Поліпшені димери sgp130fc

1. Поліпептидний димер, здатний інгібувати активність атомістичного комплексу IL-6/slL-6R, що містить два мономери, де кожний з вказаних мономерів містить зовнішньоклітинну частину молекули gp130 або її варіант або фрагмент, конденсований з доменом Fc білка IgGl, та де принаймні один амінокислотний залишок Leu235 шарнірної області домену Fc замінюють на принаймні один гідрофільний амінокислотний залишок. 2. Поліпептидний димер за п. 1, де гідрофільним амінокислотним залишком є Glu або Asp. 3. Поліпептидний димер за п. 1 або 2, де крім того амінокислотний залишок Leu234 шарнірної області замінений на Phe або Аlа. 4. Поліпептидний димер за п. 3, де амінокислотні залишки Leu234 та/або Glу237 шарнірної області замінені на амінокислотний залишок Аlа. 5. Поліпептидний димер за будь-яким з пп. 1-4, де шарнірна область містить мотив амінокислотної послідовності Ala234-Glu235-Gly236-Ala237 замість Leu234-Leu235-Gly236- Gly237. 6. Поліпептидний димер за п. 5, де шарнірна область містить амінокислотну послідовність Asp221Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226-Pro227-Pro228Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233-Ala234-Glu235-Gly236Ala237-Pro238-Ser239-Val240. 7. Поліпептидний димер за будь-яким з пп. 1-6, де розчинна молекула gр130 або її варіант або фрагмент є конденсованими з шарнірною областю домену Fc білка IgG1 безпосередньо або через гнучкий поліпептидний лінкер. 8. Поліпептидний димер за п. 7, де лінкером є лінкер, що містить 2-50 амінокислотних залишків, UA (21) a200814839 (22) 29.06.2007 (24) 25.08.2011 (86) PCT/EP2007/005812, 29.06.2007 (31) 06013668.6 (32) 30.06.2006 (33) EP (46) 25.08.2011, Бюл.№ 16, 2011 р. (72) ВЬОТЗІҐ ҐЕОРҐ, DE, СІҐЕРТ ДІРК, DE (73) КОНАРІС РІСЕРЧ ІНСТІТ'ЮТ АҐ, DE (56) SONDERMANN P ET AL: "The 3.2-ANG crystal structure of the human IgG1 Fc fragmentFcgammaRIII complex" NATURE, NATURE PUBLISHING GROUP, LONDON, GB, vol. 406, no. 6793, 20 July 2000 (2000-07-20), pages 267-273. ECONOMIDES A N ET AL: "Cytokine traps: multicomponent, high-affinity blockers of cytokine action" NATURE MEDICINE, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 9, no. 1, January 2003 (2003-01), pages 47-52. ATREYA R ET AL: "BLOCKADE OF INTERLEUKIN 6 TRANS SIGNALING SUPPRESSES T-CELL RESISTANCE AGAINST APOPTOSIS IN CHRONIC INTESTINAL INFLAMMATION: EVIDENCE IN CROHN DISEASE AND EXPERIMENTAL COLITIS IN VIVO" NATURE MEDICINE, NATURE AMERICA, NEW YORK, US, vol. 6, no. 5, May 2000 (2000-05), pages 583-588. ECONOMIDES A N ET AL: "DESIGNER CYTOKINES: TARGETING ACTIONS TO CELLS OF CHOICE" SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE,, US, vol. 270, 24 November 1995 (1995-11-24), pages 13511353. DUNCAN A R ET AL: "LOCALIZATION OF THE BINDING SITE FOR THE HUMAN HIGH-AFFINITY FC RECEPTOR ON IGG" NATURE, NATURE 2 (19) 1 3 95636 4 незалежно вибраних з групи, що складається з гліцину, серину, аспарагіну, треоніну та аланіну. 9. Поліпептидний димер за будь-яким з пп. 1-8, де один або більше сайтів N-глікозилування є вставленими між розчинною молекулою gр130 або варіантом чи фрагментом, та доменом Fc. 10. Поліпептидний димер за будь-яким з пп. 1-9, де мономери є зв'язаними з кожним іншим через простий ковалентний зв'язок, гнучкий пептидний лінкер або один або більше дисульфідних містків. 11. Поліпептидний димер за будь-яким з пп. 1-10, де принаймні один мономер вказаного димеру є ПЕГильованим. 12. Полінуклеотид, що кодує мономер поліпептидного димеру за будь-яким з пп. 1-10. 13. Вектор експресії, що містить полінуклеотид за п. 12. 14. Клітина-хазяїн, що містить вектор експресії за п. 13. 15. Спосіб отримання поліпептидного димеру за будь-яким з пп. 1-10, що полягає у культивуванні клітини-хазяїна за п. 14 та виділенні мономера або димеру з вказаних клітин хазяїна або культур. 16. Фармацевтична композиція, що містить поліпептидний димер, який визначено за будь-яким з пп. 1-11. 17. Застосування поліпептидного димеру, який визначено за будь-яким з пп. 1-11 для отримання фармацевтичної композиції для лікування та/або попередження хвороби або розладу, де блокування атомістичного комплексу IL-6/sIL-6R має цілющу дію. 18. Застосування за п. 17, де вказана хвороба є резорбцією кісток, гіперкальцемією, кахексією, пухлиною або іншим типом раку, автоімунною хворобою, запальною або атонічною хворобою, інфекцією, ендокринологічним розладом або метаболічною або катаболічною хворобою. Заявлений винахід стосується поліпептидного димеру, що містить дві розчинні молекули gp130, кожна з яких конденсована з доменом Fc білку IgGI, де шарнірна область домену Fc є модифікованою, призводячи до кращих властивостей димеру. Заявлений винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить вказаний димер, та відмінних медичних застосувань. Плейотропний цитокін інтерлейкін-6 (IL-6) виявляє широкий спектр біологічних функцій, серед котрих головним чином є значними стимулювання В-клітин та індукування синтезу гостро-фазного білку у печінці. IL-6 впливає на його активність стосовно цільових клітин зв'язуванням з IL-6 специфічним поверхневим рецептором (IL-6R). Цей комплекс рецептор/ліганд полегшує гомодимеризацію gp130, другої субодиниці комплексу IL-6рецептор. Димеризація gp130 дає результатом перетворення сигналу IL-6. Розчинні форми IL-6R (slL-6R), котрі утворюються двома за механізмами (альтернативні сплайсинг та скидання), також здатні ініціювати димеризацію gp130 та передавати сигнал при комплексуванні з IL-6. Оскільки цитоплазматична частина IL-6R не сприяє перетворенню сигналу, передачу сигналу гомодимером gp130 можна індукувати комплексом IL-6, зв'язаним з мембранами, або розчинними IL-6R. Присутність SIL-6R, однак, призводить до активації чутливих до IL-6 клітин відносно ліганду. Крім того, суворо залежні від IL-6 клітини гібридоми не проліферують у відповідь на дуже низькі кількості IL-6, коли SIL-6R у культиваційних середовищах постійно видаляють. Спочатку описаний як перетворювач сигналу інтерлейкіну-6, gp130, є ланцюгом перетворювачу у багатьох цитокінах, як-то IL-6, IL-II, інгібіторний фактор лейкемії (LIF), онкостатин Μ (OSM) та ціліарний нейротрофічний фактор (CNTF). Усі ці цитокіни діють через дво- або троїстий рецепторний комплекс, у котрому передача сигналу ініціюється гомодимеризацією (для IL-6) або гетеродимеризацією gp130 із LIF-R (для LIF, CT-I, OSM, CLC та CNTF) або OSM-R (для OSM). Ці цитокіни можуть тому опосередковувати схожі біологічні активності у відмінних тканинах. Тоді як gp130 можна виявити на майже усіх типах клітин, IL-6R виявляє набагато більш обмежену експресію. Вивільнення SIL-6R одним типом клітин спонукає інші клітини, котрі експресують тільки gp130, чутливий до IL-6. Цей сценарій є названим транс-сигналізацією. Дійсно, описані кілька клітинних активностей, котрі потребують комплексу SIL-6R та IL-6 та не є видними з IL-6 поодинці. Розчинний білок gp130 є виявленим у високій концентрації у плазмі людини. Нещодавно описано дізайнерний цитокін rinep-LL-6 (H-IL-6), у котрому С-кінець SIL-6R є ковалентно конденсованим з N-кінцем сформованого IL-6 гнучким пептидним лінкером. Як розглянуто, комплекс IL-6/slL6R, H-IL-6 також діє на клітини, котрі експресують тільки gp130. На відміну від окремих компонентів IL-6 та SIL-6R, 100 - 1000-кратно нижча концентрація цієї конденсованої молекули є достатньою для індукування порівнянних біологічних сигналів. Для лікування відмінних хвороб або розладів може бути потрібним специфічне блокування реакцій на IL-6, залежних від розчинного IL-6R. Такі хвороби охоплюють резорбцію кісток, гіперкальцемію, кахексію, пухлини або інші типи раку (наприклад, рак товстої кишки, множинна мієлома, лімфома, лейкемія, хвороба Ходжкіна), автоімунні хвороби (наприклад, розсіяний склероз (МС) або діабет типу 1), запальні або атопічні хвороби (наприклад, хвороба Крона, виразковий коліт, ревматоїдний артрит, юнацький ревматоїдний артрит, астма, псоріаз, саркоїдоз, червоний вовчак або увеїт), інфекції (наприклад, бактеріями, вірусами, грибками або іншими патогенами), а також ендокринологічні розлади та метаболічні або катаболічні хвороби (наприклад, діабет типу 2, ожиріння, гіпе 5 рглікемія або гіперхолестеринемія). Виявлено, що наприклад, димери sgp130 або димери sgp130Fc є корисними для терапевтичного застосування. Проблемою у підґрунті заявленого винаходу було отримання поліпшених димерів sgp130Fc. Розв'язання вказаної проблеми досягнуто втіленнями, вказаними у формулі винаходу. Протягом експериментів, що призвели до заявленого винаходу, виявлено, що біологічна активність, здатність до очистки та стабільність білків конденсату sgp130Fc значно залежить від амінокислотного складу шарнірної області між sgp130 та Fcчастиною. Амінокислоти 234, 235 та 237 IgGI-Fc людини (згідно із EU-нумеруванням) мутували для зменшення зв'язування Fc-рецептору з цим мотифом (Duncan et al. Nature (1988), 332: 563-564; Canfield та Morrison, J. Exp. Med. (1991), 173: 14831491; Wines et al., J. Immunol. (2000), 164: 53135318; Sondermann et al., Nature (2000), 406: 267). Неочікувано, заміною Leu235 у послідовності природного типу Leu234-Leu235-Gly236-Gly237 на глутамат (Glu, Ε) або аспартат (Asp, D) а тому, руйнуванням гідрофобного мотифу сильно гідрофільною (зарядженою) амінокислотою, біологічна активність та стабільність білків конденсату sgp130Fc може бути поліпшеною. Мутації у позиціях 234 та 237 посилюють цю дії. Найбільш потужний мутант має послідовність Ala234-Glu235-Gly236Ala237 Фіг. 1: Шарнірна область мутеїнів sgp130Fc Нижчу шарнірну область IgGI-Fc людини було модифіковано сайт-спрямованим мутагенезом. Ідеальною послідовністю, як визначено в експериментах, є "AEGA" (яку уведено у сполуку CR5/18). Скорочення та символи: аа, амінокислота; С, цистеїни, що утворюють два дисульфідних містка, потрібних для димеризації білку конденсату Fc; X, аланін (Ala, A) або фенілаланін (Phe, F); Ζ, глутамат (Glu, Ε) або аспартат (Asp, D). Фіг. 2: Хроматографічні криві елювання з виключенням за розміром sgp130Fc природного типу та CR5/18 CR5/18 виявляє значно зменшену кількість агрегатів (побічних продуктів) у порівнянні зі sgp130Fc природного типу, а тому, вищий вихід незабрудненого продукт. Фіг. 3: Інгібування IL-6/slL-6R-індуковоної проліферації клітин BAF3/gp130 за допомогою CR5/18 або sgp130Fc природного типу, як визначено за допомогою дослідженнями життєздатності клітин MTS CR5/18 є значно більш біологічно активним, ніж sgp130Fc природного типу (wt) у блокуванні проліферації, ініційованої 100 нг/мл IL-6 та 50 нг/мл SIL-6R. Це видно з ІК50 CR5/18 (1), що є приблизно половиною ІК50 sgp130Fc (2). Скорочення та символи: ІК50, концентрація із 50% інгібіторною ефективністю; IL-6, інтерлейкін-6; I/R, IL-6 плюс slL-6R; MTS, субстрат, що перетворюється метаболічно активними клітинами у розчинний продукт формазану, що поглинає при 490 нм; OD, оптична густина при 490 нм; SIL-6R, розчинний рецептор інтерлейкіну-6. Тому заявлений винахід стосується поліпептидного димеру, здатного інгібувати активність агоністичного комплексу IL-6/SIL-6R, що містить 95636 6 два мономери, де кожний мономер містить розчинну молекулу gp130 або її варіант або фрагмент, конденсований з доменом Fc білку IgG, та де принаймні один амінокислотний залишок Lеu235 шарнірної області домену Fc замінюють принаймні одним гідрофільним амінокислотним залишком. Кращими гідрофільними амінокислотними залишками є Glu та Asp. Термін "розчинний" як застосовувано тут, стосується молекули gp130, що втратила внутрішньоклітинний домен, та переважно, трансмембранний домен. Димери заявленого винаходу можна створювати, застосовуючи відомі способи. Застосовувані домени можуть складатися з суцільного зовнішньоклітинного домену gp130, або вони можуть складатися з його мутантів або фрагментів, що підтримують здатність інгібувати активність агоністичного комплексу IL-6/slL-6R. Кращими фрагментами є фрагменти, що складаються принаймні із зовнішньоклітинних доменів D1 - D3. Експресія "конденсованого з доменом Fc білку IgG" означає, що переважно, конденсатний партнер димеру складається тільки з домену Fc білку IgGI. Однак, Fc-частина може містити послідовності з більше, ніж одного ізотипу IgG, та вибір конкретних мотифів послідовності для оптимізації потрібних ефекторних функцій зрозумілий спеціалісту. У кращому втіленні поліпептидного димеру заявленого винаходу, амінокислотний залишок Leu234 шарнірної області замінюють на Phe або Ala. У ще кращому втіленні поліпептидного димеру заявленого винаходу, амінокислотні залишки Leu234 та/або Gly237 шарнірної області замінюють на амінокислотний залишок Ala. У ще більш кращому втіленні поліпептидного димеру заявленого винаходу, шарнірна область містить мотиф амінокислотної послідовності Ala234Glu235-Gly236-Ala237 замість Leu234-Leu235-Gly236Gly237. Особливо кращим є поліпептидний димер, де шарнірна область містить амінокислотну послідовність Asp221-Lys222-Thr223-His224-Thr225-Cys226Pro227-Pro228-Cys229-Pro230-Ala231-Pro232-Glu233Ala234-Glu235-Gly236-Ala237-Pro238-Ser239-Val240. Конденсати зовнішньоклітинного домену gp130 (sgp130), переважно на С-кінці, або їх варіант або фрагмент з шарнірною областю Fcчастини можуть бути безпосередніми або вони можуть застосовувати гнучкий поліпептидний лінкерний домен відмінної довжини та комбінації амінокислот. Ці лінкери можуть бути повністю штучними (наприклад, містити 2-50 амінокислотних залишків, незалежно вибраних з групи, що складається з гліцину, серину, аспарагіну, треоніну та аланіну) або адаптованими від існуючих у природі білків. Такі лінкери можуть посилювати гнучкість та зв'язувальні властивості димеру. На додаток, білки конденсату sgp130Fc винаходу можуть бути далі конденсованими з мітками, як-то noni(His), Мус, Strep, поліаргінін, Flag, білок зеленої флуоресценції (GFP), ТАР, глутатіон Sтрансфераза (GST), НА, калмодулін-зв'язувальний пептид (СВР), мальтоза-зв'язувальний білок 7 (МВР), V5, HSV, S, вірус везикулярного стоматиту (VSV), Білок С, Люцифераза, Glu-Glu, Ε, бета-GAL, Т7 або інші епітопи, для котрих є доступними антитіла або інші зв'язувальні молекули для швидкої очистки, визначення вестерн-блотуванням або ELISA, імуноосадження, або ослаблення/блокування активності у біодослідженнях. У наступному кращому втіленні поліпептидного димеру заявленого винаходу, один або більше сайтів N-глікозилування є вставленими між розчинною молекулою gp130 або варіантом чи фрагментом та доменом Fc. Амінокислотні мотифи сайтів N-глікозилування з серцевинною послідовністю Asn-X-Ser або Asn-X-Thr залежно від контексту мотифу у білку, та можуть бути прогнозованими та розробленими спеціалістом, наприклад, застосовуючи програму, як-то NetNGIyc (Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark). Кращим лінкерним елементом Nглікозилування для димерів sgp130Fc винаходу є His-Asn-Leu-Ser-Val-lle. Ще одним об'єктом заявленого винаходу є ПЕГіловані або інші хімічно модифіковані форми димерів. ПЕГілування молекул sgp130 можна проводити, наприклад, способами, описаними для IFN-γ, IFN-, IFN-β, IL-15 або IL-2 людини (Youngster et аl., Curr Pharm Des (2002), 8:2139; Grace et al., J Interferon Cytokine Res (2001), 21:1103; Pepinsky et al., J Pharmacol Exp Ther (2001), 297:1059; Pettit et al., J Biol Chem (1997), 272:2312; Goodson et al. Biotechnology NY (1990), 8:343; Katre, J Immunol (1990), 144:209). Будь-як різновид поліетиленгліколю є придатним для заявленого винаходу за умови, що ПЕГполіпептид-димер є здатним до блокування реакцій на залежність від SIL-6R, котрі можна досліджувати відомими способами. Переважно, поліетиленгліколем поліпептиддимеру заявленого винаходу є ПЕГ 1000, 2000, 3000, 5000, 10000, 15000, 20000 або 40000 з особливо кращими ПЕГ 20000 або 40000. Для утворення димеру дві розчинні молекули gp130 зв'язуються простим ковалентним зв'язком, гнучким пептидним лінкером або, переважно, одним або більше дисульфідними містками. Пептидні лінкери можуть бути повністю штучними (наприклад, містити 2-20 амінокислотних залишків, незалежно вибраних з групи, що складається з гліцину, серину, аспарагіну, треоніну та аланіну) або адаптованими від існуючих у природі білків. Утворення дисульфідного містку можна досягти, наприклад, рекомбінантною експресією, де послідовність нуклеїнових кислот, що кодує мономер sgp130Fc, містить один або більше кодонів, що кодують цистеїн, переважно у шарнірній області домену Fc. Димери заявленого винаходу є переважно рекомбінантно отримуваними застосуванням полінуклеотиду, що кодує мономер димеру та вектори, переважно вектори експресії, що містять вказані полінуклеотиди. Для утворення димерів винаходу, полінуклеотиди отримують з існуючих клонів, тобто, переважно кодують існуючий у природі поліпептид або його частину (для людини gp130/IL6ST: послідовність GenBank NM_002184 та допоміжні 95636 8 клони; для незмінної області IgGI/IGHGI людини: наприклад, послідовність GenBank AK057754). Поліпептиди, кодовані будь-яким полінуклеотидом, котрий гібридизується з комплементом природної ДНК або РНК у високо суворих або помірно суворих умовах (для визначення, дивись Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y.) так довго, щоб поліпептид підтримував біологічну активність природної послідовності, є також корисними для отримання димерів заявленого винаходу. Рекомбінантні вектори можна створювати способами, добре відомими спеціалісту; дивись, наприклад, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) Ν. Υ. Різні системи експресії вектор/хазяїн можна застосовувати для вміщення та експресії послідовності, що кодує димери заявленого винаходу. Вони охоплюють, але без обмеження, мікроорганізми, як-то бактерії, трансформовані рекомбінантними векторами експресії ДНК бактеріофагів, плазмід або космід; дріжджі, трансформовані векторами експресії дріжджів; системи клітин комах, інфектовані вірусними векторами експресії (наприклад, бакуловірус); системи клітин рослин, трансформовані вірусними векторами експресії (наприклад, вірус мозаїки цвітної капусти, CaMV; вірус мозаїки тютюну, TMV) або бактеріальними векторами експресії (наприклад, плазміди Ті або pBR322); або системи клітин тварин. У бактеріальних системах ряд векторів експресії може бути вибраним залежно від призначеного для поліпептидного димеру заявленого винаходу застосування. Вектори, придатні для застосування у заявленому винаході, охоплюють, але без обмеження вектор експресії pSKK для експресії у бактеріях. У модифікованих або природного типу (наприклад, глікосконструйованих) видах дріжджів, як-то Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe або Pichia pastoris, можна застосовувати ряд векторів, що містять конститутивні або індуцибельні промотери або системи промотерів, як-то фактор альфа, алкоголь-оксидаза, PGH, тетрациклін глюкоза тощо,; для огляду, дивись Grant et al. (1987) Methods Enzymol. L53: 516-544; Siam et al. (2004) Methods 33:189-198; Macauley-Patrick et al. (2005) Yeast:249-270, Gellissen et al. (2005) FEMS Yeast Res. 5:1079-1096; Wildt та Gerngross (2005) Nat. Rev. Microbiol. 3: 119-128. У випадках, де є застосовуваними системи експресії рослин (для огляду, дивись, наприклад, Stoger et al. (2005) Curr.Opin.Biotechnol,16:167-173; Gomord et al. (2005) Trends Biotechnol. Z3: 559565), експресія послідовності, що кодує димер (або його мономери) заявленого винаходу може бути керованою будь-яким з ряду промотерів. Наприклад, вірусні промотери, як-то промотери 35S та 19S CaMV, можна застосовувати поодинці або у комбінації з омега-лідерною послідовністю від TMV (Takamatsu (1987) ЕМВО J. 6:307-311). Альтернативно, можна застосовувати промотери рослин, як-то невелику субодиницю промотерів RUBISCO або теплового шоку (Coruzzi et al. (1984) ЕМВО J. 3:1671-1680; Brogue et al. (1984) Science 224:838 9 843; та Winter et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Ці констракти можна уводити у клітини рослин безпосереднім перетворенням ДНК або опосередкованою патогеном трансфекцією. Такі способи є описаними у ряді загально доступних оглядів (дивись, наприклад, Hobbs та Murry у McGraw Hill Yearbook of Science та Technology (1992) McGraw Hill, New York, N. Y.;pp. 191-196). Систему клітин комах можна також застосовувати для експресії димерів (або їх мономерів) заявленого винаходу. Наприклад, в одній такій системі, ядерний поліедрозний вірус Autographs californica (AcNPV) є застосовуваним як вектор для експресії чужинних генів у клітинах Spodoptera frugiperda або у Trichoplusia larvae. Послідовності можна клонувати у несуттєву область вірусу, як-то поліедринний ген, та розміщати під контролем поліедринного промотеру. Успішна вставка послідовності ДНК, що кодує мономери sgp130Fc або їх фрагменти або варіанти, спонукатиме поліедринний ген інактивуватися та продукувати рекомбінантний вірус, що втратив білок покриття. Рекомбінантні віруси можна тоді застосовувати для інфікування, наприклад, клітин S. frugiperda або Trichoplusia larvae, у котрих sgp130Fc заявленого винаходу може бути експресованим (Engelhard et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227). У клітинах хазяїна-ссавця можна застосовувати ряд систем експресії, наприклад, на основі ліпідної трансфекції або вірусної трансдукції клітин. У випадках, де аденовірус є застосовуваним як вектор експресії, послідовності, що кодують поліпептиди заявленого винаходу можна лігувати в комплекс транскрипції/трансляції аденовірусу, що складається з пізнього промотеру та троїстої лідерної послідовності. Вставку у несуттєву область ЕІ або Е3 вірусного геному можна застосовувати для отримання життєздатного вірусу, котрий є здатним експресувати поліпептиди заявленого винаходу у інфікованих клітинах хазяїна (Logan, J. та Shenk, Л Т. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 8 :3655-3659). На додаток, енхансери транскрипції, як-то енхансер вірусу саркоми Рауса (RSV), можна застосовувати для збільшення експресі у клітинах хазяїнассавця. Після уведення рекомбінантного вектору (s), клітини хазяїна вирощують у селективному середовище, котре вибирають для вирощування вектор-вмісних клітин. Будь-як число систем селекції можна застосовувати для отримання ліній трансформованих клітин. Вони охоплюють, але без обмеження, гени тимідин-кінази вірусу простого герпесу (Wigler, Μ. et al. (1977) Cell 11.:223-32) та аденін фосфорибозилтрансферази (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23), котрі можна застосовувати у клітинах tk.sup.- або aprt.sup,-, відповідно. Також, резистентність до антіметаболітів, антибіотиків або гербіцидів можна застосовувати як основу для селекції; наприклад, dhfr, котрий надає резистентність до метотрексату (Wigler, Μ. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, котрий надає резистентність до аміноглікозидів неоміцин та G-418 (Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Моl. ВіоІ. 150:114) та als або pat, котрі надають резистентність до хлорсульфурону та фосфінотрицин ацетилтранс 95636 10 ферази, відповідно. Додаткові придатні для селекції гени описані, наприклад, trpB, котрий дозволяє клітинам застосовувати індол замість триптофану, або hisD, котрий дозволяє клітинам застосовувати гістинол замість гістидину (Hartman, S. С. та R. С. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Застосування видимих маркерів популярно з такими маркерами, як антоціаніни, бетаглюкуронідаза та її субстрат GUS, та люцифераза та її субстрат люциферин, що широко застосовувані не тільки для ідентифікації трансформантів, але також для визначення кількості тимчасової або стабільної експресії білку, віднесеної до специфічної векторної системи (Rhodes, С. A. et al. (1995) Methods Мої. Biol. 55:121-131). Очистку рекомбінантних поліпептидів проводять будь-яким способом, відомим для цього, тобто, будь-яким звичайним способом, у тому числі екстракцією, осадженням, хроматографією, електрофорезом, тощо. Наступний спосіб очистки, що можна застосовувати, є афінною хроматографією, застосовуючи, наприклад, Білок А, Білок G або моноклональні антитіла, котрі зв'язують цільовий поліпептид, котрий отримують та іммобілізують на гелевому матриксі, що міститься у колонці. Забруднені препарати, що містять рекомбінантний поліпептид, пропускають через колонку. Поліпептид повинен бути зв'язаним з колонкою специфічною взаємодією з афінним гелевим матриксом, тоді як забруднення проходитимуть через нього. Після промивки поліпептид елюють з гелю зміною рН або іонної сили та тоді, якщо його отримують як мономер, димеризують та, якщо потрібно, ПЕГілують. Відповідно, заявлений винахід також стосується способу отримання поліпептидного димеру заявленого винаходу, що полягає у культивуванні клітин хазяїна, трансформованих ДНКпослідовністю, що кодує мономер вказаного поліпептиду та виділення поліпептид-мономеру або димеру з вказаних клітин хазяїна або культур. Поліпептидні димери заявленого винаходу є корисними у лікуванні та/або попередженні усіх патологій, у котрих слід інгібувати активність агоністичного комплексу IL-6/SIL6R. Тому, заявлений винахід також стосується фармацевтичної композиції, що містить ефективну кількість поліпептид-димеру заявленого винаходу, переважно комбінованого з фармацевтично прийнятним носієм. "Фармацевтично прийнятний" охоплює будь-який носій, котрий не впливає на ефективність біологічної активності активного інгредієнту та не є токсичним для хазяїна, до котрого його застосовують. Приклади придатних фармацевтичних носіїв є добре відомими та охоплюють буферований фосфатом фізіологічнй розчин, воду, емульсії, як-то емульсії олива/вода, відмінні типи змочувальних агентів, стерильні розчини тощо. Такі носії можна формувати звичайними способами та можна застосовувати в ефективній дозі. "Ефективна кількість" стосується кількості активного інгредієнту, що є достатня для впливу на хід та суворість хвороби, призводячи до зменшення або ремісії такої патології. 11 "Ефективна доза" корисна для лікування та/або попередження цих хвороб або розладів може бути визначеною, застосовуючи способи, відомі спеціалісту (дивись наприклад, Fingl et al., The Pharmocological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, pp. 1-46 ((1975)). Застосування композиції можна здійснити відмінними шляхами, наприклад, внутрішньовенно, інтраперитонеально, підшкірно, внутрішньом'язово, місцево або інтрадермально. Режим дозування визначається лікарем та іншими клінічними факторами. Як добре відомо у медицині, дозування для будь-якого пацієнта залежить від багатьох факторів, у тому числі розміру пацієнта, поверхні тіл, віку, статі, конкретної сполуки для застосування, часу та шляху застосування, різновиду терапії, загального здоров'я та інших ліків, застосовуваних одночасно. Заявлений винахід також стосується застосування поліпептидного димеру, який визначено вище, для отримання фармацевтичної композиції для лікування та/або попередження хвороби або розладу, де блокування агоністичного комплексу IL-6/SIL-6R має цілющу дію. Кращими медичними застосуваннями поліпептид-димерів заявленого винаходу є лікування/попередження резорбції кісток, гіперкальцемії, кахексії, пухлин або інших типів раку (як-то, рак товстої кишки, множинна мієлома, лімфома, лейкемія або хвороба Ходжкіна), автоімунних хвороб (як-то, розсіяний склероз або діабет типу 1), запальних або атопічних хвороб (як-то, хвороба Крона, виразковий коліт, ревматоїдний артрит, юнацький ревматоїдний артрит, астма, псоріаз, саркоїдоз, червоний вовчак або увеїт), інфекції (наприклад, бактеріями, вірусами, грибками або іншими патогенами), а також ендокринологічних розладів та метаболічних або катаболічних хвороб (як-то, діабет типу 2, ожиріння, гіперглікемія або гіперхолестеринемія). Приклади нижче описують винахід більш детально. Приклад 1 Створення та утворення мутеїну sgp130Fc CR5/18 (А) Матеріал Компоненти системи клонування Gateway (AccuPrime Pfx ДНК-полімераза, донорний вектор pDONR221, регульований промотером CMV вектор експресії pcDNA-DEST40, рекомбіназа ВР та LR для вставки пересадки, та дієздатні клітини Е. соlі) були отриманими від Invitrogen (Karlsruhe, Germany). Комплект QuikChange II сайтспрямованого мутагенезу отримували від Stratagene (Amsterdam, The Netherlands). Очищені PAGE праймери мутагенезу були від Microsynth (Balgach, Switzerland). CHO-KI-клітини отримували від German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Braunschweig, Germany). Компоненти культурного середовища були отриманими як такі: середовище Ham's F12, низький IgG FBS та PBS (РАA Laboratories; СIbе, Germany), FBS (Biochrom; Berlin, Germany), розчин трипсин/ЕДТА (Invitrogen) та розчин G418 (Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Germany). Реагент трансфекції Ліпофектамін 2000 отримували від Invitrogen. Santa 95636 12 Cruz (Heidelberg, Germany) постачав Білок A/G Плюс агароза для імуноосадження. Для імуноосадження та первинного визначення у вестернблотуванні, застосовували моноклональне антитіло миші проти IgG людини (Fc) (CBL102; Chemicon; Hofheim, Germany). Вторинне визначення вестерн-блотуванням проводили з HRPзв'язаним антитілом проти IgG миші, ECL-Плюс субстрат вестерн-блотування та Hyperfilm ECL (усі від GE Healthcare; Munich, Germany). Циліндричні флакони (2,1 л, 2,5Х поверхня) отримували від Greiner Bio-One (Frickenhausen, Germany). Фільтри з ацетату целюлози (0,45 мкм) для вакуумного фільтрування отримували від Sartorius (Gttingen, Germany). Матеріали для афінної та хроматографії з виключенням за розміром (SEC) були усі отримані від GE Healthcare (Munich, Germany): матеріал MabSelect (код продукту 17-5199-01) у колонці ХК16/20, колонці знесолювання PD-IO та колонці HiLoad 26/60 Superdex 200 pg для SEC. Концентраційні блоки мембран Amicon Ultra-15 50 кДа Ultracel-PL отримували від Millipore (Eschborn, Germany). Розчин акриламідубіс (19:1, 30%) для PAGE отримували від Bio-Rad (Munich, Germany). (В) Створення CR5/18 кДНК повної довжини sgp130Fc, що містить суцільний зовнішньоклітинний домен gp130 та IgGI Fc людини природного типу (джерела: для людини gp130/IL6ST: послідовність GenBank NM_002184 та підтримувальні клони; для незмінної області IgGI/IGHGI людини: наприклад, послідовність GenBank AK057754) були кодоноптимізованими для експресії у клітинах СНО-КІ та їх субклонували у pDONR221, застосовуючи праймери Gateway, ДНК-полімеразу AccuPrime Pfx та ВР-рекомбіназу у стандартному способі клонування Gateway. Субклонована вставка була повністю послідовність-верифікованою, застосовуючи компоновані прямі та зворотні праймери секвенсування кожні 250-300 по. У сайт-спрямованому мутагенезі з комплектом QuikChange II, нижчу шарнірну область IgGI-Fc (амінокислоти 234, 235 та 237 згідно із нумеруванням EU) мутували від послідовності природного типу, LLGG, до AEGA. Мутовані клони були верифікованими повним секвенсуванням, як описано вище. Далі, вставку переносили у вектор експресії pcDNA-DEST40 рекомбінацією Gateway LR. Оскільки вставка кодує два стопкодони після Fc-частини, мітки, кодовані у pcDNADEST40 (епітопи V5 та 6xHis) відсутні у CR5/18. Позитивні клони були ідентифіковані AlwNI рестрикційним розщепленням та послідовність верифікували знов. (C) Культура клітин та трансфекція СНО-КІ-клітини вирощували у середовищі Ham' s F12, доповненому 10% СЗТ при 37°С та 5% СО2 у насиченій водою атмосфері. Культури розділяли кожні 3-4 доби та застосовували тільки до 20 пасажувань. Клітини були трансфектованими констрактом експресії pcDNA-DEST40_CR5/18, застосовуючи Ліпофектамін 2000 та стандартні умови для СНО-КІ від Invitrogen. Для першого тесту тимчасової експресії, клітини СНО-КІ трансфектували у 6-лункових планшетах та клітини і супер 13 натанти збирали через 24 години після трансфекції. CR5/18 було імуноосаджено з супернатантів, застосовуючи Білок A/G Плюс агароза та антитіло проти IgG людини (Fc) згідно з інструкціями виробника. Білок клітин екстрагували та вестернблотування з антитілом проти IgG людини (Fc) проводили з лізатами клітин та імуноосаджували, як описано Waetzig et al.r J. Immunol. 168: 5342(2002). (D) Утворення CR5/18 у клітинах СНО-КІ Після успішної тимчасової експресі, клітини СНО-КІ трансфектували та позитивні клони були вибраними, застосовуючи 400 мкг/мл G418 у планшетах 10 см. Для визначення якості та властивостей продукту, попередньо вибране поліклональне об'єднання СНО-КІ переносили у циліндричні флакони та культивували з IgG FBS. Супернатанти конфлюєнтних клітин збирали 2-3 рази на добу, центрифугували двічі при 3,500 χ g та 4°С протягом 15 хвилин для видалення відходів клітин та обробляли негайно або заморожували при -80°С. Паралельно, стабільні клони клітин були вибрані з попередньо вибраного об'єднання, застосовуючи спосіб рестрикційного розщеплення та охарактеризованими аналізом експресії вестерн-блотуванням, як описано вище. Клон з найвищою та найбільш стабільною експресією переносили у циліндричні флакони та застосовували для довгострокового отримання. (E) Очистка афінною та хроматографією з виключенням за розміром CR5/18-BMicHi супернатанти з циліндричних флаконів культури очищали при 4°С, застосовуючи перистальтичний насос Р-І та систему очиснику АКТА 100 (від GE Healthcare; Munich, Germany). Протокол був на основі інструкцій виробника для очистки моноклональних антитіл. Після центрифугування рН свіжого або розтопленого (на льоді) супернатанту доводили до 6,77,0. Після двох циклів вакуумного фільтрування (0,45 мкм) супернатант дегазували та при необхідності рН доводили знов до 6,7-7,0. Далі, PBSурівноважену колонку афінної хроматографії (6-25 мл MabSelect у колонці ХК16/20) завантажували 24 л супернатанту при швидкості потоку 3-10 мл/хвилин, застосовуючи насос Р-І. Після промивки PBS, колонку переносили в очисник АКТА та промивали знов PBS до стабілізації А2во після кількісного видалення незв'язаного білку. Для елювання, систему АКТА оснащували двома 50 мМ натрій цитратними буферами при рН 3,25 та 5,5, відповідно, котрі змішували для отримання потрібного рН. Одну промивку при рН 5,1 супроводжували елюванням при рН 3,7. Фракції 10 мл збирали у туби 15 мл, що містять 2 мл 1 Μ ТрисНСІ (рН 11). Пікові фракції поєднували та вимірювали рН та доводили до 7,5, при необхідності. Об'єднану концентрацію білку вимірювали за допомогою А2ао та об'єднання обережно концентрували до максимум 1,5 мг/мл, застосовуючи блоки концентрації мембран Amicon Ultra-15 50 кДа Ultracel-PL. PBS-урівноважені PD-10 колонки знесолювання були застосовуваними для заміни цитратного буферу на PBS, а потім роблять ще один вимір концентрації білку при 280 нм. 95636 14 Для хроматографії з виключенням за розміром (SEC), максимумконцентрації білку 1,2 мг/мл у PBS було рекомендовано. SEC проводили із системою АКТА у PBS-урівноваженій колонці HiLoad 26/60 Superdex 200 pg при швидкості потоку 0,8 мл/хвилин. На відміну від sgp130Fc природного типу, CR5/18 елювали одним піком після низького піку агрегатів вищої молекулярної маси (Фіг. 2). При перших перебігах, зразки усіх фракцій отримували для аналізу PAGE. Пікові фракції поєднували, їх концентрації білку вимірювали та доводили до 400-500 мкг/мл у PBS, та аліквоти одиничного застосування заморожували при -80°С для довготермінового зберігання. Фракції та зразки аналізували за допомогою природного PAGE (7,5%) та наступним проявленням сріблом або Кумасі. Як показано у Фіг. 2, кількість побічних продуктів (агрегатів) CR5/18 є значно зменшеною у порівнянні з вихідною сполукою sgp130Fc, котру очищали паралельно. Більш того, елювання потрібного продукту (димер CR5/18) є чітко відділюваним від фракцій забруднення (агрегатів), чого нема у випадку sgp130Fc природного типу. Тому, вихід (внаслідок вищої пропорції потрібного продукту) та якість препаратів CR5/18 є кращими, ніж для звичайного sgp130Fc, призводячи до нижчої вартості для промислового виробництва. Ці результати показують чітке поліпшення CR5/18 у порівнянні з вихідною молекулою sgp130Fc. Приклад 2 Біоактивність CR5/18 у стандартизованому дослідженні проліферації клітин (А) Матеріал Стабільно трансфектована лінія попередників В-клітин BAF3/gp130 та дізайнерний цитокін rinepIL-б були застосовуваними. Компоненти культурних середовищ отримували як такі: DMEM та PBS (РАА Laboratories; СбІЬе, Germany), FBS (Biochrom; Berlin, Germany) та розчин трипсин/ЕДТА (Invitrogen; Karlsruhe, Germany). Інтерлейкін-6 (IL-6) та розчинний рецептор інтерлейкін6 (SIL-6R) отримували від BioSource (Solingen, Germany) та R&D Systems (Wiesbaden, Germany), відповідно. Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) отримували від Promega (Mannheim, Germany). (B) Блокування індукованої IL-6/slL-6RBAF3/gp130 проліферації клітин за допомогою sgp130Fc або CR5/18 ВАF3/gр130-клітини залежать від присутності комплексу IL-6/slL-6R у культурному середовищі для проліферації та життєздатності. Для підтримки клітини BAF3/gp130 культивували при щільності 5 менше, ніж 5 χ 10 клітин/мл у DMEM з 10% FBS та 10 нг/мл rinep-IL-б (дізайнерний цитокін, що складається з ковалентно зв'язаних IL-6 та SIL-6R; Fischer et al. 1997, Nat. Biotechnol. 15: 142-145). 10 нг/мл Гіпер-ІL-6 слід замінювати на 100 нг/мл IL-6 та 50 нг/мл SIL-6R. Клітини пасажували двічі на добу. Для досліджень клітини промивали двічі у середовищі без rinep-IL-6 (або IL-6/SIL-6R) та тоді засівали при 5000 клітин/лунку у 96-лункові планшети. CR5/18 або вихідну сполук sgp130Fc додавали при відмінних концентраціях від 20 мкг/мл до 15 78 нг/мл (серійні 1:4 розбавлення; Фіг. 3). Далі, клітини інкубували протягом 3 діб у присутність 100 нг/мл IL-6 та 50 нг/мл SIL-6R. Контролі містили нестимульовані клітини без та з максимумом концентрації CR5/18 або sgp130Fc, а також клітини, інкубовані зі стимуляторами IL-6 та тільки SIL-6R (Фіг. 3). (C) Результати Біологічну активність CR5/18 або sgp130Fc природного типу у культурі клітин вимірювали за 95636 16 зменшенням числа життєздатних клітин BAF3/gp130 (як визначено конверсією субстрату MTS) через 3 доби. CR5/18 є більш біологічно активним, ніж sgp130Fc природного типу, досягаючи ІК5о при концентрації приблизно 400 нг/мл, де sgp130Fc (ІК5о 800 нг/мл) ще не виявляє значної дії (Фіг. 3). Це показує, що CR5/18 можна застосовувати при приблизно половинній терапевтичній концентрації сполуки природного типу. 17 95636 18 19 95636 20 21 95636 22 23 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 95636 Підписне 24 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601