Біохімічний синтез 1,4-бутандіаміну

1. Спосіб біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну в мікроорганізмі, який має підвищений рівень активності орнітиндекарбоксилази (підвищена активність орнітиндекарбоксилази) у порівнянні з нативним рівнем орнітиндекарбоксилази, який відрізняється тим, що в мікроорганізмі представлена також підвищена активність утворення Nацетилглутамату в порівнянні з нативною активністю утворення N-ацетилглутамату в мікроорганізмі, і тим, що 1,4-бутандіамін, який виробляється у мікроорганізмі, секретується в середовище ферментації та вилучається із середовища ферментації. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що збільшеної активності орнітиндекарбоксилази досягають шляхом суперекспресії генів speF або speC (кожний належить КФ 4.1.1.17), що кодують орнітиндекарбоксилазу та походять від одного із родів, вибраних із групи, що складається з Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia і Schewanella. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що ген, який кодує орнітиндекарбоксилазу, походить від одного з видів, вибраних із групи, яка складається з Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Schewanella oneidensis. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що ген, який кодує орнітиндекарбоксилазу, є геном speF, що походить від одного з видів, виб 2 (19) 1 3 90479 4 fusca, Streptomyces coelicor і Bifidobacterium longum. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що додатково одержують також збільшену ферментативну активність для щонайменше двох інших ферментів за допомогою суперекспресії або (і) гена speA, який кодує аргініндекарбоксилазу (належить до КФ 4.1.1.19), і гена speB, який кодує агматиназу (належить до КФ 3.5.3.11), який називають також геном, що кодує агматинуреагідролазу; або (іі) гена speA, який кодує аргініндекарбоксилазу (належить до КФ 4.1.1.19), і гена aguA, який кодує агматиніміногідролазу (належить до КФ 3.5.3.12) і який називають також геном, що кодує агматиндеіміназу, і гена aguB, що кодує Nкарбамоїлпутресцинаміногідролазу (належить до КФ 3.5.1.53), і при необхідності також гена speB, що кодує агматиназу (належить до КФ 3.5.3.11). 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, що кодує аргініндекарбоксилазу, є геном speA аргініндекарбоксилази, що походить від одного із родів, вибраних із групи, що складається з Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella і Neisseria. 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, який кодує аргініндекарбоксилазу, є геном speA аргініндекарбоксилази, що походить від одного з видів, вибраних із групи, яка складається з Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella entericar Yersinia pestis, Pasteurella multocida і Neisseria meningitidis. 13. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, який кодує агматиназу, є геном speB агматинази, який походить від одного із родів, вибраних із групи, яка складається з Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio і Neisseria. 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, який кодує агматиназу, є геном speB агматинази, що походить від одного з видів, вибраних із групи, яка складається з Escherichia coli, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luninescens, Vibrio cholerae і Neisseria meningitidis. 15. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, який кодує агматиніміногідролазу, та/або суперекспресований ген, який кодує N-карбамоїл-путресцинамідогідролазу, є геном aguA агматинімідогідролази та/або геном aguB N-карбамоїлпутресцинамідогідролази, який походять від одного із родів, вибраних із групи, яка складається з Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium і Bacillus. 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що суперекспресований ген, який кодує агматиніміногідролазу, та/або суперекспресований ген, який кодує N-карбамоїлпутресцинамідогідролазу, є геном aguA агматиніміногідролази та/або геном aguB N-карбамоїлпутресцинамідогідролази, що походять від одного з видів, вибраних із групи, яка складається з Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans і Bacillus cereus. 17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, який відрізняється тим, що спосіб здійснюють в організміхазяїні, вибраному із групи, яка складається з Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. і Pichia sp. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що спосіб здійснюють в організміхазяїні, вибраному із групи Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium sp., Escherichia sp. і в якому, крім збільшеного рівня активності орнітиндекарбоксилази та утворення N-ацетилглутамату, збільшений щонайменше також рівень активності аргініндекарбоксидази в поєданні з агматиназою та/або агматиніміногідролазою і Nкарбамоїлпутресцинамідогідролазою. 19. Мікроорганізм, який несе підвищений рівень активності орнітиндекарбоксилази (підвищена активність ODC) у порівнянні з нативним рівнем орнітиндекарбоксилазної активності за будь-яким з пп. 1-4, і підвищений рівень активності утворення N-ацетиглутамату за будь-яким з пунктів 1 і 5-9. 20. Мікроорганізм за п. 19, які відрізняються тим, що додатково несуть підвищений рівень активності однієї або більше додаткових ферментативних активностей за будь-яким з пп. 10-18. Даний винахід відноситься до нового способу біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну (номер CAS 110-60-1; сполука позначається також як тетраметилендіамін; у біохімічній літературі частіше називається путресцином) у мікроорганізмі, який має підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності в порівнянні з нативним рівнем орнітиндекарбоксилазної активності. Орнітиндекарбоксилазу нижче ми будемо позначати як «ODC». «Підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності» нижче будемо позначати як «підвищений рівень активності ODC». Відомо, що в основному мікроорганізми, які мають активність ODC, здатні виробляти поліаміни, такі як спермідин і спермін (загальноприйняті назви для продуктів N-(-3амінопропіл)-1,4-бутандіамін і N,N'-біс-(3 амінопропіл)-1,4-бутандіамін відповідно). Такі сполуки, так само, як і самі різні короткі лінійні діаміни, такі, наприклад, як 1,4-бутандіамін і 1,5пентандіамін (який називають також кадаверіном), у біохімічних дослідженнях часто називають поліамінами, хоча, виходячи з точного хімічного визначення поліамінів, варто було б очікувати більшого числа аміногруп. Однак для цілей даної патентної заявки буде застосовуватися термін поліаміни в його біохімічному значенні, і таким чином, він включає 1,4-бутандіамін. Сполука 1,4-бутандіамін є важливим вихідним матеріалом для виробництва деяких основних інженерних пластмас: поліаміду-4,6 ефіру або у формі гомополімеру, або співполімеризованого, наприклад, з 5% (на вагу) поліамід-6 мономером 5 (капролактам). Гомополімер поліамід-4,6 (нейлон4,6) був описаний ще в 1938 році (US-A-2, 130948, Carothers). Він є продуктом поліконденсації мономерів 1,4-бутандіаміну та адипінової кислоти. На сьогодні сполуки поліаміду-4,6 виробляються та продаються головним чином у Нідерландах під торговельною назвою STANYL®. Для синтезу 1,4-бутандіаміну відомо ряд хімічних шляхів. Всі ці хімічні шляхи мають недолік, який полягає у тому, що вихідні матеріали повинні бути отримані із джерел, які розглядаються як непоновлювані. Однак існує реальна необхідність в забезпеченні новими та придатними способами синтезу 1,4-бутандіаміну з поновлюваних джерел вуглецю та у застосуванні біохімічних способів (які також називають «біотрансформацією») у живих клітинах. В основному поліаміни розглядаються як токсичні сполуки для будь-якої клітини або мікроорганізму, які застосовуються у біохімічному виробництві. Таким чином, дотепер вважали, що такі нові шляхи біохімічного синтезу є непривабливими. Це, наприклад, можна бачити з наступних посилань: Fukuchi et al., J. Biol. Chem., т. 270 (1995), стор. 18831-18835; і Suzuki et al., Proc. Natl. Sci. USA, т. 91 (1994), стор. 8930-8934. Фукуші із співавт. чітко описали зниження життєздатності клітин (і синтезу майже всіх видів білків), зумовлене акумуляцією спермідину в дефіцитних на спермідинуцетил-трансферазу клітинах Е. coli (тобто в клітинах, де немає ацетилтрансферази SpeG). Необхідно відзначити, що Лімсувум із співавт. (Limsuvum et al. J. Bacteriol. т. 182 (2000) стор. 5373-5380) показали, що за низьких температур таких проблем можна уникнути за рахунок суперекспресії гена speG. Спермідин є продуктом, який у клітинах виробляється з 1,4-бутандіаміну, що використовується як інтермедіат. Відповідно, біосинтез 1,4-бутандіаміну неминуче призводить до утворення спермідину. Сузукі із співавт., з одного боку, також продемонстрували (на клітинах мишей), що суперпродукція ODC призводить до акумуляції поліамінів, особливо спермідину, і що при додаванні малих кількостей спермідину вже спостерігається смерть клітин, навіть у клітинах, які не дефіцитні на speG. Сузукі із співавт. (цитовано вище) припустили, що ця знижена життєздатність клітин зумовлена недостатнім інгібуванням ODC антиферментами по механізму зворотного зв'язку, і це можна усунути шляхом надпродукції придатного антиферменту. Така суперпродукція антиферментів буде потім знижувати продукцію поліамінів у клітинах і, таким чином, не є дійсно можливою для продукції 1,4бутандіаміну. Крім того, як описали Кашивагі із співавт. (Kashiwagi et al., J. Bacteriol. т.170 (1988) стор. 3131-3135), вміст поліамінів в Е. coli може бути змінений за рахунок суперекспресії гена, який кодує ODC, зокрема, такого який конститутивно експресує speC. Для цих експериментів при клонуванні була застосована плазміда pODC, виготовлена Бойлем із співавт. (Boyle et al., Methods in Enzymology, т. 94 (1983), стор. 117-121). Зрозуміло, що суперпродукція ODC не призвела 90479 6 до сильного збільшення рівня 1,4-бутандіаміну в клітинах. При 70-разовому збільшенні рівня ODC спостерігалося збільшення вмісту 1,4-бутандіаміну в клітинах не більш ніж на 20%, незалежно від кількості орнітину, доданого до клітин. Однак, з іншого боку, було показано, що клітини, які ростуть у присутності орнітину, демонструють підвищену секрецію 1,4-бутандіаміну. При 70-разовому надлишку рівня ODC у підсумку було виявлено приблизно в 8,5-разів більш високу продукцію 1,4бутандіаміну (титр виробленого 1,4-бутандіаміну становив приблизно 20-25мг/л у сумі для внутрішньо- та позаклітинних концентрацій, тобто екстремально низька концентрація). Автори припустили, що така вкрай низька ефективність продукції 1,4бутандіаміну може бути обумовлена зменшенням концентрації орнітину, і спробували вирішити цю проблему шляхом підгодовування клітин орнітином зовні, але домоглися лише мінімального поліпшення. Відповідно, могло б здатися, що неможливо забезпечити способи біохімічного синтезу для виробництва 1,4-бутандіаміну до значно більш високих рівнів, ніж 30мг/мл. Більше того, ці дослідження, згадані вище, не були спрямовані на синтез поліамінів (включаючи 1,4-бутандіамін) як таких, а були покликані забезпечити краще розуміння фізіологічних функцій поліамінів на молекулярному рівні. При більш високому рівні орнітину в клітинах, імовірно також, що більше аргініну буде представлено в клітинах. Відповідно, на думку Кашивагі, такі більш високі кількості аргініну повинні мати значний негативний ефект на утворення 1,4-бутандіаміну. Дотепер ЕР-А-0726240 є одним з небагатьох патентів, які відносяться до біохімічного синтезу поліамінів, включаючи 1,4-бутандіамін. Однак він описує, між іншим, продукцію 1,4-бутандіаміну шляхом ферментації природних продуктів, що включають білки як основний компонент. У названому способі природні продукти спочатку обробляли, піддаючи їх частковій або повній деградації, а потім будь-які небажані сполуки (наприклад, Hg, Cr, As, Cd, Se і Pb), інгібітори росту клітин, пестициди, антибіотики, детергенти, мила, жири, олії, ціаніди та феноли видаляли до стадії ферментації. Путресцин та інші діаміни, вироблені таким шляхом, повторно застосовуються як добрива, але включають таку велику кількість інших речовин, що вони можуть бути небажаними як вихідний матеріал для продукції, наприклад, поліаміду-4,6. Відповідно зберігається необхідність ефективного альтернативного біосинтетичному шляху для синтезу 1,4-бутандіаміну зі значно більш високими титрами, ніж приблизно 30мг/л, переважно навіть без потреби в зовнішньому підгодовуванні (дорогим) орнітином. Ця необхідність поліпшення доступності 1,4-бутандіаміну ґрунтується, головним чином, на намірі застосовувати його як стартовий матеріал, наприклад, для виробництва поліаміду4,6. В основному, шляхи одержання 1,4бутандіаміну, відомі на сьогоднішній день, досить трудомісткі та клопіткі і можуть призводити до одержання такої кількості названого продукту, яку без додаткового очищення важко буде застосувати у виробництві нейлонів. Відомі хімічні способи 7 одержання 1,4-бутандіаміну вимагають відносно дорогих вихідних матеріалів та реактантів (включаючи реактанти, з якими важко поводитися) і відносно жорстких умов реакції (температура та тиск) із багатостадійним і багато-реакторним дизайном, а також застосування дорогих систем каталізу. Відповідно зберігається потреба в альтернативних способах одержання 1,4-бутандіаміну, переважно з менш дорогих вихідних матеріалів, та усунення проблем контактування з реактантами, подібними до цианістоводневої кислоти. Добре відомо, що природні вирощувані і, таким чином, поновлювані матеріали, які походять із сільськогосподарської продукції є основним джерелом вуглецю, таким як глюкоза (або інших придатних джерел вуглецю та їхніх сумішей), які можуть бути застосовані у ферментації. Такі поновлювані матеріали є відносно дешевими та доступними в великих кількостях. В основному, вважається дуже вигідним, якщо поновлювані матеріали можуть бути застосовані як вихідний матеріал для одержання всіх видів хімічних матеріалів. Таким чином, метою даного винаходу є забезпечення кращих можливостей для великомасштабного промислового виробництва 1,4-бутандіаміну шляхом біотрансформації. Не очікуючи цього винахідники даного винаходу виявили, що цю мету можливо досягти із застосуванням нового способу біохімічного синтезу 1,4бутандіаміну в мікроорганізмі, який має підвищений рівень ODC активності в порівнянні з нативним рівнем ODC активності, де мікроорганізм проявляє також підвищену активність утворення Nацетилглутамату в порівнянні з вихідним рівнем активності утворення N-ацетилглутамату в мікроорганізмі, і що вироблений 1,4-бутандіамін секретується в середовище ферментації, і його виділяють із середовища ферментації. За визначенням, у даній патентній заявці, термін «біохімічний синтез» (термін, який у контексті цієї патентної заявки альтернативно розглядається як «біотрансформація») включає не тільки способи, які передбачають (крім ряду чисто хімічних реакційних стадій) одну або більше біокаталітичних реакція із застосуванням цілих клітин придатних для продукції штамів, але також чисто біохімічні процеси, при яких використовують цілі клітини придатних для продукції штамів. Такі чисто біохімічні способи розглядаються, відповідно, як такі, що відносяться до ферментацій, у випадку, якщо біохімічний синтез починається з придатного джерела вуглецю, або розглядається як ферментація попередника у випадку, якщо біохімічний синтез починається від проміжного продукту, який вже має вуглецевий кістяк, з якого може бути отримана молекула-мішень, яка повинна бути синтезована. Ці способи можуть здійснюватися або в аеробних, або в анаеробних умовах. Біокаталітичні реакції в біохімічних синтезах даного винаходу можуть бути проведені або in vivo, або in vitro. В основному, способи in vivo є способами, які здійснюються в тому випадку, коли застосовуються живі клітини (термін «живі клітини» включає тут також так звані клітини спокою); способи in vitro, з іншого боку, звичайно прово 90479 8 дяться із застосуванням лізатів клітин або (частково) очищених ферментів. Відповідно до даного винаходу біохімічний синтез проводиться в мікроорганізмі. Це може бути здійснено із застосуванням цілих клітин придатних для продукції штамів, але також може проводитися із застосуванням пермеабілізованих клітин; відмінності між in vivo і in vitro не мають, однак, великого значення для способів, проведених з пермеабілізованими клітинами або з іммобілізованими клітинами-хазяїнами. Однак буде очевидно, що індивідуальні біокаталітичні стадії способу винаходу, коли вони проводяться, наприклад, із застосуванням іммобілізованих ферментів, та подібного, розглядаються як еквівалентні таким стадіям у біохімічному синтезі, як визначено в контексті даної заявки. Орнітиндекарбоксилази (тобто ферменти, які мають орнітиндекарбоксилазну активність, або ODC) є ферментами, що відносяться до класу КФ 4.1.1.17. При суперпродукції рівень активності орнітиндекарбоксилази можна легко порівняти з вихідним (тобто не надпродукованим) рівнем активності орнітиндекарбоксилази в стандартних умовах (при 37°С у присутності орнітину та PLP) у безкліткових екстрактах, із застосуванням набору реактивів Sigma Diagnostics для виявлення двоокису вуглецю, аналіз описаний в Остермана із співавт. (Osterman, A.L. et аl. 1994, Biochemistry 33, стор. 13662-12667). Фахівець, відповідно, може легко встановити, чи має застосована орнітиндекарбоксилаза збільшений рівень активності орнітиндекарбоксилази (підвищену активність ODC) у порівнянні з нативним рівнем активності орнітиндекарбоксилази в застосованого мікроорганізму, вимірюючи вміст білка або визначаючи рівень РНК. Різні стандартні способи визначення вмісту білка, наприклад, колориметричний, а також спектроскопічний, описані в Лоттцпейха та Зорбаса (Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spekctrum Akademisher Verlag GmbH, Heidelberg/Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 (1998), глави 3, 5, 21, 22 і 24). Способи визначення концентрації білка, а також рівня РНК, наприклад, Нозерн-гібридизація, зворотна транскрипція - полімеразна ланцюгова реакція (RT-PCR) і багато інших методів описані Самбруком із співавт. (J. Sambrook, E.F. Fritsch and Т. Maniatis, Molecular cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-879-309-6, 1989). Однак фахівцеві в цій аналітичній галузі відомі багато інших стандартних способів, і немає потреби їх тут згадувати. Придатними орнітиндекарбоксилазами, які можуть бути застосовані в способі винаходу, є всі ферменти та їх мутантні форми, які здатні декарбоксилювати орнітин. Будь-який такий фермент може бути застосованим у способі винаходу при підвищеному рівні активності, тобто у надпродукованій формі. Такий підвищений рівень активності може бути досягнутий будь-якими способами, відомими фахівцеві, наприклад, за допомогою збільшення числа копій гена або збільшенням ендогенної активності або структури ферменту шляхом мутацій, або із застосуванням дерегульованих ферментів. Однак найкраще цього можна досягти за допомогою суперекспресії гена орнітиндекарбо 9 ксилази з підвищеною транскрипційною та/або трансляційною ефективністю. Крім того, необхідно відзначити, що термін «підвищений рівень активності», як він застосовується тут для будь-якої окремо названої ферментативної активності, передбачає включення таких ситуацій, в яких така ферментивна активність, наприклад, орнітиндекарбоксилаза, взагалі не представлена в природному джерелі мікроорганізму, де реакція має місце, але вводиться туди, наприклад, шляхом генетичної модифікації. У способі запропонованому винаходом необхідно представити підвищений рівень активності утворення N-ацетилглутамату (як додатково вказується далі, коли подано обговорення у відношені залежних пунктів винаходу) у порівнянні з вихідним рівнем активності утворення Nацетилглутамату в мікроорганізмі. Порівняння збільшеного та вихідного рівнів утворення Nацетилглутамату може бути легко проведено, подібно до того, як проводиться визначення активності орнітиндекарбоксилази, з придатними реакціями тестування в стандартних умовах (аналіз описаний в Abadjieva, А., 2001, J. Biol. Chem., 276, стор. 42869-42880) у безкліткових екстрактах із застосуванням радіоізотопного аналізу з 1-[14C] глутамату та ацетил-KoA як субстрату. Відповідно до даного винаходу 1,4-бутандіамін виробляється в мікроорганізмі зі збільшеними активностями орнітиндекарбоксилази та утворення N-ацетилглутамату за допомогою біотрансформації та секретується в середовище ферментації, що оточує мікроорганізм. 1,4-бутандіамін секретується в і виділяється із середовища ферментації. Таким чином, відповідно до даного винаходу, забезпечується поліпшений біохімічний спосіб синтезу 1,4-бутандіаміну, і отриманий 1,4бутандіамін є прекрасним вихідним матеріалом для виробництва, наприклад, поліаміду-4,6. Утворення 1,4-бутандіаміну у великих кількостях, як це відбувається відповідно до винаходу, є найбільш несподіваним через той факт, що підвищений рівень активності орнітиндекарбоксилази (разом зі збільшеною активністю утворення Nацетилглутамату) без будь-яких додаткових заходів, спрямованих на усунення негативних ефектів утворення поліамінів, які впливають на життєздатність клітин, могло б призвести до очікуваної смерті клітин. Як згадувалося вище, у способі винаходу може бути застосований будь-який фермент орнітиндекарбоксилази зі збільшеною активністю, наприклад, у суперпродукованій формі. Відповідно до даного винаходу можуть бути застосовані всі орнітиндекарбоксилази, які мають достатню, тобто, щонайменше, 30%, краще, щонайменше, 45% і найкраще, щонайменше, 65% ідентичність із орнітиндекарбоксилазним ферментом порівняння з Е. coli, і здатні каталізувати орнітиндекарбоксилазну реакцію. Відомо багато орнітиндекарбоксилаз, які мають такий відносно високий рівень ідентичності з орнітиндекарбоксилазним ферментом порівняння з Е. coli. Визначення відсотка ідентичності з ферментом порівняння може бути виконано способами, 90479 10 відомими фахівцеві, наприклад шляхом застосування білкової послідовності ферменту порівняння як «ферменту запитів» для виконання пошуку в опублікованих базах даних, наприклад, ідентифікації інших членів родини або родинних послідовностей. Такі пошуки можуть бути виконані із застосуванням програм BLAST (версія 2.2.) і параметрів за замовчуванням відповідної програми. Дивися: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov. Бажано, щоб збільшена активність орнітиндекарбоксилази досягалася за рахунок суперекспресії генів speF і spec, які кодують орнітиндекарбоксилазу (кожний фермент належить до КФ 4.1.1.17), і які походять від одного із родів, обраних із групи, яка включає Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia і Shewanella. Орнітиндекарбоксилаза speF є індуцибельною орнітиндекарбоксилазою, орнітиндекарбоксилаза spec є конститутивною орнітиндекарбоксилазою. Більш бажано, щоб ген, який кодує орнітиндекарбоксилазу, походив від одного із видів, обраних із групи, яка включає Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis і Shewanella oneidensis. Дотепер у літературі менше інформації про дослідження гена spec, ніж speF. Однак найбільш неочікуваним та найбільш бажаним є те, що найкращі результати відповідно до даного винаходу досягаються, якщо ген, який кодує орнітиндекарбоксилазу є геном speF, точніше, speF, який походить від одного із видів, обраних із групи, яка включає Escherichia coli, Salmonella typhimurium і Shewanella oneidensis. При порівнянні з результатами, отриманими із суперекспресією конститутивною орнітиндекарбоксилазою, яка кодується геном speC, безумовно найкращі результати відповідно до винаходу були досягнуті, коли застосовували speF. У контексті даної заявки будь-який ген, будучи гомологічним до кожного з генів, які кодують вищезгадані орнітиндекарбоксилази, і такий, що кодуює ферменти, які мають активність орнітиндекарбоксилази, досить порівнянну з показаною орнітиндекарбоксилазою, є придатним для способу винаходу. Такі еквівалентні гени можуть бути певним чином отримані за допомогою будь-якої відповідної стратегії клонування, відомої фахівцеві, наприклад, способами, описаними тут в експериментальній частині. Альтернативно такі еквівалентні гени орнітиндекарбоксилази можуть бути також отримані шляхом цілеспрямованого конструювання. Термін «активність утворення Nацетилглутамату» відображає, у контексті даної патентної заявки, будь-яку ферментативну активність, обумовлену єдиним ферментом або комбінацією ферментів, здатну призводити до утворення N-ацетилглутамату в клітині. Зокрема, відповідно до даного винаходу можуть бути застосовані N-ацетилглутаматсинтази, які мають достатню, тобто, щонайменше, 30%, краще, щонайменше, 45%, ще краще навіть, щонайменше, 65% і найкраще, щонайменше, 75% ідентичність із N-ацетилглутаматсинтазою (ферментом порівняння) з Е. coli, які здатні каталізувати реакцію утворення N-ацетилглутамату. Відомо 11 багато N-ацетилглутаматсинтаз, які мають такий відносно високий рівень ідентичності з ферментом порівняння з Е. coli. Переважно, збільшена активність утворення N-ацетилглутамату досягається шляхом суперекспресії або гена argA, який кодує Nацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), та/або гена argJ, який кодує N2-ацетил-L-орнітин:L-глутамат-Nацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35). Очевидно, що будь-який ген, який кодує фермент або його мутантну форму, і який має таку ж функціональність одного з ферментів, як згадано вище, буде розглядатися як такий, що є еквівалентом такого ферменту в одному із класів КФ 2.3.1.1 або КФ 2.3.1.35. В одному із кращих втілень даного винаходу збільшена активність утворення Nацетилглутамату досягається шляхом суперекспресії гена argA, який кодує Nацетилглутаматсинтазу (КФ 2.3.1.1), що походить від одного із родів, обраних із групи, яка включає Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Photorhabdus і Buchnera. Ці ArgA ферменти вимагають присутності коензиму А (або джерела), щоб бути активними при формуванні Nацетилглутамату. У цьому втіленні підвищена активність утворення N-ацетилглутамату досягається шляхом суперекспресії гена argA, який кодує Nацетилглутаматсинтазу, що походить від одного з видів, обраних із групи, яка включає Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Photorhabdus luminescens і Buchnera aphidicola. В іншому кращому втіленні даного винаходу підвищена активність утворення Nацетилглутамату досягається шляхом суперекспресії гена argJ, який кодує N2-ацетил-L-орнітин:Lглутамат-N-ацетилтранферазу (КФ 2.3.1.35), що походить від одного із родів, обраних із групи, яка включає Bacillus, Listeria, Oceanobacillus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Thermobifida, Streptomyces і Bifidobaсterium. Придатними N2-ацетил-L-орнітин:L-глутаматN-ацетилтран-феразами, які можуть бути застосовані в способі запропонованому даним винаходом, є N2-ацетил-L-орнітин:L-глутамат-Nацетилтранферази, які мають достатню, тобто щонайменше, 20%, краще, щонайменше, 30%, та найкраще, щонайменше, 40% ідентичність із N2ацетил-L-орнітин:L-глутамат-Nацетилтранферазою з Bacillus (фермент порівняння) і здатні каталізувати N2-ацетил-L-орнітин:Lглутамат-N-ацетил-транферазну реакцію. Відомо, що багато N2-ацетил-L-орнітин:L-глутамат-Nацетилтранфераз мають такий рівень ідентичності з відповідним ферментом порівняння з Bacillus. На противагу ферментам ArgA, ферменти ArgJ взагалі не вимагають присутності (або наявності джерела) коферменту А, будучи активними при утворенні N-ацетилглутамату. Відповідно ці ферменти ArgJ є явно більш кращими, ніж ферменти ArgA для промислового застосування. У цьому іншому кращому втіленні даного ви 90479 12 находу підвищена активність утворення Nацетилглутамату досягається шляхом суперекспресії гена argJ, який кодує N2-ацетил-L-орнітин:Lглутамат-N-ацетилтранферазу, що походить від одного з видів обраного із групи, яка включає Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Oceanobacillus iheyensis, Staphylococcus epidermis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Mycobacterium leprae, Thermobifida fusca, Streptomyces coelicor і Bifidobacterium longum. У контексті даної заявки будь-який ген, будучи гомологічним до будь-якої вищезгаданої активності утворення N-ацетилглутамату та кодуючий ферменти, які мають активність утворення Nацетилглутамату, досить порівнянну з показаною активністю утворення N-ацетилглутамату, є придатним для способу винаходу. Такі еквівалентні гени можуть бути певним чином отримані із застосуванням будь-якої стратегії клонування, відомої фахівцеві, наприклад, способами, описаними тут в експериментальній частині. Альтернативно такі еквівалентні гени утворення N-ацетилглутамату можуть бути отримані шляхом цілеспрямованого конструювання. У додатковому кращому втіленні даного винаходу спосіб біохімічного синтезу 1,4-бутандіаміну проводиться в мікроорганізмі, в якому додатково за допомогою суперекспресії отримана також збільшена ферментативна активність для, щонайменше, двох інших ферментів, або (i) аргиніндекарбоксилази, яка кодується геном speA (КФ 4.1.1.19), та агматинази, яка кодується геном speB (КФ 3.5.3.11; позначається також як ген, який кодує агматин-уреагідролазу); або (ii) аргиніндекарбоксилази, яка кодується геном speA (КФ 4.1.1.19), та агматиніміногідролази, яка кодується геном aguA (КФ 3.5.3.12; позначається також як ген, який кодує агматиндеіміназу), та N-карбамоілпутресцинамідогідролази, яка кодується геном aguВ (КФ 3.5.1.53), та за необхідності також агматинази, яка кодується геном speB (КФ 3.5.3.11). Перевагою цього додаткового кращого втілення є те, що 1,4-діамінобутан утворюється навіть у ще більших кількостях. Суперекспресія, як визначено для використання тут, може бути досягнута у будь-який спосіб, відомий фахівцеві; наприклад, шляхом збільшення транскрипційної та/або трансляційної ефективності відповідного гена, але також будь-якими іншими відомими способами, такими як збільшення кількості копій гена, або шляхом збільшення ендогенної активності або структури ферментів за рахунок мутацій, або шляхом застосування дерегульованих ферментів. Як зазначено в частині (і) додаткового кращого втілення, згадана тут вище комбінація SpeA і SpeB призначена для подання будь-якої функціональної комбінації (або в комбінованому злитому білку, або у вигляді роздільних ферментативних активностей) SpeA і SpeB. Фактично ця комбінація може бути також позначена як SpeAB. Частина (іі) відображає, що в таких комбінаціях SpeA і SpeB, сама SpeB частина може бути замінена будь-якою функціональною комбінацією (або 13 в комбінованому злитому білку, або у вигляді роздільних ферментативних активностей) AguA і AguB. Яновіц із співавт. (Janowitz et al., FEBS Letters 544 (2003) 258-261) описали, що агматиндеіміназа AguA залучена в аргиніндекарбоксилазний шлях у вищих рослин. Крім того, відомо (Nakada et al., Microbiology, 149 (2003), 707-714), що перетворення, що каталізуються SpeB, можуть також каталізуватися ферментами, наявними в рослин, а саме: комбінованою дією агматиндеімінази AguA і Nкарбамоілпутресцинамідогідролази AguB. Відповідно, замість цього, або навіть у комбінації з SpeB, у контексті даного винаходу можуть бути застосовані також AguA і AguB. Джерелами таких aguA і aguB генів можуть бути Arabidopsis thaliana і Lycopersicon esculentum, але порівнянні гени можуть бути виявлені в мутантів Pseudomonas aeruginosa. У контексті даної заявки будь-який ген, гомологічний до будь-яких вищезгаданих аргиніндекарбоксилаз, відповідно, агматиназ або агматиніміногідролаз або Nкарбамоілпутресцинамідогідролаз, і такий, що кодує відповідні ферменти, які мають аргиніндекарбоксилазну (відповідно агматиназну або агматиніміногідролазну, або Nкарбамоілпутресцинамідогідролазну) активності, досить порівнянні з відповідними ферментами (залежно від обставин), і є придатним у цьому додатковому кращому втіленні способу винаходу. Такі еквівалентні гени можуть бути отримані у відповідний спосіб за допомогою будь-якої придатної стратегії клонування, відомої фахівцеві, наприклад, способами, описаними тут в експериментальній частині. Альтернативно такі еквівалентні гени можуть бути також отримані шляхом цілеспрямованого конструювання. Відповідно, у цьому кращому втіленні способу даного винаходу застосовуються також додаткові комбінації суперекспресованих генів, які кодують (і) аргинідекарбоксилазу та агматиназу або (іі) аргиніндекарбоксилазу та агматиніміногідролазу та N-карбамоілпутресцинамідогідролазу, і за необхідності агматиназу. У цьому кращому втіленні способу відповідно до даного винаходу, можуть бути, зокрема застосовані всі аргиніндекарбоксилази, які мають достатню, тобто, щонайменше, 30%, краще, щонайменше, 45%, і найкраще, щонайменше, 65% ідентичність із аргинідекарбоксилазою з Е. coli (фермент порівняння) і здатні каталізувати аргинідекарбоксилазну реакцію. Відомо, що багато аргніндекарбоксидаз мають такий відносно високий рівень ідентичності з ферментом порівняння з Е. coli. Більше того, у названому втіленні, зокрема, можуть бути застосовані всі агматинази, які мають достатню, тобто, щонайменше, 30%, краще, щонайменше, 45%, і найкраще, щонайменше, 60% ідентичність із агматиназою з Е. coli (фермент порівняння) і здатні каталізувати агматиназну реакцію. Відомо, що багато агматиназ мають такий відносно високий рівень ідентичності з ферментом порівняння з Е. coli. 90479 14 Додатково, у названому втіленні способу, зокрема, можуть бути застосовані всі агматиніміногідролази та/або Nкарбамоілпутерсцинамідогідролази, які мають достатню, тобто, щонайменше, 20%, краще, щонайменше, 30%, і найкраще, щонайменше, 40% ідентичність із агматиніміногідролазою та/або з Nкарбамоілпутерсцинамідогідролазою з Pseudomonas (ферменти порівняння), і здатні каталізувати агматиніміногідролазну, відповідно Nкарбамоілпутерсцинамідогідролазну реакцію. Багато з агматиніміногідролаз та Nкарбамоілпутерсцинамідогідролаз мають такий відносно високий рівень ідентичності з ферментами порівняння з Pseudomonas. Суперекспресований ген, який кодує аргиніндекарбоксилазу у вищевказаному кращому втіленні винаходу є переважно геном аргиніндекарбоксилази speA, який походить від одного із родів, обраних із групи, яка включає Escherichia, Shigella, Salmonella, Yersinia, Pasteurella і Neisseria. Бажано, щоб ген, який кодує суперекспресовану аргиніндекарбоксилазу, був геном аргинідекарбоксилази speA, який походить від одного з видів, обраних із групи, яка включає Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella enterica, Yersinia pestis, Pasteurella multocida і Neisseria meningitidis. Більше того, у цьому кращому втіленні винаходу ген, що кодує суперекспресовану агматиназу, бажано є геном агматинази speB, який походить від одного із родів, обраних із групи, яка включає Escherichia, Salmonella, Proteus, Photorhabdus, Vibrio і Neisseria. Найкраще коли ген, який кодує суперекспресовану агматиназу, є геном агматинази speB, що походить від одного з видів, обраних із групи, яка включає Escherichia coli, Shigella enterica, Proteus mirabilis, Photorhabdus luninescens, Vibrio cholerae і Neisseria meningitidis. Крім того, у цьому додатковому кращому втіленні винаходу ген, який кодує суперекспресовану агматиніміногідролазу та/або суперекспресований ген, який кодує Nкарбамоілпутресцинамідогідролазу, бажано є геном агматининіміногідролази aguA та/або геном Nкарбамоілпутресцинамідогідролази aguB, який походять від одного із родів, обраних із групи, яка включає Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Azotobacter, Arabidopsis, Novosphingobium і Bacillus. Найкраще коли ген, який кодує суперекспресовану агматинімідогідролазу та/або суперекспресовану Nкарбамоілпутресцинамідогідролазу, є геном агматинімідогідролази aguA та/або геном Nкарбамоілпутресцинамідогідролази aguB, який походить від одного з видів, обраних із групи, яка включає Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus mutans, Streptomyces avermitilis, Azotobacter vinelandii, Arabidopsis thaliana, Novosphingobium aromaticivorans і Bacillus cereus. Спосіб винаходу може втілюватися в будьякому придатному організмі-хазяїні. Хазяїни можуть бути обрані із групи продукуючих організмів (або клітин), в основному відомих фахівцеві з біосинтезу. Такі організми можуть бути еукаріотичної природи, або, що краще, прокаріотичного похо 15 дження. Еукаріотичні клітини, наприклад, можуть бути клітинами рослин або грибів, і з різних інших груп, об'єднаних під загальною назвою «протисти». Зокрема, бажано, щоб спосіб запропонований даним винаходом втілювався в організмі-хазяїні, обраному із групи, яка включає Saccharomyces sp., Bacillus sp., Corynebacterium sp., Escherichia sp. і Pichia sp. У способі винаходу особливо бажано, щоб організм, застосований як хазяїн, був здатний виробляти амінокислоти орнітин та/або аргінін. Для більшої частини природних мікроорганізмів ця вимога задовольняється, оскільки звичайно така здатність є цінною у всіх штамах дикого типу, тому що аргінін є есенціальною амінокислотою. Із цих видів Escherichia sp. є кращими, оскільки з ними легко поводитися при генетичних маніпуляціях, для того щоб забезпечити штами з бажаними суперекспресованими ферментативними активностями. Більше того, Escherichia sp. уже в природі включає всі вищезгадані ферментативні активності (тобто, крім генів agu з рослин), так що більша частина суперекспресованих генів може бути застосована як гомологічні гени. Також Corynebacterium sp. (хоча в нього відсутня природна орнітиндекарбоксилаза) є особливо бажаним, оскільки він є придатним штамом, який виробляє глутамат, з яким можна легко поводитися у ферментаційних способах. У способі даного винаходу глутамат є дуже бажаним попередником. Відповідно, спосіб переважно здійснюється в штамі хазяїна, здатному утворювати глутамат (наприклад, Corynebacterium glutamicum). Найкращі результати досягаються, коли спосіб відповідно до винаходу здійснюється в організміхазяїні із групи, яка включає Saccharomyces cereviciae, Corynebacterium sp. і Escherichia sp., де в мікроорганізмі-хазяїні крім збільшеного рівня активності орнітиндекарбоксилази та утворення Nацетилглутамату, щонайменше, збільшується також рівень активності ферментів аргинідекарбоксилази у поєднанні з ферментами агматиназою та/або агматиніміногідролазою і Nкарбамоілпутресцинамідогідролази. Як позначено тут, для кожного зі згаданих вище ферментів підвищений рівень активності порівнюється з вихідним рівнем активності відповідної названої ферментативної активності в мікроорганізмі-хазяїні. Буде ясно, що спосіб винаходу краще здійснюється в реакційних умовах, які є такими ж звичайними, як і умови ферментації. Спосіб, який може бути здійснений як груповий, але також (якщо бажано) спосіб з підживленням культури. Можна для зручності забезпечити, щоб організм, який застосовується як хазяїн, мав або забезпечувався придатною системою для експорту утвореного 1,4діамінобутану, бажано, щоб такою системою для експорту була нативна система. Даний винахід, звичайно, загалом включає також всі вектори, плазміди та хазяїни-носії, які несуть підвищений рівень орнітиндекарбоксилазної активності (підвищену активність ODC) у порівнянні з вихідним рівнем активності орнітиндекарбок 90479 16 силази, і підвищену активність утворення Nацетилгутамату в порівнянні з вихідним рівнем утворення N-ацетилглутамату. Зокрема, для кращих втілень даний винахід відноситься також до всіх векторів, плазмід і хазяїнів, які додатково несуть високий рівень одного або більше інших вищезгаданих ферментативних активностей відповідно до поданої формули винаходу. Здійснення винаходу Тепер винахід буде пояснено за допомогою деяких експериментальних результатів, які приводяться без наміру обмежити рамки винаходу. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА Основні процедури Були застосовані стандартні процедури маніпуляції із ДНК (Sambroock, J. et al. (1989), Molecular cloning: a latoratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New-York). ДНК була ампліфікована із хромосомної ДНК Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al. (2000) J. Bacteriol. 182, 4443-4452), Bacillus subtilis ATCC10783 або Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, якщо не зазначено інакше. ПЦРампліфікація була виконана із застосуванням ферментів з реагуючою активністю SAWADY ProDNA-Polymerase (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Німеччина) або Platinum Pfx DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина) відповідно до протоколів виробників, у той час як верифікація сконструйованих штамів була проведена шляхом ПЦР колоній із застосуванням Taq полімерази READYMIX (Sigma, Taufkirchen, Німеччина). Рестрикційні сайти для наступного клонування, а також додаткові мутації було введено з олігонуклеотидами, купленими у фірми MWGBiotech (Ebersberg, Німеччина). Фрагменти ДНК були очищені із застосуванням набору MinElute Gel Extraction (Qiagen, Hilden, Німеччина) відповідно до протоколу виробника. Приготування плазмідної ДНК виконували із застосуванням набору QIAprep spin Miniprep (Qiagen, Hilden, Німеччина). Верифікація сконструйованих плазмід проводилася шляхом рестрикційного аналізу й наступного секвенування (Agowa, Berlin, Німеччина). Для високого рівня експресії генів був застосований вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986). Gene 48, 119-131), який є придатним для продукції білка, індукованого дією ізопропіл бета-Dтіогалактопіранозиду (IPTG), який ґрунтується на індуцибельному під дією IPTG tac промоторі та lac репресорній системі (laclQ) . Конструювання плазмід (і) Конструювання плазміди pDAB2 (pJF119EHspeF) Індуцибельний біодеградуючий ген speF Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. основні процедури), який кодує орнітиндекарбоксилазу, був клонований в експресійний вектор PJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131). Цей вектор дозволяє забезпечити високий рівень продукції білка, заснований на транскрипційному контролі клонованих генів IPTG індуцибельним tac промотором і lac репресорною системою (laclQ) . Для конструювання експресійної плазміди pDAB2 (pJF11EHspeF) кодуючий ген speF був клонований з оригі 17 нальними сайтом зв'язування рибосоми (RBS), стартовим і стоп-кодоном. Фрагмент ДНК, який включає speF з 2247 п.о., був ампліфікований із хромосомної ДНК Е. coli 90479 18 LJ110 (номер доступу АЕ000172, нуклеотиди 10242-12468) із застосуванням наступних олігонуклеотидів: [SEQ ID: No. 1] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Kpnl - курсивом) і [SEQ ID: No. 2] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикваний в експресійний вектор PJF119EH (Furste, ційний сайт Sphl - курсивом) J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), дивися (і), що Наприкінці фрагмент був модифікований рестдозволяє забезпечити сильну експресію гена, яка рикційними ендонуклеазами Kpnl і Xbal і лігований грунтується на транскрипційному контролі під IPTG в експресійний вектор pJF119EH, який був розрііндуцибельним tac промотором і lac репресорну заний у такий же спосіб. Після трансформації в систему (laclQ) . Таким чином,кодуючий ген був клонований з оригінальним стартовим і стопклітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Німечкодоном. Оскільки для гена speC, який застосовучина) трансформовані клітини були відібрані на ється в дослідженнях in silico, не було визначено чашках з LB агаром, який включає 100мг/л ампіциконсервативного RBS, на 7 п.о. вище стартового ліну. Верифікацію отриманої плазміди pDAB3 кодона speC за допомогою точкового мутагенезу (pJFH9EH speF, 7502 п.о.) після приготування пробуло уведено оптимізований RBS. водили шляхом рестрикційного аналізу й наступФрагмент ДНК із 2235 п.о., який включає speC, ного секвенування. був ампліфікований із хромосомної ДНК Е. coli (іі) Конструювання плазміди pDAB4 LJ110 (номер доступу АЕ000379; нуклеотиди 2650(pJF119EH-speC) 4867) із застосуванням наступних олігонуклеотиКонститутивний біосинтетичний ген speC Е. дів: coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури), який кодує орнітиндекарбоксилазу, був клоно(мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Xbal - курсивом) і (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Sphl - курсивом). Після заключної модифікації ендонуклеазами основні процедури), який кодує NXbal і Sphl, продукт ПЦР було ліговано у плазміду ацетилглутаматсинтазу, був клонований в експреpJF119EH, яка була розрізана у той же спосіб. Пісійний вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), дивися (і)). Ген був клонований сля трансформації клітин Е. coli DH5 (Invitrogen, з оригінальними RBS і стоп-кодоном. Однак старт Karlsruhe, Німеччина) трансформовані клітини бутрансляції був змінений з GTG на ATG. ли відібрані на чашках з LB агаром, що включає Фрагмент ДНК із 1365 п.о., який кодує argA, 100мг/л ампіциліну. Верифікацію отриманої плазбув ампліфікований із хромосомної ДНК Е. coli міди pDAB4 (pJF119EH speC, 7491 п.о.) після приLJ110 (номер доступу АЕ000365; нуклеотиди 3312готування проводили шляхом рестрикційного ана4643) із застосуванням наступних олігонуклеотилізу й наступного секвенування. дів: (ііі) Конструювання плазміди pDAB1 (pJF119EH-argA) Ген ArgA Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див [SEQ ID: No. 5] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт EcoRI - курсивом) і [SEQ ID: No. 6] (мутації показані жирним шрифтом, рестрик(рJF119EH-argA, 6627 п.о.) після приготування ційний сайт Kpnl - курсивом). проводили шляхом рестрикційного аналізу й наНа закінчення фрагмент був модифікований ступного секвенування. рестрикційними ендонуклеазами EcoRI і Kpnl і по(iv) Конструювання плазміди pDAB5 тім ліговано в експресійну плазміду pJF119EH, яка (pJF119EH-argA-speF) була розрізана тим же способом. Після трансфорДля того щоб забезпечити паралельну продукцію орнітиндекарбоксилази SpeF і Nмації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, ацетилглутаматсинтази ArgA, кодуючий ген speF Німеччина) трансформовані клітини були відібрані Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див. основні прона чашках з LB агаром, що включає 100мг/л ампіцедури) було клоновано в arg-експресійний вектор циліну. Верифікацію отриманої плазміди pDAB1 19 pDAB1 (дивися (ііі)). Фрагмент ДНК довжиною 2225 п.о., який включає speF, було вирізано зі сконструйованої плазміди pDAB2 (дивися А.1) шляхом обробки ендонуклеазами Kpnl і Xbal і ліговано у плазміду pDAB1, що включає argA (дивися (ііі)), розрізану подібним чином. Після трансформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина) трансформовані клітини були відібрані на чашках з LB агаром, що включає 100мг/л ампіциліну. Верифікацію отриманої плазміди pDAB5 (pJF119EH-argA-speF, 8841 п.о.) для паралельної продукції SpeF і ArgA після приготування проводили шляхом рестрикційного аналізу. (v) Конструювання плазміди pDAB6 (pJF119EH-argA-speC) Для того щоб забезпечити паралельну продукцію орнітиндекарбоксилази SpeC і Nацетилглутаматсинтази ArgA, кодуючий ген speC Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et аl., див основні процедури) було клоновано в arg-експресійний вектор pDAB1 (дивися ііі) 1) . Шляхом розщеплення сконструйованої плазміди pDAB4 (див. іі) ендонуклеазами Xbal і Sphl, був відділений фрагмент розміром 2225 п.о., який включає ген speC із оптимізованим RBS. Потім 90479 20 фрагмент було ліговано у плазміду pDAB1 (дивися (і)), яка включає argA, що була розрізана в такий же спосіб. Після трансформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини були відібрані на чашках з LB агаром, що включає 100мг/л ампіциліну. Після приготування верифікація отриманої плазміди pDAB6 (pJF119EH arga-speC, 8830 п.о.), яка дозволяє забезпечити паралельну експресію speC і argA, була проведена рестрикційним аналізом і наступним секвенуванням. (vi) Конструювання плазміди pDAB7 (pJF119 ЕН-sреAB) Ген speA, який кодує аргиніндекарбоксилазу, а також ген speB, який кодує агматиназу Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et аl., див основні процедури) були клоновані в експресійний вектор pJF119EH (Furste, J.P. et al. (1986), дивися (і)). Таким шляхом була збережена оригінальна структура оперона генів, а також RBS, старт- і стоп-кодони. Фрагмент ДНК довжиною 3079 п.о., який включає speAB, було ампліфіковано із хромосомної ДНК Е. coli LJ110 (номер доступу АЕ000377; нуклеотиди 1190-4247) із застосуванням наступних олігонуклеотидів: [SEQ ID: No. 7] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Xbal - курсивом) і [SEQ ID: No. 8] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикдозволяє забезпечити паралельну продукцію ційний сайт Sphl - курсивом). SpeFAB, була проведена після приготування рестПісля заключної модифікації рестрикційними рикційним аналізом. ендонуклеазами Xbal і Sphl, ДНК-фрагмент було (viii) Конструювання плазміди pDAB10 ліговано в експресійну плазміду pJF119EH, яка (pJF119EH-argA-speF-speAB) була розрізана у той же спосіб. Після трансфорДля того щоб забезпечити паралельну продукцію орнітиндекарбоксилази SpeF, аргиніндекармації клітин Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Нібоксилази SpeA, агматинази speB і Nмеччина) трансформовані клітини були відібрані ацетилглутаматсинтази ArgA, гени speAB Е. coli на чашках з LB агаром, що включає 100мг/л ампіLJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури) циліну. Верифікацію отриманої плазміди pDAB7 були клоновані в arg-spe-експресійний вектор (pJF119EH-speAB, 8839 п.о.) після приготування pDAB5 (дивися (iv)). проводили шляхом рестрикційного аналізу й наШляхом розщеплення плазміди pDAB7 (див. ступного секвенування. (vi)) рестрикційними ендонуклеазами Xbal і Sphl, (vii) Конструювання плазміди pDAB8 був відділений фрагмент розміром 3067 п.о., який (pJF119EH-speF-speAB) включає оперон генів speAB, і його було ліговано у Для того щоб забезпечити паралельну продуплазміду pDAB5, яка включає argA-speF (дивися кцію орнітиндекарбоксилази SpeF, аргиніндекар(iv)), що була розрізана в такий же спосіб. Після боксилази SpeA і агматинази speB, гени speAB Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et аl., див основні процедутрансформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, ри) були клоновані в spe-експресійний вектор Karlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини pDAB2 (дивися (і)). були відібрані на чашках з LB агаром, що включає Шляхом розщеплення плазміди pDAB7 (див. 100мг/л ампіциліну. Верифікація отриманої плаз(vi)) рестрикційними ендонуклеазами Xbal і Sphl, міди pDAB8 (pJF119EH-ArgA-speFAB, 11886 п.о.), був відділений фрагмент розміром 3067 п.о., який яка дозволяє забезпечити паралельну продукцію включає оперон генів speAB, і його було ліговано у ArgA і SpeFAB, була проведена після приготуванплазміду pDAB26, яка включає speF (дивися (і)), ня рестрикційним аналізом, що була розрізана в такий же спосіб. Після транс(іх) Конструювання плазміди pDAB37 (рJF119EH-argJBs-speF) формації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Для того щоб забезпечити паралельну продуKarlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини кцію орнітиндекарбоксилази SpeF і N2-ацетил-Lбули відібрані на чашках з LB агаром, що включає орнітин: L-глутамат-N-ацетилтрансферази ArgJ, 100мг/л ампіциліну. Верифікація отриманої плазяка кодується геном з Bacillus subtilis ATCC 10783, міди pDAB8 (pJF119EH-speFAB, 10547 п.о.), що 21 кодуючий ген argJ В. subtilis був клонований в speекспресійний вектор pDAB5 (дивися (iv)) шляхом заміщення представленого гена argA. Ген був клонований з оригінальним RBS і стоп-кодоном. ДНК-фрагмент, який містить argJ розміром 90479 22 1279 п.о., був ампліфікований із хромосомної ДНК Bacillus subtilis ATCC 10783 (номер доступу Z99109 (В. subtilis subsp. subtilis str.168, повний геном (розділ 6 з 21)); нуклеотиди 184321-185600) із застосуванням наступних олігонуклеотидів: [SEQ ID: No. 9] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт EcoRI - курсивом) і [SEQ ID: No. 10] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикstr.168 (номер доступу САВ12961) білок ArgJ, який ційний сайт Kpnl - курсивом). Олігонуклеоиди були кодується argJ геном, представленим у плазміді сконструйовані відповідно до послідовності argJ, pDAB37, демонструє наступні зміни: H72Q, Р74А, як представлено в геномі В. subtilis subsp. subtilis Т75А, L95I, F105L, G110D, H134Q, E142Q, А169Т, str.168. R181A, Т216І, A242G, D255E, N353H, I363L, Ампліфікований фрагмент ДНК і плазміда A380D, D383E. pDAB5 були оброблені рестрикційними ендонук(х) Конструювання плазміди pDAB38 леазами EcoRI і Kpnl. У випадку рDAB5 були (pJF119EH-argJCg-speF) отримані два фрагменти розміром 1355 п.о. і 7486 Для того щоб забезпечити паралельну продуп.о. Фрагмент розміром 7486, який включає вектор кцію орнітиндекарбоксилази SpeF і N2-ацетил-LpJH119EH і ген speF, було ізольовано і ліговано з орнітин: L-глутамат-N-ацетилтрансферази ArgJ, ампліфікованним фрагментом ДНК. Після трансяка кодується геном з Corynebacterium glutamicum, кодуючий ген argJ С. glutamicum ATCC 13022 був формації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, клонований в spe-експресійний вектор pDAB5 (диKarlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини вися (iv)) шляхом заміщення представленого гена були відібрані на чашках з LB агаром, що включає argA. Ген був клонований з оригінальним RBS і 100мг/л ампіциліну. Верифікація отриманої плазстоп-кодоном. міди pDAB8 (pJF119EH-argJBs-speC, 8749 п.о.), Фрагмент ДНК, який включає argJ розміром була проведена після приготування рестрикційним 1219 п.о., був ампліфікований із хромосомної ДНК аналізом і наступним секвенуванням. СеквенуванС. glutamicum ATCC 13022 (номер доступу ня виявило, що argJ ген, клонований з В. subtilis NC006958 (С. glutamicum ATCC 13022, повний ATCC 10783, відрізняється від описаного раніше геном); нуклеотиди 1466650-1467869) із застосуargJ гена з В. subtilis subsp. subtilis str.168. У порівванням наступних олігонуклеотидів: нянні з білком ArgJ з В. subtilis subsp. subtilis [SEQ ID: No. 11] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт EcoRI - курсивом) і [SEQ ID: No. 12] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикКонститутивний біосинтетичний ген speC Е. ційний сайт Kpnl - курсивом). coli LJ110 (Zeppenfeld, et аl., див основні процедуАмпліфікований фрагмент ДНК і плазміда ри), який кодує орнітиндекарбоксилазу, був клоноpDAB5 були оброблені рестрикційними ендонукваний в експресійний вектор PJF119EH (Furste, леазами EcoRI і Kpnl. У випадку pDAB5 були J.P. et al. (1986) Gene 48, 119-131), що дозволяє отримані два фрагменти розміром 1355 п.о. і 7486 забезпечити сильну експресію гена, яка ґрунтуєтьп.о. Фрагмент розміром 7486 п.о., який включає ся на транскрипційному контролі під IPTG індуцивектор PJH119EH і ген speF, було ізольовано і бельним tac промотором і lac репресорну систему ліговано з ампліфікованим фрагментом ДНК. Після (laclQ) . Таким чином, кодуючий ген spec був клонований з оригінальним RBS, старт- і стоптрансформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, кодонами. Karlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини ДНК-фрагмент, який включає speCnRBS, розмібули відібрані на чашках з LB агаром, що включає ром 2235 п.о., був ампліфікований із хромосомної 100мг/л ампіциліну. Верифікація отриманої плазДНК Е. coli LJ110 (номер доступу АЕ000379; нукміди рDAB8 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 п.о.) леотиди 2650-4867) із застосуванням наступних була проведена після приготування рестрикційним олігонуклеотидів: аналізом і наступним секвенуванням. (хі) Конструювання плазміди pDAB3 (pJF119EH-speCnRBS) [SEQ ID: No. 13] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Xbal - курсивом) і 23 90479 24 [SEQ ID: No. 14] (мутації показані жирним шрифтом, рестрикційний сайт Sphl - курсивом). Після заключної модифікації за допомогою ендонуклеаз Xbal і Sphl, продукт ПЦР було ліговано у плазміду pJF119EH, яка була розрізана в такий же спосіб. Після трансформації в клітини Е. coli DH5 (Invitrogen, Karlsruhe, Німеччина), трансформовані клітини були відібрані на чашках з LB агаром, що включає 100мг/л ампициліну. Верифікація отриманої плазміди pDAB8 (pJF119EH-argJCg-speF, 8679 п.о.), була проведена після приготування рестрикційним аналізом і наступним секвенуванням. Порівняльний експеримент А: Продукція 1,4-бутандіаміну завдяки винятково суперекспресії speC орнітиндекарбоксилази з експресією гена, індукованої IPTG (у колбі при погойдуванні) Вплив суперекспресії кодуючого орнітиндекарбоксилазу гена speC на продукцію 1,4бутандіаміну було досліджено в штамі-хазяїні Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури), що несе плазміду pDAB3 (дивися (іх)). Цей штам було тестовано в експериментах з колбою, що погойдується, із застосуванням мінімального сольового середовища, яке включає MgSO4 7H2O (300мг/л), CaCl2 2H2O (15мг/л), KH2PO4 (3г/л), K2HPO4 (12г/л), NaCl (100мг/л), (NH4)2SO4 (5г/л), Na цитрат 3H2O (1г/л), FeSO4 7H2O (75мг/л), тіамін-НСІ (вітамін B1) (5мг/л), а також мікроелементи Al2 (SO4)3 18H2O (3мг/л), CoCl2 6H2O (1,05мг/л), CuSO4 5H2O (3, 75мг/л), H3BO3 (0,75мг/л), MnCl2 4H2O (30мг/л), Na2MoO4 2H2O (4,5мг/л), NiSO4 6H2O (3мг/л), ZnSO4 7H2O (22,5мг/л). Основний розчин глюкози (500г/л) було автоклавовано окремо й додано до стерилізованого середовища до кінцевої концентрації 10г/л. У прекультуральне мінімальне сольове середовище, яке включає 10мг/л ампіциліну, додавали 1-5мкл/мл основного розчину мікроорганізмів і інкубували при 33°С і 180об./хв. протягом 16 год до оптичної щільності 2 при 620нм. 5мл цієї культури згодом застосовували для зараження основної культури, яка включає 50мл того ж середовища, яке інкубували протягом 24 год при 33°С і 180об./хв. Як тільки клітини досягали оптичної щільності 1,5 при 620нм (через 7 годин), була індукована експресія гена шляхом додавання 50мкм IPTG. Для того щоб спостерігати продукцію 1,4бутандіаміну в часі, при культивації через різні інтервали часу були відібрані зразки. Після відділення клітин центрифугуванням розведений супернатант аналізували із застосуванням рідинної хроматографії високого розрізнення. Включені аміни виявляли як похідні орто-фтальдиальдегіду при довжині хвилі світла 230нм на приладі HewlettPackard серії 1100 із застосуванням С18зворотньовазової колонки (Nucleosil 120-5 С18, Macherey&Nagel, Duren, Німеччина), урівноваженої 50% буфером В (буфер А, 0,1М ацетат натрію, рН 7,2; буфер У метанол) . Для розділення було застосовано наступний градієнт: 1-7хв лінійний градієнт буфера В від 50% до 75%зі швидкістю 0,5мл/хв, 7-13хв від 75% до 85% буфера В зі швидкістю 0,5мл/хв, 13-14,5хв від 85% до 50% буфера В зі швидкістю 1мл/хв, 14,5-17хв 50% буфера В зі швидкістю 15мл/хв і 17-20хв 50% буфер В зі швидкістю 0,5мл/хв. Із застосуванням стандартних речовин для калібрування були визначені наступні концентрації 1,4-бутандіаміну (див. Таблиця 1), які були верифіковані ЯМР-спектроскопією. Таблиця 1 Утворення 1,4-бутандіаміну із застосуванням суперпродукції орнітиндекарбоксилази в Е. coli Застосований штам LJ110 pDAB3 Експресований ген speC Приклади: Поліпшення продукції 1,4бутандіаміну шляхом збільшеної активності орнітиндекарбоксилази у поєднанні зі збільшеною активністю утворення N-ацетилглутамату Приклад 1. Продукція 1,4-бутандіаміну із застосуванням суперпродукції орнітиндекарбоксилази, а також суперпродукції ArgA (у колбі при погойдуванні) Вплив паралельної роботи Nацетилглутаматсинтази, яка каталізує першу стадію біосинтезу орнітину, починаючи із глутамату, і орнітиндекарбоксилази SpeF або SpeC на продукцію 1,4-бутандіаміну було досліджено на штаміхазяїні Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури), що несе плазміду рDAB5 (дивися (iv)) або pDAB6 (дивися (v)) . Концентрація 1,4-бутандіаміну (мг/л) 50 Ці штами були тестовані в експериментах з колбою, яка погойдується, у мінімальному сольовому середовищі (дивися Порівняльний експеримент А). Тому до прекультурального мінімального сольового середовища, що включає 100мг/л ампіциліну, додавали 1-5мкл основного розчину мікроорганізмів та інкубували при 33°С і 180об./хв. протягом 16 год до оптичної щільності при 620нм рівній 2. Потім 5мл цієї культури застосовували для зараження основної культури, що включає 50мл того ж середовища, яке було інкубоване протягом 24 год при 33°С і 180об./хв. Як тільки клітини досягали величини оптичної щільності 1,5 при довжині хвилі 620нм (після 7 год.), додаванням 10мкм IPTG була індукована експресія гена. Для того щоб спостерігати залежну від часу 25 90479 продукцію 1,4-бутандіаміну, через різні проміжки часу під час інкубації були відібрані зразки. Після відділення клітин шляхом центрифугування супернатант аналізували із застосуванням рідинної хроматографії високого розрізнення (дивися Порі 26 вняльний експеримент А). Із застосуванням стандартних речовин для калібрування були визначені наступні концентрації 1,4-бутандіаміну (див. таблиця 2). Таблиця 2 Утворення 1,4-бутандіаміну із застосуванням паралельної суперпродукції ArgA та орнітиндекарбоксилази в Е. coli Застосований штам LJ110 рDAB5 LJ110 pDAB6 Експресований ген ArgA speF ArgA speC Приклад 2. Продукція 1,4-бутандіаміну із застосуванням суперпродукції орнітиндекарбоксилази, а також суперпродукції ArgJ (колба з погойдуванням). Був досліджений вплив паралельної роботи N2-ацетил-L-орнітин: глутамат-Lацетилтрансферази, яка кодується геном ArgJ або з С. glutamicum, або з В. subtilis, і яка каталізує утворення N-ацетилглутамату й орнітину з Lглутамату й N-ацетилорнітину, і орнітиндекарбоксилази speF або speC на продукцію 1,4бутандіаміну в штамі-хазяїні Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури), що несе плазміду pDAB37 (дивися (іх)) або pDAB38 (дивися (х)). Ці штами були тестовані в експериментах з колбою, що погойдується, у мінімальному сольовому середовищі (дивися Порівняльний експеримент А). Тому до попередньої культури з мінімальним сольовим середовищем, що включає 100мг/л ампіциліну, додавали 1-5мкл/мл основного розчину мікроорганізмів і інкубували при 33°С, 180об./хв. протягом 16 год. до оптичної щільності Концентрація 1,4-бутандіаміну (мг/л) 893 1064 при 620нм, рівної 2. 5мл цієї культури потім було застосовано для зараження основної культури, що включає 50мл того ж середовища, що інкубували протягом 24 год при 33°С і 180об./хв. Як тільки клітини досягали оптичної щільності 1,5 при довжині хвилі 620нм (після 7ч), була індукована експресія гена шляхом додавання 50мкм IPTG. Для спостереження за продукцією 1,4бутандіаміну в часі в різні проміжки часу культивації були відібрані зразки. Після відділення клітин центрифугуванням супернатант аналізували із застосуванням ЯМР. Значення рН у зразках супернатанта культури було доведено до 5,8, вони були ліофілізованні й повторно розчинені в D2O. H1ЯМР при 600МГц і 323До показав очікувані спектри резонансу, і піки, отримані при додаванні невеликих кількостей 1,4-бутандіаміну, підтвердили його присутність. При застосуванні для калібрування стандартних речовин були визначені наступні концентрації 1,4-бутандіаміну (дивися таблицю 3). Таблиця 3 Утворення 1,4-бутандіаміну із застосуванням паралельної суперпродукції ArgJ і орнітиндекарбоксилази в Е. coli Застосований штам LJ110 рDAB37 LJ110 рDAB38 Гени, щоекспресуються argJBs speF argJCg speF Приклад 3. Поліпшення продукції 1,4бутандіаміну в партії починаючи з орнітину, а також аргініну (колба з погойдуванням) Для демонстрації додаткового поліпшення утворення 1,4-бутандіаміну, починаючи з орнітину, а також з аргініну, був досліджений вплив комбінованої суперпродукції орнітиндекарбоксилази SpeF, аргінідекарбоксилази SpeA і агматинази SpeB. Крім того, для забезпечення належних запасів попередника, ці дослідження поєднувалися з додатковим експериментом із суперпродукцією Nацетилглутаматсинтази ArgA, яка каталізує першу стадію біосинтезу орнітину, починаючи із глутамату. Таким чином, була проведена культивація в колбі, що погойдується, у мінімальному сольовому середовищі (дивися А.3) шляхом застосування Концентрація 1,4-бутандіаміну (мг/л) 1050 1130 штаму-хазяїна Е. coli LJ110 (Zeppenfeld, et al., див основні процедури), що несе плазміди pDAB8 і pDAB10, відповідно (дивися 2.2 і 2.3). Тому до попередньої культури з мінімальним сольовим середовищем, що включає 100мг/л ампіциліну, додавали 1-5мкл/мл основного розчину мікроорганізмів і інкубували при 33°С, 180об./хв. протягом 16 год. до оптичної щільності при 620нм, рівної 2. 5мл цієї культури потім було застосовано для зараження основної культури, що включає 50мл того ж середовища, яке інкубували протягом 24 год при 33°С і 180об./хв. Як тільки клітини досягали оптичної щільності 1,5 при довжині хвилі 620нм (після 7ч), була індукована експресія гена шляхом додавання 10мкм IPTG. Для спостереження за продукцією 1,4 27 90479 бутандіаміну в часі в різні інтервали часу культивації були відібрані зразки. Після відділення клітин центрифугуванням супернатант аналізували із застосуванням рідинної хроматографії високого 28 розрізнення (дивися Порівняльний експеримент А) . Із застосуванням стандартних речовин для калібрування були визначені наступні концентрації 1,4бутандіаміну (див. таблиця 4). Таблиця 4 Утворення 1,4-бутандіаміну, починаючи з орнітину, а також аргініну в Е. coli Застосований штам LJ110 рDAB8 LJ110 pDAB10 Експресований ген speFAB ArgA-speFAB Концентрація 1,4-бутандіаміну (мг/л) 1025 1433 29 90479 30 31 90479 32 33 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 90479 Підписне 34 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601