Послідовності унікальні для кукурудзи mir162

1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка відрізняється тим, що містить послідовність нуклеотидів, яка є унікальною для сорту MІR162, де послідовність нуклеотидів вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49 та комплементарних до них, та де послідовність нуклеотидів є діагностичною для сорту MIR162. 2. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що послідовність нуклеотидів кодує інсектицидний білок, що містить послідовність амінокислот SEQ ID NО:2. 3. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти міститься в зерні кукурудзи, що депоноване в Американській колекції типів культур під інвентарним номером РТА-8166. 4. Амплікон, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1. 5. Пара полінуклеотидних праймерів, що включає перший полінуклеотидний праймер та другий полінуклеотидний праймер, які функціонують разом у ПЛР реакції за умови наявності еталону ДНК сорту M1R162 в зразку та продукують амплікон, діагностичний для сорту MIR162, де амплікон містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NО: 1, SEQ ID NО: 38, SEQ ID NО: 41, SEQ ID NО: 45, SEQ ID NО; 47, SEQ ID NО: 49, SEQ ID NО: 55, SEQ ID NО: 59 та комплементарних до них. 6. Пара праймерів за п. 5, яка відрізняється тим, що перша послідовність праймера та/або друга 2 (19) 1 3 полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NO: 37. 14. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 13, яка відрізняється тим, що амплікон складається з SEQ ID NO: 38. 15. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 8, яка відрізняється тим, що перший полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NО: 39 та другий полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NO: 40. 16. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 15, яка відрізняється тим, що амплікон складається з SEQ ID NO: 41. 17. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 8, яка відрізняється тим, що перший полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NO: 53 та другий полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NО: 54. 18. Пара пoлiнyклеoтидниx праймерів за п. 17, яка відрізняється тим, що амплікон складається з SEQ ID NO: 55. 19. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 8, яка відрізняється тим, що перший полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NO: 58 та другий полінуклеотидний праймер складається з SEQ ID NО: 56. 20. Пара полінуклеотидних праймерів за п. 19, яка відрізняється тим, що амплікон складається з SEQ ID NO: 59. 21. Спосіб виявлення присутності молекули нуклеїнової кислотної, яка є унікальною для сорту MIR162, в зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, який відрізняється тим, що включає: (а) з'єднання зразка з парою праймерів, що при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК сорту MIR162 продукує амплікон, який є діагностичним для сорту MIR162; (в) проведення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з одержанням амплікону; та (с) виявлення амплікону. 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що амплікон містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NО: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 або їх комплементи. 23. Спосіб виявлення присутності молекули нуклеїнової кислотної, яка є унікальною для сорту MIR162 в зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, який відрізняється тим, що включає: (a) з'єднання зразка із зондом, який в умовах високої суворості гібридизується з геномною ДНК сорту MIR162 та не гібридизується з ДНК контрольної рослини кукурудзи; (b) піддавання зразка та зонда умовам гібридизації високої суворості; та (c) виявлення гібридизації зонда до молекули нуклеїнової кислотної. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що зонд містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 та комплементарних до них. 25. Набір для виявлення нуклеїнових кислот, які є унікальними для сорту MIR162, який відрізняєть 95637 4 ся тим, що який містить як мінімум одну молекулу нуклеїнової кислоти з достатньою довжиною суміжних полінуклеотидів для того, щоб функціонувати в способі виявлення праймера або зонда в нуклеїновій кислоті, і який при ампліфікації або гібридизації до цільової послідовності нуклеїнової кислоти в зразку, з наступним виявленням амплікону або гібридизацією до цільової послідовності, є діагностичним для присутності послідовностей нуклеїнових кислот, унікальних для сорту MIR162, в зразку, де послідовності нуклеїнових кислот, унікальних для сорту MIR162 вибрана з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59 та комплементарних до них. 26. Набір за п. 25, який відрізняється тим, що молекула нуклеїнової кислоти являє собою праймер, вибраний з групи, що складається з SEQ ID NО: 15-37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50-54, SEQ ID NO: 56-58, SEQ ID NO; 60-105 та комплементарних до них. 27. Трансгенна рослина кукурудзи, її клітини або тканини, які відрізняються тим, що містять молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1. 28. Рослина кукурудзи за п. 27, яка відрізняється тим, що гідроліз геномної ДНК рослини за допомогою рестрикційної ендонуклеази КрnІ, EcoRV або NcoI приводить до утворення єдиної смужки гібридизації в умовах високої суворості при застосуванні зонда, що містить як мінімум 10 суміжних нуклеотидів SEQ ID NO: 1 або комплементарної до неї. 29. Рослина кукурудзи за п. 28, яка відрізняється тим, що зонд містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO; 13 або комплементарну до неї. 30. Рослина кукурудзи за п. 27, яка відрізняється тим, що рослина кукурудзи є резистентною до комах. 31. Рослина кукурудзи за п. 30, яка відрізняється тим, що резистентність до комах забезпечується завдяки експресії SEQ ID NO: 1, гена vip3Aa20. 32. Зерно кукурудзи, яке відрізняється тим, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 1. 33. Зерно кукурудзи, яке відрізняється тим, що є депонованим в Американській колекції типів культур за інвентарним номером РТА-8166. 34. Трансгенна рослина кукурудзи, яка відрізняється тим, що продукується із зерна за п. 32. 35. Біологічний зразок, одержаний з рослини кукурудзи сорту MIR162, тканини, або зерна, який відрізняється тим, що зразок містить послідовність нуклеотидів, що являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 або SEQ ID NO: 59, і де послідовність можна виявити в зразку із застосуванням ампліфікації нуклеїнової кислоти або способу гібридизації нуклеїнової кислоти, таким чином виявляючи присутність ДНК сорту MIR 162. 36. Біологічний зразок за п. 35, який відрізняється тим, що зразок вибраний з групи, що складається з кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна крупного помелу, кукурудзяного сиропу, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю та круп, що 5 95637 6 вироблені з суцільного зерна або частково містять побічні продукти переробки кукурудзи. 37. Екстракт, одержаний з біологічного зразка рослини кукурудзи сорту MIR162, тканини або зерна, що містить послідовність нуклеотидів, що являє собою або є комплементарною до SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 або SEQ ID NO: 59. 38. Екстракт за п. 37, який відрізняється тим, що послідовність можна виявити в екстракті із застосуванням ампліфікації нуклеїнової кислоти або способу гібридизації нуклеїнової кислоти. 39. Екстракт за п. 37 або 38, який відрізняється тим, що зразок вибраний з групи, що складається з кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна крупного помелу, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю, кукурудзяного сиропу та круп, що вироблені з суцільного зерна або частково містять побічні продукти переробки кукурудзи. 40. Спосіб продукування рослини кукурудзи, стійкої до лускокрилих шкідників, який включає: (a) статеве схрещення першої материнської рослини кукурудзи з другою материнською рослиною кукурудзи, де вказана перша або друга материнська рослина кукурудзи містить ДНК сорту MIR162, з одержанням численного потомства рослин першої генерації; (b) вибір рослини з потомства першої генерації, яка є стійкою до інвазії лускокрилих комах; (с) самозапилення рослини з потомства першої генерації, з одержанням численного потомства рослин другої генерації; (d) вибір з числа рослин потомства другої генерації рослини, яка є стійкою до лускокрилих шкідників; де рослини потомства другої генерації містять SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 або SEQ ID NO: 59. 41. Спосіб продукування гібридних зерен кукурудзи, що включає: (a) насадження зерен першої інбредної лінії кукурудзи, що містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55 або SEQ ID NO: 59, та зерен другої інбредної лінії, що має інший генотип; (b) культивація рослин кукурудзи, які одержані з вказаних вище насаджень до часу цвітіння; (c) вихолощування вказаних квіток рослин однієї з інбредних ліній кукурудзи; (d) статеве схрещення двох різних інбредних ліній одна з одною; та (е) збір урожаю гібридного зерна, продукованого таким чином. 42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що рослини першої інбредної лінії кукурудзи є жіночими материнськими особинами. 43. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що рослини першої інбредної лінії кукурудзи є чоловічими материнськими особинами. 44. Гібридне зерно, яке відрізняєтьсятим, що є продукованим у відповідності до способу за п. 41. 45. Рослина кукурудзи, яка відрізняється тим, що є продукованою вирощуванням гібридного зерна кукурудзи за п. 44. 46. Виділений інсектицидний білок сорту MIR162, який відрізняється тим, що містить SEQ ID NО:2. 47. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка відрізняється тим, що кодує інсектицидний білок сорту MIR162 за п. 46. 48. Химерний ген, який відрізняється тим, що містить послідовність гетерологічного промотору, функціонально зв'язану з молекулою нуклеїнової кислоти за п. 47. 49. Рекомбінантний вектор, який відрізняється тим, що містить химерний ген за п. 48. 50. Трансгенна клітина-хазяїн, яка відрізняється тим, що містить химерний ген за п. 48. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ [0001] Даний винахід загалом стосується галузі молекулярної біології рослин, перетворення рослин і розмноження рослин. Більш конкретно, винахід стосується трансгенних рослин кукурудзи, стійких до комах, що включають новий трансгенний генотип, і способів виявлення присутності нуклеїнових кислот, які є унікальними для трансгенних рослин кукурудзи, в зразку і в його композиціях. [0002] Шкідники рослин являють собою головний фактор зниження врожаю важливих сільськогосподарських культур у світі. Близько $8 мільярдів втрачають щороку в США тільки за рахунок інвазій шкідників - не ссавців, включаючи комах. На додаток до зниження урожаю польових культур, шкідливі комахи також призводять до збільшення витрат при вирощуванні овочів і фруктів, створюють проблеми виробникам декоративних квітів і власникам присадибних ділянок. [0003] Кількість шкідливих комах переважно контролюють інтенсивним застосуванням хімічних пестицидів, які діють шляхом пригнічення росту комах, запобігання харчуванню або розмноженню комах, або спричиняють їх загибель. Таким чином може бути досягнутий достатній контроль чисельності комах, але такі хімічні речовини іноді також можуть вражати інших, корисних комах. Інша проблема, яка виникає внаслідок широкого застосування хімічних пестицидів, являє собою появу стійких різновидів комах. Дана проблема частково вирішується різними методами управління резистентністю, але все більшою стає потреба в альтернативних агентах боротьби зі шкідниками. Біологічні агенти для боротьби з шкідниками, наприклад, штами Bacillus thuringiensis (Bt), що експресують пестицидні токсини, подібні до 5 7 ендотоксинів, також застосовували для хлібних злаків із задовільними результатами, пропонуючи альтернативу або доповнення до хімічних пестицидів. Гени, що кодують деякі з цих 6ендотоксинів, виділені, і показано, що їх експресія в гетерологічних хазяях може забезпечити інший інструмент контролю економічно важливих шкідливих комах. Зокрема, експресія 6-ендотоксинів Bt забезпечила ефективний захист проти відібраних шкідливих комах, і розведення трансгенних рослин, що експресують такі токсини, поставлено на комерційну основу, дозволяючи фермерам зменшити застосування хімічних агентів для контролю комах. [0004] Інша родина інсектицидних білків, продукованих видами Bacillus протягом вегетативної стадії росту (вегетативні інсектицидні білки [Vip]), також ідентифікована. Патенти США 5, 877, 012, 6, 107, 279, і 6, 137, 033, які включені до даного опису шляхом посилання, описують новий клас інсектицидних білків під назвою Vip3. Інші відкриття, зокрема WO98/18932, WO98/33991, WO98/00546 і WO99/57282, також ідентифікували гомологи класу білків Vip3. Послідовності кодування Vip3 кодують білки розміром приблизно 88 кДа, які володіють інсектицидною активністю проти широкого спектру лускокрилих шкідників, зокрема, але не обмежуючись ними, чорного озимого черв'яка совки (совкиіпсилон) (BCW, Agrotis ipsilon), трав'яної совки (FAW, Spodoptera frugiperda), тютюнової листовіртки-брунькоїда (TBW, Heliothis virescens), червиці цукрової тростини (SCB, Diatraea saccharalis), меншої червиці стебла кукурудзи (LCB, Elasmopalpus lignosellus), і коробчастого черв'яка (CEW, Helicoverpa zea), і при експресії в трансгенних рослинах, наприклад кукурудзі (Zea mays), надають захист рослинам від пошкодження через поїдання комахами. [0005] Дані способи перетворення рослин загалом призводять до випадкової інтеграції трансгенів, подібних до vip3, в геном рослини-хазяїна. Дана випадкова вставка введеної ДНК в геном рослин може бути смертельною, якщо чужорідна ДНК вставляється всередину і видозмінює критично важливий природний ген. Крім того, навіть якщо випадкова вставка не послаблює функціонування гена клітини-хазяїна, на експресію вставленого чужорідного гена можуть вплинути "ефекти положення", викликані навколишньою геномною ДНК. У деяких випадках ген вводиться в сайти, де ефекти положення є достатньо сильними, щоб запобігти синтезу ефективної кількості продукту з введеного гена. Наприклад, спостерігається, що в рослинах можуть існувати широкі варіації рівнів експресії гетерологічного гена, введеного в хромосому рослини, серед індивідуально відібраних випадків. Також можуть існувати просторові або часові відмінності в зразках експресії, наприклад, відмінності у відносній експресії трансгена в різних тканинах рослини, це може не відповідати зразкам, очікуваним як результат наявності транскрипційних регуляторних елементів у введеній конструкції гена. В інших випадках надмірне продукування продукту гена здійснює шкідливий вплив на клітину. Через ці потенційні проблеми прийнято продукувати сот 95637 8 ні різних варіантів і відбирати з них єдиний, який демонструє бажаний характер і рівні експресії трансгена, з комерційною метою. Однак, як тільки комерційно життєздатний сайт в межах генома рослини ідентифікований, переважним є спрямування цільових генів до такого сайта, де можлива модифікація без шкоди для рослини. [0006] Описано декілька способів цілеспрямованої вставки цільової послідовності нуклеотидів в специфічний хромосомний сайт в межах рослинної клітини. Специфічні для сайта системи рекомбінації ідентифіковані в декількох прокаріотних і нижчих еукаріотних організмах. Такі системи звичайно включають один або більше білків, які розпізнають дві копії специфічної послідовності нуклеотиду, розщеплюють і лігують такі послідовності нуклеотидів, і таким чином забезпечують точний, специфічний для сайта обмін генетичної інформації. Декілька сайт-специфічних рекомбіназ відомо в даній області. Вони включають, не обмежуючись ними, напр., систему бактеріофага PI Cre/lox (Austin et ah (1981) Cell 25:729-736), систему рекомбінази R/RS з плазміди pSRl дріжджів Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Моl. Biol.182:191-203), систему Gin/gix фага Mu (Maeser and Kahlmann (1991) Моl. Gen. Genet. 230:170176), систему рекомбінази FLP/FRT з плазміди 2.mu.m дріжджів Saccharomyces cerevisiae (Broach et al. (1982) Cell 29:227-234), і рекомбіназу Int з бактеріофага Лямбди бактеріофага (Landy (1989) Annu. Rev. Biochem. 58:912-949; Landy (1993) Curr.Opin.Genet.Dev.3: 699-707; Lorbach et al. (2000) J. Моl. Biol. 296:1175-1181; і WO 01/16345). В одному особливо придатному специфічному для сайта цільовому підході, розкритому в публікації патентної заявки США №2006/0130179, яка включена до даного опису шляхом посилання, застосовують рекомбінацію, опосередковану інтегразою лямбда. Спосіб включає введення в рослинну клітину цільової послідовності нуклеотидів, що містить перший сайт розпізнавання інтегрази; введення в рослинну клітину послідовності донорських нуклеотидів, що містить другий сайт розпізнавання інтегрази; і введення в рослинну клітину інтегрази або комплексу інтеграз. Інший придатний, специфічний для сайта цільовий підхід розкритий в публікації патентної заявки США № 2006/0253918, яка включена до даного опису шляхом посилання, в якому застосовують гомологічну рекомбінацію з метою інтеграції одного або більше генів ("стекінг" генів) у специфічних місцях розташування в геномі. [0007] Результат, який демонструє бажаний рівень або характер експресії трансгена, придатний для інтрогресії трансгена на інші генетичні підґрунтя статевим схрещуванням за допомогою звичайних методів розмноження. Нащадки такого схрещування зберігають характеристики експресії трансгена оригінального трансформанта. Дану стратегію застосовують, щоб гарантувати надійну експресію гена в ряді сортів, добре пристосованих до місцевих умов вирощування. Також переважно мати можливість виявляти присутність конкретного результату для визначення того, чи містить нащадок статевого схрещування необхідний трансген. 9 Крім того, спосіб виявлення конкретного випадку буде корисним для задоволення вимог регуляторних норм, що вимагають, наприклад, схвалення перед виведенням на ринок і позначення їжі, виробленої з рекомбінантних хлібних рослин. Можна виявити присутність трансгена будь-яким відомим способом виявлення нуклеїнових кислот, в тому числі, але не обмежуючись ними, термічною ампліфікацією (полімеразна ланцюгова реакція), застосовуючи полінуклеотидні праймери, або гібридизацію ДНК, застосовуючи зонди нуклеїнових кислот. Звичайно, заради простоти і одноманітності реактивів і методик, які застосовують у виявленні конкретної конструкції ДНК, яку застосовують для перетворення різних сортів рослини, такі способи виявлення загалом зосереджені на часто використовуваних генетичних елементах, наприклад, промоторах, термінаторах і маркерних генах, оскільки для багатьох конструкцій ДНК ділянка послідовності кодування взаємозамінною. В результаті, такі способи можуть бути непридатними для розпізнавання між конструкціями, які відрізняються тільки за послідовністю кодування. Крім того, такі способи можуть бути непридатними для розпізнавання між різними випадками, особливо одержаними із застосуванням такої ж конструкції ДНК, крім тих випадків, коли послідовність хромосомної ДНК, суміжної з вставленою гетерологічною ДНК ("фланкуючою ДНК"), є відомою. [0008] 3 вищевикладених причин, існує необхідність у трансгенних сортах кукурудзи, стійких до комах, що включають нові послідовності нуклеїнових кислот, унікальні для трансгенного сорту кукурудзи, придатні для ідентифікації трансгенного сорту кукурудзи і для виявлення нуклеїнових кислот з трансгенного сорту кукурудзи в біологічному зразку, а також існує необхідність в наборах, що містять реактиви, необхідні для застосування у виявленні цих нуклеїнових кислот в біологічному зразку. Крім того, існує необхідність у забезпеченні специфічних цільових сайтів в межах генома маїсу, щоб дозволити спрямування і контроль вставки послідовностей нуклеотидів, які повинні бути інтегровані в геном кукурудзи. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0009] Даний винахід стосується трансформованого сорту кукурудзи (Zea mays), позначеного MIR162, що має новий трансгенний генотип, який містить послідовність кодування vip3Aa20, яка є унікальною для сорту MIR162. Послідовність кодування Vip3Aa20 кодує інсектицидний білок Vip3Aa20, який надає рослинам кукурудзи MIR162 резистентності до комах. Сорт MIR162 також містить послідовність кодування pmi, що кодує білок РМІ, який надає клітинам кукурудзи здатності використовувати манозу як джерело вуглецю. На додаток до послідовності кодування vip3A20, даний винахід також пропонує інші нуклеїнові кислоти, які є унікальними для MIR162. Винахід також пропонує трансгенні рослини кукурудзи, що містять нуклеїнові кислоти, унікальні для MIR162, насіння трансгенних рослин кукурудзи, і способи одержання трансгенної рослини кукурудзи, що містить унікальні нуклеїнові кислоти за винаходом, схрещуванням рослин кукурудзи, які природжено 95637 10 містять нуклеїнові кислоти, унікальні для MIR162, між собою або з лінією кукурудзи іншого генотипу. Приклад насіння, і, відповідно, рослин кукурудзи, вирощених з насіння, які містять нуклеїнові кислоти, унікальні для MIR162, зберігається в Американській колекції типових культур, вхідний № РТА8166. Трансгенні рослини кукурудзи за винаходом можуть мати по суті всі морфологічні і фізіологічні характеристики відповідних ізогенних нетрансгенних рослин кукурудзи на додаток до наданих рослинам кукурудзи новим генотипом за винаходом. Біологічні зразки і екстракти з рослин кукурудзи MIR162, тканини і насіння також запропоновані в даному винаході. Даний винахід також пропонує композиції і способи виявлення присутності нуклеїнових кислот, унікальних для MIR162, в біологічних зразках, на базі послідовності ДНК рекомбінантних касет експресії, вставлених в геном кукурудзи, що привело до створення сорту MIR162, і геномних послідовностей, які фланкують сайт вставки. Даний винахід також пропонує цільовий сайт вставки на хромосомі маїсу, де модифікації можуть бути здійснені без шкоди для рослини, придатній для вставки цільових генів до специфічного місця розташування на хромосомі, і способи зміни генома маїсу шляхом вставки гетерологічних нуклеїнових кислот на показаному сайті вставки або поблизу розкритого сайта вставки. Сорт MIR162 можна, крім того, охарактеризувати, аналізуючи рівні експресії білків Vip3Aa20 і РМІ, а також перевіркою MIR162 на ефективність проти шкідливих лускокрилих комах. Даний винахід також пропонує способи одержання трансгенних рослин кукурудзи, стійких до ширшого спектру шкідливих комах, шляхом "стекінгу" ознаки стійкості до комах Vip3Aa20 з ознаками стійкості до комах, які відрізняються від Vip3Aa20. [0010] Вищевикладений та інші аспекти винаходу стануть більш зрозумілими з наступного детального опису. ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ У ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID No:1 являє собою послідовність кодування Vip3Aa20 в MIR162. SEQ ID No:2 являє собою послідовність амінокислот Vip3Aa20. SEQ ID No:3 являє собою послідовність плазміди pNOV1300. SEQ ID No:4-12 являють собою праймери і зонди, придатні для аналізу TAQMAN. SEQ ID No:13 являє собою послідовність зонда vip3Aa20. SEQ ID No:14 являє собою послідовність зонда pmi. SEQ ID No:15-37 являють собою праймери, придатні у відповідності до даного винаходу. SEQ ID No:38 являє собою послідовність амплікону vip3Aa20. SEQ ID No:39-40 являють собою праймери, придатні у відповідності до даного винаходу. SEQ ID No:41 являє собою послідовність амплікону CJ134/179 5'. SEQ ID No:42-43 являють собою праймери, придатні у відповідності до даного винаходу. 11 SEQ ID No:44 являє собою амплікон vip3Aa20 3'. SEQ ID No:45 являє собою з'єднання 5' вставки генома. SEQ ID No:46 являє собою послідовність генома кукурудзи, що фланкує 5' для вставки. SEQ ID No:47 являє собою з'єднання 3' генома вставки. SEQ ID No:48 являє собою геном кукурудзи, що фланкує 3' для вставки. SEQ ID No:49 являє собою вставку MIR162 і фланкуючі послідовності. SEQ ID No.50-54 являють собою праймери, придатні у відповідності до даного винаходу. SEQ ID No:55 являє собою амплікон 5' PCR. SEQ ID No.56-58 являють собою праймери, придатні у відповідності до даного винаходу. SEQ ID No:59 являє собою амплікон 3' PCR. SEQ ID No.60-105 являють собою праймери, у відповідності до даного винаходу. SEQ ID No:106 являє собою послідовність ділянки хромосоми маїсу 5, що містить показаний хромосомний цільовий сайт. SEQ ID No:107 являє собою геномну послідовність маїсу, яка була витіснена вставкою гетерологічної ДНК в MIR162. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС [0011] Наступні визначення і способи запропоновані, щоб краще визначити даний винахід і спрямувати фахівців у даній галузі в практиці даного винаходу. Якщо інше не згадується, терміни, використовувані в даному описі, необхідно розуміти згідно звичному застосуванню фахівцями в даній галузі. Визначення розповсюджених термінів у молекулярній біології також можна знайти в Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, th 5 edition, Springer-Verlag: New York, 1994. Номенклатура основ ДНК і амінокислот, як показано в 37 C.F.R. § 1, 822, застосовується в даному описі. [0012] В даному описі термін "ампліфікований" позначає конструювання множинних копій молекули нуклеїнової кислоти або множинних копій, комплементарних до молекули нуклеїнової кислоти, застосовуючи як мінімум одну з молекул нуклеїнових кислот як шаблон. Системи ампліфікації включають, не обмежуючись ними, систему полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР), ампліфікацію на базі послідовності нуклеїнової кислоти (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), системи Q-Beta Replicase, систему ампліфікації, засновану на транскрипції (TAS), і ампліфікацію зміщенням ланцюга (SDA). Див., наприклад, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). Продукт ампліфікації має назву амплікону. [0013] "Кодуюча послідовність " являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибована переписана в РНК, наприклад мРНК, рРНК, тРНК, ядерна РНК невеликого розміру, смислова РНК або анти-смислова РНК. Переважно РНК транслюється в організм з метою продукування білка. [0014] В даному описі термін "кукурудза" позначає Zea mays або маїс і включає всі сорти рос 95637 12 лини, які можуть схрещуватися з кукурудзою, в тому числі дикі види маїсу. [0015] "Набір для виявлення" в даному описі позначає набір частин, придатних для виявлення присутності або відсутності ДНК, унікальної для рослин MIR162 в зразку, де набір включає зонди нуклеїнових кислот та/або праймери за даним винаходом, які специфічно гібридизуються за дуже суворих умов з послідовністю цільової ДНК, і інші матеріали, необхідні для методів гібридизації або ампліфікації нуклеїнових кислот. [0016] В даному описі термін трансгенний "сорт" позначає рекомбінантну рослину, утворену трансформацією і регенерацією рослинної клітини або тканини з гетерологічною ДНК, наприклад, касета експресії, яка включає цільовий ген. Термін "сорт" позначає оригінальний трансформант та/або нащадків трансформанта, які включають гетерологічну ДНК. Термін "сорт" також позначає нащадків, утворених статевим схрещуванням між трансформантом та іншою лінією кукурудзи. Навіть після повторного зворотного схрещування з батьківською формою, вставлена ДНК і фланкуюча ДНК від перетвореного батька присутня в нащадках схрещування в такому ж хромосомному розташуванні. Термін "сорт" також позначає ДНК від оригінального трансформанта, що містить вставлену ДНК і фланкуючу геномну послідовність, безпосередньо суміжну з вставленою ДНК, яка, як очікувалося, перейде до нащадків, які одержують вставлену ДНК, зокрема, цільовий трансген, як результат статевого схрещування однієї материнської лінії, яка включає вставлену ДНК (наприклад, оригінальний трансформант і нащадок, отриманий у результаті самозапліднення) і материнську лінію, яка не містить вставлену ДНК. В нормі перетворення рослинної тканини дає багато різних випадків, кожний з яких представляє вставку конструкції ДНК в інше місце розташування в геномі рослинної клітини. На основі експресії трансгена або інших бажаних характеристик відбирають конкретний випадок. Таким чином, "сорт MIR162", "MIR162" або "MIR162 сорт" можна застосовувати рівнозначно. [0017] Стійка до комах рослина кукурудзи MIR162 може бути виведена першим статевим схрещуванням першої материнської рослини кукурудзи, що складається з рослини кукурудзи, вирощеної з трансгенної рослини кукурудзи MIR162, наприклад, рослини кукурудзи MIR162, вирощеної з насіння, що зберігається в АТСС за інвентарним номером РТА-6188, і її нащадка, що походить від перетворення за допомогою касет експресії варіантів за даним винаходом, який забезпечує резистентність проти комах, та другої материнської рослини кукурудзи, яка має недостатню резистентність проти комах, і таким чином одержують численні рослини першого покоління; а потім відбирають рослину першого покоління, яка стійка до комах; і самозапиленням рослин першого покоління одержують численні рослини другого покоління; а потім відбирають з рослин другого покоління рослину, стійку проти комах. Вказані стадії можуть додатково включати зворотне схрещування стійкої проти комах рослини першого 13 покоління або стійкої проти комах рослини другого покоління з другою материнською рослиною кукурудзи або третьою материнською рослиною кукурудзи; таким чином одержують рослину кукурудзи, яка є стійкою до комах. [0018] "Касета експресії" в даному описі, позначає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну до спрямування експресії конкретної послідовності нуклеотидів у відповідній клітині-хазяїні, що містить промотор, функціонально зв'язаний з цільовою послідовністю нуклеотидів, яка функціонально зв'язана з сигналами термінації. Вона також звичайно містить послідовності, необхідні для відповідної трансляції послідовності нуклеотидів. Касета експресії також може включати послідовності, які не обов'язково є необхідними для прямої експресії цільової послідовності нуклеотидів, але які присутні за рахунок придатних рестрикційних сайтів для видалення касети з вектора експресії. Касета експресії, що містить цільову послідовність нуклеотидів, може бути химерною, і це означає, що як мінімум один з її компонентів є гетерологічним по відношенню як мінімум до одного з інших її компонентів. Касета експресії може також зустрічатися в природі, але бути одержаною в рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак, звичайно, касета експресії є гетерологічною щодо хазяїна, тобто, конкретна послідовність нуклеїнових кислот касети експресії не зустрічається природно в клітині-хазяїні і повинна бути введена в клітину-хазяїна або предка клітини-хазяїна за способом трансформації, відомим у даній галузі. Експресія послідовності нуклеотидів у касеті експресії може здійснюватися під контролем конститутивного промотору або індукованого промотору, який ініціює транскрипцію тільки тоді, коли клітина-хазяїн піддана дії конкретного зовнішнього стимулу. У випадку багатоклітинного організму, наприклад рослини, промотор також може бути специфічним для конкретної тканини або органу, або стадії розвитку. Касета експресії, або її фрагмент, може також позначатися як "вставлена послідовність" або "послідовність вставки" при трансформації в рослину. [0019] "Ген" являє собою певну ділянку, яка розміщена в межах геному, яка окрім вищезазначеної кодуючої послідовності, може включати інші, перш за все регуляторні, послідовності нуклеїнових кислот, відповідальні за контроль експресії, транскрипцію і трансляцію кодуючої частини. Ген також може містити інші 5' і 3' нетрансльовані послідовності і термінаторні послідовності. Іншими елементами, які можуть бути присутніми, є, наприклад, інтрони. [0020] "Цільовий ген" означає будь-який ген, який при переміщенні в рослину надає рослині бажану характеристику, наприклад резистентність до антибіотиків, резистентність проти вірусів, резистентність проти комах, резистентність проти захворювань, або резистентність проти інших шкідників, толерантність до гербіцидів, підвищену харчову цінність, покращують промислову переробку або змінюють здатність до розмноження. [0021] "Генотип" у даному описі являє собою генетичний матеріал, успадкований від початкових 95637 14 рослин кукурудзи, який не обов'язково повністю експресується в рослинах-нащадках кукурудзи. Генотип MIR162 позначає гетерологічний генетичний матеріал, трансформований в геном рослини, а також генетичний матеріал, фланкуючий вставлену послідовність. [0022] "Гетерологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, природно не пов'язану з клітиноюхазяїном, в яку вона введена, зокрема множинні копії, які в природі не зустрічаються, послідовності нуклеїнової кислоти, яка зустрічається в природі. [0023] "Гомологічна" послідовність нуклеїнової кислоти являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, природно пов'язану з клітиною-хазяїном, в яку вона введена. [0020] "Функціонально зв'язаний" позначає об'єднання послідовностей нуклеїнових кислот на єдиному фрагменті нуклеїнової кислоти таким чином, що функція однієї впливає на функцію іншої. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю або функціональною РНК, якщо він здатний впливати на експресію вказаної кодуючої послідовності або функціональної РНК (тобто, що кодуюча послідовність або функціональна РНК знаходиться під транскрипційним контролем промотору). Кодуючі послідовності в смисловій або анти-смисловій орієнтації можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями. [0025] "Праймери" в даному описі являють собою ізольовані нуклеїнові кислоти, які гібридизовані з комплементарним ланцюгом цільової ДНК гібридизацією нуклеїнових кислот для утворення гібриду між праймером і ланцюгом цільової ДНК, а потім подовження вздовж ланцюга цільової ДНК під дією полімерази, наприклад ДНК-полімерази. Пари праймерів або набори можна застосовувати для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, полімеразною ланцюговою реакцією або іншими звичайними способами ампліфікації нуклеїнових кислот. [0026] "Зонд" являє собою ізольовану нуклеїнову кислоту, до якої приєднана звичайна мітка для виявлення або молекула репортера, наприклад радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Такий зонд є комплементарним до ланцюга цільової нуклеїнової кислоти, у відповідності до даного винаходу, до ланцюга геномної ДНК кукурудзи сорту MIR162. ДНК MIR162 може походити з рослини кукурудзи або із зразка, який містить ДНК MIR162. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди та інші матеріали зонда, які специфічно зв'язуються з послідовністю цільової ДНК і які можна застосовувати для виявлення присутності вказаної послідовності цільової ДНК. [0027] Довжина праймерів і зондів становить загалом від 10 до 15 нуклеотидів або більше. Праймери і зонди також можуть бути довжиною як мінімум 20 нуклеотидів або більше, або як мінімум 25 нуклеотидів або більше, або як мінімум 30 нуклеотидів або більше. Такі праймери і зонди специфічно гібридизуються з цільовою послідовністю 15 за дуже суворих умов гібридизації. Праймери і зонди за даним винаходом можуть бути повністю комплементарними по відношенню до послідовності з цільовою послідовністю, хоча зонди, які відмінні від цільової послідовності і зберігають здатність гібридизуватися з цільовими послідовностями, можна конструювати звичайними способами. [0028] В даному описі "стекінг" генів або ознак являє собою об'єднання бажаних ознак в одну трансгенну лінію. Фахівці здійснюють "стекінг" трансгенних ознак за допомогою схрещування батьківських особин, кожна з яких має бажану ознаку, а потім ідентифікують нащадків, які мають обидві бажані ознаки. Інший спосіб "стекінгу" генів полягає в перенесення двох або більше генів у ядро клітини рослини одночасно з перетворенням. Іншим способом "стекінгу" генів є повторна трансформація трансгенної рослини з іншим цільовим геном. Наприклад, "стекінг" гена можна застосовувати, щоб об'єднати ознаки резистентності проти двох різних комах, ознаку резистентності проти комах і ознаку резистентності проти захворювання або ознаку стійкості до дії гербіциду. Застосування селекційного маркера на додаток до цільового гена також вважається "стекінгом" генів. [0029] "Суворі умови" або "суворі умови гібридизації " включають посилання на умови, за яких зонд буде гібридизуватися з цільовою послідовністю в помітно більшому ступені, ніж з іншими послідовностями. Суворі умови залежать від цільової послідовності і відрізнятимуться в залежності від структури полінуклеотиду. За допомогою контролю суворих умов гібридизації та/або умов промивання можна ідентифікувати цільові послідовності, які є на 100 % компліментарними до зонда (гомологічне зондування). Альтернативно, суворі умови можуть бути кориговані в такий спосіб, щоб дозволити деяке помилкове спарювання в послідовностях, таким чином, що виявляються нижчі ступені подібності (гетерологічне зондування). Довші послідовності специфічно гібридизуються при вищих температурах. Докладний посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier: New York; і Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience:New York (1995), а також Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning:A th Laboratory Manual (5 Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). [0030] Специфічність звичайно являє собою функцію промивання після гібридизації, в якій критичними є фактори іонної сили і температури розчину для кінцевого промивання. Загалом, вибрані дуже суворі умови гібридизації і промивання з температурою, нижчою на 5 °C за температуру плавлення (Тпл) для специфічної послідовності за визначеної іонної сили та рН. Тпл, являє собою температуру (за визначеної іонної силі та рН), за якої 50 % цільової послідовності гібридизується з повністю відповідним зондом. Звичайно, за дуже 95637 16 суворих умов зонд буде гібридизуватися із своєю цільовою підпослідовністю, але не з іншими послідовностями. [0031] Прикладом суворих умов гібридизації для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які містять більше, ніж 100 комплементарних залишків на фільтрі при визначенні методом саузерн- або нозерн-блоттингу, є 50 % формамід з вмістом 1 мг гепарину при 42 °C, гібридизацію проводять протягом ночі. Прикладом дуже суворих умов промивання є 0, 15 М розчин NaCl при 72 °C протягом приблизно 15 хвилин. Прикладом суворих умов промивання є промивання 0, 2 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату при 65 °C протягом 15 хвилин (див. Sambrook, infra, щодо опису буфера н абазі натрію хлориду і натрію цитрату). [0032] Типові умови гібридизації для даного винаходу включають гібридизацію в 7 % розчині натрію додецилсульфату, 0, 25 М NaPO4, рН 7, 2 при 67 °C протягом ночі, після якого 2 рази промивають у 5 % розчині натрію додецилсульфату, 0, 20 М NaPO4, рН 7, 2, при 65 °C протягом 30 хвилин для кожного промивання, і два рази промивають в 1 % розчині натрію додецилсульфату, 0, 20 М NaPO4, рН 7, 2, при 65 °C протягом 30 хвилин кожне промивання. Типове промивання середньої суворості для подвійної спіралі, наприклад, довжиною більш ніж 100 нуклеотидів, складає 1 × розчин натрію хлориду і натрію цитрату при 45 °C протягом 15 хвилин. Типове промивання низької суворості для подвійної спіралі, наприклад, довжиною більш ніж 100 нуклеотидів, складає 4-6 х натрію хлориду і натрію цитрату при 40 °C протягом 15 хвилин. [0033] Для зондів довжиною приблизно від 10 до 50 нуклеотидів, суворі умови звичайно включають концентрації солі менші, ніж приблизно 1, 0 М іонів Na, звичайно концентрація від 0, 01 до 1, 0 М іонів Na (або інших солей), при рН від 7, 0 до 8, 3, і температура звичайно становить як мінімум 30°С. Умови високої суворості можна також забезпечити додаванням дестабілізуючих агентів, наприклад формаміду. Загалом, співвідношення "сигнал-шум" 2 × (або вище), ніж те, що спостерігається для незв'язаного зонда в конкретному аналізі гібридизації, вказує на специфічну гібридизацію. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною в суворих умовах, все ще є істотною мірою ідентичними, якщо білки, які вони кодують, є істотною мірою ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли копія нуклеїнової кислоти створена із застосуванням максимального виродження кодону, дозволеного генетичним кодом. [0034] Нижче наведені типові набори умов гібридизації/промивання, які можна застосовувати для гібридизації послідовностей нуклеотидів, які є істотною мірою ідентичними послідовностям еталонних нуклеотидів за даним винаходом: послідовність еталонного нуклеотиду переважно гібридизується з послідовністю еталонного нуклеотиду в 7 % розчині натрію додецилсульфату, 0, 5 М NaPO4, 1 мМ ЕДТА, при 50 °C з промиванням 2 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату, 0, 1 % натрію додецилсульфату при 50 °C, більш бажано 17 в 7 % розчині натрію додецилсульфату, що містить 0, 5 М NaPO4, 1 мМ ЕДТА, при 50 °C з промиванням 1 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату, що містить 0, 1 % натрію додецилсульфату, при 50 °C, ще більш бажано в 7 % розчині натрію додецилсульфату, що містить 0, 5 М NaPO4, 1 мМ ЕДТА при 50 °C з промиванням 0, 5 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату, що містить 0, 1 % натрію додецилсульфату, при 50 °C, переважно 7 % розчином натрію додецилсульфату, що містить 0, 5 М NaPO4, 1 мМ ЕДТА, при 50 °C з промиванням 0, 1 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату, що містить 0, 1 % натрію додецилсульфату, при 50 °C, більш переважно 7 % розчином натрію додецилсульфату, що містить 0, 5 М NaPO4, 1 мМ ЕДТА, при 50 °C з промиванням 0, 1 × розчином натрію хлориду і натрію цитрату, що містить 0, 1 % натрію додецилсульфату, при 65 °C. Послідовності за даним винаходом можна виявити, застосовуючи всі згадані вище умови. З метою визначення винаходу застосовують умови високої суворості. [0035] "Трансформація (перетворення)" являє собою процес введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину або організм-хазяїн. Зокрема, "трансформація (перетворення)" означає стабільну інтеграцію молекули ДНК в геном цільового організму. [0036] "Трансформований (перетворений)/трансгенний/рекомбінантний" позначають організм-хазяїн, наприклад бактерію або рослину, в який введена молекула гетерологічної нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно інтегрована в геном хазяїна, або молекула нуклеїнової кислоти також може бути присутня, як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути самовідтворюваною. Зрозуміло, що трансформовані (перетворені) клітини, тканини або рослини включають не тільки кінцевий продукт процесу трансформації (перетворення), але і його трансгенних нащадків. "Нетрансформований (не перетворений)", "не трансгенний" або "не рекомбінантний" хазяїн означає організм дикого типу, наприклад, бактерію або рослину, яка не містить молекул гетерологічних нуклеїнових кислот. В даному описі "трансгенний" позначає рослину, рослинну клітину або велику кількість структурованих або неструктурованих рослинних клітин, які мають інтегровану за допомогою добре відомих методів генетичного маніпулювання і вставки генів послідовність нуклеїнових кислот, яка вводить цільовий ген у геном рослини, звичайно в хромосому ядра клітини, мітохондрії або інші органели, що містять хромосоми, в інше місцеположення або в більшій кількості копій, ніж присутні в нормі в природній рослині або рослинній клітині. Трансгенні рослини є результатом маніпулювання і вставки таких послідовностей нуклеїнових кислот, на відміну від мутацій, які зустрічаються в природі, з метою одержання рослини, яка не зустрічається в природі, або рослини з генотипом, який не зустрічається в природі. Методи перетворення рослин і рослинних клітин добре відомі в даній галузі і, можуть включати, наприклад, електропорацію, мікроін'єкції, 95637 18 трансформацію, опосередковану агробактеріями, і балістичну трансформацію. [0037] В даному описі термін "унікальний", застосований по відношенню до MIR162, означає особливу характеристику MIR162. Таким чином, нуклеїнові кислоти, унікальні для сорту MIR162, не знайдені в інших рослинах кукурудзи, крім MIR162. [0038] Клас білків "Vip3" включає, наприклад, Vip3Aa, Vip3Ab, Vip3Ac, Vip3Ad, Vip3Ae, VipAf, Vip3Ag, Vip3Ba, Vip3Bb та їх гомологи. "Гомолог" означає, що вказаний білок або поліпептид має певну спорідненість з іншими членами класу білків Vip3. "Vip3Aa20" являє собою гомолог Vip3, унікальний для сорту MIR162. Він утворений спонтанними мутаціями, введеними в оптимізований для маїсу ген vip3Aa19, включений до pNOV1300 (SEQ ID No:3) в ході здійснення способу трансформації рослини. [0039] Даний винахід стосується генетично покращеної лінії кукурудзи, яке продукує білок для контролю комах, Vip3Aa20, і фермент ізомеразу фосфоманози (РМІ), який дозволяє рослині використовувати манозу як джерело вуглецю. Винахід особливо спрямований на трансгенний сорт кукурудзи, позначений як MIR162, що має новий генотип, а також на склад і способи виявлення нуклеїнових кислот, унікальних для MIR162, в біологічному зразку. Винахід додатково спрямований на рослини кукурудзи, що мають генотип MIR162, трансгенне зерно рослин кукурудзи і способи продукування рослини кукурудзи, що має генотип MIR162, схрещуванням інбредної кукурудзи, яка має генотип MIR162, з собою або іншою лінією кукурудзи. Рослини кукурудзи, що містять генотип MIR162 за винаходом, є придатними для контролю лускокрилих шкідливих комах, зокрема, але не обмежуючись ними, совки-іпсилон (BCW, Agrotis ipsilon), трав'яної совки (FAW, Spodoptera frugiperda), тютюнової листовіртки-брунькоїда (TBW, Heliothis virescens), червиці цукрової тростини (SCB, Diatraea saccharalis), червиці стебла кукурудзи (LCB, Elasmopalpus lignosellus), коробчастого черв'яка (CEW, Helicoverpa zed), і західної совки бобових (WBCW, Striacosta albicosta). Винахід додатково стосується способу захисту трансгенного зерна від пошкодження у вигляді поїдання за допомогою стекінгу ознаки резистентності до комах MIR162 з іншою ознакою резистентності до комах у такій же трансгенній рослині, що в результаті дає рослину, яка захищена від пошкодження у вигляді поїдання більшою мірою, ніж за окремої наявності ознаки резистентності до комах. [0040] В одному варіанті даний винахід включає ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеотидів, унікальна для сорту MIR162. [0041] В іншому варіанті даний винахід включає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, яка зв'язує гетерологічну молекулу ДНК, вставлену в геном MIR162, з геномною ДНК в MIR162, що містить як мінімум 10 або більше (наприклад 15, 20, 25, 50 або більше) суміжних нуклеотидів гетерологічної молекули ДНК і як мінімум 10 або більше (наприклад 15, 20, 25, 50 або більше) суміжних нуклеотидів геномної ДНК, які фланкують сайт 19 вставки гетерологічної молекули ДНК. Також включені послідовності нуклеотидів, які містять 10 або більше нуклеотидів суміжної вставленої послідовності з сорту MTR162, і як мінімум один нуклеотид фланкуючої ДНК з сорту MIR162, суміжний з вставленою послідовністю. Такі послідовності нуклеотидів є унікальними та діагностичними для сорту MIR162. Ампліфікація нуклеїнових кислот або гібридизація геномної ДНК від MIR162 продукує амплікон, який містить такі унікальні послідовності і є діагностичним для сорту MTR162. В одному аспекті даного варіанту послідовність нуклеотидів вибрана з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 та комплементарних до них. [0042] В іншому варіанті винахід включає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеотидів, яка містить як мінімум одну послідовність з'єднання сорту MIR162, де послідовність з'єднання охоплює з'єднання між гетерологічною касетою експресії, вставленою в геном кукурудзи, і ДНК з генома кукурудзи, що фланкує сайт вставки, і є діагностичною для сорту. В одному аспекті даного варіанту послідовність з'єднання вибрана з групи, що складається з SEQ ID No:45, SEQ ID No:47 та комплементарних до них. [0043] В іншому варіанті даний винахід включає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що зв'язує гетерологічну молекулу ДНК з геномом рослини кукурудзи сорту MIR162, що містить послідовність довжиною приблизно від 11 до 20 суміжних нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:45, SEQ ID No:47 та комплементарних до них. [0044] В іншому варіанті винахід включає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 та комплементарних до них. В одному аспекті даного варіанту виділена молекула нуклеїнової кислоти, включена в зерно кукурудзи, зберігається в Американській колекції типових культур, інвентарний номер РТА-8166, або в рослинах, вирощених з насіння. [0045] В одному варіанті даного винаходу запропонований амплікон, що містить послідовність нуклеотидів, унікальну для сорту MIR162. В одному аспекті даного варіанту послідовність нуклеотидів вибрана з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 та комплементарних до них. [0046] В іншому варіанті даний винахід включає праймери, які фланкують послідовність для виявлення сорту MIR162. Такі фланкуючі праймери послідовності містять послідовність нуклеотидів довжиною як мінімум 10-15 суміжних нуклеотидів з 5' або 3' фланкуючої послідовності. В одному аспекті даного варіанту суміжні нуклеотиди вибрані з нуклеотидів 1-1088 (включно) SEQ ID No:49 (довільно позначена в даному описі як 5' фланкуюча послідовність), або комплементарних до них. В 95637 20 іншому аспекті даного варіанту праймери 5' фланкуючої послідовності вибрані з групи, що складається з SEQ ID No:36, SEQ ID No:39, SEQ ID No:53, SEQ ID No:68-80 та комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту суміжні нуклеотиди вибрані з нуклеотидів 9391-10579 (включно) SEQ ID No:49 (довільно позначена в даному описі як 3' фланкуюча послідовність) або комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту праймери 3' фланкуючої послідовності вибрані з групи, що складається з SEQ ID No:58, SEQ ID No:97-105 та комплементарних до них. [0047] В іншому варіанті даний винахід включає пару полінуклеотидних праймерів, що містять перший полінуклеотидний праймер і другий полінуклеотидний праймер, які функціонують разом у присутності матриці ДНК сорту MIR162 в зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту MIR162. В одному аспекті даного варіанту перший праймер та/або другий праймер вибраний з SEQ ID No:1 або комплементарної до неї. В іншому аспекті даного варіанту перший праймер та/або другий праймер вибраний з групи, що складається з SEQ ID No:15-35, SEQ ID No:37, SEQ ID No:42 та комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту амплікон, продукований парою праймерів, містить SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:44 або комплементарних до них. [0048] В іншому варіанті даний винахід включає пару полінуклеотидних праймерів, що включає перший полінуклеотидний праймер і другий полінуклеотидний праймер, які функціонують разом за присутності матриці ДНК сорту MIR162 у зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту MIR162, де перший праймер являє собою або є комплементарним до послідовності генома рослини кукурудзи, що фланкує сайт вставки гетерологічної послідовності ДНК, вставленої в геном сорту MIR162, і послідовність другого полінуклеотидного праймера являє собою або є комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вставленої в геном сорту MIR162. [0049] В одному аспекті даного варіанту перший полінуклеотидний праймер містить як мінімум 10 суміжних нуклеотидів з послідовності нуклеотидів, вибраної з групи, що складається з нуклеотидів 1-1088 SEQ ID No:49, нуклеотидів 9391-10579 SEQ ID No:49 та комплементарних до них. У подальшому аспекті даного варіанту перший праймер вибраний з групи, що складається з SEQ ID No:36, SEQ ID No:39, SEQ ID No:53, SEQ ID No:57, SEQ ID No:68-72, SEQ ID No:79, SEQ ID No:80, SEQ ID No:97-105 та комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту другий полінуклеотидний праймер містить як мінімум 10 суміжних нуклеотидів 1089-9390 SEQ ID No:49 або комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту другий полінуклеотидний праймер вибраний з групи, що складається з SEQ ID No:15-35, SEQ ID No:37, SEQ ID No:40, SEQ ID No:50-52, SEQ ID No:54, SEQ ID No:56, SEQ ID No:57, SEQ ID No:63, SEQ ID No:73, SEQ ID No:82, SEQ ID No:96 або комплементарних до них. [0050] В іншому аспекті даного варіанту перший полінуклеотидний праймер, показаний в SEQ 21 ID No:36, і другий полінуклеотидний праймер, показаний в SEQ ID No:37, функціонують разом у присутності матриці ДНК сорту кукурудзи MIR162 в зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту кукурудзи MIR162, як описано в Прикладі 4. В одному варіанті даного аспекту амплікон містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:38. [0051] В іншому аспекті даного варіанту перший полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:39, і другий полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:40, функціонують разом у присутності матриці ДНК сорту кукурудзи MIR162 в зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту кукурудзи MIR162, як описано в Прикладі 4. В одному варіанті даного аспекту амплікон містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:41. [0052] В іншому аспекті даного варіанту перший полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:53, і другий полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:54, функціонують разом у присутності матриці ДНК сорту кукурудзи MIR162 в зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту кукурудзи MIR162, як описано в Прикладі 5. В одному варіанті даного аспекту амплікон містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:55. [0053] У подальшому аспекті даного варіанту перший полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:58, і другий полінуклеотидний праймер, показаний у SEQ ID No:56, функціонують разом у присутності матриці ДНК сорту кукурудзи MIR162 в зразку, щоб продукувати амплікон, діагностичний для сорту кукурудзи MIR162, як описано в Прикладі 5. В одному варіанті амплікон містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:59. [0054] Звичайно, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, як одержати додаткову послідовність для послідовності геному, що фланкує будь-який кінець вставлених гетерологічних послідовностей ДНК, для застосування як послідовності праймера, яку можна використовувати в таких парах праймерів для ампліфікації послідовностей, які є діагностичними для сорту MIR162. З метою розкриття цього фраза "фланкуюча будь-який кінець вставлених гетерологічних послідовностей ДНК" конкретно позначає послідовний рух від кінців вставлених гетерологічних послідовностей ДНК, точки, в яких вставлені послідовності ДНК, суміжні з природною геномною послідовністю ДНК, і далі в геномну ДНК конкретної хромосоми, в яку були вставлені гетерологічні послідовності ДНК. Переважно, послідовність праймера, яка відповідає або є комплементарною до частини вставленої послідовності, повинна розпочинати транскрипційне подовження виникаючого ланцюга ДНК або РНК у напрямку найближчого з'єднання фланкуючої послідовності. Тому послідовність праймера, що відповідає або є комплементарною до частини фланкуючої геномної послідовності, повинна розпочинати транскрипційне подовження виникаючого ланцюга ДНК або РНК у напрямку найближчого з'єднання фланкуючої послідовності. Послідовність праймера може відповідати або може 95637 22 бути комплементарною до гетерологічної послідовності ДНК, вставленої в хромосому рослини, або геномної фланкуючої послідовності. Фахівцям у даній галузі буде достатньою мірою зрозуміло, чи краще послідовності праймера відповідати, або бути комплементарною до послідовності, як показано у вставленій гетерологічній послідовності ДНК, або як показано у SEQ ID No:38, в залежності від природи продукту, бажаного для одержання шляхом застосування вкладеного набору праймерів, що призначаються для використання в ампліфікації конкретної фланкуючої послідовності, що містить з'єднання між геномною послідовністю ДНК і вставленою гетерологічною послідовністю ДНК. [0055] В іншому варіанті даний винахід включає виділений інсектицидний білок, що містить SEQ ID No:2, і молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує SEQ ID No:2. В одному аспекті даного варіанту молекула нуклеїнової кислоти являє собою SEQ ID No:1. Даний винахід також включає химерний ген, що містить гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з молекулою нуклеїнової кислоти і з рекомбінантними векторами та клітинами-хазяями, що містять химерний ген. [0056] В іншому варіанті даний винахід включає спосіб виявлення присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для сорту MIR162, в зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, де спосіб включає: (а) контакт зразка з парою полінуклеотидних праймерів, що при застосуванні в реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти з геномною ДНК сорту MIR162, продукують амплікон, який є діагностичним для сорту MIR162; (b) здійснення реакції ампліфікації нуклеїнової кислоти, таким чином продукування амплікону; і (с) виявлення амплікону. В одному аспекті даного варіанту амплікон містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 і комплементарних до них. [0057] В іншому варіанті даний винахід включає спосіб виявлення присутності молекули нуклеїнової кислоти, яка є унікальною для сорту MIR162, в зразку, що містить нуклеїнові кислоти кукурудзи, де спосіб включає: (а) контакт зразка із зондом, який гібридизується в умовах високої суворості з геномною ДНК сорту MIR162 і не гібридизується в умовах високої суворості з ДНК контрольної рослини кукурудзи; (b) піддавання зразка і зонда гібридизації в умовах високої суворості; і (с) виявлення гібридизації зонда в ДНК. Виявлення може бути здійснене будь-якими засобами, добре відомими фахівцям у даній галузі, включаючи флуоресцентні, хемілюмінесцентні, радіологічні, імунологічні і подібні. У випадку, коли гібридизацію застосовують як засіб для ампліфікації конкретної послідовності з метою продукування амплікону, який є діагностичним для сорту MIR162, продукування і виявлення амплікону будь-якими засобами, добре відомими фахівцям у даній галузі, призначене для виявлення передбачуваної гібридизації до цільової послідовності, де використовується один зонд або праймер, або послідов 23 ностей, де використовуються два або більше зондів або праймерів. Термін "біологічний зразок" призначений для позначення зразка, який містить або існує підозра щодо вмісту нуклеїнової кислоти, яка містить від п'яти до десяти нуклеотидів з кожного боку точки, в якій один або інший з двох термінальних кінців вставленої гетерологічної послідовності ДНК контактує з геномною послідовністю ДНК в межах хромосоми, в яку була вставлена гетерологічна послідовність ДНК, в даному описі також відома як послідовність з'єднання. Крім того, послідовність з'єднання містить лише два нуклеотиди: ті, що були першими нуклеотидами фланкуючої геномної ДНК, суміжної і ковалентно зв'язаної з першим нуклеотидом вставленої гетерологічної послідовності ДНК. В одному аспекті даного варіанту зонд містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 та комплементарних до них. [0058] В іншому варіанті даний винахід включає набір для виявлення нуклеїнових кислот, які є унікальними для сорту MIR162, в біологічному зразку. Набір включає як мінімум одну молекулу нуклеїнової кислоти з достатньою довжиною суміжних полінуклеотидів, щоб функціонувати як праймер або зонд у методі виявлення нуклеїнових кислот, який при ампліфікації або гібридизації з цільовою послідовністю нуклеїнових кислот у зразку з наступним виявленням амплікону або гібридизацією з цільовою послідовністю, є діагностичним для присутності в зразку послідовностей нуклеїнових кислот, унікальних для сорту MIR162. Набір додатково включає інші матеріали, необхідні для методів гібридизації нуклеїнових кислот або ампліфікації. В одному аспекті даного варіанту молекула нуклеїнової кислоти, що міститься в наборі, містить послідовність нуклеотидів у відповідності до SEQ ID No:1 або SEQ ID No:49. В іншому аспекті даного варіанту молекула нуклеїнової кислоти являє собою праймер, вибраний з групи, що складається з SEQ ID No:15-37, SEQ ID No:39, SEQ ID No:40, SEQ ID No:42, SEQ ID No: 43, SEQ ID No:50-54, SEQ ID No:56-58, SEQ ID No:60-105 та комплементарних до них. В іншому аспекті даного варіанту амплікон містить SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No59 або комплементарні до них. Різноманітні способи виявлення можна застосовувати, зокрема, не обмежуючись ними, TAQMAN (Perkin Elmer), термічну ампліфікацію, лігазну ланцюгову реакцію, саузернгібридизацію, методи ELISA, а також колориметричні і флуоресцентні способи виявлення. Зокрема, даний винахід передбачає набори для виявлення присутності цільової послідовності, тобто, як мінімум послідовності vip3Aa20 або послідовності з'єднання, в зразку, що містить геномну нуклеїнову кислоту з MIR162. Набір складається як мінімум з одного полінуклеотиду, здатного до зв'язування з цільовим сайтом або істотною мірою суміжним з цільовим сайтом, і як мінімум одного засобу для виявлення зв'язування полінуклеотиду з цільовим сайтом. Засоби для виявлення можуть бути флуо 95637 24 ресцентними, хемілюмінесцентними, колориметричними або ізотонічними, і можуть бути сполучені як мінімум з імунологічними способами для виявлення зв'язування. Також представлено набір, який дозволяє виявити присутність цільового сайта в зразку, тобто, як мінімум послідовність vip3Aa20 або послідовність з'єднання MIR162, скориставшись двома або більше полінуклеотидними послідовностями, які разом здатні до зв'язування з послідовностями нуклеотидів, суміжних або в межах приблизно 100 пар основ, або в межах приблизно 200 пар основ, або в межах приблизно 500 пар основ або в межах приблизно 1000 пар основ відносно цільової послідовності, і які можуть бути подовжені в напрямку одна до одної для утворення амплікону, що містить як мінімум цільовий сайт. [0059] В іншому варіанті даний винахід пропонує спосіб виявлення білка Vip3Aa20 в біологічному зразку, який включає: (а) добування білка з тканини сорту MIR162; (b) випробування добутого білка із застосуванням імунологічного способу з використанням антитіла, специфічного для білка Vip3Aa20, продукованого сортом MIR162; і (с) виявлення зв'язування вказаного антитіла з білком Vip3Aa20. [0060] В іншому варіанті даний винахід включає біологічний зразок, одержаний з рослини кукурудзи сорту MIR162, тканини, або зерна, де зразок включає послідовність нуклеотидів, що являє собою або є комплементарною до послідовності, що є унікальною для сорту MIR162, і де послідовність виявляють в зразку за допомогою методу ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. В одному аспекті даного варіанту послідовність нуклеотидів являє собою або є комплементарною до SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55 або SEQ ID No:59. В іншому аспекті даного варіанту зразок вибраний з групи, що складається з кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна крупного помелу, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю та круп, що вироблені з суцільного зерна або частково містять побічні продукти переробки кукурудзи. [0061] В іншому варіанті даний винахід включає екстракт біологічного зразка, одержаний з рослини кукурудзи MIR162, тканини або зерна, що включає послідовність нуклеотидів, що являє собою або є комплементарною до послідовності, яка є унікальною для MIR162. В одному аспекті даного варіанту послідовність можна виявити в екстракті, застосовуючи метод ампліфікації нуклеїнової кислоти або гібридизації нуклеїнової кислоти. В іншому аспекті даного варіанту послідовність являє собою або є комплементарною до SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55 або SEQ ID No:59. В іншому аспекті даного варіанту зразок вибраний з групи, що складається з кукурудзяного борошна, кукурудзяного борошна крупного помелу, кукурудзяної олії, кукурудзяного крохмалю та круп, що вироблені з суцільного зерна або частково містять побічні продукти переробки кукурудзи. [0062] Інший варіант даного винаходу включає рослину кукурудзи, або її частини, і зерно рослини 25 кукурудзи, що має генотип трансгенного сорту MIR162, де генотип включає послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:1, SEQ ID No:38, SEQ ID No:41, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, SEQ ID No:59 або комплементарну до них. Один з прикладів зерна кукурудзи, що містить молекули нуклеїнових кислот за винаходом, депонований 23 січня 2007 р. за інвентарним номером АТСС РТА-8166. В одному аспекті даного варіанту рослина кукурудзи походить від інбредних ліній кукурудзи CG5NA58, CG5NA58A, CG3ND97, CG5NA01, CG5NF22, CG4NU15, CG00685, CG00526, CG00716, NP904, NP911, NP948, NP934, NP982, NP991, NP993, NP2010, NP2013, NP2015, NP2017, NP2029, NP2031, NP2034, NP2045, NP2052, NP2138, NP2151, NP2166, NP2161, NP2171, NP2174, NP2208, NP2213, NP2222, NP2275, NP2276, NP2316, ВСТТ609, AF031, NPH8431, 894, BUTT201, R327H, 2044ВТ і 2070ВТ. Однак, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що генотип MIR162 може бути інтрогресований у різноманітні рослини, що можуть схрещуватися з кукурудзою, зокрема, дикі види маїсу, і тому список інбредних ліній даного варіанту не повинен інтерпретуватися як обмежуючий. [0063] В іншому варіанті даний винахід включає рослину кукурудзи, що містить як мінімум першу і другу послідовності ДНК, зв'язані разом з утворенням суміжної послідовності нуклеотидів, де перша послідовність ДНК розташована в межах послідовності з'єднання і включає як мінімум приблизно 11 суміжних нуклеотидів, вибраних з групи, що складається з нуклеотидів 1079-1098 SEQ ID No:49, нуклеотидів 9381-9400 та комплементарних до них, де друга послідовність ДНК розташована в межах гетерологічної послідовності вставленої ДНК, показаної в SEQ ID No:49, і комплементарної до неї; де перша і друга послідовності ДНК придатні як нуклеотидні праймери або зонди для виявлення присутності послідовностей нуклеїнових кислот кукурудзи сорту MIR162 в біологічному зразку. В одному аспекті даного варіанту нуклеотидні праймери застосовують у методі ампліфікації ДНК для ампліфікації послідовності цільової ДНК з матриці ДНК, екстрагованої з рослини кукурудзи, і рослина кукурудзи відрізняється від інших рослин кукурудзи продукуванням амплікону, що відповідає послідовності ДНК, яка включає SEQ ID No:45 або SEQ ID No:47. [0064] Рослини кукурудзи за винаходом додатково можна охарактеризувати тим, що одночасне розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазами KpnI, EcoRV або Ncol дає смужки гібридизації vip3Aa20 розміром приблизно до 8 тисяч пар основ, 13 тисяч пар основ або 4, 6 тисячі пар основ, відповідно, із застосуванням зонда vip3Aa20 в умовах високої суворості. Прикладом у даному описі є зонд vip3Aa20, що містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:13. [0065] Рослини кукурудзи за винаходом можна додатково охарактеризувати тим, що розщеплення геномної ДНК рослини рестриктазою Асс65І або BamНІ приводить до утворення однієї смужки гібридизації pmi, із застосуванням зонда pmi в умо 95637 26 вах високої суворості. Прикладом у даному описі є зонд pmi, що містить послідовність нуклеотидів, показану в SEQ ID No:14. [0066] В одному варіанті даний винахід пропонує рослину кукурудзи, де генотип MIR162 надає рослині кукурудзи резистентності проти комах або здатності використовувати манозу як джерело вуглецю, або надає як резистентності проти комах, так і здатності використовувати манозу як джерело вуглецю. В одному аспекті даного варіанту трансгенний генотип, що надає рослині за винаходом резистентності проти комах, містить ген vip3Aa20, і трансгенний генотип, що забезпечує здатність використовувати занозу як джерело вуглецю, як рослина маїсу за винаходом, містить ген pmi. [0067] В іншому варіанті даний винахід пропонує спосіб продукування рослини кукурудзи, стійкої до лускокрилих шкідників, зокрема: (а) статеве схрещування першої початкової рослини кукурудзи з другою початковою рослиною кукурудзи, де вказана перша або друга початкова рослина містить ДНК сорту MIR162, таким чином продукуючи численні рослини-нащадки першого покоління; (b) відбір рослини-нащадка першого покоління, стійкої до одного або більше видів лускокрилих шкідників; (с) самообпилення рослини-нащадка першого покоління з продукуванням численних рослиннащадків другого покоління; і (d) відбір з числа рослин-нащадків другого покоління рослини, стійкої до одного або більше видів лускокрилих шкідників; де рослини-нащадки другого покоління містять послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55 і SEQ ID No:59. [0068] В іншому варіанті даний винахід пропонує спосіб продукування гібридних зерен кукурудзи, який включає: (а) насадження зерен першої інбредної лінії кукурудзи, що містить послідовність нуклеотидів, вибрану з групи, що складається з SEQ ID No:1, SEQ ID No:45, SEQ ID No:47, SEQ ID No:49, SEQ ID No:55, і SEQ ID No:59, і зерен другої інбредної лінії, що містять інший генотип; (b) культивацію рослин кукурудзи, від вказаного насадження до часу цвітіння; (с) вихолощення вказаних квіток рослин однієї з інбредних ліній кукурудзи; (d) статеве схрещування двох різних інбредних ліній одна з одною; і (e) збір урожаю гібридного зерна, продукованого в такий спосіб. В одному аспекті даного варіанту перша інбредна лінія кукурудзи забезпечує батьків жіночої статі. В іншому аспекті даного варіанту перша інбредна лінія кукурудзи забезпечує батьків чоловічої статі. Даний винахід також включає гібридне зерно, продуковане способом за винаходом і гібридні рослини, вирощені із зерна. [0069] Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що трансгенний генотип MIR162 може бути інтрогресований при розведенні в інші лінії кукурудзи, що мають різні трансгенні генотипи. Наприклад, інбредну кукурудзу MIR162 можна схрещувати з інбредною кукурудзою, яка має трансгенний генотип стійкого проти лускокрилих комах сорту Bt11 (Патенти США 6114608 і 6342660, які включені до даного опису шляхом посилання). Одержане в 27 результаті зерно і рослини-нащадки мають "стекінгові" ознаки резистентності проти комах і об'єднаний спектр активності Cry1Ab і Vip3Aa20. Інші "стекінгові" стек ознаки, включені до даного винаходу, включають об'єднання ознак резистентності проти комах MIR162 та ознак резистентності проти комах MIR604 (публікація патентної заявки США № 2005/0216970, опублікована 29 вересня 2005p., яка включена до даного опису шляхом посилання). "Стекінгові" ознаки одержаного зерна і нащадків надають рослинам розширений спектр активності; тобто рослини активні як проти лускокрилих, так і твердокрилих шкідливих комах. [0070] Таким чином, даний винахід включає спосіб захисту трансгенної рослини кукурудзи від пошкодження у вигляді поїдання однією або більше шкідливими комахами, де спосіб включає стекінг в одній і тій самій трансгенній рослині кукурудзи ознаки резистентності проти комах Vip3Aa20 з іншою ознакою резистентності проти комах, яка відрізняється від Vip3Aa20, за допомогою чого "стекінгові" ознаки захищають рослину кукурудзи від пошкодження у вигляді поїдання однією або більше шкідливих комах більшою мірою, ніж очікувалося б тільки за рахунок ознаки резистентності проти комах. В одному аспекті даного варіанту здійснено "стекінг" ознаки резистентності проти комах Vip3Aa20, включеної до сорту MIR162, з ознакою резистентності проти комах Сry3А055, включеною до сорту MIR604, водній і тій самій трансгенній рослині кукурудзи, шляхом статевого схрещуванням сорту MIR162 з сортом MIR604 або сумісної трансформації ознаки в одну рослину. [0071] Приклади інших трансгенних сортів, які можна схрещувати з інбредним MIR162, включають толерантний до гліфосату сорт GA21, толерантний до гліфосату/резистентний до лускокрилих комах сорт MON802, резистентний до лускокрилих комах сорт DBT418, чоловічий стерильний сорт MS3, толерантний до фосфінотрицину сорт В16, стійкий проти лускокрилих комах сорт MON80100, толерантні до фосфінотрицину сорти Т14 і Т25, резистентний до лускокрилих комах сорт 176 і резистентний до твердокрилих комах сорт MON863, всі з яких відомі в даній галузі. Крім того, відомо, що інші комбінації або стеки можуть бути продуковані з трансгенним генотипом за винаходом, і тому наведені приклади не слід розглядати як обмежуючі. [0072] Фахівці в даній галузі також зрозуміють, що трансгенне зерно кукурудзи, яке містить генотип MIR162, можна обробляти різними хімічними речовинами для обробки насіння, зокрема, інсектицидами, до збільшення ефекту або синергічного ефекту з інсектицидною активністю білка Vip3Aa20. [0073] Заявник розкриває в даному описі специфічний сайт на хромосомі 5 в геномі маїсу, який є найбільш придатним для вставки гетерологічних нуклеїнових кислот. Також розкритий молекулярний маркер 5' (оріе2; нуклеотиди 1680-3338, SEQ ID No:106) і молекулярний маркер 3' (ген капсидних білків (вірусу) (gag); нуклеотиди 43275-45086, SEQ ID No:106), придатні для ідентифікації розташування цільового сайта на хромосомі 5. Таким 95637 28 чином, винахід пропонує способи введення цільових гетерологічних нуклеїнових кислот в даний, попередньо визначений цільовий сайт або поблизу даного цільового сайта. Об'єкт винаходу також включає зерно кукурудзи та/або рослину кукурудзи, що містить будь-яку гетерологічну послідовність нуклеотидів, вставлену в показаний цільовий сайт або поблизу такого сайта. Один з варіантів забезпечення такої цілеспрямованої інтеграції являє собою заміну на іншу вставку замість касети експресії vip3Aa20, що була прикладом у даному описі. З точки зору загальних міркувань, цілеспрямовану гомологічну рекомбінацію, наприклад, не обмежуючись ними, можна застосовувати у відповідності до об'єкту винаходу. "Гомологічна рекомбінація" позначає реакцію між будь-якою парою послідовностей нуклеотидів, що мають відповідні сайти, які містять подібні послідовності нуклеотидів (тобто, гомологічні послідовності), через які дві молекули можуть взаємодіяти (рекомбінувати) з утворенням нової, рекомбінантної послідовності ДНК. Кожний сайт з подібною послідовністю нуклеотидів позначений у даному описі як "гомологічна послідовність". Загалом, частота гомологічних рекомбінацій зростає, коли зростає довжина гомологічної послідовності. Таким чином, хоча гомологічна рекомбінація може відбуватися між двома послідовностями нуклеотидів, які є меншою мірою ідентичними, частота рекомбінацій (або ефективність) знижується, оскільки дивергенція між двома послідовностями зростає. Рекомбінації можна досягти, застосовуючи одну гомологічну послідовність на кожній з донорських і цільових молекул; таким чином одержують продукт рекомбінації "простою гібридизацією". Альтернативно, дві гомологічні послідовності можна розмістити на кожній з цільових і донорських послідовностей нуклеотидів. Рекомбінація між двома гомологічними послідовностями на донорі та двома гомологічними послідовностями на цільовій молекулі дає продукт рекомбінації "подвійною гібридизацією". Якщо гомологічні послідовності на донорській молекулі фланкують послідовність, якою необхідно маніпулювати (наприклад, цільову послідовність), рекомбінація подвійною гібридизацією з цільовою молекулою буде призводити до продукту рекомбінації, де цільова послідовність замінює послідовність ДНК, яка спочатку була розташована між гомологічними послідовностями на цільовій молекулі. Обмін послідовностей ДНК між цільовою молекулою і донором шляхом рекомбінації подвійною гібридизацією має назву "заміни послідовності". Даний тип технології є об'єктом, наприклад, публікації патентної заявки США № 2006/0253918, яка включена до даного опису шляхом посилання. Фахівці в даній галузі зрозуміють, що з показаним цільовим сайтом, ідентифікованим в даному описі, і з послідовностями, що оточують ідентифікований цільовий сайт, можна застосовувати інші способи цілеспрямованої інтеграції гетерологічних нуклеїнових кислот. Такі способи, наприклад, не обмежуючись ними, розкриті в публікації патентних заявок США №№ 2007/0039074 і 2006/0130179. [0074] В одному варіанті даний винахід включає хромосомний цільовий сайт маїсу, розміщений 29 на хромосомі 5 між молекулярним маркером оріе2, визначеним як нуклеотиди 1680-3338 SEQ ID No:106 і молекулярним маркером gag, визначеним як нуклеотиди 43275-45086 SEQ ID No:106, де цільовий сайт включає гетерологічну нуклеїнову кислоту. В іншому варіанті хромосомний цільовий сайт маїсу розміщений на хромосомі 5 між нуклеотидами 25454 і 25513 SEQ ID No:106. В іншому варіанті хромосомний цільовий сайт фланкують 5' нуклеотиди від 5454 до 25454 SEQ ID No:106 і 3' фланкують нуклеотиди від 25513 до 45513 SEQ ID No:106. [0075] В одному варіанті даний винахід включає спосіб одержання трансгенної рослини маїсу, що включає вставку гетерологічної нуклеїнової кислоти в положенні на хромосомі 5, розміщеному між молекулярним маркером оріе2, визначеним як нуклеотиди 1680-3338 SEQ ID No:106, і молекулярним маркером gag, встановленим як нуклеотиди 43275-45086 SEQ ID No:106. В іншому варіанті гетерологічна нуклеїнова кислота вставлена на хромосомі 5 між нуклеотидами 25454 і 25513 SEQ ID No:106. В іншому варіанті фланг вставленої гетерологічної нуклеїнової кислоти захищений 5' нуклеотидами від 5454 до 25454 SEQ ID No:106, і 3' фланкований нуклеотидами 25513-45513 SEQ ID No:106 [0076] Трансгенний генотип за даним винаходом може бути інтрогресований в будь-яку інбредну або гібридну рослину кукурудзи із застосуванням відомих способів розведення. Метою розведення рослин є об'єднання в одному сорті або гібриді різних бажаних ознак. Для польових культур такі ознаки можуть включати резистентність до комах і захворювань, толерантність до гербіцидів, толерантність до перегрівання і посухи, скорочення часу дозрівання врожаю, більшу врожайність і кращу агрономічну якість. В умовах механічного збирання врожаю багатьох культур важлива одноманітність характеристик рослини, наприклад, проростання і приживання, швидкості росту, зрілості і висоти рослини та качана. [0077] Польові культури вирощують за методами, в яких використовують спосіб запилення рослин. Рослина самообпилюється, якщо пилок від однієї квітки переміщується в ту ж або іншу квітку тієї ж рослини. Рослина перехресно обпилюється, якщо пилок надходить з квітки на іншій рослині. [0078] Рослини, що самообпилюються, відібрані протягом багатьох поколінь, стають гомозиготними майже у всіх місцеположеннях гена і дають однорідну популяцію вірно вирощених нащадків. Схрещування між двома різними гомозиготними лініями дає однорідну популяцію гібридних рослин, які можуть бути гетерозиготними в багатьох місцеположеннях генів. Схрещування двох рослин, кожна з яких ж гетерозиготною в цілому ряді місцеположень генів, дає популяцію гібридних рослин, які відрізняються генетично і не будуть однорідними. [0079] Кукурудза (Zea mays L.), може розмножуватися як самозапиленням, так і методами перехресного запилення. Кукурудза має окремі чоловічі і жіночі квітки на одній рослині, розміщені на волоті і качані, відповідно. Природне запилення 95637 30 відбувається в кукурудзі, коли вітер переносить пилок від волотей до стовпчиків, які стирчать від верхівок качанів. [0080] Надійний спосіб управління фертильністю особин чоловічої статі для рослин пропонує можливість покращеного розведення рослин. Це є особливо справедливим для створення гібридів кукурудзи, яке спирається на певний різновид системи безплідності особин чоловічої статі. Існує декілька варіантів управління чоловічою плодючістю, доступних виробникам, наприклад: ручне або механічне вихолощення (або обривання волотей), цитоплазматична безплідність особин чоловічої статі, генетична безплідність особин чоловічої статі гаметоциди, тощо. [0081] Гібридне зерно кукурудзи звичайно продукується системою безплідності особин чоловічої статі, що включає ручне або механічне обривання волотей. Змінні смуги двох інбредних сортів кукурудзи висаджують у полі, і волоті, що містять пилок, видаляють з одного з них (жіночий). За умов достатньої ізоляції від джерел чужорідного кукурудзяного пилку, качани будуть запліднюватися тільки від іншого інбредного сорту (чоловічий); одержане зерно, таким чином, буде гібридним і сформує гібридні рослини. [0082] Копіткого і часто ненадійного способу обривання волотей можна уникнути, застосовуючи один з багатьох способів забезпечення генетичної безплідності особин чоловічої статі в даній галузі, кожен з власними перевагами і недоліками. В таких способи застосовують різноманітні підходи, наприклад, доставку в рослину гена, що кодує цитотоксичну субстанцію, пов'язану зі специфічним промотором чоловічої тканини, або антисмисловою системою, в якій ідентифікований ген, критичний для фертильності, і антисмисловий до нього ген вставлено в рослину [див.: Fabinjanski, et al. ЕРО 89/3010153.8, публікація №. 329308 і РСТ заявка РСТ/СА90/00037, опублікована як WO90/08828]. [0083] Застосування інбредних сортів із стерильними особинами чоловічої статі є тільки одним фактором у продукуванні гібридів кукурудзи. Методи розведення рослин, що відомі в даній галузі і застосовуються в програмі розведення кукурудзи, включають, не обмежуючись ними, періодичний відбір, зворотне схрещування, племінне розведення, підсилений поліморфізмом обмеження довжини відбір, посилений генетичним маркером відбір і трансформацію. Створення гібридів кукурудзи в програмі розведення кукурудзи загалом вимагає створення гомозиготних інбредних ліній, схрещування таких ліній і оцінки схрещування. Методи племінного розведення і періодичного відбору застосовують для розвитку інбредних ліній з вирощених популяцій. Програми розведення кукурудзи об'єднують генетичний фон двох або більше інбредних ліній або різні інші джерела зародкової плазми в галузі розмноження, з яких нові лінії розвиваються самозаплідненням і виділенням бажаного фенотипу. Нові інбредні сорти схрещують з іншими інбредними лініями, і гібриди, одержані в результаті такого схрещування, оцінюють, щоб визначити, який з них має комерційний потенціал. 31 Розведення рослин і створення гібридів, як практикують у програмі розведення рослин кукурудзи, є дорогими і вимагають багато часу. [0084] Племінне розведення починається із схрещування двох генотипів, кожний з яких може мати одну або більше бажаних характеристик, яких не вистачає іншому або які доповнюють інший. Якщо двоє оригінальних батьків не пропонують усіх бажаних характеристик, інші джерела можуть бути введені до популяції розведення. У племінному способі найкращі рослини являють собою такі, що самозапилюються і відбираються в послідовних поколіннях. В успішних поколіннях гетерозиготний стан поступиться гомогенним лініям у результаті самозапилення і відбору. Звичайно в племінному способі виведення практикується п'ять або більше поколінь самозапилення і відбору: F1  F2; F2  F3;F3  F4; F4  F5, тощо. [0085] Розведення шляхом періодичного відбору, наприклад, зворотне схрещування, можна застосовувати для покращення інбредної лінії і гібрида, одержаного із застосуванням таких інбредних ліній. Зворотне схрещування можна застосовувати для переносу специфічної бажаної ознаки з однієї інбредної лінії або джерела до інбредної лінії, якій не вистачає цієї ознаки. Цього можна досягнути, наприклад, першим схрещуванням вищої інбредної лінії (періодичний батько) з донорською інбредною лінією (не періодичний батько), яка несе відповідний ген (гени) для цільової ознаки. Нащадків даного схрещування далі схрещують назад з вищим періодичним батьком, після чого відбирають з одержаних нащадків тих, які мають бажані ознаки, перенесені з не періодичного батька. Після п'яти або більше поколінь зворотного схрещування з відбором за бажаною ознакою нащадок буде гомозиготним за місцеположеннями, що контролюють перенесену характеристику, але буде подібний вищому батькові по суті за всіма іншими генами. Останнє покоління зворотного схрещування далі самозапилюється, щоб дати чистих виведених нащадків за геном (генами), які перенесені. Гібрид, що розвивається з інбредних ліній, які містять перенесений ген (гени), є по суті таким же, як гібрид, що розвивається з таких же інбредних ліній без перенесеного гена (генів). [0086] Елітні інбредні лінії, після чистого розведення, гомозиготні інбредні лінії, можна також застосовувати як початкові матеріали для розведення або початкові популяції, з яких розвиваються інші інбредні лінії. Такі інбредні лінії, що походять від елітних інбредних ліній, можна розвивати, застосовуючи методи племінного розведення і періодичного відбору, описані вище. Наприклад, якщо зворотне схрещування застосовують, щоб створити такі інбредні лінії в програмі виведення рослин кукурудзи, елітні інбредні лінії можна застосовувати як материнську лінію або початковий матеріал або початкову популяцію, і вони можуть служити або як донор, або як періодичний батько. [0087] Простий гібрид кукурудзи одержують в результаті схрещування двох інбредних ліній, кожна з яких має генотип, який доповнює генотип іншої. Гібридних нащадків першого покоління позначають F1. В ході створення комерційних гібридів у 95637 32 програмі виведення рослин кукурудзи шукають тільки гібридні рослини F1. Переважні гібриди F1 сильніші, ніж їх інбредні батьки. Така сила гібриду, або гетерозис, може виявлятися в багатьох полігенних ознаках, зокрема в посиленому вегетативному рості і збільшеній врожайності. [0088] Створення гібрида кукурудзи в програмі виведення рослин кукурудзи складається з трьох стадій: (1) відбір рослин з різних пулів зародкової плазми для початкового схрещування; (2) самозапилення відібраних рослин від схрещування протягом декількох поколінь для одержання серії інбредних ліній, які, хоча й відрізняються одна від одної, виведені чистими і є дуже однорідними; і (3) схрещування відібраних інбредних ліній з різними інбредними лініями для одержання гібридних нащадків (F1). У процесі близько родинного розмноження кукурудзи сила ліній зменшується. Сила відновлюється при схрещуванні двох різних інбредних ліній з одержанням гібридних нащадків (F1). Важливий результат гомозиготності і однорідності інбредних ліній виявляється в тому, що гібрид визначеної пари інбредних ліній завжди буде однаковим. Як тільки визначені інбредні лінії, які дають перевершуючий гібрид, гібридну кукурудзу можна відтворювати невизначено довго, поки зберігається однорідність інбредних батьків. [0089] Простий гібрид продукується при схрещуванні двох інбредних ліній і одержанні нащадків Fi. Гібрид подвійного схрещування продукується з чотирьох інбредних ліній, схрещених попарно (А × В і С × D), якщо потім два гібриди F1 схрещують знову (А × В) × (С × D). Гібрид потрійного схрещування продукується з трьох інбредних ліній, коли схрещують дві з інбредних ліній (А × В), а потім одержаний гібрид F1 схрещують з третьою інбредною лінією (А × В) × С. Більша частина гібридної сили, продемонстрованої гібридами F1 втрачається в наступному поколінні (F2). Тому зерно від гібридів не застосовують як посівний матеріал. [0090] Продукування гібридного насіння вимагає усунення або інактивації пилку, продукованого жіночою рослиною. Неповне видалення або інактивація пилку забезпечує потенціал для самозапилення. Таке ненавмисно самообпилене зерно може бути помилково зібране і упаковане з гібридним зерном. [0091] Як тільки зерно висаджене, можна ідентифікувати та відібрати такі самообпилені рослини. Такі самообпилені рослини будуть генетично рівноцінними до жіночої інбредної лінії, яку застосовують для одержання гібрида. [0092] Звичайно такі самообпилені рослини можуть бути ідентифіковані і відібрані за рахунок їх зменшеної сили. Жіночі самообпилені рослини ідентифікують за їх менш сильним виглядом за вегетативними та/або репродуктивними характеристиками, зокрема, меншою висотою рослини, дрібними качанами, формою качана і зерна, кольором качана або іншими характеристиками. [0093] Ідентифікувати такі самообпилені лінії також можна за допомогою аналізів молекулярних маркерів. Див. "The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electrophoresis and Morphology", Smith, J.S.C. and Wych, R. D., 33 Seed Science and Technology14, pp.1-8 (1995), що включено до даного опису шляхом посилання. За допомогою цих технологій гомозиготність самообпиленої лінії можна перевірити, аналізуючи склад алельних генів у різних місцеположеннях уздовж геному. Такі способи дозволяють швидку ідентифікацію винаходу, показаного в даному описі. Див. також, "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol.20 (1) p.29-42. [0094] Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що вищевикладене являє собою тільки деякі з різних шляхів, якими можуть одержати інбредні рослини за даним винаходом ті, хто шукає можливість інтрогресії трансгенного генотипу за винаходом в інші лінії кукурудзи. Інші засоби доступні, і згадані вище приклади є тільки ілюстративними. [0095] Наступні приклади призначаються виключно для ілюстрації одного або більше переважних варіантів винаходу і їх не слід інтерпретувати як обмеження контексту винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Трансформація та селекція сорту MIR162 [0096] Сорт MIR604 було продуковано опосередкованою Agrobacterium трансформацією запатентованої лінії кукурудзи (Zea mays). Незрілі ембріони були трансформовані головним чином так, як описано в Negrotto та інші. (Plant Cell Reports19:798-803, 2000), який включений до даного опису шляхом посилання, із застосуванням фрагменту ДНК з плазміди pNOV1300 (SEQ ID NO:3). pNOV1300 містить послідовність нуклеотиду, що включає тандем касет експресії. Перша касета експресії включає ділянку промотору ZmUbilnt гена поліубіхітину Zea mays, яка містить перший інтрон (GenBank®, інвентарний номер S94464), функціонально зв'язану з послідовністю, що кодує vip3Aa19, що додатково функціонально зв'язана з РЕРС Інтроном #9 гена фосфоенолпіруваткарбоксилази (GenBank® інвентарний номер X15239) Zea mays Matsuoka and Minami, 1989. European J.of Biochem.181:593-598) і термінаторною послідовністю 35S з 35S РНК генома вірусу мозаїки цвітної капусти (подібний до GenBank® інвентарний номер AF140604). її функція полягає в тому, щоб забезпечити послідовність поліаденілювання (Franck et al, 1980. Cell 21:285-294). Ген vip3Aa19 в pNOV1300 включає синтетичну, оптимізовану для маїсу послідовність, що кодує vip3Aa (Estruch, et al., 1999.), яка була синтезована з метою пристосування використання переважного кодону для маїсу (Murray et al., 1989). Синтетична послідовністю, що кодує vip3Aa19, яка використовується для трансформації рослин, кодує послідовність амінокислот, ідентичну кодованій послідовністю, що кодує природний vip3Aa1, знайденою в штамі бактерій ґрунту Bacillus thuringiensis AB88 (Патент США 5, 877, 012), за винятком єдиної відмінності - амінокислоти в положенні 284; послідовність, що кодує природний vip3Aa1, кодує лізин, тоді як послідовність, що кодує синтетичний vip3Aa19, кодує глутамін в даному положенні. Послідовність, що кодує Vip3Aa19, кодує контроль 95637 34 ний білок комах, Vip3Aa19, який забезпечує резистентність до лускокрилих комах. Друга касета експресії складається з промотору ZmUbilnt, функціонально зв'язаного з послідовністю, що кодує pmi (також відомий як manА Е. coli), яка кодує фосфоманнозоізомеразу (GenBank® інвентарний номер М15380), яка каталізує ізомеризацію маннози-6фосфату до фруктози-6-фосфату (Negrotto et al., 2000). Послідовність, що кодує pmi додатково функціонально зв'язана з 3' кінцем послідовності термінації транскрипції та поліаденіювання нопалінсинтетази. [0097] Незрілі ембріони вилучали з 8-12 денних початків та промивали свіжим середовищем з метою підготовки до трансформації. Ембріони змішували з суспензією клітин Agrobacterium, що містили вектор трансформації pNOV1300, перемішували протягом 30 секунд та залишали для інкубації протягом додаткових 5 хвилин. Надлишковий розчин, що містить Agrobacterium, аспірували та ембріони переміщували на чашки, що містили неселективне середовище для культивування. Ембріони культивували спільно з рештою Agrobacterium при 22 °C протягом 2-3 днів в темряві. Ембріони переміщували в середовище для культивування з додаванням тикарциліну (100 мг/мл) та срібла нітрату (1,6 мг/л) та інкубували в темряві протягом 10 днів. Ембріони, що продукували ембріогенний наріст, були переміщені в середовище для культивування, що містило манозу. [0098] Регенеровані рослини були перевірені за допомогою аналізу TAQMAN® PCR (див. приклад 2) щодо присутності генів як pmi, так і vip3Aa19, а також щодо відсутності гена, що забезпечує резистентність до антибіотика спектиноміцину (spec). Пізніше було з'ясовано (див. приклад 4, який наведено нижче), що протягом процесу трансформації дві мутації було введено в послідовність, що кодує vip3Aa19, одна з яких привела до заміни амінокислоти в білку Vip3Aa19. Таким чином, одержана нова послідовність, що кодує vip3Aa, яка є унікальною для сорту MIR162, була позначена як vip3Aa20. Послідовність, що кодує Vip3Aa20, кодує ізолейцин в положенні 129 замість залишку метіоніну, кодованого геном vip3Aa19. [0099] Рослини, позитивні щодо обох трансгенів та негативні щодо гена spec, були переміщені в теплицю для подальшого розмноження. Позитивні сорти були ідентифіковані та пройшли скринінг із застосуванням біологічних проб проти трав'яної совки з використанням комах. Інсектицидні сорти були охарактеризовані щодо кількості копії за допомогою аналізу TAQMAN. MIR162 був вибраний для подальшого аналізу, спираючись на наявність єдиної копії трансгенів, високий рівень експресії білка, який було ідентифіковано із застосуванням ELISA, та високу інсектицидну активність проти трав'яної совки. [0100] Генеалогія виведення сорту MIR162 була наступною: рослина Т0 MIR162 (× NPH8431)NPH8431 (MIR162)F1 (×NP2161)NP2161(MIR162)F1 (×NP2161)NP2161 (MIR162) BC1F1 (× B9620)F1 (× B9620)BC1F1 (× B9620)BC2F1 (× 35 95637 B9620)BC3F1 (× B9620)BC4F1 ( B9620). Рослинний матеріал з генерації ВС4 застосовувався для Саузерн-блотингу, визначення кількості копій та встановлення послідовності вставки ДНК. Негативні контрольні особини для експериментів складалися з 10 негативних рослин, виділених з генерації ВС4. Приклад 2. Виявлення MIR162 за допомогою TAQMAN PCR [0101] Аналіз TAQMAN головним чином проводили так, як описано в Ingham і інші. [Biotechniques, 31:132-140, 2001], який включений до даного опису шляхом посилання. Якщо коротко, геномна ДНК була виділена з листя трансгенних та нетрансгенних рослин кукурудзи за допомогою набору для екстракції ДНК Puregene® Genomic (Gentra Systems, Міннеаполіс, Міннесота), в основному згідно з інструкцією виробника, за винятком того, що всі стадії проводили в 96-лункових планшетах з об'ємом лунки 1,2 мл. Висушені гранули ДНК були повторно суспендовані в буфері ТЕ (10 Мм Трис -НСl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА). [0102] Реакції ПЛР TAQMAN проводили в 96лункових планшетах. Для генного контролю ендогенної кукурудзи праймери та зонди були розроблені конкретно для послідовності, що кодує алкогольдегідрогеназу (adhl) Zea mays (Genbank, інве 36 інвентарний номер AF044295). Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що інші гени кукурудзи можуть застосовуватися як ендогенний контроль. Реакції були мультиплексними для того, щоб одночасно ампліфікувати vip3Aa та adhl або pmi та adhl. Для кожного зразка, зразкова суміш була генерована об'єднанням 20 мкл екстрагованої геномної ДНК з 35 мкл 2 × TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) з додаванням праймерів до кінцевої концентрації кожного 900 нм, зондів до кінцевої концентрації кожного 100 нм та води до кінцевого об'єму 70 мкл. Дана суміш була розподілена на три повторення по 20 мкл кожен в 96-лункові планшети для ампліфікації та опечатана оптично прозорою термоплівкою (Marsh Bio Products). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в приладі АВІ Prism7700 із застосуванням наступних параметрів ампліфікації: 2 хвилини при 50 °C та 10 хвилин при 95 °C, за якими слідують 35 циклів по 15 секунд при 95 °C та 1 хвилина при 60 °C. [0103] Результати аналізу TAQMAN продемонстрували, що сорт MIR162 містив одну копію гена vip3Aa20 та одну копію гена pmi. [0104] Праймери та зонди, які застосовувались в ході реакцій ПЛР TAQMAN, наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Праймери, які використовувані в аналізі TAQMAN № послідовності SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 Назва праймера Послідовність праймера Vір3Аа-прямий Vір3Аа-зворотний Vір3Аа-зонд 5'САССТТСАGСААСССGААСТА3' 5'GCTTAGCCTCCACGATCATCTT3' 5'GTCCTCGTCGCTGCCCTTCACCT3' (5' мітка = FAM, 3' мітка = TAMRA) РМІ-прямий РМІ-зворотний РМІ-зонд 5'CCGGGTGAATCAGCGTTT3' 5'GCCGTGGCCTTTGACAGT3' 5'TGCCGCCAACGAATCACCGG3' (5' мітка = FAM, 3' мітка = TAMRA) SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 ZmADH-267 прямий ZmADH-337 зворотний ZmADH-316 зонд 5'GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT3' SEQ ID NO:10 5'TCCAGCAATCCTTGCACCTT3' SEQ ID NO:11 5'TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA3' (5' мітка = ТЕТ, 3' мітка = TAMRA) SEQ ID NO:12 Приклад 3. Виявлення MIR162 за допомогою Саузерн-блотингу [0105] Геномна ДНК, яку використовувала для Саузерн-блотингу, була виділена з об'єднаної листової тканини 10 рослин, що представляють ВС4 генерацію MIR162, із застосуванням головним чином способу Thomas etal. [Theor. Appl. Genet. 86:173-180, 1993], який включений до даного опису шляхом посилання. Всі рослини, що використовувались для ізоляції ДНК, були індивідуально проаналізовані із застосуванням ПЛР TAQMAN (як описано в Прикладі 2) з метою підтвердження присутності єдиної копії гена vip3Aa20 та гена pmi. Для виділених негативних контрольних особин ДНК була виділена з об'єднаної листової тканини виділених негативних особин з генерації ВС4. Такі виділені негативні рослини були індивідуально проаналізовані із застосуванням ПЛР TAQMAN з метою підтвердження генів vip3Aa20 та pmi, але вони були, як і передбачалося, позитивними щодо ендогенного гена adhl маїсу. [0106] Саузерн-блотинг проводили з використанням традиційних методів молекулярної біології. [Див. Chomczynski, P. 1992. Analytical Biochemistry 201:34-139.] Геномна ДНК (7,5 мкг) була гідролізована з використанням рестрикційних ферментів, що здійснюють гідроліз в межах вставки сорту MIR162, але не в межах кодуючої послідовності, 37 яка належить до конкретного зонду, що використовувався під час експерименту. Даний підхід дозволив провести визначення кількості копій кожного гена, що відповідає конкретному зонду, що використовувався для кожного Саузерн-блотингу, який був інкорпорований в сорт MIR162. [0107] Було проведено інші серії гідролізу рестрикційними ферментами, в яких вставка гідролізувалася рестрикційними ферментами, які вивільняли фрагмент відомого розміру з вставки. Даний підхід забезпечив додатковий доказ присутності єдиної копії кожної послідовності в MIR162 та дозволив виявити часткові копії вставки, яка може бути близько зв'язаною з вставкою MIR162. Гібридизація після електрофорезу на агарозному гелі та лужного переносу до мембрани Zeta-Probe® GT (Bio-Rad, кат. № 162-0195) була проведена з використанням генерованих ПЛР елементних зондів з повною довжиною. До зондів було введено мітку у 32 вигляді Р шляхом випадкового праймування із застосуванням системи MegaPrime™ (Amersham Biosciences, кат. № RPN1607). Гібридизацію проводили при 65 °C, з наступними декількома сеансами промивання у 2 × розчині натрію хлориду + натрію цитрату, 0,1 % розчині натрію додецилсульфату, а потім у 0,1 × розчині натрію хлориду + натрію цитрату та 0,1 % розчині натрію додецилсульфату. Мембрани далі піддавали ауторадіографії. [0108] В ході кожного Саузерн-блотингу використовували три контрольні вибірки: (1) ДНК виділеної негативні (нетрансформовані) особини, яку використовували для того, щоб ідентифікувати будь-які ендогенні послідовності Zea mays, які можуть перехресно гібридизуватися із специфічним для елементу зондом; (2) ДНК виділеної негативні особини, до якої введена кількість гідролізованого pNOV1300, яка дорівнює кількості однієї копії, що базується на розмірі плазміди, була введена для того, щоб продемонструвати чутливість експерименту щодо виявлення єдиної копії гена в межах генома Zea mays; та (3) плазміда з гідролізованим pNOV1300, що дорівнює кількості однієї копії, яка базується на розмірі плазміди, як позитивний контроль гібридизації, а також для того, щоб продемонструвати чутливість експерименту. [0109] Результати Саузерн-блотингу продемонстрували, що вставка MIR162 містить єдину копію гена vip3Аа20 та гена pmi і не містить послідовностей основи pNOV1300. Зонд (SEQ ID NO:13) vip3Aa19 застосовувався для Саузерн-блотингу vip3Aa20. Послідовності нуклеотидів vip3Aa19 та vip3Aa20 відрізняються двома нуклеотидами і є на 99,9 % ідентичними. Таким чином, зонд vip3Aa19 гібридизувався з послідовністю vip3Aa20, що наявна в MIR162, у суворих умовах. Застосування зонду vip3Aa19, та розщеплення за допомогою KpnI ЕсоRV приводило до появи єдиної смужки гібридизації з розміром приблизно 8 тисяч пар основ та 13 тисяч пар основ, відповідно. Крім того, подвійне розщеплення Ncol приводило до появи єдиної смужки гібридизації, що відповідала очікуваному розміру 4, 6 тисяч пар основ. Застосування зонду pmi (SEQ ID NO:14), та розщеплення за допомогою Асс65І BamHI приводило до появи єдиної 95637 38 смужки гібридизації з розміром приблизно 4 тисяч пар основ та 6 тисяч пар основ, відповідно. Крім того, подвійне розщеплення ХmaI + НіndIII. приводили до появи єдиної смужки гібридизації, що відповідала очікуваному розміру 8,1 тисяч пар основ. Смужка ХmaI + НіndIII pNOV1300 розміром 8,1 тисяч пар основ (позитивний контроль) також гібридизувалася з vip3Aa19 та pmi зондами, як передбачалося. Була виявлена деяка перехресна гібридизація тільки в плазмідних доріжках із сходинковим зондом ДНК. Традиційно комерційно доступні сходинкові ДНК можуть містити деякі послідовності вектора, які можуть перехресно гібридизуватися з контрольними послідовностями плазміди, як спостерігалося в даних експериментах, але це не впливає на дані, що були одержані в ході даного дослідження. Остаточно, зонд основи pNOV1300 не гібридизується, що демонструє відсутність інкорпорації будь-яких послідовностей основи вектора pNOV1300 у MR162 в ході процесу трансформації. Приклад 4. Гетерологічне упорядкування вставки ДНК [0110] Послідовність нуклеотиду vip3Aa та послідовності, що кодують pmi в гетерологічній молекулі ДНК, вставленій в MIR162, були визначені для того, щоб продемонструвати повну цілісність вставки, суміжність функціональних елементів та для пошуку будь-яких індивідуальних змін комплементарної пари основ нуклеїнових кислот. Кодуючі послідовності були ампліфіковані з ДНК, що походить з генерації ВС4. ПЛР ампліфікація здійснювалася з використанням системи Expand High Fidelity PCR (Roche, кат. № 1732650) або PfuUltra™ Hotstart High-Fidelity ДНК полімерази (Stratagene, кат. № 600390). Кожен продукт ПЛР був індивідуально клонований у вектор pCR®-XLTOPO (Invitrogen, кат. № К4700-20) або у вектор pCR®-BluntII-ТОРО (Invitrogen, кат. № К2800-20) і три окремі клони для кожного продукту ПЛР було ідентифіковано та упорядковано. Упорядкування здійснювали з використанням аналізатора ABI3730XL із застосуванням хімічних методів АВІ BigDye® 1.1 або Big Dye 3.1 dGTP (для GCзбагачених шаблонів). Аналіз послідовності був проведений із застосуванням пакету Phred, Phrap та Consed (Університет Вашингтона) до частоти появи помилок менш, ніж 1 на 10000 основ [Ewing & Green, 1998.Genome Research 8:186-194]. Завершальна консенсусна послідовність для кожного гена була визначена шляхом об'єднання даних послідовності трьох індивідуальних клонів з метою генерації однієї консенсусної послідовності для кожного гена. Вирівнювання послідовностей проводилося із застосуванням програми ClustalW, що має наступні параметри: матриця кількісного оцінювання blosum55, штраф двохланцюгового разриву 15, штраф подовження розриву 6, 66 [Thompson et al, 1994.Nucleic Acids Research22:4673-4680]. [0111] Повна послідовність, що кодує vip3Aa20, була ПЛР-ампліфікована з використанням праймерів MOV3Aa-01-5': 5'ATGAACAAGAACAACACCAA3' (SEQ ID NO:15) та MOV3Aa-01-3': 39 95637 5'CTACTTGATGCTCACGTCGTAG3' (SEQ ID NO:16) та PfuUltra Hotstart, що генерує продукт розміром 2370 тисяч пар основ. ПЛР амплікон був 40 упорядкований з використанням праймерів, наведених в таблиці 2. Таблиця 2 Назва праймера b03503b b03503с b03503d b03503е b03503f b03503g b03503h b03504b b03504c b03504d b03504e b03504f b03504g b03504h b00203c b00203d b00203e b00203f b00203g Послідовність (5'3') ACGAGCAGAACCAGGTGC GGTGAAGAAGGACGGCAG ACCTGTCGCAAGCTGCTGGG TGGACAAGCTGCTGTGTC TGCAGGCCGACGAGAACAG TGATCCAGTACACCGTGAA ACCCTGACCCTGTACCAG GTGTTGCCGCTGATGTTG CGTACTCGGTCTTCGGCT CTGCAGGCCAAAGCCGTT TCGCCGTAGATCACCTCG GCTTGCGACAGGTGGTCA TTGCTGCTGGTCTCGGTGG CGTTGGCGATCTTAAGGAT GCAAGCCATCGATTCAC GCAACACCCTGACCCTG TCTACGACGTGAGCATCAAG GTAGAAGTGCACGATCGGG CGGTGCTGGTCCAGTTG [0112] Дві інші реакції ПЛР перекривали повну послідовність, що кодує vip3Aa20.5' кінець vip3Aa20 був охоплений ПЛР-ампліфікацією із застосуванням праймерів 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO:36) та VIP_R4 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEQ ID NO:37), a також ферменту Expand High Fidelity. Друга реакція охоплювала 3' кінець vip3Aa20; продукт був ампліфікований з використанням праймерів VIP-F3:S'GGTGCTGTTCGAGAAGAGGTS' (SEQ ID NO:42) та PMI_REV1: 5'CGATTTATCACTCTCAATCACAT3' (SEQ ID NO:43), а також ферменту Expand High Fidelity. Амплікони, генеровані даними реакціями, містили нуклеотидні послідовності розміром 2946 тисяч пар основ (SEQ ID NO:38) та нуклеотидні послідовності розміром 2577 тисяч пар основ (SEQ ID NO:44), відповідно. [0113] Дані консенсусної послідовності виявили дві заміни нуклеотидів в послідовності, що ко № послідовності SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ Ю NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEO ID NO:35 дує vip3Aa в MIR162 (позначений vip3Aa20) у порівнянні з послідовністю, що кодує vip3Aa в pNOV1300 (позначений vip3Aa19), який застосовувався для трансформації MIR162. Перша заміна нуклеотиду, G до Т мутації, відбувалася у положенні 387 послідовності, що кодує vip3Aa19 (SEQ ID NO:3). Дана мутація привела до заміни метіоніну в положенні 129 Vip3Aa19 на ізолейцин в Vip3Aa20 (M129I). Друга заміна нуклеотиду відбулася у положенні 1683 кодуючої послідовності, мутація G до С, але не привела до заміни амінокислоти. Таким чином, послідовність, що кодує vip3Aa20, та білок Vip3Aa20 є унікальними для сорту MIR162 і можуть застосовуватися для ідентифікації будь-якої рослини, що містить трансгенний генотип MIR162. Послідовність, що кодує Pmi MIR162, була ідентичною послідовності в трансформації плазміди pNOV1300. Вирівнювання інсектицидних білків Vip3Aa20 та Vip3Aa19 показане в таблиці 3. 41 95637 42 Таблиця 3 Порівняння послідовностей амінокислот Vip3Aa20 та Vip3Aa19 Приклад 5. Аналіз послідовності, що фланкує ДНК [0114] Фахівцям в даній галузі відомо багато способів ампліфікації невідомих послідовностей ДНК, суміжних з основною ділянкою відомої послідовності. Дані способи включають, не обмежуючись ними, зворотну ПЛР (iPCR) [Ochman et.al., Genetics120:621-623 (1988); Triglia et.al., Nucleic Acids Res.16:8186 (1988 panhandle PCR [Jones and Winistorfer, Nucleic Acids Res.20:595-600 (1992); Jones and Winistorfer, Biotechniques 23:132-138 (1997)], лігування касети-фіксована ПЛР [Mueller and Wold, Science 246:780-786 (1989)], векторетуПЛР [vectorette-PCR, Riley et.al., Nucleic Acids Res.18:2887-2890 (1990)], ПЛР з новим Alu [Puskas et.al., Nucleic Acids Res.22:3251-3252 (1994)] і термічну ПЛР з асиметричним переплетенням (TAIL 43 PCR) [Liu and Whittier, Genomics 25:673-681 (1995)]. [0115] Один спосіб, що використовується для ампліфікації послідовності геному ДНК кукурудзи, що фланкує гетерологічну ДНК, вставлену в сорт MIR162, являв собою векторету-ПЛР (vectorette PCR) головним чином, як описано в Riley et al., Nucleic Acids Res.18:2887-2890 (1990), який включено до даного опису шляхом посилання. [0116] Послідовність, що фланкує 5', та послідовність з'єднання були підтверджені із застосуванням стандартних методів ПЛР. Наступні пари праймерів або комплементарні до них застосовувались для того, щоб підтвердити послідовність: 162INSERT-F2: 5'ACACCAATGATGCAAATAGGC3' (SEQ ID NO:36) / VIP_R4: 5'GAAGGTGTTCAGGTAGAACTCGAAG3' (SEQ ID NO:37) та CJB179:5'ATGCAAATAGGCTGGGAATAGTC3' (SEQ ID NO:39)/ CJB134 5'GTACCAGCTTGCTGAGTGGCT3' (SEQ ID NO:40). Одержаний в результаті цього амплікон містить послідовність, наведену в SEQ ID NO:41 та включає 5' послідовність з'єднання у відповідності до SEQ ID NO:45. Слід розуміти, що інші послідовності праймерів можуть застосовуватись для того, щоб підтвердити фланкуючі послідовності та послідовності з'єднання. За допомогою даного способу було виявлено, що вставка MR162 фланкується 5' нуклеотидами 1040-1088 послідовності генома кукурудзи, що наведена в SEQ ID NO:46. [0117] Більша ділянка фланкуючої послідовності 5' з сорту MIR162, була генерована із застосуванням набору Seegene DNA Walking SpeedUp™ Premix, відповідно до інструкцій виробника. [0118] Перша реакція ПЛР проводилася незалежно в чотирьох індивідуальних пробірках із застосуванням праймера FE1002:FE1002: 5'CGTGACTCCCTTAATTCTCCGCT3' (SEQ ID NO:50) з одним із праймерів DW-ACP 1, 2, 3, або 4, що поставляються виробником. Наступні реактиви були змішані у пробірці для ПЛР на льоду: 100 мкг ДНК геному MIR162, 4 мкл 2,5 мМ DW-ACP (кожен з DW-ACP 1, 2, 3 або 4), 4 мкл 2,5 мМ FE1002, 19 мкл дистильованої води та 25 мкл 2 × SeeAmp™ ACP™ Master Mix II. Пробірки були розміщені в попередньо нагрітому (94 °C) термоциклері. ПЛР завершували із застосуванням наступної програми: один цикл при 94 °C протягом п'яти хвилин, при 42 °C протягом однієї хвилини та при 72 °C протягом двох хвилин, 30 циклів при 94 °C протягом 40 секунд, при 55 °C протягом 40 секунд та при 72 °C протягом 90 секунд, а також один цикл при 72 °C протягом семи хвилин. Продукти ПЛР були очищені із застосуванням Exonuclease I та Shrimp Alkaline Phosphatase. [0119] Друга реакція ПЛР проводилася незалежно в чотирьох індивідуальних пробірках із застосуванням праймера FE1003:5'GATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTT3' (SEQ ID NO:51) з праймером DW-ACPN, що поставляється виробником набору. Наступні реактиви були змішані у пробірці для ПЛР на льоду: 3 мкл очищеного продукту ПЛР, 1 мкл 10 мМ DW-ACPN, 1 мкл 10 мМ FE1003, 5 мкл дистильованої води та 95637 44 10 мкл 2 х SeeAmp™ ACP™ Master Mix II. Пробірки були розміщені в попередньо нагрітому (94 °C) термоциклері. Завершували із застосуванням наступної програми: один цикл при 94 °C протягом п'яти хвилин, 35 циклів при 94 °C протягом 40 секунд, при 60 °C протягом 40 секунд та при 72 °C протягом 90 секунд, а також однин цикл при 72 °C протягом семи хвилин. [0120] Третя реакція ПЛР проводилася незалежно в чотирьох індивідуальних пробірках із застосуванням праймера: FE1004:5'GATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT3' (SEQ ID NO:52) з універсальним праймером, що поставляється виробником. Наступні реактиви були змішані у пробірці для ПЛР на льоду: 2 мкл очищеного продукту ПЛР, 1 мкл 10 мМ універсального праймера, 1 мкл 10 мМ FE1004, 6 мкл дистильованої води та 10 мл 2 × SeeAmp™ ACP™ Master Mix II. Пробірки були розміщені в попередньо нагрітому (94 °C) термоциклері. завершували із застосуванням наступної програми: один цикл при 94 °C протягом п'яти хвилин, 35 циклів при 94 °C протягом 40 секунд, при 60 °C протягом 40 секунд та при 72 °C протягом 90 секунд, а також однин цикл при 72 °C протягом семи хвилин. [0121] По 10 мкл продуктів ПЛР аналізували на 1 % гелю агарози, що містив етидію бромід. Відповідна група була екстрагована з гелю агарози та очищена із застосуванням набору Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit згідно з інструкціями виробника. Екстрагована ДНК була клонована у вектор для клонування Invitrogen TOPO-XL згідно з інструкціями виробника. Даний клон був трансформований в Е. coli, та ДНК плазміди була екстрагована з клітин після культивування протягом ночі з набором Qiagen Miniprep згідно з інструкціями виробника. Дана плазміда застосовувалася для остаточного упорядкування. [0122] Новий праймер був розроблений в межах нової, попередньо невідомої послідовності, яка має застосовуватися з праймером в гетерологічній вставці ДНК для того, щоб ампліфікувати повну фланкуючу послідовність довжиною 1 тисяча пар основ поза межами геномної ДНК. Послідовність, що фланкує праймер 162DWConf3:5'CCTGTGTTGTTGGAACAGACTTCT GTC3' (SEQ ID NO:53) та вставка ДНК праймера FE0900:5'GGCTCCTTCAACGTTGCGGTTCTGTC3' (SEQ ID NO:54) застосовувались для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, що містить 5' фланкуючу послідовність, для підтвердження. Послідовність одержаного амплікону сформульована в SEQ ID NO:55. Даний 5' амплікон включає 5' послідовність з'єднання, сформульовану в SEQ ID NO:45. По 10 мкл продуктів ПЛР аналізували на 1 % гелю агарози, що містив етидію бромід. Відповідна група була екстрагована з гелю агарози та очищена із застосуванням набору Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit згідно з інструкціями виробника. Екстрагована ДНК була клонована у вектор для клонування Invitrogen TOPO-XL згідно з інструкціями виробника. Даний клон був трансформований в Е. coli, та ДНК плазміди була екстрагована з клітин після культивування протягом ночі з набором Qiagen Miniprep згідно з інструкціями виробника. 45 95637 Три плазміди були повністю упорядковані з використанням праймерів, наведених в таблиці 4. Послідовності плазмід були вирівняні для того, щоб генерувати повністю підтверджену 5' фланкуючу 46 послідовність. За допомогою даного способу було визначено приблизно 1 тисячу пар основ 5/ фланкуючої послідовності (SEQ ID NO:46). Таблиця 4 Послідовності праймерів Назва праймера Послідовність (5'3') № послідовності b00201h b00605а b00701b b00702b b00704h b01106f b01709f b03504а b05102f b05102g b05102h b05103a b05103b b05103c b05103d b05103e b05103f b05103g b05103h b05210a b05210b TTCACGGGAGACTTTATCTG CCGATTCATTAATGCAG ACGTAAAACGGCTTGTC GTTTAAACTGAAGGCGG AATAATATCACTCTGTACATCC GTTGTAAAACGACGG TAGGCACCCCAGGCTTTA AATTGAATTTAGCGGCCG GGTCCCTACAACATAAATAG TTCGTCCCTACTATCAACGC CTTTAGGCATCAGCGGGT AGCATCTGCGTAAGCACA CTGATGACACCAATGATGC GATCAGATTGTCGTTTCCC GCATCATTGGTGTCATCAG TGTGCTTACGCAGATGCT ACCCGCTGATGCCTAAAG GCGTTGATAGTAGGGACGAA CTATTTATGTTGTAGGGACC CTAGACTGGAAAGCGGAG CCACTTTCATCCCTAGTTG SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 67 SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 80 [0123] 3' Фланкуюча послідовність із сорту MIR162 була генерована із застосуванням універсального набору Clonetech Genome Walker™ Universal kit (Clonetech Laboratories, Inc.) відповідно до інструкцій виробника. [0124] Спершу було створено пули не клонованих адаптер-лігованих фрагментів геному ДНК, відомих як "бібліотеки" Genome Walker. Кожна бібліотека була створена шляхом розщеплення геномної ДНК MIR162 рестрикційним ферментом (Dral, EcoRV, PvuII, StuI та XmnI), як вказано нижче: наприклад, 25 мкл геномної ДНК MIR162 (0,1 мкг/мкл), 8 мкл рестрикційного ферменту (10 одиниць/мкл), 10 мкл буфера рестрикційного ферменту (10 ×) та 57 мкл Н2О було змішано у пробірці та інкубовано при 37 °C протягом ночі. [0125] Далі ДНК була очищена із застосуванням декількох циклів екстракції фенолом/хлороформом. Остаточно, ДНК осадили та промили етанолом, висушили та розчинили у 20 мкл буфера ТЕ. [0126] Для того, щоб лігувати кінці адаптера Genome Walker до геномної ДНК MIR162, 4 мкл гідролізованої очищеної ДНК було змішано з 1,9 мкл адаптера Genome Walker (25 мкМ), 1,6 мкл 10 × буфера для лігування та 0,5 мкл Т4 ДНК лігази (6 одиниць/ мкл). Одержані реакційні суміші інкубували протягом ночі при 16 °C. Реакції зупиняли інкубацією при 70 °C протягом п'яти хвилин. Після зупинки реакції 72 мкл ТЕ додали до кожної пробірки, та їх вміст ретельно перемішували. [0127] Перша реакція ПЛР проводилася із застосуванням праймера АРІ, що поставляється виробником, з різними праймерами, розробленими в межах відомої гетерологічної послідовності вставки ДНК (цикл 1 "специфічні для гену праймери " або "GSP1"). Наступні реактиви було змішано у пробірці для ПЛР на льоду: 1 мкл відповідної бібліотеки ДНК MR162, 1 мкл 10 мкМ АРІ, 1 мкл 10 мкМ GSP1, 1 мкл 10 мМ dNTP, 5 мкл 10 × буфера для ПЛР Advantage 2,1 мкл BD полімерази Advantage 2 та 40 мкл дистильованої води, завершували з використанням наступної програми: сім циклів при 94 °C протягом 25 секунд та при 72 °C протягом п'яти, 32 цикли при 94 °C протягом 25 секунд та при 67 °C протягом чотирьох хвилин та один цикл при 67 °C протягом чотирьох хвилин. Кожна первинна реакційна суміш ПЛР була розведена в 50 разів додаванням до 1 мкл первинного продукту ПЛР 49 мкл дистильованої води. Реакціями, що дали результат, були (1) Dral та XmnІ бібліотеки з GSP1 праймером 162GW3F1: 5'TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGATCCG3' (SEQ ID NO:56) та праймером АР1. [0128] Друга реакція ПЛР була здійснена незалежно з використанням праймера АР2, що поставляється виробником, з різними праймерами, розробленими в межах відомої гетерологічні послідовності вставки ДНК (цикл 2 "специфічні для гену праймери " або "GSP2"). Наступні реактиви було змішано у пробірці ПЛР на льоду: 1 мкл відповідного розбавленого первинного продукту ПЛР, 1 мкл 10 мМ АР2, 1 мкл 10 мМ GSP2, 1 мкл 10 мМ 47 95637 dNTP, 5 мкл 10 × буфера для ПЛР Advantage 2, 1 мкл полімерази BD Advantage 2 та 40 мкл дистильованої води. Завершували з використанням наступної програми: п'ять циклів при 94 °C протягом 25 секунд та при 72 °C протягом чотирьох хвилин, 20 циклів при 94 °C протягом 25 секунд та при 67 °C протягом чотирьох хвилин та один цикл при 67 °C протягом чотирьох хвилин. Реакціями, що дали результат, були (1) Dral та Xmnl бібліотеки з GSP2 з праймером 162GW3F2:5'AAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTT GCG3' (SEQ ID NO:57) та праймер АР2. [0129] По 10 мкл продуктів ПЛР аналізували на 1 % гелю агарози, що містив етидію бромід. Відповідна смужка була екстрагована з гелю агарози та очищена із застосуванням набору Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit згідно з інструкціями виробника. Екстрагована ДНК була клонована у вектор для клонування InvitrogenTOPO-XL згідно з інструкціями виробника. Даний клон був трансформований в Е. coli, та ДНК плазміди була екстрагована з клітин після культивування протягом ночі з набором Qiagen Miniprep згідно з інструкціями виробника. Дана плазміда застосовувалася для остаточного упорядкування. [0130] Новий праймер був розроблений в межах нової наперед невідомої послідовності, яка має застосовуватися з праймером у вставці ДНК для того, щоб ампліфікувати приблизно 1 тисячу 48 пар основ 3' фланкуючої послідовності поза межами геномної ДНК. Праймер вставки ДНК 162GW3F1:5TCTCTTGCTAAGCTGGGAGCTCGAT 1 і CCG3 (SEQ ID NO:56) та праймер 3 фланкуючої послідовності 1623'GWR1:5CTGGTGAACCGATTTTTACGGAGG3' (SEQ ID NO:58) застосовувались для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, що містить 3' фланкуючу послідовність, з метою підтвердження. Послідовність одержаного амплікону сформульована в SEQ ID NO:59. Даний 3' амплікон включає послідовностей 3' з'єднання, сформульовану в SEQ ID NO:47. По 10 мкл продуктів ПЛР аналізували на 1 % гелю агарози, що містив етидію бромід. Відповідна група була екстрагована з гелю агарози та очищена із застосуванням набору Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit згідно з інструкціями виробника. Екстрагована ДНК була клонована у вектор для клонування Invitrogen TOPO-XL згідно з інструкціями виробника. Даний клон був трансформований в Е. coli, та ДНК плазміди була екстрагована з клітин після культивування протягом ночі з набором Qiagen Miniprep згідно з інструкціями виробника. Три плазміди були повністю упорядковані з використанням праймерів, наведених в таблиці 5. Послідовності плазмід були вирівняні для того, щоб генерувати повністю підтверджену 3' фланкуючу послідовність (SEQ ID NO:48). Таблиця 5 Послідовності праймерів Назва праймера b00106а b00106b b00108а b00201h b00605а b00704h b00712е b01106а b01106f b01107h b01108e b01111f b01709f b02701a b02701c b02702a b02702e b02703a b02703e b02704a b02811a b05104c b05104d b05104e b05104f b05104g b05104h b05105c b05105e b05105f Послідовність (5'3') GATTGAATCCTGTTGCC TCTCATAAATAACGTCATGC TCTGTGGATAACCGTATTAC TTCACGGGAGACTTTATCTG CCGATTCATTAATGCAG AATAATATCACTCTGTACATCC AGTAACATAGATGACACCGC CCAGTGTGCTGGAATTCG GTTGTAAAACGACGG CCAGTGTGATGGATATCTGC CCAGTGTGCTGGAATTCG CCAGTGTGATGGATATCTGC TAGGCACCCCAGGCTTTA GTGTGCTGGAATTCGCCCTT TATCTGCAGAATTCGCCCTT GTGTGCTGGAATTCGCCCTT TATCTGCAGAATTCGCCCTT GTGTGCTGGAATTCGCCCTT TATCTGCAGAATTCGCCCTT GTGTGCTGGAATTCGCCCTT GGTCTTGCGATGATTATC GAGAGGAATGGCAGCAGA CATGACGGGTTTGAGATT AATCTCAAACCCGTCATG TCTGCTGCCATTCCTCTC GATCAACCCGGAGAGGAAT CCATGACGGGTTTGAGAT CAACCGACCTGACAAGTGAC ATCTCAAACCCGTCATGG ATTCCTCTCCGGGTTGATC № послідовності SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 64 SEQ ID NO: 84 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 86 SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88 SEQ ID NO: 66 SEQ ID NO: 89 SEQ ID NO: 90 SEQ ID NO: 91 SEQ ID NO: 92 SEQ ID NO: 93 SEQ ID NO: 94 SEQ ID NO: 95 SEQ ID NO: 96 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 100 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 103 SEQ ID NO: 104 SEQ ID NO: 105 49 Приклад 6. Виявлення білка Vip3Aa20 в MIR162 за допомогою ELISA [0131] Екстракти були виготовлені з листя, коріння, м'якоті, зерен, шовку, пилку та цілих рослин MIR162. Вони були кількісно проаналізовані щодо Vip3Aa20 за допомогою ELISA з використанням очищених імуноафінним способом анти-Vір3А антитіл кози та очищених за допомогою протеїну А поліклональних анти-Vір3А антитіл кролика із застосуванням традиційних в даній галузі способів ELISA. Vip3Aa20 був виявлений у всіх тканинах, які було проаналізовано протягом всіх стадій росту. Середній рівень білка Vip3Aa20, знайдений в суцільній рослині при цвітінні та зрілості зерна, становив 10 мкг/г свіжої сировини та 16 мкг/г свіжої сировини, відповідно. Середній рівень білка Vip3Aa20 в листі при цвітінні становив 22 мкг/г свіжої сировини. Приклад 7. Польова ефективність MIR162. [0132] Сорт MIR162 було перевірене в полі щодо ефективності проти трав'яної совки (FAW, Spodoptera frugiperda), коробчастого черв'яка (CEW, Helicoverpa zea), чорного озимого черв'яка совки (BCW, Agrotis ipsilon) та огнівки кукурудзяної (ЕСВ, Ostrinia nubilalis). Ефективність сорту MIR162 порівнювалася з ефективністю Warrior® (Syngenta, Inc.), звичайного стандартного інсектициду, що застосовувався в кількості 11,2 г активного інгредієнта /акр, трансгенного сорту кукурудзи Bt11, що містить ген cry1Ab, та гібриду Bt11 X MIR162, що був продукований схрещуванням природженої лінії Bt11 з природженою лінією MIR162. [0133] Двадцять-вісім дослідницьких ділянок було висаджено в 13 штатах, що являють собою головні райони континентальної частини Сполучених Штатів, де вирощується кукурудза. Дослідницькі ділянки були висаджені за моделлю рандомізованого повного блоку з чотирма повторюваними ділянками в одному блоці. Ділянки склали 17,5 футів рядів на одну обробку в одному повторенні. Цільова густина насадження становила приблизно 30000 рослин/акр. Імунодіагностичні смуги застосовувались для того, щоб підтвердити присутність або відсутність білків Vip3Aa20 та Cry1Ab в різних групах обробки. [0134] Природні інвазії шкідників використовувалися у випробуваннях, де популяції були достатньо щільними; якщо їх не було, проводились штучні інвазії. Штучна інвазія з використанням двох личинок 2-ої або 3-ої вікової стадії при V1-V2 використовувалася у випробуваннях BCW. Ділянки оцінювали на 3, 7 та 14 день після інвазії. Пошкодження BCW були зафіксовані як частково пошкоджені рослини та повністю зрізані рослини. Ділянки FAW оцінювались на 7 та 14 день після інвазії, або після того, як личинки 3-ої вікової стадії виявлялися в контрольних рослинах. Наступну шкалу було застосовано з метою оцінки пошкодження листя FAW та CEW: 0.01 - Немає видимого листового пошкодження листя 1 - Пошкодження невеликого розміру на декількох листках 95637 50 2 - Невелика кількість пошкоджень розміром з червоточину на декількох листках 3 - Пошкодження розміром з червоточину на декількох листках 4 - Пошкодження розміром з червоточину та ураження на декількох листках 5 - Ураження на декількох листках 6 - Великі ураження на декількох листках 7 - Великі ураження та з'їдені частини на декількох листках 8 - Великі ураження та з'їдені частини на кількох листках 9 - Великі ураження та з'їдені частини на більшості листя [0135] Пошкодження рослин оцінювали для першої та другої генерації ЕСВ. Наступна шкала застосовувалась для рейтингу пошкодження першої генерації, як правило, коли личинки знаходилися у 3-ій або 4-ій віковій стадії: 1 - Немає видимого пошкодження листя 2 - Невелика кількість пошкоджень розміром з червоточину на декількох листках 3 - Багато пошкодження розміром з червоточину, на декількох листках 4 - Декілька листків з пошкодженнями розміром з червоточину та видовженими ураженнями 5 - Декілька листків з видовженими ураженнями 6 - Декілька листків з видовженими ураженнями розміром близько 2,5 см 7 - Великі ураження, поширені приблизно на половині листя 8 - Великі ураження, поширені приблизно на двох третинах листя 9 - Більшість листя з великими ураженнями [0136] Пошкодження другої генерації ЕСВ оцінювали через 3-4 тижні після штучної інвазії або наприкінці періоду піку відкладання яєць. Було проведено наступні вимірювання: кількість живих личинок/черешок, кількість живих личинок/стебло, кількість живих личинок/початок, кількість тунелів/черешок, сукупна довжина (см) тунелю/черешок, сукупна довжина (см) тунелю/стебло, кількість тунелів/початок, сукупна довжина тунелю пошкодження зерна (см)/початок та % заражених паразитами рослин. [0137] Дослідницькі ділянки CEW були загалом висаджені пізно для того, щоб збільшити рівні природної інвазії. Пошкодження початків личинками оцінювали, коли личинки CEW на контрольних рослинах знаходились на стадіях росту L5-L6. Рейтинги початків включали реєстрацію кількості личинок, що спостерігалися на одному початку, та довжину очевидно з'їденого зерна, яка вимірювалась від верхівки початку до середнього найнижчого знищеного зерна. [0138] Результати польового випробування BCW наведено в таблиці 6. Менш, ніж 3 % рослин MIR162 та рослин Bt11 X MIR162 були зрізані личинками BCW. Істотні кількості Bt11 та контрольних рослин були вирізані. Рослини, що містять генотип MIR162, демонстрували менше пошкодження личинками BCW, ніж рослини, оброблені звичайним інсектицидом. 51 95637 52 Таблиця 6 Рейтинги пошкодження черешків для п'яти дослідницьких ділянок з BCW на 21-й день після інвазії. Пошкодження вимірювали як відсоток загальної кількості зрізаних рослин. Обробка MIR162 Bt11 Bt11 × MIR162 Інсектицид Warrior Негативні контрольні особини [0139] Результати польових випробувань FAW наведено в таблиці 7. Пошкодження у вигляді поїдання FAW вимірювали за шкалою 0,01-9. Середнє пошкодження у вигляді поїдання гібридів MIR162 було дуже низьким (