Біохімічний синтез 1,4-бутандіаміну

1. Спосіб біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну в мікроорганізмі, який має підвищений рівень активності орнітиндекарбоксилази (підвищена активність ODC) у порівнянні з нативним рівнем орнітиндекарбоксилазної активності, який відрізняється 2 (19) 1 3 91686 4 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що з родів, вибраних із групи, яка складається з Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia і надекспресований ген, який кодує агматиназу, є Shewanella. геном speB агматинази, що походить від одного з 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що навидів, вибраних із групи, яка складається з декспресований ген, який кодує орнітиндекарбокEscherichia coli, Shigella enterica, Proteus mirabilis, силазу, є геном орнітиндекарбоксилази, що похоPhotorhabdus lunimescens. Vibrio cholerae і дить від одного із видів, вибраних із групи, яка Neisseria meningitidis. 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що складається з Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis і Shewanella надекспресований ген, який кодує агматиніміногідoneidensis. ролазу та/або надекспресований ген, який кодує 10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що агматиніміногідролазу та/або надекспресований надекспресований ген, який кодує орнітиндекарбоген, який кодує Nксилазу, є геном speF, що походить від одного з карбамоїлпутресцинамідогідролазу, є геном agu видів, вибраних із групи, яка складається з агматиніміногідролази та/або геном aguB NEscherichia coli, Salmonella typhimurium і карбамоїлпутресцинамідогідролази, що походить Shewanella oneidens. від родів, вибраних з групи, яка складається з 11. Спосіб за будь-яким із пп. 1-10, який відрізняPseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, ється тим, що додатково до збільшеної активності Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium і орнітиндекарбоксилази одержують також збільшеBacillus. 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що ну активність для принаймні двох ферментів, за допомогою надекспресії або (і) гена speA, який надекспресований ген, який кодує агматиніміногідкодує аргініндекарбоксилазу (яка належить до КФ ролазу та/або надекспресований ген, який кодує 4.1.1.19), і гена speB, який кодує агматиназу (яка N-карбамоїлпутресцинамідогідролазу, є геном agu належить до КФ 3.5.3.11), який також називають агматиніміногідролази та/або геном aguB Nгеном, що кодує агматинуреагідролазу, або (іі) карбамоїлпутресцинамідогідролази, що походить гена speA, який кодує аргініндекарбоксилазу (яка від одного з видів, вибраних із групи, яка складаналежить до КФ 4.1.1.9) та гена aguA, який кодує ється з Pseudomonas aeruginosa. Streptococcus агматиніміногідролазу (яка належить до КФ mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter 3.5.3.12), який також називають геном, що кодує vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium агматиндеіміназу, та гена aguB, який кодує Naromaticivorans і Bacillus cereus. 18. Спосіб за будь-яким із пп. 1-17, який відрізнякарбамоїлпутресцинамідогідролазу (яка належить ється тим, що він проводиться при забезпеченні до КФ 3.5.1.53), і необов'язково також гена speB, який кодує агматиназу (яка належить до КФ 15 підвищеного внутрішньоклітинного рівня орні3.5.3.11). тину. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що 19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, який відрізняється тим, що його проводять в мікроорганізмі, надекспресований ген, який кодує аргініндекарбоксилазу, є геном speA аргініндекарбоксилази, який вибраному із групи, яка складається з походить від одного із родів, вибраних із групи, яка Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium складається з Escherichia, Shigella, Salmonella, sp., Escherichia sp. і Pichia sp. 20. Спосіб за будь-яким із пп. 1-19, який відрізняYersinia, Pasteurella і Neisseria. 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що ється тим, що його проводять в мікроорганізмі, надекспресований ген, який кодує аргініндекарбовибраному із групи, яка складається з ксилазу, є геном speA аргініндекарбоксилази, що Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp., походить від одного з видів, вибраних із групи, яка Escherichia sp., причому мікроорганізм має збільскладається з Escherichia coli, Shigella flexneri, шений рівень активності орнітиндекарбоксилази, а Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella також щонайменше рівень активності аргініндекаmultocida і Neisseria meningitidis. рбоксилази в поєднанні з активностями агматина14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що зи та/або агматиніміногідролази і Nнадекспресований ген, який кодує агматиназу, є карбамоїлпутресцинамідогідролази є збільшеним геном sреВ агматинази, що походить від одного з у порівнянні з нативним рівнем вказаної активності родів, вибраних із групи, яка складається з мікроорганізма. Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio і Neisseria. Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до нового способу біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну (номер CAS 110-60-1; сполука позначається також як тетраметилендіамін; у біохімічній літературі частіше називається путресцином) у мікроорганізмі, який має підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності в порівнянні зі звичайно властивим рівнем орнітиндекарбоксилазної активності. Орнітиндека рбоксилазу нижче ми будемо позначати як «ODC». «Підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності» нижче будемо позначати як «підвищений рівень активності ODC». Відомо, що в основному мікроорганізми, які мають активність ODC, здатні виробляти поліаміни, такі як спермідин і спермін (загальноприйняті назви для продуктів N-(-3амінопропіл)-1,4-бутандіамін та Ν,Ν'-біс-(3амінопропіл)-1,4-бутандіамін відповідно). Такі спо 5 91686 6 луки, також як і самі різноманітні короткі лінійні зворотного зв'язку ODC антизимами, і цьому мождіаміни, такі, наприклад, як 1,4-бутандіамін і 1,5на запобігти шляхом надпродукції придатного анпентандіамін (який називають також кадаверином) тизима. Така надпродукція антизимів буде потім у біохімічних дослідженнях часто називають полізнижувати продукцію поліамінів у клітинах і, таким амінами, хоча виходячи з точного хімічного визначином, цей шлях не є реально можливим для прочення поліамінів варто було б очікувати більшого дукції 1,4-бутандіаміну. числа аміногруп. Однак для цілей даної патентної Крім того, як описали Кашівагі зі співавт. заявки буде застосовуватися термін поліаміни в (Kashiwagi et al., J. Bacteriol. т. 170 (1988) стор. його біохімічному значенні, і таким чином, він 3131-3135), вміст поліамінів в Е. coli може бути включає 1,4-бутандіамін. змінений за рахунок надекспресії гена, який кодує Рівень техніки ODC, зокрема, конститутивно експресованого Сполука 1,4-бутандіамін є важливим вихідним speC. Для цих експериментів при клонуванні була матеріалом для виробництва деяких основних застосована плазміда pODC, вироблена Бойлем із інженерних пластмас: поліаміду-4,6 ефіру або у співавт. (Boyle et al., Methods in Enzymology, т. 94 формі гомополімера, або співполімеризованого, (1983), стор. 117-121). Як показали Кашівагі із спінаприклад, з 5% (за масою) поліамід-6 мономером вавт., навіть 70-разова надпродукція ODC specC (капролактам). Гомополімер поліамід-4,6 (нейлонпри вихідному контролі транскрипції й трансляції 4,6) був описаний ще в 1938 році (US-A-2, 130948, (тобто при застосуванні нативних генетичних елеCarothers). ментів, включаючи сайт зв'язування рибосом Він є продуктом поліконденсації мономерів (RBS) і промотор) призводить лише до невеликого 1,4-бутандіаміну та адипінової кислоти. На сьогодзбільшення рівнів сумарного вмісту поза- і внутріні сполуки поліаміду-4,6 виготовляються й продашньоклітинного 1,4-бутандіаміну. Як можна бачити ються головним чином у Нідерландах під комеріз цитованої роботи Кашівагі із співавт., ці автори не змогли досягти більш високих рівнів продукції ційною назвою STANYL . 1,4-бутандіаміну, ніж 25 мг/л (без підживлення куДля синтезу 1,4-бутандіаміну відомо ряд хімічльтури орнітином). Більше того, вони показали, що них шляхів. Всі ці хімічні способи мають недолік, надпродукція ODC призводить до істотного зменякий полягає у тому, що стартові матеріали повиншення вмісту орнітину в клітинах (приблизно від 65 ні бути отримані із джерел, які розглядаються як мкмоль/л менш ніж до 1 мкмоль/л), і зробили виневідновні. Однак існує реальна потреба в забезсновок, що клітини стають дефіцитними за орнітипеченні новими й придатними способами синтезу ном у випадку надпродукції ODC. Кашівагі із спі1,4-бутандіаміну з відновних джерел вуглецю та у вавт. спробували подолати дане обмеження в застосуванні біохімічних способів (які також назирівні орнітину шляхом підживлення клітин орнітивають «біотрансформацією») у живих клітинах. В ном ззовні, але, хоча невелике покращення й було основному поліаміни розглядаються як токсичні досягнуто, рівні продукції 1,4-бутандіаміну не досполуки для будь-якої клітини або мікроорганізму, сягли більш високих значень, аніж приблизно 30 які застосовуються в біохімічному виробництві. мг/л. Через описане вище обмеження запасу поТаким чином, дотепер вважали, що такі нові шляхи передника при надекспресії ODC і, а оскільки й біохімічного синтезу є непривабливими. більш того, через очікування, що більш високі рівні Це, наприклад, можна бачити з наступних побілків, подібних ODC, будуть викликати зростаючі силань: Fukuchi et al., J. Biol. Chem., т. 270 (1995), ефекти токсичності в клітинах, обумовлені присутстор. 18831-18835; та Suzuki et al., Proc. Natl. Sci. ністю більш високих кількостей поліамінів, фахіUSA, т. 91 (1994), стор. 8930-8934. вець, з точки зору цитованих вище робіт, міг би Фукуші чітко описав зниження життєздатності припустити, що буде неможливо забезпечити споклітин (і синтезу майже всіх видів білків), обумовсоби біохімічного синтезу для продукції 1,4лене акумуляцією спермідину в дефіцитних за бутандіаміну зі значно більш високим рівнем, ніж спермідинацетилтрансферазою клітинах Е. coli 30 мг/мл. (тобто в клітинах, де немає ацетилтрансферази Дотепер ЕР-А-072640 є одним з небагатьох SpeG). Спермідин є продуктом, який у клітинах патентів, які належать до біохімічного синтезу попродукується з 1,4-бутандіаміну, який використоліамінів, включаючи 1,4-бутандіамін. Однак він вується як інтермедіат. Відповідно, біосинтез 1,4описує, між іншим, продукцію 1,4-бутандіаміну бутандіаміну неминуче призводить також до утвошляхом ферментації природних продуктів, які рення спермідину. включають білки як основний компонент. У назваСузукі із співавт., з одного боку, також проденому способі природні продукти спочатку обробмонстрували (на клітинах мишей), що надпродукляли шляхом проведення часткової або повної ція ODC призводить до акумуляції поліамінів, осодеградації, а потім будь-які небажані сполуки (набливо спермідину, і що при додаванні малих приклад, Hg, Cr, As, Cd, Se і Pb), інгібітори росту кількостей спермідину вже спостерігається смерть клітин, пестициди, антибіотики, детергенти, мила, клітин, навіть у клітинах, які не дефіцитні за speG. жири, олії, ціаніди й феноли видаляли до стадії Необхідно відзначити, що Лімсувум із співавт. ферментації. Путресцин та інші діаміни, виготов(Limsuvum et al. J. Bacteriol. т. 182 (2000) стор. лені таким шляхом, повторно застосовуються як 5373-5380) показали, що за низьких температур добрива, але включає таку велику кількість інших таких проблем можна уникнути за рахунок надекссубстратів, що вони можуть бути небажаними як пресії спеціально призначеного гена speG. Сузукі вихідний матеріал для продукції, наприклад, полііз співавт. (цитовано вище) припустили, що за ниаміду-4,6. зьких температур знижена життєздатність клітин обумовлена недостатнім інгібуванням шляхом 7 91686 8 Відповідно залишається необхідність ефектицілих клітин придатних для продукції штамів, але вного біосинтетичного шляху для синтезу 1, 4також чисто біохімічні процеси, що застосовують бутандіаміну зі значно більш високим титром, ніж цілі клітини придатних для продукції штамів. Такі 30 мг/л, бажано навіть без підживлення ззовні дочисто біохімічні способи розглядаються відповідно рогим орнітином. Ця необхідність в поліпшенні як ферментації, у випадку, якщо біохімічний синтез доступності 1,4-бутандіаміну грунтується, головпочинається з придатного джерела вуглецю, або ним чином, на намірі застосовувати його як старрозглядається як ферментації попередника у витовий матеріал, наприклад, для виробництва поліпадку, якщо біохімічний синтез починається від аміду-4,6. В основному, шляхи одержання 1,4проміжного продукту, який вже має вуглецевий бутандіаміну, відомі на сьогоднішній день, досить кістяк, з якого може бути отримана молекулатрудомісткі й клопіткі, і можуть приводити до одемішень, яка повинна бути синтезована. Ці способи ржання кількості названого продукту, яку без додаможуть здійснюватися або в аеробних, або в анаткового очищення важко буде застосовувати у еробних умовах. виробництві нейлону. Відомі хімічні способи одерБіокаталітичні реакції в біохімічних синтезах жання 1,4-бутандіаміну вимагають відносно дороданого винаходу можуть бути проведені або in гих вихідних матеріалів та реактантів (включаючи vivo, або in vitro. В основному, способи in vivo є реактанти, з якими важко поводитися) і щодо жорспособами, здійснюваними в тому випадку, коли стких умов реакції (температура й тиск) із багатосзастосовуються живі клітини (термін «живі клітитадійним та багатореакторним дизайном, а також ни» включає тут також так звані спочиваючі клітизастосування дорогих систем каталізу. Відповідно ни); способи in vitro, з іншого боку, звичайно прозберігається потреба в альтернативних способах водяться із застосуванням лізатів клітин або одержання 1,4-бутандіаміну, бажано з менш доро(частково) очищених ферментів. Відповідно до гих вихідних матеріалів, і усунення проблем поводаного винаходу біохімічний синтез проводиться в дження з реактантами, подібними до цианістоводмікроорганізмі. Це може бути зроблене із застосуневої кислоти. Добре відомо, що природні ванням цілих клітин придатних для продукції штавирощувані й, таким чином, поновлювані матеріамів, але також може здійснюватися із застосуванли із сільськогосподарської продукції є основними ням пермеабілізованих клітин; диференціація між джерелами вуглецю, такого як глюкоза (або інших in vivo і in vitro не має, однак, великого значення придатних джерел вуглецю та їхніх сумішей), які для способів, проведених з пермеабілізованими можуть бути застосовані у ферментації. Такі поноклітинами або з іммобілізованими клітинамивлювані матеріали є відносно дешевими й доступхазяїнами. Однак очевидним буде, що індивідуаними у великих кількостях. В основному, виглядає льні біокаталітичні стадії способу винаходу, коли дуже вигідним, якщо поновлювані матеріали мовони проводяться, наприклад, із застосуванням жуть бути застосовані як вихідний матеріал для іммобілізованих ферментів, тощо, розглядаються одержання всіх видів хімічних матеріалів. як еквіваленти таких стадій у біохімічному синтезі, Таким чином, метою даного винаходу є забезяк це обумовлено в даній заявці. печення покращених можливостей для великомаОрнітиндекарбоксилази (тобто ферменти, які сштабного промислового виробництва 1,4мають орнітиндекарбоксилазну активність, або бутандіаміну шляхом біотрансформації. ODC) є ферментами, які належать до класу Розкриття винаходу К.Ф.4.1.1.17. При суперпродукції рівень активності Несподівано винахідники даного винаходу виODC можна легко порівняти з нативним (тобто не явили, що ця мета досягається із застосуванням надпродукованим) рівнем активності ODC у станнового способу біохімічного синтезу 1,4дартних умовах (при 37°С у присутності орнітину бутандіаміну в мікроорганізмі, який має підвищета PLP) у безклітинних екстрактах, із застосуванний рівень орнітиндекарбоксилазної активності ням у наборі реактивів Sigma Diagnostics для ви(підвищена активність ОДС) у порівнянні з вихідявлення двоокису вуглецю, аналіз описаний у ним властивим рівнем активності ODC, де збільОстермана із співавт. (Osterman, A.L. et al. 1994, шена активність ODC отримана за допомогою наBiochemistry 33, стор. 13662-12667). Фахівець, віддекспресії гена, який кодує ODC, що має повідно, може легко встановити, чи має застосопідвищену транскрипційну та/або трансляційну вувана ODC збільшений рівень активності ODC, ефективність, і що 1,4-бутандіамін, вироблений який ґрунтується на підвищеній транскрипційній таким мікроорганізмом шляхом біотрансформації, та/або трансляційній ефективності в порівнянні з виділяється у ферментаційне середовище, і його вихідним рівнем активності ODC у мікроорганізму, виділяють із ферментаційного середовища. вимірюючи вміст білка або визначаючи рівень Таким чином, відповідно до даного винаходу РНК. Різні стандартні способи визначення вмісту забезпечується поліпшений біохімічний спосіб сибілка, наприклад, колориметричний, а також спекнтезу 1,4-бутандіаміну, і отриманий 1,4троскопічний, описані в Лоттцпейха та Зорбаса бутандіамін чудово підходить як вихідний матері(Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spekctrum ал, наприклад, для виробництва поліаміду-1,6. Akademisher Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN Здійснення винаходу 3-8274-0041-4 (1998), глави 3, 5, 21, 22 і 24). СпоЯк зазначено в даній патентній заявці, термін соби визначення концентрації білка, а також рівня «біохімічний синтез» (термін, який у контексті цієї РНК, наприклад, Нозерн-гібридизація, зворотна патентної заявки розглядається як «біотрансфортранскрипція-ПЦР-аналіз (RT-PCR) і багато інших мація») включає не тільки способи, в яких залучені методів описані Самбруком із співавт. (J. (крім ряду чисто хімічних реакційних стадій) одна Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular або більше біохімічна реакція із застосуванням cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold 9 91686 10 Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-879-309-6, Особливо бажаним є те, що надекспресований 1989). Однак фахівцеві відомі багато інших станген, який кодує ODC, застосований у способі віддартних способів, які можуть бути застосовані у повідно до винаходу, є геном speF або speC, що цій аналітичній галузі, і немає потреби їх згадувати походить з одного з родів, обраних із групи, яка тут. складається з Escherichia, Shigella, Salmonella, Придатними орнітиндекарбоксилазами, які Yersinia i Shewanella. ODC speF є індуцибельною можуть бути застосовані в способі винаходу, є всі ODC, ODC speC є конститутивною ODC. ферменти й їх мутантні форми, які здатні декарбоКраще, коли надекспресований ген, який кодує ксилювати орнітин. Будь-який такий фермент моODC, є геном ODC, що походить з одного із видів, же бути застосований у способі винаходу при підобраних із групи, що складається з Escherichia coli, вищеному рівні активності, тобто у Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia надпродукованій формі, отриманій шляхом надекpestis і Shewanella oneidensis. Більш бажаним, є спресії гена ODC з підвищеною транскрипційною коли надекспресований ген, який кодує ODC, є та/або трансляційною ефективністю. Крім того, геном speF, що походить з одного із видів, обранеобхідно відзначити, що термін «підвищений ріних із групи, що складається з Escherichia coli, вень активності», як він застосовується тут для Salmonella typhimurium і Shewanella oneidensis. будь-якої специфічно названої ферментативної При порівнянні з результатами, отриманими з наактивності, призначений для включення таких сидекспресією конститутивної ODC, геном speC, туацій, де така ферментивна активність, наприякий кодує, безумовно найкращі результати відпоклад ODC, взагалі не представлена в природному відно до винаходу були досягнуті, коли застосовуджерелі мікроорганізму, де реакція має місце, але вали speF. вводиться туди навмисно шляхом генетичної моЗокрема, відповідно до даного винаходу модифікації зі збільшеною транскрипційною та/або жуть бути застосовані всі орнітиндекарбоксилази, трансляційною ефективністю. які мають достатню, тобто, не менше, 30%, або ще Як згадувалося вище, у біохімічному синтезі краще, не менше, 45% і найкраще, не менше, 65% 1,4-бутандіаміну може бути застосований будьідентичність із ODC ферментом порівняння з Е. який фермент ODC, який має збільшену ODC акcoli, і здатні каталізувати ODC реакцію. Відомо тивність, отриманий шляхом надекспресії гена, що багато ODC, які мають такий відносно високий кодує ODC, зі збільшеною транскрипційною та/або рівень ідентичності з ферментом порівняння з Е. трансляційною ефективністю. Краще, коли збільcoli. шена транскрипційна та/або трансляційна ефектиВизначення відсотка ідентичності з ферменвність забезпечується за рахунок застосування том порівняння може бути виконано способами, сильного регульованого промотору, бажано застовідомими фахівцеві, наприклад шляхом застосусуванням сильного індуцибельного промотору. вання білкової послідовності ферменту порівняння Ще краще, якщо збільшена транскрипційна як «послідовності запиту» для виконання пошуку в та/або трансляційна ефективність отримана заопублікованих базах даних, наприклад, ідентифівдяки застосуванню сильного промотору, індукокації інших членів родини або споріднених послідовностей. Такі пошуки можуть бути виконані із ваного ізопропіл- -тіогалакто-піранозидом (IPTG). застосуванням програм BLAST (версія 2.2.) із стаПридатні сильні промотори описані Самбруком із ндартними параметрами відповідної програми. співавт. (J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Дивися: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov. Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Таким чином, відповідно до даного винаходу Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-879забезпечений поліпшений біохімічний спосіб син309-6, 1989). тезу 1,4-бутандіаміну, і отриманий 1,4-бутандіамін Зокрема, збільшена транскрипційна та/або прекрасно підходить як вихідний матеріал для витрансляційна ефективність отримана завдяки заробництва поліаміду-4,6 та/або інших поліамідів. стосуванню промотору, обраного із групи, яка Буде ясно, що (у контексті даного винаходу) включає Т7, Т5, ptac і рlас промотори. Фахівцю будь-який ген, будучи гомологічним до будь-якого буде зрозуміло, що оптимальний вибір промотору з генів, які кодують вищезгадані ODC, і який кодує буде залежати від того, який хазяїн і реакційні ферменти, що мають орнітиндекарбоксилазну акумови будуть застосовуватися. тивність, яка може бути достатньо порівнянною з У кращому втіленні винаходу ген, який кодує показаними орнітиндекарбоксилазами, повинен ODC, має сайт зв'язування рибосом (RBS), розтарозглядатися як їхній еквівалент і як придатний шований вище області, яка кодує названий ген, для способу винаходу. Такі еквівалентні гени моRBS якого адаптований для досягнення кращого жуть бути певним чином отримані за допомогою розпізнавання матричної РНК рибосомами. Адапбудь-якої відповідної стратегії клонування, відомої тація RBS може бути проведена у будь-який, відофахівцеві, наприклад, способами, описаними тут в мий фахівцеві спосіб, і буде враховувати специфіекспериментальній частині. чні властивості застосованого хазяїна тощо. Альтернативно такі еквівалентні гени ODC Краще, коли надекспресований ген, який кодує можуть бути також отримані шляхом цілеспрямоODC, є геном ODC speF або speC (кожний з ферваного конструювання. ментів належить до К.Ф.4.1.1.17). Дотепер у літеУ додатковому кращому втіленні даного винаратурі було більше даних про дослідження SpeC ходу спосіб біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну ніж SpeF. Однак найбільш неочікуваним та найпроводиться в мікроорганізмі, де додатково до більш цікавим виявилось те, що кращі результати ODC активності за допомогою надекспресії одервідповідно до даного винаходу були досягнуті у випадку, коли це був ген ODC speF. 11 91686 12 жують також збільшену ферментативну активність Такі еквівалентні гени можуть бути отримані у віддля,щонайменше, двох інших ферментів, або повідний спосіб за допомогою будь-якої підходя(і) гена speA, який кодує аргиніндекарбоксилащої стратегії клонування, відомої фахівцеві, назу (належить до К.Ф.4.1.1.19), і гена speB, який приклад, способами, описаними тут в кодує агматиназу (належить до К.Ф.3.5.3.11; позекспериментальній частині. Альтернативно такі начається також як ген, який кодує агматинуреагіеквівалентні гени можуть бути також отримані дролазу); або шляхом цілеспрямованого конструювання. (іі) гена speA, який кодує аргиніндекарбоксилаВідповідно в цьому кращому втіленні способу зу (належить до К.Ф.4.1.1.19), і гена aguA, який запропонованого даним винаходом використовукодує агматиніміногідролазу (належить до ються також додаткові комбінації надекспресоваК.Ф.3.5.3.12; позначається також як ген, який кодує них генів, які кодують (і) аргинідекарбоксилазу та агматиндеіміназу), і гена аguВ, який кодує Nагматиназу або (іі) аргиніндекарбоксилазу та агмакарбамоілпутресцинамідогідролазу (належить до тиніміногідролазу й NК.Ф.3.5.1.53), і необов'язково також гена speB, карбамоілпутресцинамідогідролазу, і необов'язкоякий кодує агматиназу (належить до К.Ф.3.5.3.11). во агматиназу. Надекспресія, як її слід розглядати в контексті У цьому додатковому кращому втіленні винаданого опису, для цього додаткового збільшення ходу ген, який кодує надекспресовану аргиніндеферментативних активностей може бути досягнута карбоксилазу, є переважно геном аргиніндекарбоу будь-який спосіб, відомий фахівцеві; наприклад, ксилази speA, який походить із одного з родів, шляхом збільшення транскрипційною та/або транобраного із групи, яка складається з Escherichia, сляційної ефективності відповідного гена, а також Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella і у будь-який інший відомий спосіб, такий як збільNeisseria. Бажано, щоб ген, який кодує надекспрешення кількості копій гена, або шляхом збільшенсовану аргиніндекарбоксилазу, був геном аргиніня ендогенної активності або структури ферментів декарбоксилази speA, який походить від одного з шляхом мутацій, або шляхом застосування деревидів, обраного із групи, яка складається з гульованих ферментів. Як визначено в частині (і) Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella додаткового кращого втілення, вищезгадана комentericar Yersinia pestis, Pasteurella multocida і бінація SpeA і SpeB призначена для подання будьNeisseria meningitidis. якої функціональної комбінації (або в комбіноваЗокрема, відповідно до даного винаходу моному злитому білку, або у вигляді роздільних фержуть бути застосовані всі аргиніндекарбоксилази, ментативних активностей) SpeA і SpeB. Фактично які мають достатню, тобто, не менше, 30%, або ще ця комбінація може бути також позначена як краще, не менше, 45% і найкраще, не менше, 65% SpeAB. Частина (іі) тут відображає, що в таких ідентичність із аргиніндекарбоксилазою з Е. coli комбінаціях SpeA і SpeB сама SpeB частина може (фермент порівняння), здатні каталізувати аргинібути замінена будь-якою функціональною комбіндекарбоксилазну реакцію. Відомо багато аргинінацією (або в комбінованому злитому білку, або у декарбоксилаз, які мають такий відносно високий вигляді роздільних ферментативних активностей) рівень ідентичності з ферментом порівняння з Ε. AguA і AguB. coli. Яновіц із співавт. (Janowitz et al., FEBS Letters У цьому додатковому кращому втіленні вина544 (2003) 258-261) описали, що агматиндеіміназа ходу ген, який кодує надекспресовану агматиназу, AguA залучена в аргиніндекарбоксилазному шляху є геном агматинази speB, який походить з одного з у вищих рослин. Крім того, відомо (Nakada et al., родів, обраних із групи, яка складається з Microbiology, 149 (2003), 707-714), що перетворенEscherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, ня, які каталізуються SpeB, можуть також каталізуVibrio і Neisseria. Більш переважно ген, що кодуватися ферментами, наявними у рослин, а саме: ють надекспресовану агматиназу, є геном агматикомбінованою дією агматиндеімінази AguA і Nнази speB, що походить з одного з видів, обраних карбамоілпутресцинамідогідролази AguB. Відповііз групи, що складається з Escherichia coli, Shigella дно замість цього, або навіть у комбінації з SpeB у enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus контексті даного винаходу можуть бути застосоваluminescens, Vibrio cholerae і Neisseria meningitidis. ні також AguA і AguB. Джерелами таких aguА і Зокрема, відповідно до даного винаходу моaguВ генів можуть бути Arabidopsis thaliana і жуть бути застосовані всі агматинази, які мають Lycopersicon esculentum, але схожі гени можу бути достатню, тобто, не менше, 30%, або ще краще, виявлені у мутантів Pseudomonas aeroginosa. не менше, 45% і найкраще, не менше, 65% ідентиБуде ясно, що (у контексті даного винаходу) чність із агматиназою з Е. coli (фермент порівнянбудь-який ген, гомологічний до будь-яких генів, які ня), здатні каталізувати агматиназну реакцію. Вікодують вищезгадані аргиніндекарбоксилази, віддомо багато агматиназ, які мають такий відносно повідні агматинази або агматиніміногідролази або високий рівень ідентичності з ферментом порівN-карбамоілпутресцинамідогідролази, і які кодуняння з Е. coli. ють відповідні ферменти, що мають аргиніндекарБільше того, у цьому додатковому кращому боксилазну (відповідно агматиназу або агматинівтіленні винаходу ген, який кодує надекспресовану міногідролазу, або Nагматиніміногідролазу та/або надекспресовану Nкарбамоілпутресцинамідогідролазу) активність, карбамоілпутресцинамідогідролазу, є переважно яка може бути достатньо порівнянною з відповідгеном агматинініміногідролази aguA та/або геном ними ферментами (залежно від обставин), повиN-карбамоілпутресцинамідогідролази aguB, що нен розглядатися як їхній еквівалент і придатний походить із одного з родів, обраного із групи, яка для цього кращого втілення способу винаходу. складається з Pseudomonas, Streptococcus, 13 91686 14 Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, У способі даного винаходу глутамат є дуже Novosphingobium і Bacillus. Бажано щоб ген, який зручним попередником. Відповідно, спосіб бажано кодує надекспресовану агматинімідогідролазу здійснюється в штамі хазяїна, здатному утворювата/або N-карбамоілпутресцинамідогідролазу, був ти глутамат (наприклад, Corynebacterium геном агматинімідогідролази aguA та/або геном Nglutamaticum). карбамоілпутресцинамідогідролази aguB, що поНайкращі результати досягаються, коли спосіб ходить із одного з видів, обраного із групи, яка відповідно до винаходу здійснюється в організміскладається з Pseudomonas aeruginosa, хазяїні із групи, яка складається з Saccharomyces Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, cereviciae, Corynebacterium sp. і Escherichia sp., де Azotobacter vinelandiif Arabidopsis thalianar в мікроорганізмі-хазяїні крім активності ODC на Novosphingobium aromaticivorans і Bacillus cereus. високому рівні представлені ферментативні активЗокрема, відповідно до даного винаходу моності аргиніндекарбоксилази й, щонайменше, агжуть бути застосовані всі агматинімідогідролази матинази або агматиніміногідролази й Nта/або N-карбамоілпутресцинамідогідролази, які карбамоілпутресцинамідогідролази в порівнянні з мають достатню, тобто, не менше 30%, або ще вихідним рівнем названих ферментативних активкраще, не менше, 45% і найкраще, не менше 65% ностей, представлених у мікроорганізмі-хазяїні зі ідентичність із агматиніміногідролазою та/або Nзбільшеним рівнем активності в порівнянні з натикарбамоілпутресцинамідогідролазою з вним рівнем названої ферментативної активності, Pseudomonas (фермент порівняння), здатні каталіщо є гомологом у мікроорганізмі-хазяїні. зувати агматиніміногідролазну реакцію та/або NБуде ясно, що бажаним є здійснення способу карбамоілпутресцинамідогідролазну реакцію. Вівинаходу за реакційних умов, які є такими ж звидомо багато агматиніміногідролаз та/або Nчайними, як умови ферментації. Спосіб, таким карбамоілпутресцинамідогідролаз, які мають такий чином, може бути здійснений як періодичний, але відносно високий рівень ідентичності з ферментом також (якщо необхідно) як періодичний з підживпорівняння з Pseudomonas. ленням культури. Можна для зручності забезпечиБажано, щоб спосіб відповідно до винаходу ти, щоб організм, який застосовується як хазяїн, здійснювався, поки є гарантія підвищеного внутрімав або забезпечувався придатною системою для шньоклітинного рівня орнітину. Цього можна досяекспорту утвореного 1,4-діамінобутану, бажано, гнути, наприклад, шляхом підживлення культури щоб такою системою для експорту була нативна орнітином ззовні. система. Спосіб винаходу може здійснюватися в будьДаний винахід, звичайно, включає також всі якому придатному організмі-хазяїні. Хазяїни мовектори, плазміди й хазяїни, які мають, при підвижуть бути обрані із групи продукуючих організмів щених рівнях активності, одну або більше вище(або клітин), в основному відомих фахівцеві з біозгаданих ферментативні активності відповідно до синтезу. Такі організми можуть мати еукаріотичну прикладеної формули винаходу. природу, або бути, що є кращим, прокаріотичного Винахід буде тепер роз'яснено за допомогою походження. Еукаріотичні клітини, наприклад, модеяких експериментальних результатів, які навежуть бути клітинами рослин або грибів, або різних дені без наміру обмежити рамки винаходу. інших груп, що мають загальну назву «Протисти». Експериментальна частина Зокрема, бажано, щоб процес відповідно до Основні процедури винаходу проводився в організмі-хазяїні, обраному Були застосовані стандартні процедури для із групи, яка складається з Saccharomyces sp., всіх маніпуляцій із ДНК (Sambrook, J. et al. (1989), Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. і Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Pichia sp. Spring Harbor, New-York). ДНК була ампліфікована У способі винаходу особливо бажано, щоб оріз хромосомної ДНК Ε. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al. ганізм, який застосовується як хазяїн, був здатний (2000) J. Bacteriol. 182, 4443-4452), якщо не зазнавиробляти амінокислоти орнітин та/або аргінін. чено інакше. ПЦР-ампліфікація була виконана із Для більшої частини природних мікроорганізмів ця застосуванням ферментів з корелюючою активнісвимога задовольняється, оскільки звичайно така тю SAWADY Pro-DNA-Polymerase (Peqlab здатність є цінною у всіх штамах дикого типу, тому Biotechnologie GmbH, Erlangen, Німеччина) або що аргінін є незамінною амінокислотою. Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Із цих видів Escherichia sp. є кращими, оскільки Німеччина) відповідно до протоколів виробників, у з ними легко поводитися при генетичних маніпутой час як верифікація сконструйованих штамів ляціях, для того щоб забезпечити штами з бажабула проведена шляхом ПЦР колоній із застосуними надекспресованими ферментативними активанням Taq полімерази READYMIX (Sigma, вностями. Більше того, Escherichia sp. уже в Taufkirchen, Німеччина). Рестрикційні сайти для природі включає всі вищезгадані ферментативні наступного клонування, а також додаткові мутації активності (тобто, крім генів agu з рослин), так що були введені з олігонуклеотидами, купленими у більша частина надекспресованих генів може бути фірми MWG-Biotech (Ebersberg, Німеччина). Фрагзастосована як гомологичні гени. Також менти ДНК були очищені із застосуванням набору Corynebacterium sp. (хоча в неї відсутня природна MinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Німеччина) орнітиндекарбоксилаза) є особливо бажаною, відповідно до протоколу виробника. Приготування оскільки вона є придатним штамом, який виробляє плазмідної ДНК виконували із застосуванням наглутамат, з яким можна легко упоратися в процебору QIAprep spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Німечсах ферментації. чина). Верифікація сконструйованих плазмід проводилася шляхом рестрикційного аналізу й 15 91686 16 наступного секвенування (Agowa, Berlin, Німеччи(мутації показані жирним шрифтом, рестрикна). ційний сайт Xbal - курсивом) Конструювання плазмід та 5'-ТТТ TGC ATG СТТ ACT ТСА АСА CAT ААС (і) Конструювання плазміди pDAB3 (pJF119EHspeCnRBS) CGT АС-3' [SEQ ID: No. 2] Ген speC Ε. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див (мутації показані жирним шрифтом, рестрикосновні процедури), який кодує конститутивну біоційний сайт Sphl - курсивом). синтетичну орнітиндекарбоксилазу, був клоноваПісля заключної модифікації ендонуклеазами ний в експресійний вектор pJF119EH (Furste, J.P. Xbal і Sphl, продукт ПЦР було ліговано у плазміду et al. (1986) Gene 48, 119-131), що дозволяє заpJF119EH, яка була розрізана у той же спосіб. Пібезпечити сильну експресію гена, яка грунтується сля трансформації клітин Е. coli DH5 (Invitrogen, на транскрипційному контролі під ізопропіл- -ДKarlsruhe, Німеччина) трансформовані клітини бутіогалактопіранозид (IPTG)-індуцибельним tac ли відібрані на чашках з LB агаром, що містить 100 промотором і lac репресорною системою (laclQ). мг/л ампіциліну. Верифікацію отриманої плазміди Таким чином, кодуючий ген speC був клонований з pDAB4 (pJF119EH specks, 7491 bp) після приготувихідними RBS, стартовим і стоп-кодоном. вання проводили шляхом рестрикційного аналізу й Фрагмент ДНК, який включає speCnRBS з 2235 наступного секвенування. п.о., був ампліфікований із хромосомної ДНК Ε. (ііі) Конструювання плазміди pDAB2 coli LJ110 (номер доступу АЕ 000379, нуклеотиди (pJF119EH-speF) 2650-4867) із застосуванням наступних олігонукГен speF E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. леотидів: основні процедури), який кодує індуцибельну біо5'GAG СТС TAG ACC AGT TTG ACC CAT АТС деградуючу орнітиндекарбоксилазу, був клоноваТ3' [SEQ ID: No. 1] ний в експресійний вектор pJF119EH (Furste, J.P. (мутації показано жирним шрифтом, рестрикet al. (1986) Gene 48, 119-131). Цей вектор дозвоційний сайт Xbal - курсивом) ляє забезпечити високий рівень продукції білка, та який ґрунтується на транскрипційному контролі 5'-ТТТ TGC ATG СТТ ACT TCA АСА CAT AAC клонованих генів під ізопропіл- -ДCGT АС-3' [SEQ ID: No. 2] тіогалактопіранозид (IPTG)-індуцибельним tac (мутації показані жирним шрифтом, рестрикпромотором і lac репресорною системою (laclQ). ційний сайт Sphl - курсивом) Для конструювання експресійної плазміди pDAB2 Після заключної модифікації ендонуклеазами (pJF119EH-speF) кодуючий ген speF був клоноваXbal і Sphl ПЦР-продукт було ліговано у плазміду ний з вихідними RBS (сайт зв'язування рибосом), pJF119EH, яка була розрізана в такий же спосіб. стартовим і стоп-кодоном. Після трансформації в клітини Е. coli DH5 Фрагмент ДНК із 2247 п.о., який включає speF, (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина) трансформовані був ампліфікований із хромосомної ДНК Ε. coli клітини були відібрані на чашках з LB агаром, що LJ110 (номер доступу АЕ000172; нуклеотиди містить 100 мг/л ампіциліну. Верифікацію отрима10242-12468) із застосуванням наступних олігонуної плазміди pDAB3 (pJF119EH speCnRBS, 7491 bp) клеотидів: 5'-GAC CTG CTG GTA CCT AAA ATA AAG AGA після приготування проводили шляхом рестрикційного аналізу й наступного секвенування. TGA AA-3' [SEQ ID: No. 4] (іі) Конструювання плазміди pDAB4 (мутації показані жирним шрифтом, рестрик(pJF119EH-speCnRBS) ційний сайт Kpnl - курсивом) Ген speC E. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див та 5'-TCG АТС TAG ACT GAC TCA ΤΑΆ TTT TTC загальні методи), який кодує конститутивну біосинтетичну орнітиндекарбоксилазу, був клонований CCC-3' [SEQ ID: No. 5] в експресійний вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (мутації показані жирним шрифтом, рестрик(1986) Gene 48, 119-131), що дозволяє забезпечиційний сайт Xbal - курсивом). ти сильну експресію гена, яка грунтується на транНаприкінці фрагмент було модифіковано ендонуклеазами Kpnl і Xbal і ліговано в експресійний скрипційному контролі під ізопропіл- -Двектор pJF119EH, що був розрізаний у той же спотіогалактопіранозид (IPTG)-індуцибельним tac сіб. Після трансформації клітин Е. coli DH5 промотором і lac репресорною системою (laclQ). Таким чином, кодуючий ген speC був клонований з (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина) трансформовані оригінальним стартовим і стоп-кодоном. Оскільки клітини були відібрані на чашках з LB агаром, що для гена speC, який застосовується в дослідженмістить 100 мг/л ампіциліну. Верифікацію отриманях in silico, не було визначено консервативного ної плазміди pDAB2 (pJF119EH speF, 7502 bp) пісRBS, до консенсусної послідовності Е. coli шляхом ля приготування проводили шляхом рестрикційноточкового мутагенезу був адаптований RBS, розго аналізу й наступного секвенування. ташований на 7 п.о. вище стартового кодона (iv) Конструювання плазміди pDAB7 SpeC. (pJF119EH-speAB) Фрагмент ДНК із 2235 п.о., який включає Ген speA, який кодує аргинідекарбоксилазу, а speCaRBS, був ампліфікований із хромосомної ДНК також ген speB, який кодує агматиназу Е. coli Ε. coli LJ110 (номер доступу АЕ000379; нуклеотиLJ110 (Zeppenfeld, et al., див. основні процедури), ди 2650-4867) із застосуванням наступних олігонубули клоновані в експресійний вектор pJF119EH клеотидів: (Furste, J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), що 5'-GAG СТС TAG ACC AGT TTG AGG ААТ дозволяє забезпечити високий рівень продукції АТС Т-3' [SEQ ID: No. 3] білка, який грунтується на транскрипційному конт 17 91686 18 Вплив надекспресії генів ODC speF або speC ролі клонованих генів під ізопропіл- -Д(зі збільшеною транскрипційною та/або транслятіогалактопіранозид (IPTG)-індуцибельним tac ційною ефективністю) на продукцію 1,4промотором і lac репресорною системою (laclQ). бутандіаміну був досліджений в штамі-хазяїні Е. Цей шлях дозволяє зберегти оригінальну структуcoli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. основні процедуру оперона генів, а також RBS, стартовий і стопри), який несе плазміду pDAB2 (дивися (ііі)) або кодони. pDAB3 (дивися (і)) або pDAB4 (дивися (іі)). Фрагмент ДНК із 3079 п.о., що включає speAB, Ці штами були тестовані в експериментах з був ампліфікований із хромосомної ДНК Ε. coli качалочними колбами із застосуванням мінімальLJ110 (номер доступу АЕ000377; нуклеотиди 1190ного сольового середовища, яке містить 4247) із застосуванням наступних олігонуклеотиMgSO4·7Η2Ο (300 мг/л), СаСІ2·2Н2O (15 мг/л), дів: KН2РО4 (3 г/л), K2НРО4 (12 г/л), NaCl (100 мг/л), 5'-АС СТТ ТСТ AGA ATA ATT TGA GGT TCG (NH4)2SO4 (5 г/л), Na цитрат·3H2O (1 г/л), СТА TG-3' [SEQ ID: No. 6] FeSO4·7Н2О (75 мг/л), тіамін-НСІ (вітамін В1) (5 (мутації показані жирним шрифтом, рестрикмг/л), а також мікроелементи Al2(SO4)3·18Н2О (3 ційний сайт Xbal - курсивом) мг/л), СоСl2·6Н2О (1,05 мг/л), CuSO4·5Н2О (3,75 та мг/л), Н3ВО3 (0,75 мг/л), МnСl2·4Н2О (30 мг/л), 5'-CAT GGC ATG CGG TGC TTA CTC G-3' Na2MoO4·2Н2О (4,5 мг/л), NiSO4·6 Н2О (3 мг/л), [SEQ ID: No.7] ZnSO4·7Н2О (22,5 мг/л). Основний розчин глюкози (мутації показані жирним шрифтом, рестрик(500 г/л) пройшов обробку в автоклаві окремо і був ційний сайт Sphl - курсивом). доданий до стерилізованого середовища до кінцеПісля заключної модифікації ендонуклеазами вої концентрації 10 г/л. Xbal і Sphl, фрагмент ДНК було ліговано в експреУ прекультуру з мінімальним сольовим сересійну плазміду pJF119EH, яка була розрізана у той довищем, яка містить 100 мг/л ампіциліну, додаже спосіб. Після трансформації клітин Е. coli DH5 вали 1-5 мкл/мл основного розчину мікроорганізмів (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина) трансформовані на мл та інкубували при 33°С та 180 об/хв протяклітини були відібрані на чашках з LB агаром, що гом 16 год до оптичної щільності 2 при 620 нм. 5мл містить 100 мг/л ампіциліну. Верифікацію отримацієї культури згодом застосовували для зараження ної плазміди pDAB7 (pJF119EH speaB, 8339 bp) основної культури, яка включає 50 мл того ж серепісля готування проводили шляхом рестрикційного довища, що інкубували протягом 24 год при 33°С аналізу й наступного секвенування. та 180 об/хв. Як тільки клітини досягали оптичної (ν) Конструювання плазміди pDAB8 щільності 1,5 при 620 нм (через 7 годин), була (pJF119EH-speF-speAB) індукована експресія гена шляхом додавання 50 Для того щоб забезпечити паралельну продумкМ IPTG. кцію орнітиндекарбоксилази SpeF, аргиніндекарДля того щоб спостерігати динаміку продукції боксилази SpeA та агматинази SpeB, гени speAB 1,4-бутандіаміну в часі, при культивації через різні Ε. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. основні проінтервали часу були відібрані зразки. Після віддіцедури), були клоновані в експресійний вектор лення клітин центрифугуванням розведений супеpDAB (дивися ііі)). рнатант аналізували із застосуванням рідинної Шляхом розщеплення плазміди pDAB7 (див. хроматографії високого розрізнення. Присутні аміiv) рестрикційними ендонуклеазами Xbal і Sphl, був ни було виявлено як похідні орто-фталевоговідділений оперон, який включає гени speAB, роздиальдегіду при довжині хвилі світла 230 нм на міром 3067 п.о. і його було ліговано у плазміду приладі Hewlett-Packard серії 1100 із застосуванpDAB2 (дивися ііі)), яка включає speF. Далі плазміням С18-оберненофазової колонки (Nucleosil 120-5 да була розрізана в такий же спосіб. Після трансС18, Macherey&Nagel, Duren, Німеччина), урівноформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, важеної 50% буфером В (буфер А, 0,1М ацетат Karlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини натрію, рН 7,2; буфер В метанол). Для розділення були відібрані на чашках з LB агаром, який містить був застосований наступний градієнт: 1-7 хв ліній100 мг/л ампіциліну. Отримана плазміда pDAB8 ний градієнт буфера В від 50% до 70% зі швидкіс(pJF119EH speFaB, 10547 bp), яка дозволяє затю 0,5 мл/хв, 7-13 хв від 75% до 85% буфера В зі безпечити паралельну продукцію SpeFAB, була швидкістю 0,5 мл/хв, 13-14,5 хв від 85% до 50% верифікована після одержання рестрикційним буфера В зі швидкістю 1 мл/хв, 14,5-17 хв 50% аналізом. буфера В зі швидкістю 15 мл/хв і 17-20 хв 50% Приклад 1: Поліпшення продукції 1,4буфер В зі швидкістю 0,5 мл/хв. бутандіаміну завдяки надекспресії генів, які кодуІз застосуванням стандартних речовин для кають орнітиндекарбоксилазу зі збільшеною трансклібрування були визначені наступні концентрації рипційною та/або трансляційною ефективністю. 1,4-бутандіаміну (див. Таблиця 1), які були верифіПриклад 1.1. Продукція 1,4-бутандіаміну шляковані ЯМР-спектроскопією. хом надекспресії орнітиндекарбоксилази (у качалочних колбах) 19 91686 20 Таблиця 1 Утворення 1,4-бутандіаміну із застосуванням суперпродукції ODC в Е. coli Застосований штам LJ110 pDAB2 LJ110 pDAB3 LJ110 pDAB4 Експресований ген speF speCnRBS SpeCaRBS Концентрація 1,4бутандіаміну (мг/л) 869 50 715 Приклад 1.2. Продукціяя 1,4-бутандіаміну шляхом суперпродукції ODC з культивацією в періодичному режимі з підживленням (2 л) Потенціал ферментативної продукції 1,4бутандіаміну був досліджений в умовах періодичної культури з підживленням із застосуванням штаму-продуцента LJ110 pDAB2, який продукує 1,4-бутандіамін у високих концентраціях, у біореакторі Labfors (Infors, Einsbach, Німеччина). Оскільки ріст штаму продукуючого 1,4-бутандіамін, не залежить від амінокислот, для того щоб обмежити ріст клітин, було застосовано розроблений протокол для культивації, лімітованої фосфатом. Таким чином, було застосоване мінімальне сольове середовище, обмежене за фосфатом, яке включає MgSO4·7Н2О (3 г/л), СаСl2·2Н2О (15 мг/л), KН2РО4 (400 мг/л), NaCl (1 г/л), (NH4)2SO4 (5 г/л), а також мікроелементи Al2(SO4)3·18Н2О (3 мг/л), СоСl2·6Н2О (1,05 мг/л), CuSO4·5Н2О (3,75 мг/л), Н3ВО3 (0,75 мг/л), МnСl2·4Н2О (30 мг/л), Na2MoO4·2Н2О (4,5 мг/л), NiSO4·6Н2О (3 мг/л) і ZnSO4·7Н2О (22,5 мг/л). Після автоклавування в стерильних умовах у біореактор були додані цитрат натрію·3Н2O (1,5 г/л), FeSO4·7Н2O (112,5 мг/л), тіамін-НСІ (вітамін В1) (7,5 мг/л), ампіцилін 100 мг/л) і глюкоза (10 г/л). У прекультуру з мінімальним сольовим середовищем (дивися 1.1), що містить 100 мг/л ампіциліну, додавали 1-5 мкл основного розчину мікроорганізмів на мл та інкубували при 33°С і 180об/хв до оптичної щільності при 620 нм, рівній 2. Потім цю культуру у співвідношенні 1:10 застосовували для зараження основної культури, яка містить 2л лімітованого за фосфатом мінімального сольового середовища. Під час культивації температура постійно підтримувалася рівною 33°С, а рН - у межах 6,8±0,1 за рахунок додавання 5N KОН. Під час росту була застосовувалось перемішування із стабільною швидкістю 1500 об/хв. Для того щоб усунути обмеження в надходженні кисню під час культивації, потік газу в посудину був збільшений від 2,5 до 10 л/хв. Якщо було необхідно, то додавали піногасник Dehysan. Клітини були індуковані додаванням 50 мкм IPTG при оптичній щільності (620 нм), рівній 5, з наступним комбінованим підживленням глюкозою (500 г/л)/сульфатом амонію (200 г/л), у той час як швидкість підживлення була адаптована, для того щоб одержати стабільну концентрацію глюкози 10г/л та 1,5 г/л амонію. Через 2 години після індукції була почата підгодівля фосфатом, що включає 18 г/л KН2РО4 зі швидкістю 7 мл/год, яка тривала 8год. Таким чином ріст клітин міг би бути обмежений до досягнення оптичної щільності при довжині хвилі 620 нм 50. Зауваження Індукція IPTG; nRBS Індукція IPTG; nRBS Адаптований RBS+індукція IPTG Для того щоб спостерігати залежну від часу продукцію 1,4-бутандіаміну, через різні часові інтервали під час інкубації були взяті зразки. Після відділення клітин шляхом центрифугування супернатант аналізували із застосуванням рідинної хроматографії високого розрізнення (дивися 1.1.), визначаючи 1,4-бутандіамін у кількості 5,1 г/л (0,403 г/г сухої ваги біомаси) і верифікуючи ці дані із застосуванням ЯМР-спектроскопії. Приклад 2. Продукція 1,4-бутандіаміну в періодичній культурі, починаючи з орнітину й аргініну (начальна колба) Для демонстрації додаткового покращення утворення 1,4-бутандіаміну, починаючи з ортинітину, а також з аргініну, був досліджений вплив комбінованої суперпродукції орнітиндекарбоксилази SpeF (з підвищеною транскрипційною ефективністю), аргиніндекарбоксилази SpeA і агматинази SpeB. Тому була здійснена культивація в качальних колбах у мінімальному сольовому середовищі (дивися 1.1) штаму-хазяїна Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. загальні методи), який несе плазміду pDAB8 (дивися (ν)). Із цієї причини до попередньої культури з мінімальним сольовим середовищем, що містить 100 мг/л ампіциліну, додавали 15мкл/мл основного розчину й проінкубували при 33°С, 180 об/хв до оптичної щільності при 620 нм, рівній 2.5 мл цієї культури потім було використано для зараження основної культури, яка містить 50мл того ж середовища, що його інкубували протягом 24 год при 33°С і 180 об/хв. Як тільки клітини досягали оптичної щільності 1,5 при довжині хвилі 620 нм (після 7 год), була індукована експресія гена шляхом додавання 10 мкм IPTG. Для спостереження за продукцією 1,4бутандіаміну залежно від часу в різні моменти часу культивації були взяті зразки. Після відділення клітин центрифугуванням супернатант аналізували із застосуванням рідинної хроматографії високого розрізнення (ВЕРХ) (дивися 1.1). При застосуванні для калібрування стандартних речовин були визначені наступні концентрації 1,4бутандіаміну (дивися таблицю 2). Таблиця 2 Утворення 1,4-бутандіаміну з орнітину, а також з аргініну в Е. coli Штам d LJ110 pDAB8 Експресовані Концентрація 1,4гени бутандіаміну (мг/л) SpeFAB 1025 21 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 91686 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601