Спосіб отримання позаклітинного дифтерійного антигена

Спосіб отримання позаклітинного дифтерійного антигену шляхом культивування токсигенного штаму Corynebacterium diphtheriae PW-8 у рідкому живильному середовищі, який відрізняється тим, що використовують іммобілізовану на діетиламіноетилцелюлозі (ДЕАЕ-целюлозі) попередньо оброблену 0,08-0,12% етилендіамінтетраацетатом натрію (ЕДТА-Nа2) культуру; культивування С. diphtheriae PW-8 проводять на живильному середовищі, виготовленому на основі відходів гамаглобулінового виробництва в присутності 40-60 мкг/мл бензилпеніциліна. (19) (21) 2000052925 (22) 23.05.2000 (24) 15.06.2001 (33) UA (46) 15.06.2001, Бюл. № 5, 2001 р. (72) Щетініна Валентина Миколаївна, Ніколаєнко Вероніка Миколаївна, Альсабан Абдулхакім, YE, Тарасов Олександр Андрійович, Клиса Тетяна Леонідівна (73) Харківський науково-дослідний інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова 39348 Суттєвими ознаками запропонованого способу є використання прийомів, що служать оптимізації процесу токсиноутворення: 1. Використання преобробленої 0,08-0,12% етилендіамінтетраацетатом натрію (ЕДТА-Nа2) та іммобілізованої на діетиламіноетилцелюлозі (ДЕАЕ-целюлозі) культури. 2. Використання живильного середовища, розробленого спеціально для токсиноутворення С. diphtheriae на основі відходів гамаглобулінового виробництва (Пат. № 96041475). 3. Використання добавок бензилпеніциліну в кількості 40-60 мкг/мл з метою стимулювання продукції флокулюючого антигену С. diphtheriae та стабілізації іммобілізованої форми. Ознаки 1-3 є достатніми у всіх випадках, що доводиться нижче наведеними даними. Доведено, що приєднання клітин до твердої основи дає можливість стимулювання певних ланок метаболізму, яке дозволяє оптимізувати технології одержання позаклітинних речовин [Anderson J.C. Immobilized cell physiology // Proc. Eng. Asp. Immobilized cell sys. - 1986 – V 9., № 1. P. 153-176; Cainer J. Z. Immobilization of Microorganisms // Ann. N.J.Acad. See. - 1986. – V 147. – P 465-467]. В способі, що пропонується, як носій використовується діетиламіноетилцелюлоза (ДЕАЕцелюлоза). Доцільність вибору цього носія встановлено експериментально, дані з порівняльної характеристики різних способів іммобілізації С. diphtheriae наведені в табл. 1. Як видно із приведених даних, найбільша щільність іммобілізації із збереженням життєздатності, що оцінювалась за показником дегідрогеназної активності, має місце при використанні ДЕАЕцелюлози. Відомо, що оптимізація технологічних процесів, заснованих на іммобілізованих клітинах, часто досягається використанням частково пошкоджених клітин, які, однак, не втратили необхідні метаболічні послідовності або життєздатність [Saburo Fukui, Atsuo Tanaka. Immobilized microbial cells.// Ann.Rev.MicrobioL - 1982. - v. 36. - P. 145-172]. Порівняльна ефективність використання різних пошкоджуючих речовин на здатність С. diphtheriae до продукції позаклітинного антигену наведена в табл. 2. Дані табл. 2 доводять, що здатність до задовільної продукції флокулюючих антигенів після проведеної преобробки стимулюється тільки при використанні ЕДТА. В роботі використовувалась комерційна динатрієва сіль етилендіамінтетраацетат: C10H14O8N2Na2 x 2H2O Було визначено оптимальну концентрацію ЕДТА (табл. 3). Як видно із приведених результатів, найбільшою мірою вихід флокулюючого антигену відбувається при преобробці клітин С. diphtheriae в діапазоні концентрацій ЕДТА 0,08-0,16%, а більш високі концентрації преоброблюючого агента не сприяють досягненню ефекту. Відомо, що присутність в середовищі бактеріостатичних концентрацій пеніциліну сприяє утворенню позаклітинних антигенів (токсинів) [Кушнарёв В.М., Смирнова Г.А., Ильинская Е.А., Лобанова A.H. Электронномикроскопическое изучение дифтерийных бактерий в процессе токсинообразования // ЖМЭИ. - 1978. - № 6. - с. 12-17; Кушнарёв В.М., Иващенко В.И., Смирнова Г.А., Лобанова А.Н. и др. Ультраструктура и токсинообразование Corynebacterium diphtheriae PW-8 при культивировании в присутствии пенициллина // ЖМЭИ. 1973. - № 9. - с. 25-30]. Результати, що підтверджують доцільність добавок бензилпеніциліну для оптимізації продукції флокулюючого антигену іммобілізованою формою, приведені в табл. 4. Як видно із приведених даних, добавка бензилпеніциліна в суббактеріостатичних концентраціях (40-60 мкг/мл) стимулює продукцію антигену, що вступає в реакцію флокуляції, і може розглядатись як фактор, що сприяє стабільності іммобілізованої культури, перешкоджаючи виходу мікроорганізмів в середовище культивування. Результати, що були одержані у наведених вище експериментах, дозволили визначити такі параметри способу одержання флокулюючого антигену С. diphtheriae: - носій для іммобілізації - ДЕАЕ-целюлоза; - реагент для преобробки – ЕДТА-Nа2 в концентрації 0,08-0,12; - добавка бензилпеніциліну - 40-60 мкг/мл; - середовище культивування - середовище, виготовлене на основі відходів гама-глобулінового виробництва (Пат. № 96041475). Спосіб одержання фільтратів, що містять позаклітинний флокулюючий антиген, з використанням іммобілізованої С. diphtheriae здійснюється в три етапи: 1. Преобробка клітин С. diphtheriae; 2. Іммобілізація преоброблених клітин С. diphtheriae на ДЕАЕ-целюлозі; 3. Одержання фільтратів, що містять флокулюючий антиген С. diphtheriae. 1. Преобробка клітин С. diphtheriae. С. diphtheriae вирощують на щільному середовищі. 24-годинну культуру змивають 0,08-0,12% водним розчином ЕДТА-Nа2 і готують суспензію з щільністю 15-20 млрд/мл. Суспензію витримують при кімнатній температурі 1-2 год., після чого відмивають 1/15 M Na-K фосфатним буфером рН 6,8. 2. Іммобілізація преоброблених клітин С. diphtheriae на ДЕАЕ-целюлозі. Відмиті преоброблені клітини С. diphtheriae іммобілізують на ДЕАЕ-целюлозі за відомим методом [Д.Ф. Кеннеди, И.А. Кабрал. Иммобилизация биокатализаторов металлохелатным методом / В кн. Иммобилизованные клетки и ферменты. - М.: Мир, 1988. - 215 c]. Целюлозу з іммобілізованими клітинами зберігають в холодильнику. 3. Одержання фільтратів, що містять флокулюючий антиген С. diphtheriae. Іммобілізовану культуру поміщають в рідке живильне середовище, виготовлене за патентом № 96041475 з вмістом амінного азоту 180 мг%, вносять бензилпеніцилін із розрахунку 40-60 мкг/мл і витримують в термостаті при t 37°С протягом 120 год., контролюючи процес наростання титрів Lf щодобово (табл. 5). Як видно із приведених даних, використання іммобілізованої форми дає більш високий титр реакції флокуляції (45-56 Lf) i накопичення відбувається раніше, ніж у вільної культури. 2 39348 Прозору рідину відділяють від іммобілізата, фільтрують через стерилізуючі пластини фільтра Зейтца і використовують в роботі. Приклад № 1 Штам С. diphtheriae PW-8 (ізолят № 667) засіяно газоном на чашку Петрі з середовищем, виготовленим за Пат. № 96041475. Посів проінкубовано 24 год. в термостаті при t 35°С, після чого змито 0,085% розчином ЕДТА-Nа2. Об'єм змитої культури становив 10 мл, оптична щільність за стандартом каламутності - 16 млрд/мл. Клітини залишили при кімнатній температурі 1 год., після чого відділили від рідкої фази центрифугуванням при 6000 g, відмили двічі 1/15 М K-Na фосфатним буфером рН 6,8. Відмиту преоброблену культуру іммобілізували на ДЕАЕ-целюлозі. Для цього відмиту культуру ресуспендували в 10 мл 1/15 М K-Na фосфатного буфера рН 6,8 i з'єднали з 2 см^3 ДЕАЕ-целюлози, приготованій в аніонітній формі і урівноваженій тим же буфером (Аналитические методы белковой химии // Под ред. В. Ореховича. - М.: Издательство иностранной литературы.-1963. - 643 с.). Суміш розмішали i залишили при кімнатній температурі 1 год. збовтуючи протягом перших 30 хвилин. Через 1 год. вміст пробірки просвітлішав. Надосадову рідину злили, ДЕАЕ-целюлозу з іммобілізованими клітинами помістили в живильне середовище, виготовлене за Пат. № 96041475. Об'єм середовища - 50 мл, вміст амінного азоту - 148 мг%, вміст бензилпеніциліна - 40 мкг/мл. Суміш витримали при t 35°С 96 год., контролюючи наростання титру Lf. Кінцевий титр 48 Lf. Прозору рідину злили з іммобілізованої культури i використали в роботі. Приклад № 2 С. diphtheriae шт. PW-8 (ізолят № 195) виростили на чашках Петрі на кров'яному агарі. 24годинну культуру змили 0,098% ЕДТА-Nа2, витримали при кімнатній температурі 1 год.; відділили клітини від рідкої фази центрифугуванням при 6000 g i двічі відмили 1/15 М K-Na фосфатним буфером рН 6,8. Клітини іммобілізували на ДЕАЕ-целюлозі як описано вище. Іммобілізовану культуру помістили в живильне середовище, виготовлене за патентом № 96041475 з вмістом бензилпеніциліна 50 мкг/мл. Інкубація в термостаті тривала 96 год. Кінцевий титр Lf - 39 Lf. Приклад № 3 Клітини С. diphtheriae шт. PW-8 (ізолят № 155) вирощені на чашках Петрі з агаризованим середовищем, виготовленим за патентом № 96041475 змили 10 мл 0,12% ЕДТА-Nа2. Щільність суспензії – 16,3 млрд/мл. Суспензію витримали при кімнатній температурі 1 год., відмили та іммобілізували, як в попередніх прикладах. Іммобілізовану культуру перенесли в 50 мл середовища, виготовленого за патентом № 96041475 з вмістом бензилпеніциліна 60 мкг/мл. Інкубація тривала 96 год. Кінцевий титр Lf - 47 Lf. Таблиця 1 Підбір носіїв для іммобілізації С. diphtheriae. Носій 1 Активоване вугілля Пемза, активована CrCl3 Хлорид титана Тип зв’язку мікроб-носій, що має місце % іммобілізації Corynebacterium diphtheriae в 2 3 4 Дегідрогеназна активність (показник життєздатності) мкг дфф/млрд.год 5 адсорбція 10-13 4,8 0,010 3 доби хелатний зв’язок 6,0 2,6 0,005 5 діб хелатний зв’язок 100 80-85 0,000 15-20 10-12 0,015 Весь час спостереження (1 міс.) 3 доби 20-30 15-20 0,004 3 доби 56-65 61,5 0,038 Весь час спостереження (1 міс.) 100 100 0 Целюлоза адсорбція Целюлоза, акхелатний тивована зв’язок FeCl3 Діетиламіноетилцелюлоза (ДЕАЕІонний зв’язок целюлоза в аніонітній формі) ПоліакріламіВключення в дний гель гель (ПААГ) тфф-трифенілформазан 3 Стабільність при зберіганні в холодильнику 6 39348 Таблиця 2. Дія пошкоджуючих речовин на здатність С. diphtheriae до іммобілізації і продукція флокулюючого антигену пошкодженою культурою С. diphtheriae Пошкоджуюча речовина ЕДТА етилендіамінтетраацетат ДСН додецилсульфат натрію Хлороформ Пеніцилін Контроль 0,1% Здатність до іммобілізації (% іммобілізації) 57% 0,1% Продукція флокулюючого антигену [по годинах] 24 48 72 96 120 33% Концентрація 1-2 краплини на 2мл культури 16 млрд/мл 50 мг/мл культури 15 млрд/мл необроблена культура 16 Lf 32 Lf 48 Lf 10 Lf 12 Lf 54% антиген не утворюється 56% антиген не утворюється 65% 12 Lf 16 Lf Таблиця 3. Накопичення антигену, здатного вступати в реакцію флокуляції, іммобілізованою С. diphtheriae, преобробленою різними концентраціями ЕДТА. Концентрація преоброблюючого агента (ЕДТА),% 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,16 0,18 0,20 0,25 Накопичення антигену, Lf/мл. Тривалість експозиції. [по годинах] 24 48 72 96 5 10 5 8 18 12 5 10 12 15 12 30 12 30 12 32 антиген не утворюється антиген не утворюється антиген не утворюється 22 16 12 15 36 46 46 Таблиця 4. Накопичення позаклітинного антигену С. diphtheriae іммобілізованою формою культури в присутності бензилпеніциліну. Концентрація антибіотика мкг/мл 25 40 50 60 75 100 без антибіотика Титр антигену в реакції флокуляції, Lf/мл Тривалість культивування [по годинах] Вигляд культури 24 48 72 72 год.-частковий вихід ку12 36 38 льтури з носія 36 38 40 надосадова рідина прозора 38 38 42 надосадова рідина прозора 32 36 40 надосадова рідина прозора 10 11 надосадова рідина прозора надосадова рідина прозора 72 год.-часткове 16 28 від’єднання культури від носія 4 39348 Таблиця 5. Наростання титрів флокулюючого антигену в досліді. Тривалість культивування, год. 24 48 72 96 120 Титр флокулюючого антигену, Lf/мл вільна культура на бульйоні іммобілізована культура Мартена (прототип) Флокуляція відсутня Флокуляція відсутня 28 Флокуляція відсутня 30 Флокуляція відсутня 45 16 45-56 38 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5