли в течение двух неты, полученные при испытании, показывают, что дель без дополнительного лечения, она не преKLP-602, применяемый местно, индуцирует рост кратила терапию и закончила испытание с волос у больных, страдающих очаговой алопехорошим результатом Один субъект, лечившийцией ся 2% раствором миноксидила жаловался на Резюме сальность волос, и никаких значительных клиниБыло выполнено исследование с целью опческих признаков не наблюдалось при исследоределения эффективности и переносимости вании волосистой части головы Пациент связыбальзама для волос, содержащего KLP-602, в вал это явление с испытанием, но он хотел отношении роста волос при очаговой алопеции продолжать лечение Никаких существенных Применение 0,05% лосьона KLP-602 три раза в данных не было отмечено в связи с возобновледень хорошо переносилось при 4-месячном пением роста волос и возрастом пациентов, локариоде лечения Не наблюдалось никаких местлизацией областей облысения и продолжительных или системных побочных эффектов В групностью текущего эпизода, который был коротким пе KLP-602 наблюдался лучший ответ по росту и сходным для обеих групп и оценивался в преволос, чем в группе миноксидила Ответ на лечеделах от одной недели до одного года, максиние с возобновлением роста волос наблюдался у мум Все не ответившие на лечение в обеих ле66% субъектов при применении 0,05% лосьона чившихся группах имели в анамнезе очаговую KLP-602 Процент пациентов, у которых наблюалопецию, продолжительностью по крайней мере дался ответ на лечение с умеренным или густым пять лет (5-15 лет) ростом волос был больше среди больных, у которых область облысения охватывала менее Обсуждение 25% волосистой части головы 0,05% KLP-602 поИсследование произведено с целью оценки видимому является отличным средством для безопасности и эффективности местно примелечения очаговой алопеции няемого 0,05% лосьона KLP-602 в отношении роста волос у больных с очаговой алопецией и для сравнения его с эффективностью 2% раствора миноксидила во время четырехмесячной терапии Бальзам для волос, содержащий KLP-602, хорошо переносился больными У 66% субъектов, лечившихся 0,05% лосьоном KLP-602, показан усиленный рост волос во время исследования по сравнению с 50% субъектов в группе миноксидила Косметически приемлемый рост волос наблюдался у 33% пациентов в группе KLP-602 и у 25% в группе миноксидила, соответственно Лучшие результаты лечения наблюдали у больных со степенью алопеции ниже 25% измененной волосистой части головы 0,05%-ый лосьон KLP602 легко использовать для местного применения и он не вызывает каких-либо местных или общих побочных явлений Учитывая короткий срок исследования (16 недель), полученные результаты очень обнадеживают Выводы 1 Бальзам для волос, содержащий KLP-602, хорошо переносился и не вызывал каких-либо побочных эффектов Пример 3 Профилактическое применение димера лизоцима для индуциро-вания неспецифической стимуляции иммунной системы рыб План испытания Испытанию подвергали триста здоровых рыб вида радужной форели (Oncorhynchus mykiss, семейство лососевых), весящих каждая 90 - ЮОг Димер лизоцима, произведенный по WO 91/10731 (здесь обозначенный "KLP-602"), содержащий примерно 10% по весу или менее нежелательных побочных продуктов и по существу свободный от мономерной формы лизоцима, растворяли в ФБФР для получения инъекционных растворов для введения 10 - ЮОмкг димера лизоцима на кг веса тела, подходящих для внутри-брюшинного введения рыбам Лекарственный препарат вводили один раз в день Протокол терапии включал различные группы рыб, подвергаемых введению лекарственного средства или только в 1-ый день, или в 1-ый день и в 3-ий день, или в дни 1, 3 и 5, соответственно Рыбы из контрольной группы подвергались введению димера лизоцима Через 1, 2, 3 и 4 недели после введения последней инъекции из каждой группы лечившихся 19 и из контрольной брали для образцов 10 индивидов Рыб иммобилизировали и отбирали примерно 2 мл крови из хвостовой вены с помощью гепаринизированной вакуетки (Gremer) Определяли фагоцитарную способность ГЦ и мононуклеарных (МН) клеток, респираторную окислительную активность и потенциальную бактерицидную активность ГЦ и мононуклеарных клеток МПО (миелопероксидазную) активность в ГЦ фагоцитах, уровни лизоцима и гаммаглобулинов в сыворотке К тому же 20 индивидов из каждой группы подвергали испытанию с заражением заболеванием (фурункулезом) Рыбы получали однократную внутрибрюшинную инъекцию суспензии бактерий Aeromonas salmonpcida, выращенных на питательной среде в течение 48 часов Определяли смертность животных (скорость смерти), и ее взаимосвязь с бактериальной инфекцией подтверждали путем выделения возбудителей из почек мертвых животных Результаты В лечившихся KLP-602 группах все из вышеупомянутых иммуноло-гических параметров были значительно повышены (Р < 0,05) над соответствующими значениями контрольной группы Эти удивительные результаты наблюдались во всех группах, т е после одно-, двух- и трехкратного введения KLP-602 и оставались такими в течение всего периода наблюдения вплоть до 4 недель после последнего введения К тому же гибель рыб в лечившихся KLP-602 группах была значительно ниже, чем в контрольной группе Респираторная окислительная активность была даже значительно выше, чем показатели фагоцитоза и уровни миелопероксидазы нейтрофилов (МПО) в группах, лечившихся двухи трехкратным введением KLP-602 Известная чувствительность радужной форели к заражению вирулентным бактериальным штаммом A salmonicida и результаты, наблюдаемые в группах, профилактически лечившихся композицией димера лизоцима, свидетельствуют, что этот лекарственный препарат фактически способен индуцировать кратковременную защиту от указанного микробного заражения Кроме того, установлено, что защита была выше в группах, которые получали две или три дозы KLP-602, чем в группах, лечившихся только однократным введением Заключение Применение высоко очищенного димера лизоцима у рыб усиливает механизмы неспецифической защиты и значительно улучшает защиту от микробного заражения, например, A salmonicida (вызывающей фурункулез) Это наблюдение имеет большое значение для профилактической и терапевтической обработки рыбы в индустрии рыбоводства с целью снижения до минимума потерь рыбы, часто связанных с появлением заболевания рыб, особенно в весенний сезон Пример 4 Терапевтическое применение димера лизоцима для того, чтобы вызвать неспецифическую стимуляцию иммунной системы у рыб 50728 20 План испытания В это сравнительное исследование неспецифических механизмов защиты в ходе естественно возникающей инфекции, вызванной ВИНПЖ (вирусом инфекционного некроза поджелудочной железы), и при применении композиции, включающей димеризованный лизоцим (KLP-602) было включено двести радужных форелей После идентификации инфекции ВИНПЖ часть рыб лечили KLP-602, тогда как контрольная группа оставалась без лечения Основные параметры, характеризующие неспецифический клеточный и гуморальный механизмы защиты, были проанализированы иммунологическими и серологическими методами Эти методы включали еженедельное определение общего числа лейкоцитов, относительного числа лейкоцитов, фагоцитарной способности ГЦ и МН клеток, респираторную окислительную активность и потенциальную бактерицидную активность, МПО активность нейтрофилов, активность лизоцима и серулоплазмина в плазме и общего белка и уровня гамма-глобулинов во время 2 месяцев периода наблюдения Продублированные группы радужных форелей получали пищу, содержащую неспецифический иммуностимулятор KLP-602 в дозе 20мкг на кг веса тела Лиофилизированные образцы KLP602 принимались вместе с пищей или перорально в твердой форме (хлопья, гранулы) или растворялись в воде пруда для содержания рыбы, т е в виде водного раствора в течение семидневного срока Считается, что лекарственный препарат мог также резорбироваться путем метаболизма через жабры рыбы Затем у них брали пробы и исследовали на изменения неспецифических клеточных и гуморальных механизмов защиты через недельные интервалы Каждый раз 10 рыб отбирали случайным образом для иммунологических исследований и идентификации ВИНПЖ Кроме того, всех рыб ежедневно наблюдали для выявления необычного поведения, морфологических изменений и гибели Результаты У рыб, естественно инфицированных ВИНПЖ, можно было наблюдать иммуносупрессивный эффект Во время всего срока наблюдения параметры, показывающие неспецифические клеточные и гуморальные механизмы защиты, были значительно снижены, тогда как после одной недели кормления пищей, содержащей димер лизоцима, некоторые параметры, например, уровень церулоплазмина, респираторная окислительная активность, уровень иммуноглобулинов и активность лизоцима, были значительно повышены (например, примерно 31% повышения уровня церулоплазмина, примерно 40% повышения активности лизоцима, примерно 33% повышения респираторной окислительной активности) по сравнению с контрольной группой После применения KLP-602 были недвусмысленно идентифицированы иммуностимулирующие эффекты по неспецифическим механизмам защиты К тому же совокупная гибель была наинизшей в группах, питавшейся кормом, содержавшим KLP 50728 21 602 Заключение У рыбы, которую лечили кормом, содержащим димер лизоцима (KLP-602), показаны благоприятные изменения неспецифических иммунных механизмов защиты Эти изменения коррелировали со сниженной гибелью, т е это 22 указывает на защиту от естественно встречающейся инфекции ВИНПЖ, и эти данные дают веские рекомендации для дальнейшей разработки и оптимизации стратегии профилактики и/или терапии заболеваний рыб путем введения димера лизоцима, о котором здесь говорилось Ч Фиг 1 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71