Тетрапептид, що регулює рівень глюкози в крові при цукровому діабеті

1. Тетрапептид лізил-глутаміл-аспартилтриптофан амід загальної формули Lys-Glu-AspTrp-NH2 [SEQ ID NO:1]. 2. Тетрапептид лізил-глутаміл-аспартилтриптофан амід загальної формули Lys-Glu-Asp C2 2 (19) 1 3 85204 Діабетон MB і глібенез-ретард є препаратами продовженої дії. Слід зазначити, що часто у хворих цукровим діабетом розвивається так звана вторинна резистентність до сульфонілсечовинних препаратів, пов'язана з підвищенням залишкової секреції інсуліну. При застосуванні препаратів сульфонілсечовини спостерігаються побічні ефекти: диспепсичні розлади, алергійні реакції, пригноблення функції кісткового мозку, токсичний вплив на печінку і нирки, виникнення гіпоглікемії. Застосовуються також бігуаніди - метформін (глюкофаж, сіофор і ін.), глітазони або сенситайзери інсуліну: актос і авандія і інгібітори альфа-глюкозидаз: акарбоза і меглитол. Ці пероральні препарати підвищують чутливість тканин до інсуліну і мають позитивний нормалізуючий вплив на вуглеводний обмін. Разом з тим їхнє застосування може бути обмежене через низьку ефективність або побічні ефекти [Балаболкін М.І. Діабетологія. - M.: Медицина, 2000. - 672с.; Регістр лікарських засобів Росії. Енциклопедія ліків. 10 вип. - M.: РЛС-2003. 2003. -1438с.] Відомий декапептидний фрагмент інсуліну [Патент РФ №2078769 «Пептидний фрагмент, що має біологічну активність інсуліну», МПК А61ДО38/28, 1997], що має біологічну активність порівняну з активністю інсуліну. Відомі аналоги пептиду р277 - епітопа людського білка теплового шоку (hsp 60) [Патент РФ №2159250 «Аналоги пептиду р277 і утримуючі їх фармацевтичні композиції для лікування і діагностики діабету», МПК А61ДО39/00, 38/00,2000]. Однак біологічна активність, вказана у зазначених ви ще патентах, проявляється в інсуліноподібній дії цих пептидів і може застосовуватися з метою створення пептидних препаратів для лікування цукрового діабету тип у 1. Відомі короткі інсулінпотенціюючи пептиди, описані в патенті [EP №1268518 «Insulin potentiating peptides», МПК І307ДО5/10; А61ДО38/07; А61ДО38/08, 2001], прийнятому за прототип стосовно фармакологічного засобу (фармацевтичної композиції) і способу профілактики і/або лікування цукрового діабету. Ці короткі пептиди можуть служити пептидними фармацевтичними агентами, які можуть застосовуватися для лікування цукрового діабету. Слід зазначити, пептидна сполука, яка заявляється - тетрапептид, який не має структурних аналогів. Заявлений винахід, спрямовано на одержання нової біологічно активної сполуки пептидної природи, що регулює рівень глюкози у пацієнтів із цукровим діабетом типу 1 і тип у 2. Даний винахід стосується нового тетрапептиду лізил-глутаміл-аспартил-триптофан амід загальної формули Lys-Glu-Asp-Trp-NKb послідовності 1 [SEQ ID NO:1]. Тетрапептид одержують класичним методом пептидного синтезу в розчині [Якубке X. - Д., Ешкайт X. Амінокислоти, пептиди, білки: Пер. з нім. M.: Мир, 1985. - 456с.]. Даний винахід стосується нового тетрапептиду лізил-глутаміл-аспартил-триптофан амід загальної формули: L ys-Glu-Asp-Trp-NEb послідовності 1 4 [SEQ ID NO:1], який має біологічну активність, що проявляється в регуляції рівня глюкози. Регуляторна дія тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NHb на рівень глюкози при цукровому діабеті виявлена при його вивченні в експерименті при алоксановому діабеті. Припускається, що алоксановий діабет характеризується поразкою β-клітин підшлункової залози і супроводжується вираженою гіперглікемією, внаслідок дефіциту інсуліну і активації глюконеогенеза. У результаті експериментального вивчення встановлено, що тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH2 не токсичний. Даний винахід також стосується фармакологічного засобу (фармацевтичної композиції), що містить як активний пептидний агент ефективну кількість тетрапептида лізил-глутаміл-аспартилтриптофан амід загальної формули Lys-Glu-AspTrp-NH2 послідовності 1[SEQ ID NO:1], що регулює рівень глюкози при цукровому діабеті. Поняття «фармакологічний засіб», використане в даній заявці, припускає використання такої лікарської форми, що містить ефективну кількість тетрапептида загальної формули Lys-Glu-Asp-TrpNH2, яка може знайти профілактичне і/або лікувальне застосування в медицині як засіб для регуляції рівня глюкози при цукровому діабеті. Поняття "ефективна кількість", використане в даній заявці, припускає використання тієї кількості активного пептидного агента, що відповідно до його кількісних показників активності і токсичності, а також на підставі знань фахівця повинне бути ефективним у даній лікарській формі. Для одержання фармацевтичних композицій, що відповідають винаходу, запропонований тетрапептид змішують, як активний інгредієнт, із фармацевтичним носієм згідно прийнятим у фармацевтиці способам компаундування. Носій може мати різні форми, які залежать від лікарської форми препарату, бажаної для введення в організм, наприклад, парентерального або перорального. При виготовленні композицій у переважній дозованій формі для перорального застосування можуть використатися відомі фармацевтичні компоненти. Для парентерального введення носій зазвичай включає стерильну воду, хоча можуть бути включені інші інгредієнти, що сприяють стабільності, або для збереження стерильності. Відповідно до даного винаходу, фармакологічний засіб призначається переважно для парентерального і/або перорального застосування. Даний винахід також стосується способу профілактики і/або лікування цукрового діабету, що полягає у введенні пацієнту фармакологічного засобу, що містить як активний пептидний агент ефективну кількість тетрапептида загальної формули Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозах 0,1-30мкг/кг маси тіла, щонайменше, один раз у день протягом періоду, необхідного для досягнення терапевтичного ефекту. Метод профілактики і/або лікування цукрового діабету полягає у профілактичному або лікуваль 5 85204 ному парентеральному або пероральному введенні фармакологічного засобу пацієнтові. Відповідно до винаходу тетрапептид Lys-GluAsp-Trp-NH 2 активний при введенні його в дозах 0,1-30мкг/кг маси тіла, хоча можуть бути використані і більш низькі (високі) дози залежно від характеру і ступеня важкості патологічного процесу. Технічний результат, що досягається при використанні винаходу, полягає в регуляції рівня глюкози за рахунок збільшення секреції інсуліну і підвищення чутливості тканин до інсуліну. Можливість досягнення об'єктивного технічного результату при використанні винаходу підтверджена достовірними експериментальними і клінічними даними, отриманими методами, загальноприйнятими в даній області знань. Сутність винаходу пояснюється таблицями. У Таблиці 1 показаний вплив тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 на вміст глюкози в крові щурів з алоксановим діабетом (варіант лікування). У Таблиці 2 показаний вплив тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 на вміст глюкози в крові щурів з алоксановим діабетом (варіант профілактики й лікування). У Таблиці 3 показаний вплив тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у різних дозах на вміст глюкози в крові щурів з алоксановим діабетом. У Таблиці 4 показаний вплив тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 на вміст інсуліну в крові щурів з алоксановим діабетом. У Таблиці 5 показані результати тесту на толерантність у глюкозі щурів з алоксановим діабетом (44 доба після завершення курсу тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2). У Таблиці 6 показаний вплив інсуліну на вміст глюкози в крові щурів з алоксановим діабетом (28 доба після завершення курсу тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2). У Таблиці 7 представлений розподіл хворих цукровим діабетом при проведенні дослідження. У Таблиці 8 показана ефективність парентерального введення тетрапептида Lys-Glu-Asp-TrpNH2 хворим цукровим діабетом типу 1 і типу 2, що отримували інсулін. Даний винахід ілюструється прикладом синтезу тетрапептида формули лізил-глутаміласпартил-триптофан амід (Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2) (приклад 1), прикладами випробування біологічної активності тетрапептида (Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2) (приклади 2, 3, 4, 5, 6, 7), а також прикладом результатів клінічного застосування тетрапептида (Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2), що демонструє його фармакологічні властивості і підтверджує можливість досягнення профілактичного і/або лікувального ефекту (приклад 8). Приклад 1. Синтез тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 1. Назва сполуки: лізил-глутаміл-аспартилтриптофан амід 2. Структурна формула: 6 3. Брутто-формула без протиіона: C26H37N7O 8 4. Молекулярна вага без протиіона: 575,62 5. Протиіон: відсутній 6. Зовнішній вигляд: білий аморфний порошок без запаху 7. Спосіб синтезу: пептид отриманий класичним методом синтезу в розчині за схемою: Z - бензилоксикарбонільна група BOC - трет.бутилоксикарбонільна група OSu - N-оксисукцинімідний ефір OBzI - бензиловий ефір DCC - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиімід HOBT - N-оксибензотриазол. Як розчинник використали Ν,Ν'диметилформамід. При введенні аспарагінової кислоти використали захист α-СООН групи солеутворенням із триетиламіном. Деблокування ВОСзахисної групи проводили розчином трифтороцтової кислоти (TFA), Z-захисних груп каталітичним гідрогенолізом. Препарат був ізольований і очищений методом препаративної хроматографії на колонці з нормальною фазою (силікагель). Характеристики готового препарату: - амінокислотний аналіз Lys GIu Asp Trp 0,95 1,00 1,06 0,90 - вміст пептиду: 97,48% (по ВЕРХ, 220нм) - TCX - індивідуальний, Rf=0,64 (пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силікагель CTX-IBE 8-12мкм, ацетонітрил:вода 3:1) - вміст вологи: 7% - рН0,01% розчину: 4,05 - УФ-спектр: пік при 280нм - індольне кільце триптофану - питоме оптичне обертання: [α]D23 : - 26,53° (с=1,0; Н2О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Приклад синтезу: BOC-Glu(OBzI)-Asp(OBzl)-OH (I), N-трет.бутилоксикарбоніл-(g-бензил)глутаміл-(β-бензил)аспартат. 7 85204 N-оксисукцинімідний ефір Nтрет.бутилоксикарбоніл-(g-бензил)глутамінової кислоти BOC-GIu(OBzI)-OSu 4,34г (0,0100моль) розчиняють у 20мл диметилформаміда, додають триетиламін 1,72мл (0,0125моль) і βбензиласпартат 2,80г (0,0125моль). Перемішують при кімнатній температурі 24 години. Продукт висаджують 0,5н розчином сірчаної кислоти (150мл), екстрагують в етилацетат (3x30мл), промивають 0,5н розчином сірчаної кислоти (2´20мл), водою, 5% розчином бікарбонату натрію (1´20мл), водою, 0,5н розчином сірчаної кислоти (2´20мл), водою. Продукт сушать над безводним сульфатом натрію. Етилацетат фільтрують, упарюють у вакуумі при 40°С, залишок сушать у вакуумі над Р2О5. Одержують масло 5,68г (»100%). Rf=0,42 (бензолацетон 2:1, пластинки Sorbfil, силікагель 8-12мкм, прояв УΦ і хлор/бензидин). 2) TFAH-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), трифторацетат (g-бензил)-глутаміл-(β-бензил)аспартата. N-трет.бутилоксикарбоніл-(g-бензил)глутаміл(β-бензил)аспартат (І) 5,68г (»0,01моль) розчиняють у 20мл суміші дихлорметан-трифтороцтова кислота (3:1). Через 2 години розчинник упарюють у вакуумі при 40°С. Упарювання повторюють із новою порцією дихлорметана (2´10мл), залишок сушать у вакуумі над NaOH. Одержують масло 5,80г (»100%). Rf=0,63 (н-бутанол-піридин-оцтова кислота-вода, 15:10:3:12). 3) Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), 838,92 Ν,Νe-дибензилоксикарбоніллізил-(g-бензил) глутаміл-(β-бензил)аспартат. Трифторацетат (g-бeнзил)глyтaмiл-(βбeнзил)acпapтaтa (II) 5,65г (0,01моль) розчиняють в 10мл диметилформаміда, додають триетиламін 2,80мл (0,02моль) і N-оксисукцинімідний ефір Ν,Νeдибензилоксикарбоніллізина 6,64г (0,013моль). Реакційну суміш перемішують 24 години при кімнатній температурі. Продукт висаджують 0,5н розчином сірчаної кислоти (150мл), екстрагують в етилацетат (3´30мл), промивають 0,5н розчином сірчаної кислоти (2´20мл), водою, 5% розчином бікарбонату натрію (1´20мл), водою, 0,5н розчином сірчаної кислоти (2´20мл), водою і сушать над безводним сульфатом натрію. Етилацетат фільтрують, упарюють у вакуумі при 40°3, залишок закристалізовують у системі етилацетат/гексан. Продукт відфільтровують і суша ть у вакуумі над Р2О5 . Ви хід 6,04г (72%). Температура плавлення T пл.=142°C. Rf=0, 60 (бензол-ацетон, 1:1). 4) Z-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Trp-NH 2 (IV), 1024,15 Ν,Νe-дибензилоксикарбоніллізил-(gбензил)глутаміл-(β-бензил)аспартил-триптофан амід. HClH-Trp-NH2 , гідрохлорид аміду триптофану 1,8г (7,2ммоль) суспендують в 15мл тетрагідрофурана і при перемішуванні додають триетиламін 1,0мл (7,2ммоль). Через 5хв. Ν,Νeдибензилоксикарбоніллізил-(g-бензил)глутаміл-(βбензил)аспартат (III) 4,0г (4,8ммоль), Nоксибензотриазол 0,8г (5,8ммоль). Суміш прохолоджують до 0°C. Потім додають охолоджений до 0°C розчин Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиіміда 1,2г 8 (5,8ммоль) в 5мл тетрагідрофурана. Суміш перемішують при цій температурі 2 години і залишають на ніч перемішуватися при кімнатній температурі. Реакційну суміш виливають у крижану воду (150мл), осад розтирають і відфільтровують. Осад суспендують в етилацетаті (200мл) і промивають гель, що утворився, послідовно 1N H2SO4 (2´100мл) , водою (2´100мл) , 5% NaHCO3 (2´100мл) , 1N H2SO4 (2´100мл) , водою (2´100мл) , насиченим розчином NaCl. Розчинник упарюють у вакуумі, і продукт двічі перекристалізовують у ізопропіловому спирті. Вихід 4,9г (95%), Rf=0,67 (бензол-ацетон, 2:1). 5) H-Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 (V), лізил-глутаміласпартил-триптофан амід, 575,62 Ν,Νe-дикарбобензоксиллізил-(g-бензил)глутаміл-(β-бензил)аспартил-триптофан амід (IV) 4,7г гідровали в системі метанол-вода (5:1) над каталізатором Pd/C. Контроль за повнотою деблокування здійснювався в TCX системах бензол-ацетон (2:1) і ацетонітрил-вода (1:3). Після закінчення реакції каталізатор відфільтровували, фільтрат упарювали у вакуумі і залишок закристалізовували в системі вода/метанол. Продукт сушили у вакуумі над KOH. Вихід 2,6г ( 95%). Rf=0,64 (ацетонітрилвода, 1:1). Для очищення продукту 2,6мг речовини розчиняли в 5мл суміші ацетонітрил-вода (1:3) і наносили на колонку 21´4,5см із силікагелем "Sigma", 230-400міш (40-63μ). Елюювання системою ацетонітрил-вода (1:3). Отримано 1г хроматографічно однорідної речовини. 6) Аналіз готового препарату. - Вміст основної речовини визначали методом ВЕРХ на колонці Nucleosil C18 4,6´250mm. A: 0,1% TFA; В: MeCN; grad. B 0(30% за 30хв. Швидкість потоку 1мл\хв. Детекція при 220нм, сканування 190-600нм, проба 20μl. Вміст пептиду 97,48%. Амінокислотний аналіз проводили на аналізаторі ААА"Т-339" Prague. Lys GIu Asp Trp 0,95 1,00 1,06 0,90 - TCX: індивідуальний, Rf=0,64 (ацетонітрилвода 3:1, пластинки Sorbfil, силікагель 8-12мкм, прояв хлор/бензидин і УФ). - Вміст вологи: 7% (гравіметрично по втраті маси при сушінні 20мг при 100°C). - рН0,01% розчину: 4,05 (потенціометрично). - Питоме оптичне обертання: [α]D23: -26,53° (с=1,0 H 2O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. - УФ-спектр: пік при 280нм - індольне кільце триптофану, "Beckman DU 650", 0,001% розчин у воді. Приклад 2. Вплив тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 на плин алоксанового діабету у щурів (варіант лікування) Експеримент проведений на 21 білих безпородних щурах-самцях із середньою масою тіла 375±35г. Після визначення концентрації глюкози в крові всі тварини рандомізовано були розділені на 2 групи. Потім всім тваринам однократно внутрівенно ввели по 1мл розчину алоксана («Spofa») у дозі 35мг/кг. Через 15 діб тваринам контрольної групи почали вводити внутрішньочеревно щодня 9 85204 однократно по 0,3мл 0,9% розчину NaCl, а щурам основної групи - тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозі 3мкг (в 0,3мл 0,9% розчину NaCl) на щура протягом 11 діб. Результати експерименту наведені в таблиці 1, з якої випливає, що введення тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2 сприяло достовірному зниженню рівня глюкози в крові у тварин в усі строки дослідження на 38,4% (30-47,7%). Зниження рівня глюкози при введенні тетрапептида Lys-Glu-Asp-TrpNH2 корелювало зі зниженням летальності серед тварин основної групи. Так, у контрольній групі тварин до завершення експерименту (84 доба від моменту введення алоксана) летальність склала 70%, у той час як у групі щурів, що одержували тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, - 36,4%. Таким чином, застосування тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 дозволило зменшити летальність у тварин з алоксановим діабетом майже в 2 рази. Приклад 3. Вплив тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 на плин алоксанового діабету у щурів (варіант профілактики і лікування) Експеримент проведений на 15 білих безпородних щурах-самцях із середньою масою тіла 375±35г. Тварини рандомізовано були розділені на 2 групи. Контрольним тваринам вводили внутрішньочеревно щодня однократно по 0,3мл 0,9% розчину NaCl, а щурам основної групи - тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозі 3мкг (в 0,3мл 0,9% розчину NaCl) на щура протягом 7 діб. Потім всім тваринам однократно внутрівенно вводили по 1мл розчину алоксана («Spofa») у дозі 35мг/кг. Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 продовжували вводити ще протягом 3 діб після введення алоксана. Потім щурам основної групи провели 2-й курс тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 з 18 по 28 добу (усього 11 діб) у тій же дозі. Результати експерименту наведені в таблиці 2. Насамперед, необхідно відзначити, що введення тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 здоровим тваринам не призводило до зниження концентрації глюкози в крові. У тварин контрольної групи в усі строки експерименту після введення алоксана відзначений розвиток діабету зі збільшенням рівня глюкози в крові в 1,9-4,9 рази в порівнянні з вихідним рівнем. У щурів, що одержали 1 курс тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, відзначене зниження рівня глюкози на 22-30% у порівнянні з контролем. Після проведення 2-го курсу тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2 у тварин відзначена повна нормалізація концентрації глюкози в крові в усі досліджені строки (28, 33, 40 діб), у той час як у контрольних тварин у ці ж строки вміст глюкози в крові був ви ще відповідно в 2; 4,2; 3,8 рази. Слід зазначити, що важка форма діабету розвилася тільки в 2 з 8 щурів, що одержали тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, у той час як у контрольній групі - в 5 з 7 щурів, тобто цей показник у контрольних тварин був в 2,9 рази вище. До завершення досліду (40 доба від моменту введення алоксана) у контролі збереглося 57,1% тварин, а при введенні тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 - 75%. Результати експерименту дають підставу зробити висновок, що застосування тетрапептида 10 Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 сприяє повній нормалізації рівня глюкози в крові у щурів з алоксановим діабетом, що супроводжується зниженням летальності. Приклад 4. Вплив тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 у різних дозах на плин алоксанового діабету у щурів Експеримент проведений на 23 білих безпородних щурах-самцях із середньою масою тіла 375±35г. Всім тваринам однократно внутрівенно ввели по 1мл розчину алоксана («Spofa») у дозі 35мг/кг. Потім тварини рандомізовано були розділені на 3 групи. Контрольним тваринам вводили внутрішньочеревно щодня однократно по 0,3мл 0,9% розчину NaCl, щурам 2 і З групи - тетрапептид LysGlu-Asp-Trp-NH 2 у дозах 1мкг (в 0,1мл 0,9% розчину NaCl) і 10мкг (в 1,0мл 0,9% розчину NaCl) на щура протягом 7 діб. Результати експерименту наведені в таблиці 3. Введення тетрапептида Lys-Glu-Asp-Тrр-NH2 щурам у дозі 1мкг сприяло достовірному зниженню показника рівня глюкози в крові в 1 і 4 добу після завершення курсу препарату відповідно на 17,3 і 12,3% у порівнянні з контролем. Введення ж тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 щурам у дозі 10мкг призвело до більше істотного достовірного зниження концентрації глюкози в 1, 4, 7, 17 добу відповідно на 30; 23,8; 26; 12,7%. Із цих даних ви тікає, що збільшення дози тетрапептида Lys-GluAsp-Trp-NH 2 призводить до більше вираженої дії на вміст глюкози в крові у тварин. Приклад 5. Вплив тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 на вміст інсуліну в крові щурів з алоксановим діабетом Експеримент проведений на 18 білих безпородних щурах-самцях із середньою масою тіла 375±35г. Після визначення концентрації глюкози в крові всі тварини рандомізовано були розділені на 2 групи. Потім всім тваринам однократно внутрівенно ввели по 1мл розчину алоксана («Spofa») у дозі 35мг/кг. Через 15 діб контрольним тваринам почали вводити внутрішньочеревно щодня однократно по 0,3мл 0,9% розчину NaCl, а щурам основної групи - тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозі 3мкг (в 0,3мл 0,9% розчину NaCl) на щура протягом 11 діб. Результати експерименту наведені в таблиці 4, з якої витікає, що у тварин на 15 добу після введення алоксана розвився діабет. У щурів, що одержали тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH2, вміст інсуліну в крові після введення препарату протягом 8 діб було в 3,9 рази вище, ніж у тварин контрольної групи. В усі наступні строки експерименту відзначене збереження деякої кількості інсуліну в крові щурів (13-18% від вихідного рівня), у той час як у контрольних тварин інсулін у крові повністю був відсутній. До завершення досліду (на 70 добу від моменту введення алоксана) у контролі збереглося 62,5% тварин, а при введенні тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 - 70%. Аналіз результатів експерименту показав, що введення тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 тваринам з алоксановим діабетом сприяє збереженню деякого рівня інсуліну в крові, що зв'язано, мо 11 85204 жливо, із частковим відновленням структури і функції клітин, що виробляють інсулін. Приклад 6. Вплив тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 на показники цукрової кривої у щурів з алоксановим діабетом Експеримент проведений на 13 щурах-самцях, які були раніше в досліді (варіант лікування - 44 доби після закінчення введення тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2). Окрему групу склали 7 здорових щурів з аналогічною масою тіла. Всім тваринам внутрівенно ввели по 1мл 2% розчину глюкози і потім визначали її концентрацію в крові. Результати експерименту представлені в таблиці 5, з якої витікає, що у здорових щурів після введення глюкози її концентрація в крові склала через 5, 30, 60, 120хв. відповідно 203,9; 156,3; 124,6; 114,5% у порівнянні з вихідним рівнем, прийнятим за 100%. Ці дані вказують на різке придушення функції підшлункової залози після поразки алоксаном. У контрольних тварин аналогічний показник склав відповідно 129,8; 127,5; 123,5; 121,1%. Цей же показник у щурів, що одержали тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, склав 142,9; 97,3; 95,6; 77,9%. Результати цього експерименту вказують на здатність тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 стимулювати функцію підшлункової залози у щурів з алоксановим діабетом. Приклад 7. Вплив інсуліну на вміст глюкози в крові щурів з алоксановим діабетом після застосування тетрапептида Lys~Glu-Asp-Trp-NH 2 Експеримент проведений на 13 щурах-самцях, які були раніше в досліді (варіант лікування - 28 діб після закінчення введення тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2). Окрему групу склали 8 здорових щурів з аналогічною масою тіла. Всім тваринам внутрівенно вводили інсулін (0,3 MO) і потім визначали концентрацію глюкози в крові. Результати експерименту наведені в таблиці 6. У здорових тварин відзначене фізіологічне різке зниження рівня глюкози, у той час як у контролі (алоксановий діабет) цей показник був в 2,8 рази нижче. У тварин з алоксановим діабетом, що одержали тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, відзначено після введення інсуліну достовірне зниження рівня глюкози майже в 2 рази в порівнянні з контролем. Ці дані вказують на здатність тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у значній мірі зберігати чутливість тканин до інсуліну. Виявлені в результаті експериментального дослідження властивості тетрапептида Lys-Glu-AspTrp-NH2 дозволяють рекомендувати його профілактичне і/або лікувальне застосування як засіб, що регулює рівень глюкози, для лікування цукрового діабету. Наведені нижче результати клінічного вивчення заявленого тетрапептида демонструють його фармакологічні властивості і підтверджують можливість здійснення винаходу. Приклад 8. Ефективність застосування тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у хворих цукровим діабетом Дослідження проведене у 36 хворих у віці від 16 до 83 років (7 чоловіків, 29 жінок). У 23 хворих виявлений діабет типу 1, у 13 - тип у 2. Тривалість захворювання коливалася від 1 року до 30 років. 12 32 хворих одержували інсулін. Більшість хворих із цукровим діабетом надходили в стаціонар у стадії декомпенсації. Вміст глюкози в крові натще коливалося від 9,5 до 27мкмоль/л; рівень глікозильованого гемоглобіну - від 7,8 до 12,7%. Всім хворим була призначена сувора дієта. Методом стратифікаційної рандомізації всі хворі були розділені на 2 групи за віком, статтю, тривалістю і важкості захворювання (таблиця 7). Додатково до стандартного лікування 16 хворим цукровим діабетом був призначений тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозі 10мкг (в 1мл 0,9% розчину NaCl) внутрішньом'язово щодня однократно протягом 10 діб. 4 хворим цукровим діабетом типу 2 додатково до стандартного лікування був призначений тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у дозі 100мкг (1 таблетка) 2 рази на день перед їжею щодня протягом 10 діб. Пацієнти контрольної групи одержували як плацебо по 1мл 0,9% розчину NaCl за аналогічною схемою. Результати вивчення ефективності тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 наведені в таблиці 8. У 8 хворих (з 16, що отримували інсулін) після завершення курсу тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 щоденна доза інсуліну була знижена в середньому на 8 ОД, і при цьому досягнута компенсація. У 6 хворих доза інсуліну залишилася попередньою, і при цьому досягнута компенсація. І тільки у 2 хворих для досягнення компенсації доза інсуліну була збільшена: у одного на 4 ОД, у другого на 14 ОД. У той же час, у контрольній групі (з 16, що отримували інсулін) тільки у 2 пацієнтів доза інсуліну для досягнення компенсації залишилася попередньою, а у 14 хворих для досягнення компенсації доза інсуліну була збільшена на 4-8 ОД. У хвори х цукровим діабетом типу 2 (1 хворий) і типу 1 (3 хворих) основної групи, які щодня одержували тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 у таблетованій формі, відзначене зниження дози інсуліну на 25 ОД, а у хворих, які одержували пероральні антидіабетичні препарати, вдалося досягти повної компенсації зі зменшенням дози препаратів практично в 2 рази. Таким чином, застосування тетрапептида LysGlu-Asp-Trp-NH 2 у хворих цукровим діабетом сприяло підвищенню чутливості тканин до інсуліну і деякого відновлення функції підшлункової залози. Необхідно відзначити досить високу ефективність тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, що проявлялося у зниженні дози інсуліну у 50% обстежуваних пацієнтів, у той час як у контрольній групі подібного ефекту в жодного хворого досягти не вдалося. Як приклади приводимо 3 короткі витяги з історій хвороби: Витяг з історії хвороби №1. Хвора К., 69 років, інвалід 2-ої групи. Хвора цукровим діабетом протягом 17 років. З 1986р. одержувала таблетовані антидіабетичні препарати, з 1996р. переведена на інсулін: При обстеженні виявлені пізні діабетичні ускладнення. Діагноз: Цукровий діабет типу 2, вторинна інсулінорезистентність, діабетична ретинопатія, полінейропатія, діабетична нефропатія, симптоматична гіпертензія. 13 85204 При надходженні в стаціонар: вміст глюкози в крові натще - 10мкмоль/л, через 2г після їжі 14мкмоль/л. Клінічний аналіз крові - норма, у сечі білок - до 0,66г/л, на EKГ відзначена гіпертрофія лівого шлуночка. Щоденна доза інсуліну - 82 ОД. Терапія: дієта, вітаміни групи В, берлітіон, парентеральна форма фармацевтичної композиції, що включає тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, по 10мкг внутрішньом'язово щодня протягом 10 діб. При виписці на 18 добу - вміст глюкози в крові натще - 5,9мкмоль/л. Щоденна доза інсуліну - 56 ОД (зниження на 26 ОД у порівнянні з вихідним рівнем). У хворої відзначене значне поліпшення показників коагулограми. Витяг з історії хвороби №2, Хворий M., 40 років, інвалід 2-ої групи. Хворий цукровим діабетом протягом 13 років і із часу початку захворювання постійно одержує інсулін. Діагноз: Цукровий діабет типу 1 середнього ступеня важкості, діабетична ретинопатія, полінейропатія, енцефалопатія. При надходженні у стаціонар: вміст глюкози в крові натще -17,8мкмоль/л. Клінічний аналіз крові і сечі - норма. Щоденна доза інсуліну - 40 ОД. Терапія: дієта, вітаміни групи В, парентеральна форма фармацевтичної композиції, яка включає тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH2, по 10мкг внутрішньом'язово щодня протягом 10 діб. 14 При виписці на 15 добу - вміст глюкози в крові натще -3,4мкмоль/л. Щоденна доза інсуліну - 32 ОД (зниження на 8 ОД у порівнянні з вихідним рівнем). Витяг з історії хвороби №3. Хвора Л., 83 роки. Хвора цукровим діабетом протягом 25 років, одержувала різні антидіабетичні таблетовані препарати. Суворого дотримується дієти, почуває себе задовільно. Діагноз: Цукровий діабет типу 2, діабетична ретинопатія. При надходженні в стаціонар: вміст глюкози в крові натще - 11мкмоль/л. Клінічний аналіз крові і сечі - норма. Приймає щодня по 2 таблетки діабетона. У зв'язку з розвиненою резистентністю до таблетованих антидіабетичних препаратів рекомендоване введення інсуліну. Однак хвора відмовилася від інсуліну, після чого їй була призначена пероральна форма фармацевтичної композиції, що включає тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2, по 100мкг (1 таблетка) 2 рази на день до їжі щодня протягом 10 діб на фоні застосування 2 таблеток діабетона. На 2-й день вміст глюкози в крові натще - 6мкмоль/л. Далі доза діабетона була зменшена в 2 рази. Послу завершення зазначеного курсу лікування тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp-NH 2 рівень глюкози в крові залишався практично в межах норми. Стан хворої задовільний. 15 85204 16 17 85204 18 19 85204 20 21 Комп’ютерна в ерстка Т. Чепелев а 85204 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601