Спосіб ідентифікації патотипів картопляних нематод globodera

Реферат: Спосіб ідентифікації патотипів картопляних нематод включає в себе виділення білків з цист нематод. При цьому проводять ізоелектрофокусування білків цист патотипів та ізолятів картопляних нематод у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0; в результаті чого отримують специфічні для картопляних нематод білкові спектри, за якими ідентифікують виявлені ізоляти. UA 97673 U (12) UA 97673 U UA 97673 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до виявлення структурних елементів мікроорганізмів з ґрунту, а також для їх ідентифікації. В картоплярстві відомий спосіб диференціації патотипів картопляних нематод польовим методом за допомогою тест-сортів картоплі, які по-різному вражаються патотипами або ізолятами збудника хвороби у вогнищах, що аналізуються [1] (найближчий аналог). У вогнищах картопляних нематод навесні висаджують сорти-диференціатори картоплі: Лугівська, Водограй, S. andigenum (клон СРС 1673, S. multidisektum (клон Р55/7), S. kurtsianum КТТ (клон 60.21.19), S. vernei G-LKS (клон 58.1642/4), S. vernei (VTn) 2 (клон 62.33.3), S. vernei (клон 65.346/19) та S. vernei (клон 69.1377/94). Через 75 днів проводять облік уражених сортів картоплі, на яких нематоди розмножуються по-різному: 1 група - сорти картоплі, на яких розмножуються цисти всіх патотипів нематод: Лугівська; 2 група - сорти картоплі, на яких розмножуються цисти всіх картопляних нематод, крім Ro1: Водограй; 3 група - види картоплі, які диференційовано уражуються патотипами золотистих нематод: S. multidisektum (клон Р55/7), S. kurtsianum КТТ (клон 60.21.19), S. vernei GLKS (клон 58.1642/4), S. vernei (VTn) 2 (клон 62.33.3), S. vernei (клон 65.346/19) та S. vernei (клон 69.1377/94), який не уражується жодним патотипом картопляних нематод. За реакцією тест-сортів картоплі на зараження патогеном визначають, який патотип існує в даному вогнищі [2]. Згадані способи мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими і їх використання пов'язане з затратою часу, які займають цілий вегетаційний період розвитку патогена та рослин картоплі. 2. Використовується багато сортів-диференціаторів картоплі. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб біохімічної ідентифікації патотипів та ізолятів картопляних нематод, який може бути використаний фітосанітарною службою для диференціації патотипу у новому вогнищі хвороби. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі ідентифікацію патотипів проводять біохімічним методом ізоелектрофокусування білків патотипів та ізолятів картопляних нематод у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0. Таким чином патотипи збудника хвороби ідентифікують за їх білковим спектром. Результат, що досягається внаслідок цього, є більш точним, ніж при здійсненні інших способів та найближчого аналога. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити невідомий патотип або ізолят картопляних нематод за значно коротший термін часу (1 день). 2. Для його проведення застосовуються сполуки, які не є шкідливими для здоров'я людини. 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що при біохімічному дослідженні ізолятів картопляних нематод отримується специфічні білкові спектри. Приклад 1. Навесні, у квітні місяці, висаджують сорти-диференціатори та види картоплі: Лугівська, Обрій, Вернісаж, Кіммерія, S.andigenum (клон СРС 1673), S.multidisektum (клон Р55/7), S.kurtsianum КТТ (клон 60.21.19), S.vernei G-LKS (клон 58.1642/4), S.vernei (клон 65.346/19) та S.vernei (клон 69.1377/94) у виявлених вогнищах хвороби. Через 75 днів проводять облік уражених рослин картоплі, на яких нематоди розмножуються по-різному. Отримані результати наведено у таблиці. 1 група - сорти картоплі, які уражались всіма патотипами картопляних нематод: Лугівська; 2 група - сорти картоплі, які уражались всіма патотипами, крім Ro1: Водограй; 3 група - вид картоплі, який диференційовано уражався всіма ізолятами нематод, крім Ro1 та Ro4: S. andigenum (клон СРС 1673); 4 група - види картоплі, які уражались патотипами золотистої нематоди, але не блідою нематодою: S. vernei (VTn)2 (клон 62.33.3), S. vernei (клон 65.346/19). За реакцією тест-сортів картоплі на зараження патогеном визначають, який патотип існує в даному вогнищі [2]. Таким чином, у результаті проведення досліджень виявлено, що всі 5 ізолятів глободери, відібраних у різних вогнищах належать до патотипу Ro1. Приклад 2. Зі зразків цист картопляних нематод, відібраних з різних вогнищ глободерозу виділяють білки шляхом розтирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифугують протягом 10 хвилин при 8000 об/хв. [3]. При цьому білки виділяються в супернатант (центрифугат), а суміші випадають в осад, який видаляють. Супернатант використовують для ізоелектрофокусування білків у поліакриламідному гелі (Т - 5 %, С - 3 %) з амфолитом діапазону рН 3,5-10,0. Ізоелектрофокусування проводять при напрузі 600 В протягом 2-х годин [4,5]. Білкові спектри виявляють фарбуванням за допомогою Кумассі блакитним G-250. Для цього спочатку відмивають амфоліти сумішшю : трихлороцтова кислота : етанол : вода (10:25:65) і забарвлюють гель 0,05 % Кумассі блакитним G-250 в суміші: оцтова кислота : етанол : вода 1 UA 97673 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 (10:25:65). Відмивку від надлишку барвника проводять цією ж сумішшю [6]. Розрахунок білкових компонентів проводять розробленою нами комп'ютерною програмою [7]. В результаті проведених досліджень при ізоелектрофокусуванні ізоляту картопляної нематоди з с. Поркулина Путильського району Чернівецької області виявлено до 32 білкових компонентів (фіг. 1 - Ізоелектрофореграми білків ізолятів картопляних нематод Globodera, де: 1 - ізоелектрофореграма білків ізоляту картопляних нематод Globodera с. Поркулина, Путильського району Чернівецької області; 2 - ізоелектрофореграма білків ізоляту картопляних нематод Globodera с. Майдан Міжгірського району Закарпатської області; 3 ізоелектрофореграма білків ізоляту картопляних нематод Globodera с. Сурупи Рахівського району Закарпатської області; 4 - ізоелектрофореграма білків ізоляту картопляних нематод Globodera с. Ясіня Рухівського району Закарпатської області; 5 - ізоелектрофореграма білків ізоляту картопляних нематод Globodera с. Жорнава Велико-Березнянського району Закарпатської області; фіг. 2 - Ізоелектрофореграма білків цист картопляних нематод Globodera, виділених з вогнища с. Поркулина, Путильського району Чернівецької області). У ізоляту з с. Майдан Міжгірського району Закарпатської області на ізоелектрофореграмі виявлено до 33 білкових компонентів (фіг. 1, фіг. 3 - Ізоелектрофореграма білків цист картопляних нематод Globodera, виділених з вогнища с. Майдан Міжгірського району Закарпатської області). У ізоляту с. Сурупи Рахівського району Закарпатської області - 33 білкових компонентів (фіг. 1, фіг. 4 - Ізоелектрофореграма білків цист картопляних нематод Globodera, виділених з вогнища с. Сурупи Рахівського району Закарпатської області), у ізоляту з с. Ясіня, Рахівського району Закарпатської області - до 33 компонентів (фіг. 1, фіг. 5 Ізоелектрофореграма білків цист картопляних нематод Globodera, виділених з вогнища с. Ясіня Рахівського району Закарпатської області), у ізоляту з с. Жорнава Веліко-Березнянського району Закарпатської області на ізоелектрофореграмі виявлено також до 33 білкових компонентів (фіг. 1, фіг. 6 - Ізоелектрофореграма білків цисткартопляних нематод Globodera, виділених з вогнища с. Жорнава Велико-Березнянського району Закарпатської області). Таким чином, в результаті ідентифікації ізолятів картопляних нематод, відібраних з різних регіонів України шляхом ізолелектрофокусування їх білків у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,510,0 виявлено одинакові білкові спектри і встановлено, що всі відібрані ізоляти належать до патотипу Ro1. Запропонований метод ідентифікації патотипів картопляних нематод Globodera підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при біохімічній ідентифікації ізолятів картопляних нематод з різних регіонів України. Літературні джерела: 1. Положення про порядок випробування селекційного матеріалу картоплі на стійкість проти раку та золотистої картопляної цистоутворюючої нематоди. Ч. - 1999. - 14 с. 2. Деккер X. Нематоды растений и борьба с ними / X. Деккер // М.: Колос, 1972. - 443 с. 3. Кирьянова Е.С. Методы исследования нематод сельскохозяйственных растений, почвы и насекомых / Е.С. Кирьянова // М.-Л.: АН СССР, 1983. - 33 с. 4. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // М.: Колос, 1973. - 336 с. 5. Остерман Н.А. Исследование биологических макромолекул электрофорезом, ультрацентрифугированием / Н.А. Остерман // М.: Наука, 1983. - 304 с. 6. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусирование белков. Теория, методы, применение / Ригетти Т. // М.: Мир. - 1986. - 294 с. 7. Авт. свід. № 26245 від 29.10.2008 р. Комп'ютерна програма "Розрахунок ізоелектричних білкових спектрів" / Мельник П.О., Куц B.C., Сологуб О.С. 2 UA 97673 U Таблиця Ідентифікація ізолятів картопляних нематод Globodera в Україні за допомогою сортівдиференціаторів (2014р.) № групи 1 2 3 4 5 6 Рослини-диференціатори Лугівська Водограй S. andigenum (клон СРС 1673 і нематодостійкі сорти картоплі) S. multidisektum (клон Р55/7) S. kurtsianum KTT (клон 60.21.19) S. vernei G-LKS (клон 58.1642/4) S. vernei (клон 65.346/19) S. vernei (клон 69.1377/94) Ізоляти с. Поркулина с. Майдан с. Сурупи с. Ясіня с. Жорнава 1 2 3 4 5 + + + + + + + + + + «+» - цисти нематод розмножуються; «-» - цисти нематод не розмножуються ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб ідентифікації патотипів картопляних нематод, який включає в себе виділення білків з цист нематод, який відрізняється тим, що проводять ізоелектрофокусування білків цист патотипів та ізолятів картопляних нематод у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0; в результаті чого отримують специфічні для картопляних нематод білкові спектри, за якими ідентифікують виявлені ізоляти. 3 UA 97673 U 4 UA 97673 U 5 UA 97673 U 6 UA 97673 U 7 UA 97673 U 8 UA 97673 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9