Трансформована рослина

1. Трансформована рослина з поліпшеною толерантністю до гербіцидів фосфометилгліцинової родини, одержана шляхом регенерації трансформованих клітин, що містять химерний ген, який включає в напрямку транскрипції: промоторну ділянку, яка складається принаймні з одного генного промотору або промоторного фрагмента, який експресується в рослинах природним способом, ділянку транзитного пептиду, яка дозволяє націлювання зрілого білка в пластидний компартмент, послідовність гена, що кодує фермент толерантності до гліфосату, та 2 (19) 1 3 80895 Даний винахід стосується нової 5єнолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (або EPSPS), яка відзначається підвищеною толерантністю стосовно гербіцидів, яка являє собою конкурентні інгібітори по відношенню до фосфоенолпірувантної (PEP) активності EPSPS. Це більш толерантна EPSPS-синтаза відзначається, як мінімум, однією заміною "треонін на ізолейцин". Цей винахід стосується також гена, що кодує такий білок, рослинних клітин, трансформованих за допомогою химерних генних конструкцій, що містять цей ген, рослин, регенерованих з цих клітин, а також рослин, одержаних внаслідок схрещування з використанням цих трансформованих рослин. Гліфосат, сульфосат і фосаметин являють собою системні гербіциди широкого спектра фосфонометилгліцинової родини. По суті, вони діють як конкурентні інгібітори 5єнолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EC 2.5.1.19) або EPSPS, по відношенню до PEP (фосфоєнолпірувату). Після їх нанесення на рослину, вони переміщаються в дану рослину, де акумулюються в її частинах, які швидко ростуть, зокрема, у верхівках стебел та коріння, спричинюючи пошкодження у відповідній точці руйнування чутливи х рослин. Пластидна EPSPS, на яку головним чином спрямована дія цих продуктів, являє собою фермент біосинтетичного шляху ароматичних амінокислот, який кодується одним або кількома ядерними генами і синтезується у формі цитоплазматичного попередника, що імпортується потім в ці пластиди, де він нагромаджується у вигляді своє? зрілої форми. Толерантність рослин до гліфосату і до продуктів даної родини досягають шляхом стійкої Інтродукції в їхній геном гена EPSPS рослинного або бактеріального походження, який є мутантним або інакшим стосовно характеристик інгібування продукту цього гена гліфосатом. Враховуючи тип дії гліфосату і міру толерантності до гліфосату продуктів генів, які використовуються, це надає перевагу в здібності експресувати продукт трансляції цього гена з погляду можливості нагромадження його в пластидах в значних кількостях. [З патенту США 4535060], наприклад, відомо, що для надання рослині толерантності до гербіциду вищезгаданого типу, особливо Nфосфонометилгліцину або гліфосату, в геном рослини інтродукують ген, що кодує EPSPS, який несе, як мінімум, одну мутацію, яка робить цей фермент більш резистентним до його конкурентного інгібітора (гліфосату) після розміщення даного ферменту в пластидному компартменті. Однак, ці методи необхідно вдосконалювати, з метою досягнення більш високої надійності застосування цих рослин в умовах сільського господарства. У цьому описі "рослина" являє собою поняття для позначення будь-якого диференційованого багатоклітинного організму, здатного до фотосинтезу, а "рослинна клітина" являє собою поняття для позначення будь-якої клітини, що 4 походить з рослини і є здатною створювати недиференційовані тканини, такі як кап юси, або диференційовані тканини, такі як зародки чи частини рослини або насіння. Мета цього винаходу полягає в одержанні трансформованих рослин, що відзначаються підвищеною толерантністю до гербіцидів фосфонометилгліцинової родини, шляхом регенерації клітин, трансформованих через нові химерні гени, що містять ген толерантності до цих гербіцидів. Метою цього винаходу є також химерний ген для надання рослинам підвищеної толерантності щодо гербіциду, об'єктом дії якого є EPSPS і який включає такі елементи, призначені для керування транскрипцією: промоторну ділянку, необов'язково - ділянку транзитного пептиду, послідовність гена, що кодує фермент толерантності до гліфосату, і ділянку нетранслюємого сигналу поліаденілювання на 3'-кінці, який відрізняється тим, що ген толерантності до гліфосату містить стосовно гена, з якого він одержаний - заміну "треонін 102 на ізолейцин" в "aroA"-ділянці (EPSPS). У способі, якому віддається перевага, він включає, крім того, в тій самій ділянці, заміну "пролін 106 на серин". Ці заміни можуть бути інтродукованими або присутніми в EPSPSпослідовності будь-якого походження, зокрема, рослинного, бактеріального, водоростевого або грибкового походження. Транзитні пептиди, які використовуються в галузі, можуть бути, per se, рослинного походження, наприклад, походити з кукурудзи, соняшника, гороху або подібних до них к ультур. Перший та другий транзитні пептиди можуть бути ідентичними, аналогічними або різними. Кожний з них може включати, крім того, одну або декілька одиниць транзитного пептиду, відповідно до Європейської Патентної Заявки ЕР 0508909. Значення цієї характеристичної ділянки полягає в тому, щоб дозволити вивільнення зрілого та нативного білку, і, особливо, згаданої вище мутантної EPSPS, в плазмідний компартмент з максимальною ефективністю. Промоторна ділянка відповідного химерного гена, згідно з цим винаходом, переважно складається, як мінімум, з одного генного промотору або промоторного фрагменту, який експресується в рослинах природним способом (тубулін, інтрони, актин, гістон). Нетранслюєма ділянка сигналу термінації транскрипції на 3'-кінці даного химерного гена може бути будь-якого походження, наприклад, бактеріального походження, такого як ділянка гена нопалінсинтази, або рослинного походження, такого як ділянка гістону Н4А748 з Arabidopsis thaliana., згідно з [Європейською Патентною Заявкою (Європейська заявка 633317)]. Химерний ген згідно з цим винаходом включає, крім вищезгаданих основних частин, як мінімум, одну проміжну (лінкерну) нетранслюєму ділянку, яка може бути розташованою між ділянками, що транскрибуються диференційно, описаними вище. Ця проміжна ділянка може бути будь-якого походження, наприклад, 5 80895 6 бактеріального, вірусного або рослинного доводять до 2,5Μ LJCI. Після інкубації протягом походження. 12год. при °С осад, здобутий після Виділення кДНК, що кодує EPSPS кукур удзи: центрифугування протягом 15хв. при 30000g та Нижче описані різні стадії, які призводять до 4°С, розчиняли повторно. Далі повторювали LiCIотримання кДНК EPSPS кукурудзи, яка служить осадження. Цей перерозчинений осад являє субстратом для інтродукції двох мутацій. Всі собою фракцію РНК загальної нуклеїнової операції, описані нижче, даються як приклад, кислоти. згідно з вибором, зробленим на підставі б) Poly (А)+-РНК-фракцію з фракції РНК використання різних способів, придатних для отримували шляхом хроматографії на оліго(dТ) досягнення того ж самого результату. Цей вибір не целюлозній колонці, як це [описано в "Current впливає на відповідну якість одержуваного Protocols in Molecular Biology"]. результату, і через це будь-який з відповідних в) Синтез дволанцюгової кДНК, що має методів може використовуватися фа хівцями для синтетичний EcoRI-кінець: це здійснюють отримання того ж самого результату. Більшість відповідно до протоколу постачальника різних цих методів, за принципом техніки здобуття реагентів, необхідних для такого синтезу, у вигляді фрагментів ДНК, [описані в "Current Protocols in набору: "колійний набір" від компанії In Vitrogen. Molecular Biology", Том 1 і 2, Ausubel F.M. зі Два однониткові та частково комплементарні співавт., опублікованому видавництвами Greene олігонуклеотиди відповідних послідовностей: Publishing Associates та Wiley-lnterscience (1989)] 5'-AATTCCCGGG-3' (надалі посилання на умови експериментів, 5'-CCCGGG-3' (остання є фосфорильованою) описані в даній роботі, будуть позначатися як "ref. лігували з тупими кінцями дволанцюгових кДНК. CPMB"). Операції, які стосуються ДНК, що їх Це лігування адаптерів призводить до здійснювали згідно з умовами експериментів, утворення Smal-сайтів, приєднаних до описаних в цій роботі, полягають, зокрема, у таких двохланцюгових кДНК і EcoRI-сайтам у липкій діях: лігування ДНК-фрагментів, обробка за формі на кожному кінці цих двохланцюгови х кДНК. допомогою ДНК-полімерази «льонова і Т4-ДНКг) Створення бібліотеки: полімерази, одержання плазміди і ДНКЦі кДНК, що відзначаються наявністю штучни х бактеріофага λ, у вигляді мініпрепарату або у липких EcoRI-сайтів на своїх кінцях, лігували з вигляді максипрепарату, і, відповідно, аналіз ДНК і кДНК бактеріофага lgt10, який розрізали EcoRI і РНК згідно з Саузерн- і Нозерн-методами, дефосфорилювали відповідно до протоколу відповідно. Інші методи, описані в даній роботі, постачальника New England Biolabs. були суп утніми, і нижче описані тільки суттєві Аліквоту з реакції лігування інкапсулювали in модифікації і доповнення до цих умов vitro за допомогою інкапсулюючих екстрактів, а експериментів. саме Gigapack Gold, згідно з інструкціями Приклад 1: постачальника; цю бібліотеку титрували з 1. Одержання фрагменту EPSPS з Arabldopsls використанням бактерії E coli C600hf1. Одержану thaliana таким чином бібліотеку ампліфікували і зберігали а) Два 20-ланкових олігонуклеотиди згідно з інструкціями того ж самого постачальника, відповідної послідовності: і створювали кДНК-бібліотеку суспензії BMS-клітин 5'-GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' кукурудзи. 5'-GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3 3. Скринінг кДНК-бібліотеки суспензії клітин синтезували з послідовності EPSPS-гена BMS кук урудзи за допомогою EPSPS-зонда Arabidopsis thaliana [Klee H.J. зі співавт. (1987) Моl. Arabidopsis thaliana Gen. Genet., 210, 437-442]. Ці два олігонуклеотиди Наведений нижче протокол являв собою знаходяться, відповідно, в позиціях 1523-1543 і умови, взяті з "Current Protocols in Molecular 1737-1717, опублікованої послідовності і в Biology", томи 1 і 2, Ausubel F.M. зі співавт., протилежних напрямах. опублікованих у Greene Publishing Associates і б) Тотальна ДНК Arabidopsis thaliana (var. Willey-interscience (1989) (CPMB). Якщо викласти Columbia) одержана від Clontech (каталогове стисло, приблизно 106 рекомбінантних фагів посилання: 6970-1). поміщали на LB-чашки при середній густині в) 50 нанограмів (нг) ДНК змішували з 300нг 100фагів/см 2. Здобуті літичні бляшки реплікували кожного з цих олігонуклеотидів і піддавали 35 повторно на мембрани Amersham Нуbond N. циклам ампліфікації в апараті Perkin-Elmer 9600, в ДНК фіксували на фільтрах шля хом обробки умовах стандартного середовища для 1600kJUV (Stratagene Stratalinker). Ці фільтри ампліфікації, яке рекомендоване постачальником. прегібридизувапи в 6´SSC/0,1% SDS/0,25 Одержуваний 204 п.н.-фрагмент складає EPSPSзбираного молока протягом 2год. при 65°С. Пробу фрагмент Arabidopsis thaliana. EPSPS Arabidopsis thaliana помічали за допомогою 2. Створення бібліотеки кДНК з BMS лінії [32P]dCTP шля хом випадкового праймування клітин кукурудзи відповідно до інструкцій постачальника (Pharmacia а) 5г відфільтрованих клітин подрібнюють в Ready to Go kit). Одержана специфічна активність рідкому азоті, і тотальну нуклеїнову кислоту становить порядку 10срm на мкг фрагменту. Після екстрагують згідно з методом, описаним у Shure зі денатурації протягом 5хв. при 100°С цю пробу співавт., з такими модифікаціями: додавали до вказаного прегібридизаційного - рН лізуючого буфера доводять до рН9,0; середовища, і гібридизацію продовжували - після осадження за допомогою ізопропанолу, протягом 14 годин при 55°С. Одержані фільтри осад піднімається у воді і, після розчинення, піддавали флюорографії протягом 48год. при 7 80895 8 80°С з плівкою Kodak XAR5 та підсилюючими аліквоти електрокомпетентної Е. coli DH10B; екранами Amersham Hyperscreen RPN. трансформацію виконували шляхом Співставлення позитивних плям на фільтрі з електропорації з використанням наведених нижче чашками, з яких вони походять, дає можливість умов: суміш з компетентних бактерій та лігуючого зонам, що відповідають фагам, які показують середовища поміщали до кювети для позитивну гібридизаційну відповідь із зондом електропорації товщиною 0,2cм (Biorad), EPSPS Arabidopsis thaliana, бути відібраними з заздалегідь охолоджену до 0°С. Фізичні умови чашки. Ця стадія посіву, перенесення, гібридизації електропорації, з використанням електропоратора та витягання повторюється доти, поки всі плями на від фірми Biorad, такі: 2500 вольт, 25 mkF та 200 чашці послідовно очищуваних фагів не засвідчать Ω. У цих умовах середній час розряджання 100%-ий позитив в гібридизації. Незалежну пляму конденсатора становить порядку 4,2 мілісекунд. фагового лізису відбирають потім в розбавленому Потім бактерії поміщають в 1мл SOC-середовища (ref. CPMB) і перемішують протягом 1 години при середовищі l (Тріс-НСІ рН7,5; 10-мМ MgSO4 ; 0,1Μ 200об./хв. на ротаційній мішалці в 15-мілілітрових NaCI; 0,1% желатин); ці фаги в розчині утворюють ретортоподібних пробірках. Після поміщення на EPSPS-позитивні клони суспензії BNS клітин LB/агарове середовище, з додаванням 100мкг/мл кукурудзи. карбеніциліну, мініпрепарати з бактеріальних 4. Одержання та аналіз ДНК з EPSPS клонів клонів, які росли протягом ночі при 37°С, суспензії BMS клітин кукурудзи одержували відповідно до умов експерименту, Близько 5´108 фагів додавали до 20мл описаного в "Current Protocols in Molecular Biology". бактерій C600hfl при значенні OD600нм 2/мл та Після розщеплення ДНК за допомогою EcoRI і інкубували протягом 15 хвилин при 37°С. Цю розділення електрофорезом в 0,8% LGTA/TBE суспензію розбавляли потім в 200мл агарозному гелі (ref. CPMB), зберігали клони, що бактеріального ростового середовища в 1-1 мали 1/7т.п.н. вставку. Остаточний контроль Ерленмейерівській склянці та перемішували на здійснювали перевіркою, в якій виділена ДНК ротаційній мішалці при 250об./хв. Лізис дійсно виявляє гібридизаційний сигнал з EPSPSреєстрували, коли це середовище ставало зондом Arabidopsis thaliana. Після електрофорезу прозорим, що свідчило про лізис бактерій, які одержані фрагменти ДНК переносили на каламутили середовище, приблизно через 4год. мембрани Amershame Hybond N відповідно до перемішування. Потім цей супернатант обробляли умов Саузерн-аналізу, [описаного в "Current згідно з описом в "Current Protocols in Molecular Protocols in Molecular Biology"]. Одержаний фільтр Biology". Одержувана ДНК відповідає згаданим гібридизували з EPSPS-зондом Arabidopsis EPSPS-клонам із суспензії BMS-клітин кукурудзи. thaliana відповідно до умов, описаних у Від одного до двох мкг цієї ДНК розрізали за наведеному вище розділі 3. Плазмідний клон, що допомогою EcoRI та розділяли в 0,8%-ому мав 1,7т.п.н. вставку і гібридизується з EPSPSLGTA/TBE агарозному гелі (ref. CPMB). Остаточне зондом Arabidopsis thaliana, одержували в здійснення контролю полягає у перевірці того, щоб найбільшій кількості, а ДНК, що одержується після виділена ДНК дійсно проявляла гібридизаційний лізису бактерій, очищали в градієнті CsCI, як це сигнал з EPSPS-пробою Arabidopsis thaliana. Після [описано в "Current Protocols in Molecular Biology"]. електрофорезу одержані фрагменти ДНК Очищену ДНК частково секвенували за допомогою переносили на мембрани Amersham Hybond N набору Farmacia, відповідно до інструкцій відповідно до протоколу Саузерн-аналізу, постачальника, прямий та зворотний універсальні описаного в "Current Protocols in Molecular Biology". праймери, Μ13, що поставляються тим самим Одержаний фільтр гібридизували з EPSPS-пробою постачальником, використовували як праймери. Arabidopsis thaliana згідно з умовами, описаними у Одержувана неповна послідовність охоплює наведеному вище розділі 3. Клон, що виявляє приблизно 0,5т.п.н. Одержувана амінокислотна гібридизаційний сигнал з EPSPS-пробою послідовність у відповідній ділянці цього зрілого Arabidopsis thaliana і вміщує найбільш довгий білка (близько 50 амінокислотних залишків) EcoRI-фрагмент, має ділянку, за оцінкою в гелі, свідчить про 100%-ну ідентичність з відповідною приблизно у вигляді 1,7т.п.н. амінокислотною послідовністю зрілої EPSPS 5. Одержання клону pRPA-ML-711 кукурудзи, [описаною в Американському патенті Десять мкг фагового клону, що містив 1,7т.п.н. USP 4971908]. Цей клон, що відповідає 1,7т.п.н. вставку, розщеплювали за допомогою EcoRI та EcoRI-фрагменту ДНК EPSPS із суспензії BMSрозділяли у 0,8 LGTA/TBE агарозному гелі (ref. клітин кукурудзи, позначили як pRPA-ML-711. CPMB). Одержаний у гелі фрагмент, що містив Повну послідовність цього клону визначали в обох згадану 1,7т.п.н. вставку, вирізали з цього гелю ланцюгах з використанням протоколу набору після забарвлення ЕтБ, і гелевий фрагмент Pharmacia і синтезу комплементарних обробляли за допомогою β-агарази відповідно до олігонуклеотидів і олігонуклеотидів протилежної протоколу постачальника, New England Biolabs. орієнтації, кожний, приблизно, по 250п.н. Повна ДНК, що виділяється з 1,7т.п.н. фрагменту, послідовність, одержана з цього 1713п.н. клону, лігували при 12°С протягом 14год. із ДНК з надається у SEQ ID No.1. плазміди pUC 19 (New England Biolabs), різали за 6. Одержання клону pRPA-ML-715 допомогою EcoRI відповідно до умов Аналіз послідовності одержаного клону pRPAексперименту з лігування, описаного в "Current ML-711, і, особливо, порівняння одержаної Protocols in Molecular Biology". Два мкл з амінокислотної послідовності з послідовністю з одержаної згідно з наведеним вище описом суміші кукурудзи, свідчать про подовження послідовності для лігування використовували для трансформації 9 80895 10 на 92п.н. вище від кодону GCG, що кодує NН2термінації трансляції зрілої EPSPS кукурудзи, і кінцевий аланін зрілої частини EPSPS кукурудзи наступні послідовності з полілінкера pUC19, аж до [Американський Патент USP 4971908]. Аналогічно Hindlll-сайта, був позначені як pRPA-ML-712. спостерігали подовження на 288п.н. нижче від б) Модифікація 5'-кінця pRPA-ML-712: кодону ААТ, що кодує СООН-кінцевий аспарагін конструювання pRPA-ML-715: зрілої частини EPSPS кукурудзи [Американський Клон pRPA-ML-712 розрізали за допомогою Патент USP 4971908]. Ці дві частини могли б ферментів рестрикції Pstl і Hindlll. ДНК, яку відповідати, у разі NН2-кінцевого подовження, одержували внаслідок цих маніпуляцій, розділяли частині послідовності транзитного пептиду, для електрофорезом у 0,8%-ому LGTA/TBE локалізації у пластиді, а у разі СООН-кінцевого агарозному гелі (ref. CPMB). Фрагмент гелю, що подовження, - 3'-нетранслюємій ділянці кДНК. містив 1,3т.п.н. вставку Pstl-WcoRI, вирізали з Для одержання кДНК, що кодує зрілу частину цього гелю і очищали відповідно до протоколу, кДНК EPSPS кукурудзи, як [описано в USP описаного у наведеному вище розділі 5. Цю 4971908], виконували такі операції: вставку лігували в присутності еквімолярної а) Видалення 3'-нетранслюємої ділянки: кількості кожної з двох частково комплементарних конструювання pRPA-ML-712: олігонуклеотидних послідовностей: Клон pRPA-ML-711 розрізали за допомогою рестрикційного ферменту Asel, і кінці, одержані внаслідок цього розщеплення, затупляли шляхом обробки за допомогою фрагменту «льонова ДНКполімерази І, згідно з протоколом, описаним в СРМВ. Далі виконували розщеплення за а також у присутності ДНК плазміди pUC19, допомогою ферменту рестрикції Sacll. ДНК, що її розщепленої рестрикційними ферментами ВатНІ і одержували у ци х операціях, розділяли в 1%-ому Hindlll. LGTA/TBE агарозному гелі (ref. СРМВ). Два мкл цієї лігуючої суміші використовували Гелевий фрагмент, що містив 0,4т.п.н. вставк у для трансформації Е. coli DH10B, як описано вище "Asel з тупими кінцями/Sacll", вирізали з цього у розділі 5. Після аналізу плазмідної ДНК з різних гелю і очищали відповідно до протоколу, клонів згідно з методикою, описаною вище у описаного у наведеному вище розділі 5. ДНК, розділі 5, один з клонів, що має приблизно одержану з клону pRPA-ML-711, різали за 1,3т.п.н. вставку, зберігали для наступних аналізів. допомогою рестрикційного ферменту Hindlll пo Послідовність з 5'-кінця відібраного клону виявляє, Hindlll-11-сайті, локалізованому в полілінкері що послідовність ДНК в цій ділянці є такою: клонуючого вектора pUC19, і кінці, одержувані послідовність з полілінкера pUC19 від сайта EcoRI внаслідок цього розщеплення, затупляли до сайта BamHI, за якою слідує послідовність обробкою за допомогою фрагменту «льонова ДНКолігонуклеотидів, що використовуються для полімерази І. Після цього здійснювали клонування, після чого слідує залишок розщеплення за допомогою ферменту рестрикції послідовності, представленої в pRPA-ML-712. Цей Sacll. ДНК, що одержували внаслідок цих клон позначили як pRPA-ML-713. Цей клон має маніпуляцій, розділяли електрофорезом в 0,7%метіоніновий ATG-кодон, включений у Ncol-сайт ному LGTA/TBE агарозному гелі (ref. CPMB). вище N-термінального аланінового кодону зрілої Фрагмент гелю, що містив приблизно 3,7 т.п.н. EPSPS-синтази. Крім того, аланіновий і гліциновий вставку Hindlll з тупими кінцями/Sacll, вирізали з кодони N-кінця були збережені, але модифіковані цього гелю і виділяли очищенням відповідно до за третьою варіабельною основою: початкова протоколу, описаного у наведеному вище розділі GCGGGI дає модифіковану GCCGGC. 5. Клон pRPA-ML-713 розрізали за допомогою Ці дві вставки лігували, і 2мкл лігуючої суміші рестрикційного ферменту Hindlll, і кінці цього використовували для трансформації E соli DH10В, розщеплення затупляли шляхом обробки за як описано вище у розділі 5. допомогою фрагменту «льонова ДНК-полімерази Плазмідну ДНК з різних клонів аналізували 1. Далі здійснювали розщеплення за допомогою згідно з методикою, описаною для pRPA-ML-711. рестрикційного ферменту Sad. ДНК, що її Один з відібраних плазмідних клонів містив одержували після цих маніпуляцій, розділяли приблизно 1,45т.п.н. вставку EcoRI-Hindlll. електрофорезом в 0,8%-ному LGTA/TBE Послідовність кінців цього клону показує, що 5'агарозному гелі (ref. CPMB). Фрагмент гелю, що кінець даної вставки точно відповідає кінцю pRPAмістив 1,3т.п.н. вставк у "Hind III з тупими ML-711, і що 3'-кінець відзначається такою кінцями/Sacl", вирізали з цього гелю і очищали послідовністю: відповідно до протоколу, описаного у наведеному "5'вище розділі 5. Цю вставку лігували в присутності …AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGC AGGC ATGC ДНК плазміди pUC19, розщепленої за допомогою AAGCTT-3'". рестрикційного ферменту Xbal, і кінці цього Підкреслена послідовність відповідає кодону розщеплення затупляли шляхом обробки за СООН-термінальної амінокислоти аспарагіна, а допомогою фрагменту «льонова ДНК-полімерази наступний кодон відповідає стоп-кодону 1. Потім здійснювали розщеплення за допомогою трансляції. Нуклеотиди, розташовані нижче, рестрикційного ферменту Sad. Два мкл цієї відповідають елементам послідовності з лігуючої суміші використовували для полілінкера pUC19. Цей клон, який включає трансформації E соlі DH10B, як описано вище у послідовність pRPA-ML-711, аж до сайта розділі 5. Після аналізу плазмідної ДНК з різних 11 80895 12 клонів, згідно з методом, описаним вище у розділі 1340п.н. послідовність, одержана з цього 5, один з цих клонів, що має вставку приблизно клону, представлена в SEQ ID No.2 і SEQ ID No.3. 1,3т.п.н., зберігали для наступних аналізів. Б) модифікації послідовності, що Послідовність одержаних кінців відібраного клону забезпечують можливість підвищення EPSPSпоказує, що послідовність ДНК є такою: стійкості до продуктів, які є конкурентними послідовність з полілінкера pUC19 від сайта EcoRI інгібіторами синтазної активності EPSPS. до сайта Sacl, за якою слідує послідовність Використовували такі олігонуклеотиди: олігонуклеотидів, що використовуються для а) мутація Thr 102→Ilе. клонування, з якої видаляли 4п.н. GATCC з 5'олігонуклеотиду І, описаного вище, за якою слідує GAATGCTGGAATCGC AATGCGGCCATTGAC AGCзалишок послідовності, представленої в pRPA-ML3' 712 аж до Hindlll-сайта, і послідовність з б) мутація Pro 106→Ser. полілінкера pUC19 від Xbal до Hindlll. Цей клон 5'позначили як pRPA-ML-715. GAATGCTGGAACTGC AATGCGGTCCTTGAC AGC7. Одержання кДНК, що кодує мутантн ую 3' EPSPS кукур удзи в) мутація Gl y 101→Ala і Thr 102→Ilе. Усі стадії мутагенезу здійснювали за 5допомогою набору для мутагенезу Pharmacia CTTGGGGAATGCTGCCATCGC AATGCGGCCATT U.S.Ε., відповідно до інструкцій постачальників. G-3' Принцип цієї системи мутагенезу полягає у таких г) мутації Thr 102→Ue і Pro 106→Ser. операціях: плазмідну ДНК денатур ують 5'нагріванням і реасоціюють у присутності GGGGAATGCTGGAATCGC AATGCGGTCCTTGAC молярного надлишку, в одному випадку AGC-3' олігонуклеотиду, що використовується для Після секвенування послідовність, що мутагенезу, а в іншому випадку, - олігонуклеотиду, зчитується після мутагенезу по трьох мутантних що дає можливість унікальному сайтові фрагментах, була ідентичною батьківській ДНКрестрикційного ферменту, присутньому в послідовності pRPA-ML-716, за винятком полілінкері, бути елімінованим. Після стадії мутагенізованоТ ділянки, яка відповідає ділянці реасоціації здійснювали синтез комплементарного використаних для мутагенезу олігонуклеотидів. Ці ланцюга під впливом Т4-ДНК-полімерази в клони були позначені: присутності Т4-ДНК-лігази і гена 32 білка у pRPA-ML-717 для мутації Thr 102→Ilе, pRPAвідповідному буфері, що додається. ML-718 для мутації Pro 106→Ser, pRPA-ML-719 Одержаний продукт синтезу інкубують у для мутації Gly 101→Ala і Thr 102→llе і pRPA-MLприсутності рестрикційного ферменту, для якого 720 для мутації Thr 102→llе і Pro 106→Ser. допускається зникнення сайта під час мутагенезу. 1340п.н. послідовність з pRPA-ML-720 Штам Е. соlі, який відзначається, зокрема, представлена в SEQ ID No. 4 і SEQ ID No.5. мутацією mutS, використовують як хазяїн для 1395п.н. вставка Ncol-Hindlll є основою всіх трансформації цієї ДНК. Після вирощування в конструкцій, що використовуються для рідкому середовищі одержували тотальну трансформації рослин, для інтродукції стійкості до плазмідну ДНК і інкубували в присутності раніше гербіцидів, які є конкурентними до інгібіторів використаного рестрикційного ферменту. Після EPSPS, і, особливо - для інтродукції стійкості до цих обробок, штам Е. соlі використовували як гліфосату. Ця вставка буде позначатися в іншій хазяїн для трансформації. Одержували плазмідну частині опису як "подвійний мутант EPSPS ДНК з виділених клонів, а наявність інтродукованої кукурудзи". мутації контролювали секвенуванням. Приклад 2; А) - модифікація сайтів або послідовностей Толерантність до гліфосату для різних In vitro без принципового впливу на характер EPSPSмутантів стійкості кукурудзи до продуктів, які є 2. а: Екстрагування EPSPS-синтази конкурентними інгібіторами синтазної активності Різні гени EPSPS-синтази, які інтродукуються у EPSPS: елімінація внутрішнього Ncol-сайта з вигляді касети Ncol-Hindlll в плазмідний вектор pRPA-ML-715. pTrc99a (Pharmacia, ref. 27-5007-01), розрізали за Послідовність pRPA-ML-715 нумерували допомогою Ncol і Hindlll. Рекомбінантні бактерії Е. довільно шляхом поміщення першої основи Ncoli DH10B, які надекспресують різні EPSPSтермінального ал ані нового кодону в позицію 1. синтази, обробляли ультразвуком в 40мл буфера Ця послідовність має Ncol-сайт в позиції 1217. на 10г осаджених клітин, і промивали тим же Сайт-модифікуючий олігонуклеотид має таку буфером (200мМ Тріс-НСІ рН7,8, 50мМ послідовність: меркаптоетанолу, 5мМ ЕДТА і 1мМ PMSF), до 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' якого додавали 1г полівінілпіролідону. Цю Після секвенування, згідно з посиланнями, суспензію перемішували протягом 15 хвилин при наведеними вище, послідовність, що зчитується 4°С і потім центрифугували протягом 20 хвилин після мутагенезу, відповідає послідовності при 27000g і 4°С. використаного олігонуклеотиду. Ncol-сайт був До супернатанту додавали сульфат амонію, дійсно елімінований, і трансляція амінокислот в цій щоб довести цей розчин до 40%-го насичення ділянці зберігає початкову послідовність, присутню сульфатом амонію. Одержану суміш в pRPA-ML-715. центрифугували протягом 20 хвилин при 27000g і Цей клон позначили як pRPA-ML-716. 4°С. Сульфат амонію додавали до одержаного 13 80895 14 нового супернатанту, щоб довести цей розчин до одержані під час цієї стадії, розвиваються далі 70%-го насичення по відношенню до сульфату протягом 10 днів при культивуванні на MSамонію. Одержану суміш центрифугували середовищі, з додаванням 30г/л сахарози, але яке протягом 30 хвилин при 27000g і 4°С. EPSPSне містить ніякого гормону. Далі розвинуті кільчики синтазу, присутню в цьому білковому осаді, видаляли та культивували на MS-середовищі для відбирали в 1мл буфера (20мМ Тріс-НСІ рН7,8, вкорінення, яке мале половинний вміст солей, 50мМ меркаптоетанолу). Цей розчин діалізували вітамінів та цукру і не містило ніякого гормону. протягом доби проти двох лі трів цього ж буфера Приблизно через 15 днів, вкорінені кільчики при 4°С. переносили в ґрунт. 2. б: Ферментативна активність 1-3-СтіЙкістьдо гліфосату Активність кожного ферменту, як і їх стійкість Регенерували двадцять трансформованих до гліфосату, вимірювали in vitro протягом 10 рослин і переносили їх до оранжереї для хвилин при 37°С у такій реакційній суміші: 100мМ конструювання pRPA-RD-173. Ці рослини малеїнової кислоти рН5,6, 1мМ обробляли в оранжереї, на стадії 5-го листа, фосфоенолпірувату, 3мМ шикімат-3-фосфату водною суспензією RoundUp, яка відповідає 0,8кг (приготовленого згідно з [Knowless P.F. і Sprinson активної речовини гліфосату на гектар. D.B. 1970. Methods in Enzymol 17A, 351-352 з Відповідні результати показників Aerobacter aerogenes], штам АТСС 25597) і 10мМ спостережень фітотоксичности протоколювали фториду калію. Екстракт ферменту додавали в через 3 тижні після обробки. За цих умов останній момент після додавання гліфосату, встановлено, що рослини, трансформовані за остаточна концентрація якого варіювала від 0 до допомогою конструкції pRPA-RD-173, виявили 20мМ. дуже хорошу толерантність, тоді як Активність вимірювали шляхом кількісного нетрансформовані контрольні рослини повністю визначення фосфату, що вивільнювався, згідно [з гинули. методикою Tausky Н.А. і Shorr Ε. 1953. J. Biol. Ці результати ясно свідчать, що таке Chem. 202, 675-685]. поліпшення викликане використанням химерного У цих умовах природний фермент (WT) гена згідно з цим винаходом замість такого ж гена, інгібується вже на 85% при концентрації гліфосату що кодує толерантність до гліфосату. 0,12мМ. При цій концентрації мутантний фермент, Приклад 4: відомий як Ser106, інгібується лише на 50%, а інші Трансформація та селекція клітин кукурудзи три мутанти, І1е102, l1e102/Ser106 і АІа101/І1е102, BMS (Black Me xican Sweet)-клітин кукурудзи в демонструють низьку інгібіцію або взагалі не експонентній фазі росту бомбардували інгібуються. конструкцією pRPA-RD-130 згідно зі специфікою та Концентрацію гліфосату збільшували на умовами експерименту, [описаними у Klein зі порядок, тобто до 1,2мМ, з метою досягнення співавт. 1987 (Klein T.M., Wolf E.D., Wu R. і 50%-го інгібування мутантного ферменту І1е102, Sandford J.C. (1987): High velocity microprojectiles мутантів l1e102/Ser106, Ala/I1e і Ala, які до цієї for delivering nucleic acids into living cells, NATURE концентрації не інгібувалися. Vol.327 pp.70-73)]. Слід зазначити, що активність мутантів Ala/l1е Через два дні після бомбардування ці клітини і Ala не інгібується аж до концентрації гліфосату переносили в те ж саме середовище, що містило 10мМ, і що активність мутанта l1e102/Ser106 не 2мМ N-(фосфонометил) гліцину. знижується навіть при збільшенні концентрації Через 8 тижнів селекції на цьому середовищі, гліфосату вдвічі, тобто, до 20мМ. кал юси, які виросли, відбирали, потім Приклад 3: ампліфікували та аналізували за допомогою PCR і Резистентность трансформованих тютюнови х виявляли очевидну присутність химерного OTPрослин EPSPS-гена. 1-1 - Трансформація Клітини, які не піддавали бомбардуванню і які Вектор pRPA-RD-173 інтродукувапи в не росли на тому ж середовищі, що містило 2мМ grobacterium tumefaciens штам ЕНА101 (Hood зі N-(фосфонометил) гліцину, блокувалися співавт., 1987), несучий косміду pTVK291 [Komari зі гербіцидом і не розвивалися. слівавт., 1986]. Техніка трансформації заснована Рослини, трансформовані згідно з цим на методі Horsh зі співавт. (1985). винаходом, можуть бути використані як батьківські 1-2 - Регенерація для одержання ліній та гібридів, які відзначаються Регенерацію тютюну PBD6 (джерело SEITA фенотипічною ознакою, що відповідає експресії France) здійснювали з листових експлантатів в інтродукованого химерного гена. основному середовищі Murashige і Skoog (MS), що Опис конструкцій плазмід включає 30г/л сахарози, а також 200мкг/мл pRPA-RD-124: До pRPA-ML-720 додавали канаміцину. Листові експлантати видаляли з "nos" поліаденілюючий сигнал для створення рослин, що культивуються в оранжереї або in vitro, клонуючої касети, що містить подвійний мутант і трансформували згідно з методикою листових EPSPS-гена кукурудзи (ThR 102→Ilе і Pro дисків [Science, 1985, Vol.227, pp.1229-1231] на 106→Ser). pRPA-ML-720 розщеплювали за протязі трьох послідовних стадій: перша включає допомогою Hindlll та обробляли фрагментом індукцію проростання, протягом 15 днів, у «льонова ДНК-полімерази І Е. соlі для одержання середовищі з додаванням 30г/л сахарози, яка тупого кінця. Друге розщеплення здійснювали за містить 0,05мг/л нафтилоцтової кислоти (NAA) і допомогою Ncol, і одержаний фрагмент EPSPS 2мг/л бензиламінопурину (ВАР). Кільчики, очищали. Потім EPSPS-ген лігували з очищеною 15 80895 pRPA-RD-12 (клонуюча касета, що містила сигнал поліаденілювання нопалінсинтази) для одержання pRPA-RD-124. Для того, щоб одержати практично чистий вектор pRPA-RF-12, останній необхідно завчасно розщепити за допомогою Sail, обробити ДНК-полімеразою Кльонова і потім другий раз розщепити за допомогою Ncol. pRPA-RF-125: До pRPA-RD-124 додавали оптимізований транзитний пептид (ОТР) для створення клонуючої касети, що містить EPSPSген, націлений на плазміди. pRPA-RD-7 [Європейська Патентна Заявка ЕР 652286] розщеплювали за допомогою Sphl, обробляли за допомогою Т4-ДНК-полімерази і потім розщеплювали за допомогою Spel, а одержаний фрагмент ОТР очищали. Цей ОТР-фрагмент клону вал и в pRPA-RD-124, який заздалегідь розщеплювали за допомогою Ncol, обробляли за допомогою ДНК-полімерази Кльонова для видалення виступаючої 3'-частини і потім розщеплювали за допомогою Spel. Далі цей клон секвенували з метою гарантування правильного трансляційного злиття між згаданим ОТР і згаданим EPSPS-геном. Після цього одержували pRPA-RD-125. pRPA-RD-130: До pRPA-RD-125 додавали послідовність НЗС4 кукурудзяного гістонового промотора і послідовність інтрону 1 adh1 з pRPARD-123 [Патентна Заявка ЕР 507698], з метою створення касети для експресії в рослинах подвійного мутантного EPSPS-гена в тканинах однодольних. pRPA-RD-123 (касета, що містить згаданий НЗС4 кукурудзяний гістоновий промотор, злитий із згаданим інтроном. 1 adh1, розщеплювали за допомогою Ncol і Sacl. Фрагмент ДНК, що містив вказаний промотор, одержаний з pRPA-RD-123, після цього очищали і лігували з pRPA-RD-125, яку заздалегідь розщеплювали за допомогою Ncol і Sacl. pRPA-RD-159: До pRPA-RD-125 додавали гістоновий подвійний промотор Н4А748 Arabidopsis [Патентна Заявка ЕР 507698], з метою створення касети для експресії в рослинах, для експресії "ОТР-подвійного мутантного EPSPSгена", гена в тканинах дводольних. pRPA-RD-132 (касета, що містить згаданий подвійний промотор Н4А748 [Патентна Заявка ЕР 507698] розщеплювали за допомогою Ncol і Sacl. Одержаний очищений фрагмент промотора клонували після цього в pRPA-RD-125, яку розщеплювали за допомогою ЕсоІ і Sacl. pRPA-RD-173: До плазміди pRPA-BL-150A [Європейська Патентна Заявка 508909] додавали "Н4А748 промотор-ОТР-подвійний мутантний EPSPS-ген), ген з pRPA-RD-159, для створення з Agrobacterium tumefaciens трансформуючого вектора. pRPA-RD-159 розщеплювали за допомогою Notl і обробляли полімеразою Кльонова. Цей фрагмент клонували після цього в pRPA-BL-150A за допомогою Smal. 16 17 80895 18 19 80895 20 21 80895 22