Спосіб отримання протективного кашлюкового антигену

Спосіб отримання протективного кашлюкового антигену із застосуванням ультразвукових коливань низьких частот та подальшим фракціонуванням, який відрізняється тим, що культури бактерій кашлюку дезінтегрують ультразвуковими хвилями з частотою 60 кГц, потужністю 5 Вт/см2 впродовж не менш ніж 7 годин, ультрацентрифугують при 12 тис. об./хв. - 18000 g впродовж 1 години та виділяють фракцію з молекулярною вагою 8,1 кДа із застосуванням гель-хроматографії. (19) (21) u201008396 (22) 05.07.2010 (24) 27.12.2010 (46) 27.12.2010, Бюл.№ 24, 2010 р. (72) БАБИЧ ЄВГЕН МИХАЙЛОВИЧ, ВОЛЯНСЬКИЙ ЮРІЙ ЛЕОНІДОВИЧ, ЄЛИСЕЄВА ІРИНА ВІТАЛІЇВНА, ІСАЄНКО ОЛЕНА ЮРІЇВНА, ВОЛЯНСЬКИЙ АНДРІЙ ЮРІЙОВИЧ, КУЧМА ІРИНА ЮРІЇВНА, АНТУШЕВА ТЕТЯНА ІВАНІВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ" 3 56103 4 Потім позбавляються двох останніх антигенів, а кашлюкових антигенів без додаткового застосупертактин піддають хроматографії [18]. Недолікавання будь-яких речовин. ми даного методу є застосування хімічних речовин Відомо отримання протективного антигену та багатоступеневі операції очищення. (М.С. Захарова с соав. Методы получения и эксОписаний також ряд технологій одержання периментальное изучение основных биологичеспротективних кашлюкових антигенів, котрі передких свойств защитных антигенов коклюшного микбачають застосування ультразвукової дезінтеграроба) із 48-годинної культури кашлюку за ції мікробних клітин. Вони мають певні переваги допомогою високочастотного ультразвуку. Опронад хімічними технологіями виділення антигенів, а мінення 500 млрд. суспензії В.pertussis ультразвусаме: реалізуються в стандартних умовах, виклюком здійснювалось в режимах: статичному - безчають необхідність операцій по очищенню виділеперервному (1000 кГц, 210 Вт, по 10 секунд 20 них антигенних комплексів від екстрагентів, дозворазів з інтервалом 2-3 хвилини) та імпульсному ляють контрольовано здійснювати руйнування (1000 кГц, 500 Вт, по 12 секунд 10 разів). До 19 мікробних клітин в залежності від параметрів чинчастин опроміненої мікробної суспензії додавали 1 ника [19]. При цьому розкривається перспектива частину розчину Ігла, витримували 24 години при одержання хімічно не змінених антигенів з висотемпературі 6-8 °С, центрифугували 2 години при кою протективною активністю. 3000 об/хв. З'єднували 30 частин центрифугату з 1 Так, в роботі К.П. Москаленко з спів, пропонучастиною строми еритроцитів людини на водяній ється руйнування мікробних клітин в діапазоні ульбані 37 °С впродовж 2 годин, центрифугували 2 тразвукових частот 42-50 кГц, фільтрування дезінгодини при 3000 об/хв. Надосадову рідину залитеграту, витримування антигенного матеріалу з 1% шали, а осад доводили до початкового об'єму глірозчином дезоксіхолату натрію та виділення розцин -фосфатним буфером (9 частин 0,3 М гліцину чинних антигенів сірчанокислим амонієм (до 30 %) та 1 частина М/15 фосфатного буферу), рН=7,4, [20]. який містив мертиолят у співвідношенні 1:10000 В патенті Москаленко К.П і співав. "Способ по[23]. Застосування високочастотного ультразвуку лучения протективного коклюшного антигена" задозволяє отримати антигени, захисна активність пропонована технологія виділення протективного яких, при інтрацеребральному зараженні мишей кашлюкового антигену на основі синтетичного новірулентною культурою, находиться в межах 61,1сія. Дезінтеграцію 72-годинних мікробних клітин 66,6 % тварин, що вижили в залежності від режиму здійснювали низькочастотним ультразвуком впрообробки. довж 5 хвилин, діалізували в целофановому мішку Ознаками, що збігаються з суттєвими ознака(розміри пор 40-60 Å) проти попередньо озвученоми рішення, яке заявляється, є використання ульго протягом 5 хвилин 0,15 М розчину хлориду натразвукового опромінення для дезінтеграції мікротрію на холоду (при температурі 3-6 °С); струшубних клітин В. pertussis, центрифугування та вали в шуттель - апараті чотири доби, кожного дня однаковий рівень імуногенних властивостей отриобробляючи матеріал по 5 хвилин ультразвуком. маних антигенів. Отриманий кашлюковий антиген в дозі 0,05-0,1Отриманню бажаного технічного результату 0,2мкг по білку володів низькими протективними перешкоджають наступні моменти: властивостями та захищав не більше 15 % щепI) здійснення методу передбачає використання лених лабораторних тварин. Суттєвими ознаками строми еритроцитів, що заважає отриманню натицього методу є додавання до 0,1 мкг по білку провних антигенів, а також сприяє додатковому наватективного антигену 0,1 мкг синтетичного поліелентаженню організму при щепленні; ктроліту - поліоксідонію, розчиненого в фосфатноII) на відміну від рішення, що заявляється, му буфері, перемішування в магнітній мішалці спосіб забезпечує отримання реактогенних антивпродовж 20 хвилин при температурі 37 °С, вигенів. тримування в рефрижераторі 3 години при темпеВ основу корисної моделі поставлено задачу: ратурі 3-6 °С, фільтрування скрізь фільтр з розмірозробити спосіб одержання протективного кашром пор 0,45 мкм. Отримання коньюгованого люкового антигену, в якому за рахунок добору оппротективного кашлюкового антигену на основі тимальних умов дезінтеграції низькочастотним синтетичного носія - поліоксідонію, характеризуультразвуком забезпечити можливість одержання ється високими імуногенними властивостями (винативних нетоксичних антигенів із мікробних клітин живаність 95 %) [22]. збудника кашлюку. Ознаками, що збігаються з суттєвими ознакаСуттєвими ознаками запропонованого способу ми рішення, яке заявляється, є використання низьє використання прийомів: кочастотного ультразвукового опромінення, однак - дезінтеграція кашлюкових клітин низькочасвідсутність частоти та потужності застосованого тотним ультразвуком з частотою 60 кГц, потужнісприладу, а також невизначеність ступеню руйнутю 5 Вт/см2 «впродовж не менш ніж 7 годин»; вання кашлюкових клітин ускладнює порівняння - ультрацентрифугування дезінтеграту при ефектів дезінтеграції. Відсутність в описі даних 12тис. об./хв. - 18000 g впродовж 1 години для прояви токсичних властивостей отриманого антизбільшення питомої ваги протективної фракції; гену унеможливлює порівняння реактогенності - фракціонування гель-хроматографією суперантигенів. натанту з метою очищення протективної фракції з Недоліками зазначеного методу є багатостумолекулярною вагою 8,1 кДа. пеневі операції очищення, необхідність в додаткоІ) В способі, що пропонується в якості джерела вому обладнанні та застосування синтетичного ультразвукового опромінення використовується носія, який перешкоджає отриманню нативних низькочастотний генератор Г3-109 з робочою час 5 56103 6 тотою 60 кГц та низькою енергетичною потужністю б) опромінення впродовж 6 годин викликає до5 Вт/см2. Тривалість опромінення у способі, що стовірно нижчий дезінтегруючий ефект у порівнянзаявляється, визначено як часова експозиція ні з 7 годинною експозицією; «впродовж не менш ніж 7 годин», оскільки: в) подальше збільшення тривалості опроміа) при експозиції менше 6 годин дезінтеграція нення (8 годин) не призводить до статистично знаклітин В. pertussis не відбувається; чущого збільшення відносної кількості виділених білкових комплексів і на характер отриманого технічного результату не впливає (Таб. 1). Таблиця 1 Ступінь руйнування клітин В. pertussis після дезінтеграції ультразвуком у низькочастотному діапазоні (60 кГц) Час озвучення, години 4 5 6 7 8 Контроль Середні показники (М±m) Оптична щільність суспензій, McF 1,0 1,0 0,95 0,9 0,9 1,0 II) Дезінтеграт піддаємо ультрацентрифугуванню при 12 тис. об./хв. - 18000 g впродовж 1 години, що дозволяє збільшити питому вагу фракції з молекулярною масою 8,1 кДа, яка володіє оптимальними параметрами імуногенності та реактогенності, на 23,7 % (Таб. 2). III) Фракціонування супернатанту проводимо методом гельхроматографії на колонці, заповненій гелем TSK-GEL TOYOPEARL HW-60 Fine. В якості елюенту використовуємо фосфатно-сольовий бу Білок, мкг/мл 4,3±0,1 4,5±0,1 15,3±0,2 20,3±0,1 20,5±0,03 3,9±0,2 фер (Na2HPO4/NaH2PO4 - 30 ммоль/л, NaCl 100ммоль/л (рН 7,4)). Швидкість рухливої фази становить 1,7 мл/хв. Розділення супернатанту збудника кашлюку дозволяє виділити із суміші антигенів протективну фракцію з молекулярною масою ~8,1 кДа, питома вага якої, після етапу ультрацентрифугування, складає 86,2 % (Табл. 2). Таблиця 2 Питома вага фракцій, виділених із мікробних клітин дезінтеграту В. pertussis в режимі озвучення низькочастотним ультразвуком (60 кГц) Характеристика фракцій дезінтеграт до ультрацентрифугування дезінтеграт після ультрацентрифугування молекулярна маса, питома вага фракцій, (М±m), молекулярна маса, питома вага фракцій, (М±m), кДа % кДа % ≥1000 6,6±2,4 ≥1000 4,3±1,6 ~8,1 62,5±9,1 ~8,1 86,2±4,6 ~3,0 13,0±4,4 ~3,0 3,4±1,3 1,5 10,4±3,6