Білок, який зв’язує tnf-a

Реферат: Винахід належить до зв'язувального білка, який зв'язує TNF-α, фармацевтичної композиції, що містить зв'язувальний білок, клітини-хазяїна, способів застосування зв'язувального білка для зниження активності TNF-α та для лікування захворювання або порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою. UA 108912 C2 (12) UA 108912 C2 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 За даною заявкою вимагається пріоритет тимчасової заявки США № 61/420999, поданої 8 грудня 2010 року. Галузь винаходу Винахід стосується білків, що зв'язують TNF-α, і їх застосування для профілактики і/або лікування гострих і хронічних імунологічних захворювань, таких як ревматоїдний артрит, остеоартрит, псоріаз, розсіяний склероз і інші аутоімунні захворювання. Рівень техніки У даній галузі існує потреба в удосконалених антитілах, здатних зв'язувати TNF-α. Суть винаходу Винахід стосується нового сімейства білків, антитіл з пересадженою CDR, гуманізованих антитіл і їхніх фрагментів, здатних зв'язувати TNF-α, зв'язувати TNF-α з високою афінністю і зв'язувати і нейтралізувати TNF-α. Також винахід стосується антитіл і їхніх антигензв'язувальних частин, здатних зв'язувати TNF-α, що містить будь-яку амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 31-46. Докладний опис Винахід стосується зв'язувальних TNF-α білків, наприклад, антитіл або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язують TNF-α. Різні аспекти стосуються антитіл і фрагментів антитіл, і їх фармацевтичних композицій, а також нуклеїнових кислот, рекомбінантних експресуючих векторів і клітин-хазяїв для одержання таких антитіл і їх фрагментів. Винахід також стосується способів застосування зв'язувальних білків для виявлення TNF-α людини, для інгібування TNF-α людини, або in vitro, або in vivo, і для регуляції експресії генів. Якщо в даному описі не визначено інакше, наукові і технічні терміни, використовувані в рамках даного винаходу, будуть мати ті значення, що звичайно розуміють фахівці в даній галузі. Значення й об'єм термінів повинні бути очевидні, однак у випадку якої-небудь прихованої невизначеності, визначення, представлені в даному описі, мають перевага над будь-яким словником або стороннім визначенням. Крім того, якщо контекстом не потрібно інше, терміни в однині включають множину, і терміни в множині включають однину. Термін "або" включає "і/або", якщо немає інших указівок. Застосування терміна "що включає", "включає" і "включений", є необмежуючим. Також терміни, такі як "елемент" або "компонент", охоплюють як елементи і компоненти, що містять одну одиницю, так і елементи і компоненти, що включають більше однієї субодиниці, якщо немає інших конкретних вказівок. Способи і технології, головним чином, здійснюють відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомими в галузі культивування клітин і тканин, молекулярної біології, імунології, мікробіології, генетики, хімії білків і нуклеїнових кислот і гібридизації, аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної і фармацевтичної хімії, одержання, складання і доставки фармацевтичних препаратів і лікування пацієнтів. Такі способи також описані в посиланнях, цитованих у даному описі. Ферментативні реакції і способи очищення проводять відповідно до описів виготівника, як широко відомо в даній галузі або в іншому випадку описано в даному описі. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовують взаємозамінно, і вони позначають полімерний ланцюг амінокислот. Термін "поліпептид" стосується нативних або штучних білків, фрагментів білків і аналогів білкової послідовності. Поліпептид може бути мономерним або полімерним. Термін "виділений білок" або "виділений поліпептид" означає або білок поліпептид, який не асоційований з компонентами, які супроводжують його в його нативному стані, наприклад, він по суті не містить інших білків або клітин або клітинних компонентів того ж виду, експресується клітиною відмінного виду або яка не зустрічається в природі. Таким чином, поліпептид, що є хімічно синтезованим або синтезованим в клітинній системі, відмінній від клітини, що є його природним джерелом, є "виділеним" з асоційованих з ним у природі компонентів. Також білок можна робити таким, що по суті не містить асоційованих з ним у природі компонентів, виділенням з використанням способів очищення білка, добре відомих у даній галузі. Термін "виділення" стосується процесу, коли хімічна молекула, така як поліпептид, по суті не містить зв'язаних з нею в природі компонентів, за допомогою виділення, наприклад, з використанням способів очищення білків, добре відомих у даній галузі. Термін "TNF-α людини" (позначається скорочено в даному описі як hTNF-α) включає димерний білок-цитокін. Термін включає гомотримерний білок, що містить три білки масою TNFα 17,5 кДа. Гомотримерний білок позначають як "білок TNF-α". Термін "TNF-α" людини включає рекомбінантний TNF-α людини (TNF-α), що може бути отриманий стандартними способами рекомбінантної експресії. Послідовність TNF-α людини представлена в таблиці 1. 60 1 UA 108912 C2 Таблиця 1 Послідовність TNF-α людини Білок TNF-α людини 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ідентифікатор послідовності SEQ ID NO:1 Послідовність 123456789012345678901234567890 VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNDRANALLANGVELRDNQL VVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSP CQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQV YFGIIAL Термін "біологічна активність" стосується всіх властивих молекулі біологічних властивостей. Біологічні властивості TNF-α включають, але не обмежуються ними, зв'язування рецептора TNF. Терміни "специфічне зв'язування" або "що специфічно зв'язується" відносно взаємодії антитіла, білка або пептиду з другою хімічною молекулою, означає, що взаємодія залежить від наявності конкретної структури (наприклад, антигенної детермінанти або епітопа) на хімічній молекулі; наприклад, антитіло розпізнає і зв'язує конкретну білкову структуру, а не білок загалом. Якщо антитіло є специфічним до епітопа "A", наявність молекули, що містить епітоп A (вільного або неміченого A), у реакційній суміші, що містить мічений "A" і антитіло, буде знижувати кількість міченого A, що зв'язався з антитілом. Термін "зв'язувальний білок" включає, але не обмежується ними, будь-яке антитіло або його антиген-зв'язувальну частину. Зв'язувальні білки також включають інші конструкції, що зберігають афінність зв'язування з мішенню. У деяких випадках, ці зв'язувальні білки можуть мати структурну подібність з антитілами або їх антиген-зв'язувальними частинами, і вони також можуть мати структурні відмінності, що відрізняють їх від антитіл і їхніх антиген-зв'язувальних частин. Термін "антитіло" у широкому значенні стосується будь-якої молекули імуноглобуліну (Ig), що містить чотири поліпептидні ланцюги: два важкі (H) ланцюги і два легкі (L) ланцюги, або будь-якого її функціонального фрагмента, мутанту, варіанта або похідного, які зберігають істотні ознаки зв'язування епітопа молекулою Ig. Такі форми мутантів, варіантів або похідних антитіл відомі в даній галузі, і їх необмежуючі варіанти здійснення розглянуті нижче. У повнорозмірному антитілі кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (позначається скорочено в даному описі як HCVR або VH) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домена: CH1, CH2 і CH3. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (позначається скорочено в даному описі як LCVR або VL) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить один домен CL. Області VH і VL далі можуть бути підрозділені на області гіперваріабельності, що називаються визначальними комплементарність областями (CDR), розташовані між областями, що є більш консервативними, які називаються каркасними областями (FR). Кожна VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від Nкінця до С-кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекули імуноглобулінів можуть належати до будь-якого типу (наприклад, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA і IgY), класу (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2) або підкласу. Термін "антиген-зв'язувальна частина" антитіла стосується одного або декількох фрагментів антитіла, що зберігають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, hTNFα). Антиген-зв'язувальну функцію антитіла може виконувати один або декілька фрагментів повнорозмірного антитіла. Такі варіанти здійснення антитіл також можуть бути біспецифічними, що мають подвійну специфічність, або поліспецифічними, що специфічно зв'язуються з двома або більше різними антигенами. Приклади зв'язувальних фрагментів, охоплюваних терміном "антиген-зв'язувальна частина" антитіла, включають (i) Fab-фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з доменів VL, VH, CL і CH1; (ii) F(ab') 2-фрагмент - двовалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагменти, зв'язані дисульфідним зв'язком у шарнірній області; (iii) Fd-фрагмент, що складається з доменів VH і CH1; (iv) Fv-фрагмент, що складається з доменів VL і VH одного плеча антитіла, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature, 341: 544546; Winter et al., публікація PCT № WO 90/05144), що містить один варіабельний домен; і (vi) окрему визначальну комплементарність область (CDR). Більше того, хоча два домена Fvфрагменти, VL і VH, кодуються окремими генами, їх можна зв'язувати з використанням рекомбінантних способів синтетичним лінкером, що дозволяє одержання їх як єдиного білкового 2 UA 108912 C2 5 10 15 20 ланцюга, у якій області VL і VH утворюють пари, формуючи одновалентні молекули (відомі як одноланцюжкові Fv (scFv); див. наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюжкові антитіла також охоплюються терміном "антиген-зв'язувальна частина" антитіла. Також охоплюються інші форми одноланцюжкових антитіл, такі як діантитіла. Діантитіла являють собою двовалентні біспецифічні антитіла, у яких домени VH і VL експресуються на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, що є занадто коротким, щоб забезпечувати утворення пар між двома доменами на одному ланцюзі, тим самим змушуючи домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга і формувати дві антиген-зв'язувальні ділянки (див., наприклад, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Такі зв'язувальні частини антитіл відомі в даній галузі (Kontermann і Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5). Термін "конструкція антитіла" стосується поліпептиду, що містить одну або декілька антигензв'язувальних частин, зв'язаних з лінкерним поліпептидом або константним доменом імуноглобуліну. Лінкерні поліпептиди містять два або більше амінокислотних залишків, зв'язаних пептидними зв'язками, і їх використовують для зв'язування однієї або декількох антиген-зв'язувальних частин. Такі лінкерні поліпептиди добре відомі в даній галузі (див., наприклад, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Константний домен імуноглобуліну стосується константного домену важкого (гамма) або легкого ланцюга (каппа і дельта). Амінокислотні послідовності константних доменів важких і легких ланцюгів IgG людини відомі в даній галузі і представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Послідовність константного домена важкого ланцюга і константного домена легкого ланцюга IgG людини Білок Ідентифікатор послідовності Константна область SEQ ID NO:2 гамма-1 Ig Мутантна константна SEQ ID NO:3 область гамма-1 Ig Константна область SEQ ID NO:4 каппа Ig Константна область SEQ ID NO:5 лямбда Ig 25 30 Послідовність 12345678901234567890123456789012 ASTKGPSVFFLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPV KAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTV EKTVAPTECS Більше того, антитіло або його антиген-зв'язувальна частина можуть бути частиною більшої молекули імуноадгезії, утвореної ковалентним або нековалентним зв'язуванням антитіла або антиген-зв'язувальної частини з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають застосування центральної області стрептавідину для одержання тетрамерної молекули scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibod. Hybridom. 6:93-101) і застосування залишку цистеїну, маркерного пептиду і C-кінцевої полігістидинової мітки для одержання двовалентних і біотинілованих молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058). Антиген-зв'язувальні частини антитіл, такі як Fab- і F(ab')2-фрагменти, можна одержувати з цілих антитіл з використанням загальноприйнятих 3 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способів, таких як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, цілих антитіл. Більше того, антитіла, їх антиген-зв'язувальні частини і молекули імуноадгезії можна одержувати з використанням стандартних способів рекомбінантних ДНК, як описано в даному описі. Термін "виділене антитіло" стосується антитіла, що по суті вільне від інших антитіл, що мають відмінну специфічність зв'язування (наприклад, виділене антитіло, що специфічно зв'язує hTNFα, по суті вільне від антитіл, що специфічно зв'язують антигени, відмінні від hTNFα). Однак виділене антитіло, що специфічно зв'язує hTNFα, може мати перехресну реактивність до інших антигенів, таких як молекули TNFα з інших видів. Більше того, виділене антитіло може бути по суті вільне від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. Термін "антитіло людини" включає антитіла, що мають варіабельні і константні області з послідовностей імуноглобулінів ембріонального типу людини. Антитіла людини можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані послідовностями імуноглобулінів ембріонального типу людини (наприклад, мутації, внесені випадковим абосайт-специфічним мутагенезом in vitro або за допомогою соматичної мутації in vivo), наприклад, у CDR, і зокрема, у CDR3. Однак термін "антитіло людини" не включає антитіла, у яких послідовності CDR, утворені з послідовностей ембріонального типу інших видів ссавців, таких як миша, пересаджені в каркасні послідовності людини. Термін "рекомбінантне антитіло людини" включає всі антитіла людини, що одержують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними способами, такі як антитіла, що експресуються з використанням рекомбінантного експресуюючого вектора, трансфікованого в клітину-хазяїна (додатково описану в розділі II, нижче), антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл людини (Hoogenboom (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy and Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo and Larrick (2002) BioTechniques 29:128145; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-378), антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною по генах імуноглобулінів людини (див., наприклад, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann and Green (2002) Current Opin. Biotechnol. 13:593-597; Little et al. (2000) Immunol. Today 21: 364-370), або антитіла, отримані, експресовані, утворені або виділені будь-яким іншим способом, що залучає сплайсинг послідовностей генів імуноглобулінів людини з іншими послідовностями ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні області, утворені з послідовностей імуноглобулінів ембріонального типу. Однак у визначених варіантах здійснення такі рекомбінантні антитіла людини піддають мутагенезу in vitro (або, коли використовують тварину, трансгенну по послідовностях Ig людини, вони піддаються соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, амінокислотні послідовності областей VH і VL рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, коли вони утворені з послідовностей VH і VL ембріонального типу людини або коли вони є спорідненими їм, можуть не існувати в природі в наборі антитіл ембріонального типу людини in vivo. Термін "химерне антитіло" стосується антитіл, що містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів з одного виду і послідовності константних областей з іншого виду, таких як антитіла, що мають варіабельні області важкого і легкого ланцюгів миші, зв'язані з константними областями людини. Термін "антитіло з пересадженої CDR" стосується антитіл, що містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів одного виду, але в яких послідовності однієї або декількох з областей CDR VH- і/або VL-областей замінені послідовностями CDR іншого виду, таких як антитіла, що мають варіабельні області важкого і легкого ланцюгів людини, у яких одна або декілька з CDR людини (наприклад, CDR3) замінені послідовностями CDR миші. Термін "CDR" стосується визначальної комплементарність області у варіабельних послідовностях антитіла. У кожній з варіабельних областей важкого і легкого ланцюга є три CDR, що позначають як CDR1, CDR2 і CDR3, для кожної з варіабельних областей. Термін "набір CDR" стосується групи з трьох CDR, що зустрічаються в одній варіабельній області (тобто VH або VL) антиген-зв'язувального центра. Точні межі цих CDR визначаються по-різному відповідно до різних систем. Система, описана Кабат (Kabat et al. (1987, 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland), не тільки забезпечує однозначну систему нумерації залишків, застосовну до будь-якої варіабельної області антитіла, але також надає точні межі залишків, що визначають три CDR. Ці CDR можуть бути позначені як CDR по Кабат. Chothia і колеги (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 і Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883) знайшли, що визначені ділянки в CDR по Кабат приймають практично ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на наявність великої різноманітності на рівні амінокислотної послідовності. Ці ділянки були позначені як L1, L2 і L3 або H1, H2 і H3, де "L" і "H" позначають області легкого ланцюга і важкого ланцюга, відповідно. 4 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ці області можуть бути позначені як CDR по Chothia, що мають межі, які перекривають CDR по Кабат. Інші межі, які визначають CDR, що перекриваються з CDR по Кабат, були описані Padlan et al. (FASEB J. 9:133-139 (1995)) і MacCallum et al. (J Mol. Biol 262 (5): 732-45 (1996)). Інші визначення меж CDR можуть не точно відповідати одній із систем, але проте, вони перекривають CDR по Кабат, хоча вони можуть мати більшу або меншу довжину з урахуванням передбачення або експериментальних даних про те, що конкретні залишки або групи залишків або навіть цілі CDR не роблять значного впливу на зв'язування антигену. У способах, використовуваних у рамках винаходу, можуть бути використані CDR, визначені відповідно до кожної з цих систем, хоча у визначених варіантах здійснення використовуються CDR, визначені по Кабат або Chothia. Терміни "нумерація по Кабат", "визначення по Кабат" і "позначення по Кабат" використовують у даному описі взаємозамінний. Ці терміни стосуються системи нумерації амінокислотних залишків, що є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними), ніж інші амінокислотні залишки у варіабельних областях важкого і легкого ланцюгів антитіла або його антиген-зв'язувальної частини (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 і Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Що стосується варіабельної області важкого ланцюга, гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні амінокислотних положень з 31 по 35 для CDR1, амінокислотних положень з 50 по 65 для CDR2, і амінокислотних положень з 95 по 102 для CDR3. Що стосується варіабельної області легкого ланцюга, гіперваріабельна область знаходиться в діапазоні амінокислотних положень з 24 по 34 для CDR1, амінокислотних положень з 50 по 56 для CDR2 і амінокислотних положень з 89 по 97 для CDR3. Розширення й аналіз великих суспільних баз даних амінокислотних послідовностей варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів протягом останніх двадцяти років привели до розуміння типових меж між послідовностями каркасних областей (FR) і CDR у послідовностях варіабельних областей і дозволили фахівцям у даній галузі точно визначити CDR відповідно до нумерації Кабат, нумерації Chothia або інших систем. Див., наприклад, Martin, Kontermann and Dubel, eds., Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin, 2001), chapter 31, pages 432-433. Прийнятний спосіб визначення амінокислотних послідовностей CDR по Кабат в амінокислотних послідовностях варіабельної області важкого ланцюга (VH) і варіабельної області легкого ланцюга (VL) представлений нижче: Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-L1: Починається приблизно через 24 амінокислотних залишків від N-кінця області VL; Залишок перед послідовністю CDR-L1 завжди являє собою цистеїн (C); Залишок після послідовності CDR-L1 завжди являє собою залишок триптофану (W), як правило, Trp-Tyr-Gln (W-Y-Q), але також Trp-Leu-Gln (W-L-Q), Trp-Phe-Gln (W-F-Q) і Trp-Tyr-Leu (W-Y-L); Довжина, як правило, складає від 10 до 17 амінокислотних залишків. Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-L2: Починається завжди через 16 залишків після кінця CDR-L1; Залишки перед послідовністю CDR-L2, як правило, являють собою Ile-Tyr (I-Y), але також Val-Tyr (V-Y), Ile-Lys (I-K) і Ile-Phe (I-F); Довжина завжди складає 7 амінокислотних залишків. Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-L3: Починається завжди через 33 амінокислоти після кінця CDR-L2; Залишок перед амінокислотною послідовністю CDR-L3 завжди являє собою цистеїн (C); Залишки після послідовності CDR-L3 завжди являють собою Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) (SEQ ID NO: 6), де X являє собою будь-яку амінокислоту; Довжина, як правило, складає від 7 до 11 амінокислотних залишків. Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-H1: Починається приблизно через 31 амінокислотний залишок після N-кінця VH-області і завжди через 9 залишків після цистеїну (C); Залишки перед послідовністю CDR-H1 завжди являють собою Cys-X-X-X-X-X-X-X-X (SEQ ID NO: 7), де X являє собою будь-яку амінокислоту; Залишок після послідовності CDR-H1 завжди являє собою Trp (W), як правило, Trp-Val (WV), але також Trp-Ile (W-I) і Trp-Ala (W-A); Довжина, як правило, складає від 5 до 7 амінокислотних залишків. Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-H2: Починається завжди через 15 амінокислотних залишків після кінця CDR-H1; 5 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Залишки перед послідовністю CDR-H2, як правило, являють собою Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (L-EW-I-G) (SEQ ID NO: 8), а також інші варіанти; Залишки після послідовності CDR-H2 являють собою Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/AlaThr/Ser/Ile/Ala (K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A); Довжина, як правило, складає від 16 до 19 амінокислотних залишків. Для ідентифікації амінокислотної послідовності CDR-H3: Починається завжди через 33 амінокислотних залишки після кінця CDR-H2 і завжди через 3 залишки після цистеїну (C), Залишки перед послідовністю CDR-H3 завжди являють собою Cys-X-X (C-X-X), де X являє собою будь-яку амінокислоту, як правило, Cys-Ala-Arg (C-A-R); Залишки після послідовності CDR-H3 завжди являють собою Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) (SEQ ID NO: 9), де X являє собою будь-яку амінокислоту; Довжина, як правило, складає від 3 до 25 амінокислотних залишків. Терміни "акцептор" і "акцепторне антитіло" стосуються антитіла або послідовності нуклеїнової кислоти, що забезпечує або кодує щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, щонайменше приблизно 98 % або 100 % амінокислотних послідовностей однієї або декількох з каркасних областей. У деяких варіантах здійснення термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнової кислоти антитіла, що забезпечує або кодує константну область(-і). В іншому варіанті здійснення термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнових кислот антитіла, що забезпечує або кодує одну або декілька з каркасних областей і константну область(-і). У конкретному варіанті здійснення термін "акцептор" стосується амінокислотної послідовності або послідовності нуклеїнових кислот антитіла людини, що забезпечують або кодують щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, щонайменше 98 % або приблизно 100 % амінокислотних послідовностей однієї або декількох з каркасних областей. Відповідно до цього варіанта здійснення акцептор може містити щонайменше 1, щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5 або щонайменше 10 амінокислотних залишків, що не зустрічаються в одному або декількох конкретних положеннях антитіла людини. Акцепторна каркасна область і/або акцепторна константна область(-і) може бути утворена або отримана, наприклад, з гена антитіла ембріонального типу, зрілого гена антитіла, функціонального антитіла (наприклад, антитіл, добре відомих у даній галузі, розроблювальних антитіл або комерційно доступних антитіл). Термін "канонічний" залишок стосується залишку в CDR або каркасної області, що визначає конкретну канонічну структуру CDR, при визначенні по Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901907 і Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799). Згідно Chothia et al., критичні положення CDR багатьох антитіл мають практично ідентичні конформації пептидного кістяка, незважаючи на велику різноманітність на рівні амінокислотної послідовності. Кожна канонічна структура визначає, головним чином, набір кутів повороту пептидного кістяка для безперервного сегмента з амінокислотних залишків, що утворюють петлю. Терміни "донор" і "донорне антитіло" стосуються антитіла, що надає одну або декілька CDR. У конкретному варіанті здійснення донорне антитіло являє собою антитіло з виду, що відрізняється від виду, з якого отримані або походять каркасні області. У контексті гуманізованого антитіла термін "донорне антитіло" стосується не антитіла, що не є людським, що надає одну або декілька CDR. Термін "каркасна область" або "послідовність каркасної області" стосується інших послідовностей варіабельної області без CDR. Оскільки точне визначення послідовності CDR можна проводити за допомогою різних систем, значення каркасної послідовності інтерпретують, відповідно, по-різному. Шість CDR (CDR-L1, -L2 і -L3 легкого ланцюга і CDR-H1, -H2 і -H3 важкого ланцюга) також поділяють каркасні області легкого ланцюга і важкого ланцюга на підобласті (FR1, FR2, FR3 і FR4) на кожному ланцюзі, у яких CDR1 розташована між FR1 і FR2, CDR2 розташована між FR2 і FR3, і CDR3 розташована між FR3 і FR4. Без указівки конкретних підобластей як FR1, FR2, FR3 або FR4, каркасна область, відповідно до інших джерел, являє собою об'єднані FR біля варіабельної області одного ланцюга імуноглобуліну, що зустрічається в природі. FR, вказана в однині, являє собою одну з чотирьох підобластей, і FR, вказані в множині, являють собою дві або більше з чотирьох підобластей, що складають каркасну область. Акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини відомі в даній галузі. В одному з варіантів здійснення винаходу акцепторні послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини вибрані з послідовностей, перерахованих у V-base (http://vbase.mrc 6 UA 108912 C2 cpe.cam.ac.uk/) або в IMGT®, міжнародній системі ImMunoGeneTics information system® (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/). В іншому варіанті здійснення акцепторі послідовності важкого ланцюга і легкого ланцюга людини вибрані з послідовностей, описаних у таблиці 3 і таблиці 4. 5 Таблиця 3 Акцепторні послідовності важкого ланцюга SEQ ID NO: Область білка 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Послідовність 12345678901234567890123456789012 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT WVRQAPGQGLEWMG rvtmttdtststaymelrslrsddtavyycar qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytft wvrqapgqglewmg rfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycar WGQGTLVTVSS WGRGTLVTVSS WGQGTTVTVSS WGQGTMVTVSS VH1-18 FR1 VH1-18 FR2 VH1-18 FR3 VH7-4.1 FR1 VH7-4.1FR2 VH7-4.1 FR3 JH1/JH4/JH5 FR4 JH2 FR4 JH6 FR4 jh3 fR4 Таблиця 4 Акцепторні послідовності легкого ланцюга SEQ ID NO: 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 10 15 20 25 Область білка Послідовність 12345678901234567890123456789012 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKlLIY GVPSRFSGSGSGTdFTLTISSLQPEDFATYYC dvVmTQSPaFlSVTPgEKVTITC WYQQKPDQaPKLLIK GVPSRFSGSGSGTDFTfTIsSLEAEDAATYYC FGQGTKLEIKr fgqgtrleikr fgqgtkveikr FGGGTKVEIKr FGpGTKVdIKr 1-39/o12 FR1 1-39/o12 FR2 1-39/o12 FR3 6d-41/A14 FR1 6d-41/A14 FR2 6d-41/A14 FR3 JK2 FR4 jk5 fr4 jk1 fr4 jk4 fr4 JK3 FR4 Термін "ген антитіла ембріонального типу" або "фрагмент гена" стосується послідовності імуноглобуліну, кодованої нелімфоїдними клітинами, що не піддавалася процесу дозрівання, що приведе до генетичного реаранжування і мутації для експресії конкретного імуноглобуліну. (Див., наприклад, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Маrсгалоnіs et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30 (2001)). Одна з переваг, забезпечуваних різними варіантами здійснення є наслідком усвідомлення, що гени антитіла ембріонального типу з більшою імовірністю, ніж гени зрілих антитіл, зберігають основні структури амінокислотної послідовності, характерні для індивідуумів у виді, таким чином, вони з меншою імовірністю будуть розпізнаватися як послідовності з чужорідного джерела, при їхньому терапевтичному застосуванні в цього виду. Термін "ключові" залишки стосується визначених залишків у варіабельній області, що впливають на специфічність зв'язування і/або афінність антитіла, зокрема, гуманізованого антитіла. Ключовий залишок включає, але не обмежується ними, один або декілька з наступних: залишок, сусідній з CDR, потенційна ділянка глікозилування (може являти собою ділянку або N-, або O-глікозилування), рідкий залишок, залишок, здатний взаємодіяти з антигеном, залишок, здатний взаємодіяти з CDR, канонічний залишок, контактний залишок між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга, залишок у зоні Vernier і залишок в області, що перекриває варіабельну область важкого ланцюга CDR1, визначену по Chothia, і першу каркасну область важкого ланцюга, визначену по Кабат. 7 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "гуманізоване антитіло" стосується антитіл, що містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів з виду, що не є людиною (наприклад, миші), але в який щонайменше частина послідовності VH і/або VL змінена так, щоб вона була більш "подібною до людської", тобто більш подібною з варіабельними послідовностями ембріонального типу людини. Одним з типів гуманізованого антитіла є антитіло з пересадженими CDR, у якому послідовності не є людськими CDR убудовані в послідовності VH і VL людини, для заміни відповідних послідовностей, які не є людськими послідовностями каркасної області (FR). Наприклад, "гуманізоване антитіло" являє собою антитіло або його варіант, похідне, аналог або фрагмент, що імуноспецифічно зв'язуються з антигеном, що представляє інтерес, і які містять каркасну (FR) область, по суті амінокислотну послідовність, що має антитіла людини, і визначальну комплементарність область (CDR), по суті амінокислотну послідовність, що має антитіла, яке не є людським. Термін "по суті" у контексті CDR стосується CDR, що має амінокислотну послідовність, щонайменше приблизно на 80 %, щонайменше приблизно на 85 %, щонайменше приблизно на 90 %, щонайменше приблизно на 95 %, щонайменше приблизно на 98 % або щонайменше приблизно на 99 % ідентичну амінокислотній послідовності CDR антитіла, що не є людським. Гуманізоване антитіло містить по суті усі зі щонайменше одного, і як правило, двох, варіабельних доменів (Fab, Fab', F(ab') 2, Fab, Fv), у яких усі або по суті усі з CDR-областей відповідають CDR-областям не є людським імуноглобуліну (тобто, донорного антитіла), і всі або по суті усі з каркасних областей являють собою каркасні області консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. В одному з варіантів здійснення гуманізоване антитіло також містить щонайменше частину константної області (Fc) імуноглобуліну, як правило, константної області імуноглобуліну людини. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить як легкий ланцюг, так і щонайменше варіабельний домен важкого ланцюга. Антитіло також може включати CH1-область, шарнірну область, CH2-, CH3- і CH4-області важкого ланцюга. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований легкий ланцюг. У деяких варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований важкий ланцюг. У конкретних варіантах здійснення гуманізоване антитіло містить тільки гуманізований варіабельний домен легкого ланцюга і/або гуманізований важкий ланцюг. Гуманізоване антитіло може бути вибране з будь-якого класу імуноглобулінів, включаючи IgM, IgG, IgD, IgA і IgE, і будь-якого ізотипу, включаючи, але не обмежуючи ними, IgG1, IgG2, IgG і IgG4. Гуманізоване антитіло може містити послідовності з більше ніж одного або класу ізотипу, і конкретні константні домени можуть бути вибрані, щоб оптимізувати бажані ефекторні функції з використанням способів, добре відомих у даній галузі. Каркасні області і CDR гуманізованого антитіла не обов'язково повинні точно відповідати вихідним послідовностям, наприклад, CDR донорного антитіла або консенсусну каркасну область можна піддавати мутагенезу заміщенням, вставкою і/або делецією щонайменше приблизно одного амінокислотного залишку, так щоб залишок CDR або каркасної області в цій ділянці не відповідав ні донорному антитілу, ні консенсусній каркасній області. У конкретному варіанті здійснення такі мутації не є великими. Як правило, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 % і щонайменше приблизно 95 % залишків гуманізованого антитіла будуть відповідати залишкам вихідних послідовностей FR і CDR. Термін "консенсусна каркасна область" стосується каркасної області в консенсусній послідовності імуноглобуліну. Термін "консенсусна послідовність імуноглобуліну" стосується послідовності, утвореної амінокислотами, що найчастіше зустрічаються (або нуклеотидами) у сімействі споріднених послідовностей імуноглобулінів (див. наприклад, Winnaker, (1987) From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany). У такий спосіб "консенсусна послідовність імуноглобуліну" може включати "консенсусний варіабельний домен" і/або "консенсусний константний домен". "Консенсусний варіабельний домен", у свою чергу, може включати одну або декілька "консенсусних каркасних областей" і/або одну або декілька "консенсусних CDR". У сімействі імуноглобулінів кожне положення в консенсусній послідовності займає амінокислота, що зустрічається найчастіше в цьому положенні в сімействі. Якщо дві амінокислоти зустрічаються з однаковою частотою, кожна з них може бути включена в консенсусну послідовність. Термін зона "Vernier" стосується підгрупи каркасних залишків, що можуть коректувати структуру CDR і регулювати відповідність антигену, як описано Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499). Залишки зони Vernier утворюють шар, що лежить під CDR, і вони можуть впливати на структуру CDR і афінність антитіла. Термін "полівалентний зв'язувальний білок" використовують у даному описі для позначення зв'язувального білка, що містить дві або більше антиген-зв'язувальні ділянки. В одному варіанті 8 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення полівалентний зв'язувальний білок переважно конструюють, щоб він мав три або більше антиген-зв'язувальних ділянок, і, як правило, він являє собою антитіло, що не зустрічається в природі. Термін "поліспецифічний зв'язувальний білок" стосується зв'язувального білка, здатного зв'язувати дві або більше споріднені або неспоріднені мішені. Зв'язувальні білки "з подвійним варіабельним доменом" ("DVD") за винаходом містять дві або більше антиген-зв'язувальні ділянки і являють собою четиривалентні або полівалентні зв'язувальні білки. Такі зв'язувальні білки з DVD можуть бути моноспецифічними, тобто здатними зв'язувати один антиген, або поліспецифічними, тобто здатними зв'язувати два або більше антигенів. Зв'язувальний білок з DVD, що містить два поліпептиди DVD важкого ланцюга TM і два поліпептиди DVD легкого ланцюга, називають молекулою DVD-Ig . Кожна половина DVDIg містить поліпептид DVD важкого ланцюга і поліпептид DVD легкого ланцюга, і дві антигензв'язувальні ділянки. Кожна зв'язувальна ділянка містить варіабельний домен важкого ланцюга і варіабельний домен легкого ланцюга усього з 6 CDR, залученими до зв'язування антигену, на антиген-зв'язувальну ділянку. Зв'язувальні білки з DVD і способи одержання зв'язувальних білків з DVD описані в патенті США № 7612181. Один аспект стосується зв'язувального білка з DVD, що включає зв'язувальні білки, здатні зв'язувати TNFα. В одному варіанті здійснення зв'язувальний білок з DVD здатний зв'язувати TNF-α і другу мішень. Термін "нейтралізуючий" стосується нейтралізації біологічної активності цитокіну, коли зв'язувальний білок специфічно зв'язується з цитокіном. В одному варіанті здійснення нейтралізуючий зв'язувальний білок являє собою нейтралізуюче антитіло, зв'язування якого з hTNF-α приводить до інгібування біологічної активності hTNF-α. В одному варіанті здійснення нейтралізуючий зв'язувальний білок зв'язує hTNFα і знижує біологічну активність hTNF-α щонайменше приблизно на 20 %, щонайменше приблизно на 40 %, щонайменше приблизно 60 %, щонайменше приблизно на 80 %, щонайменше приблизно на 85 % або більше. Інгібування біологічної активності hTNFα нейтралізуючим зв'язувальним білком можна оцінювати шляхом вимірювання одного або декількох індикаторів біологічної активності hTNF-α, добре відомих у даній галузі. Наприклад, індикатором є нейтралізація цитотоксичності TNFα на клітинах L929. Термін "активність" включає види активності, такі як специфічність/афінність зв'язування антитіла з антигеном, наприклад, антитіла проти hTNF-α, що зв'язується з антигеном TNF-α, і/або нейтралізуюча ефективність антитіла, наприклад, антитіла проти hTNF-α, зв'язування якого з hTNF-α інгібує біологічну активність hTNF-α, наприклад, нейтралізує цитотоксичність TNFα на клітинах L929. Термін "епітоп" включає будь-яку поліпептидну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з імуноглобуліном або T-клітинним рецептором. У визначених варіантах здійснення детермінанти епітопів включають хімічно активні поверхневі групи молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорил або сульфоніл, і, у визначених варіантах здійснення, вона може мати конкретні характеристики тривимірної структури і/або конкретні характеристики заряду. Епітоп являє собою область антигену, що зв'язується антитілом. Таким чином, епітоп складається з амінокислотних залишків області антигену (або його фрагмента), про які відомо, що вони зв'язуються з комплементарною ділянкою на специфічному зв'язувальному партнері. Антигенний фрагмент може містити більше одного епітопа. У визначених варіантах здійснення, антитіло специфічно зв'язує антиген, коли воно переважно розпізнає його антиген-мішень у комплексній суміші білків і/або макромолекул. Таким чином, епітоп складається з амінокислотних залишків області антигену (або його фрагмента), про які відомо, що вони зв'язуються з комплементарною ділянкою на специфічному зв'язувальному партнері. Антигенний фрагмент може містити більше одного епітопа. Термін "поверхневий плазмонний резонанс" стосується оптичного явища, що дозволяє аналіз у режимі реального часу біоспецифічних взаємодій шляхом виявлення змін концентрацій білків на біосенсорній матриці, наприклад, з використанням системи BIACORE (Biacore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, New Jersey). Для додаткових описів, див. Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; і Johnnson et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. Термін "Kon" стосується константи швидкості асоціації для асоціації зв'язувального білка (наприклад, антитіла) з антигеном з утворенням, наприклад, комплексу антитіло/антиген, як відомо в даній галузі. "Kon" також відома під термінами "константа швидкості асоціації" або "k a", Як використовують у рамках винаходу взаємозамінно. Цю величина вказує на швидкість 9 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування антитіла з його мішенню або швидкість утворення комплексу між антитілом і антигеном, як показано за допомогою рівняння: Антитіло ("Ab") + Антиген ("Ag")  Ab-Ag. Термін "Koff" стосується константи швидкості дисоціації зв'язувального білка (наприклад, антитіла) з, наприклад, комплексу антитіло/антиген), як відомо в даній галузі. "K off" також відома під термінами "константа швидкості дисоціації" або "kd", як використовують у даному описі взаємозамінно. Ця величина, указує на швидкість дисоціації антитіла від його мішені або поділу комплексу Ab-Ag з часом на вільне антитіло й антиген, як показують за допомогою рівняння, нижче: Ab+Ag  Ab-Ag. Терміни "рівноважна константа дисоціації" або "KD", як використовують у даному описі взаємозамінно, стосуються величини, одержуваної шляхом титраційного вимірювання при рівновазі, або шляхом розподілу константи швидкості дисоціації (K off) на константу швидкості асоціації (Kon). Константу швидкості асоціації, константу швидкості дисоціації і рівноважну константу дисоціації використовують для відображення афінності зв'язування антитіла з антигеном. Способи визначення констант швидкості асоціації і дисоціації добре відомі в даній галузі. Застосування флуоресцентних способів забезпечує високу чутливість і можливість досліджувати зразки у фізіологічних буферах при рівновазі. Можна використовувати інші експериментальні підходи й інструменти, такі як BIACORE (аналіз біомолекулярної взаємодії) (наприклад, інструмент, доступний від BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Швеція). Крім того, також можна використовувати KinExA® (аналіз кінетики виключення), доступний від Sapidyne Instruments (Boise, Idaho). Термін "мічений зв'язувальний білок" стосується білка з міткою, що забезпечує ідентифікацію зв'язувального білка. В одному з варіантів здійснення мітка являє собою маркер, що піддається виявленню, як наприклад, включення радіоактивно міченої амінокислоти або приєднання до поліпептиду біотинільних груп, які можна виявляти за допомогою маркірованого авідину (наприклад, стрептавідину, що містить флуоресцентний маркер або маркер, що має ферментативну активність, яку можна виявляти оптичними або колориметричними способами). Приклади міток для поліпептидів включають, але не обмежуються ними, наступні: радіоізотопи 3 14 35 90 99 111 125 131 177 166 153 або радіонукліди (наприклад, H, C, S, Y, Tc, In, I, I, Lu, Ho або Sm); флуоресцентні мітки (наприклад, FITC, родамін, лантаноїдні люмінофори), ферментні мітки (наприклад, пероксидаза хрону, люцифераза, лужна фосфатаза); хемілюмінесцентні маркери; біотинільні групи; визначені поліпептидні епітопи, розпізнавані вторинним репортером (наприклад, парні послідовності "лейцинових блискавок", ділянки зв'язування для вторинних антитіл, домени, що зв'язують метал, і епітопні мітки); і магнітні агенти, такі як хелати гадолінію. Термін "кон'югат антитіла" стосується зв'язувального білка, такого як антитіло, хімічно зв'язаного з другою хімічною групою, такою як терапевтичний або цитотоксичний засіб. Термін "засіб" позначає хімічну сполуку, суміш хімічних сполук, біологічну макромолекулу або екстракт, отримані з біологічних матеріалів. В одному варіанті здійснення терапевтичні або цитотоксичні засоби включають, але не обмежуються ними, коклюшний токсин, таксол, цитохалазин B, граміцидин D, бромід етидію, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідроксіантрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, татракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин і їх аналоги або гомологи. Терміни "кристал" і "кристалізований" стосуються антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, що існують у формі кристала. Кристали являють собою одну з форм твердого стану речовини, що відрізняється від інших форм, таких як аморфний твердий стан або рідкокристалічний стан. Кристали складаються з регулярних, повторюваних, тривимірних структур з атомів, іонів, молекул (наприклад, білків, таких як антитіла) або молекулярних агрегатів (наприклад, комплексів антиген/антитіло). Ці тривимірні структури упорядковані відповідно до визначеної математичної залежності, що добре зрозуміла в даній галузі. Основна ланка або структурний блок, що повторюється в кристалі, називають асиметричним елементом. Повторення асиметричного елемента в порядку, що надає даної чітко визначеної кристалографічної симетрії, забезпечує "елементарну комірку" кристала. Повторення елементарної комірки за допомогою правильного руху у всіх трьох вимірах дає кристал. Див. Giege and Ducruix (1999) Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York. Термін "полінуклеотид" означає полімерну форму з двох або більше нуклеотидів: або рибонуклеотидів, або дезоксинуклеотидів, або модифіковану форму нуклеотидів будь-якого типу. Термін включає одноланцюжкову і дволанцюжкову форми ДНК або РНК. 10 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "виділений полінуклеотид" означає полінуклеотид (наприклад, геномного походження, із кДНК, або синтетичного походження, або їх комбінації), що не асоційований із усім полінуклеотидом, або частиною, з якими він асоційований у природі; з якими він функціонально зв'язаний у природі; або з якими він зустрічається в природі як частину більшої послідовності. Термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Одним з типів вектора є "плазміда", що стосується кільцевої дволанцюжкової петлі ДНК, у яку можна лігувати додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, де у вірусний геном можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Деякі вектори здатні до аутосомної реплікації в клітині-хазяїні, у якій вони введені (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальний оріджин реплікації і епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть вбудовуватися в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна, і, тим самим, реплікуватися разом з геномом хазяїна. Більше того, визначені вектори здатні спрямовувати експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори позначають у даному описі як "рекомбінантні експресуючі вектори" (або просто, "експресуючі вектори"). Як правило, експресуючі вектори, застосовні в способах рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У даному описі, терміни "плазміда" і "вектор" можуть бути використані взаємозамінно, оскільки плазміда є найчастіше використовуваною формою вектора. Однак мають на увазі, що варіанти здійснення включають інші форми експресуючих векторів, такі як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси з дефектом реплікації, аденовіруси й аденоасоційовані віруси), що виконують еквівалентні функції. Термін "функціонально зв'язаний" стосується розташування компонентів, так щоб вони могли функціонувати передбачуваним для них чином. Послідовність контролю, "функціонально зв'язану" з кодуючою послідовністю, лігують таким чином, щоб досягати експресії кодуючої послідовності, в умовах, сумісних з послідовностями контролю. "Функціонально зв'язані" послідовності включають послідовності контролю експресії, що є суміжними з нуклеїновою кислотою, що представляє інтерес, і послідовності контролю експресії, що здійснюють трансрегуляцію, тобто розташовані на іншій молекулі нуклеїнової кислоти щодо нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, але, проте, здійснюють їхній контроль над нуклеїновою кислотою, що представляє інтерес, і послідовності контролю експресії, що розташовані на тій же молекулі нуклеїнової кислоти, що і нуклеїнова кислота, яка представляє інтерес, але на відстані від неї. Термін "послідовність контролю експресії" стосується полінуклеотидних послідовностей, що необхідні для здійснення експресії і процесингу кодуючи послідовностей, з якими вони ліговані. Послідовності контролю експресії включають відповідні послідовності ініціації, термінації транскрипції, промоторні і енхансерні послідовності; сигнали ефективного процесингу РНК, такі як сигнали сплайсингу і поліаденілування; послідовності, що стабілізують цитоплазматичну мРНК; послідовності, що підсилюють ефективність трансляції (тобто консенсусна послідовність Козака); послідовності, що підсилюють стабільність білка; і, якщо бажано, послідовності, що підсилюють секрецію білка. Тип таких послідовностей контролю відрізняється, залежно від організму хазяїна; у прокаріотах такі послідовності контролю, як правило, включають промотор, ділянку зв'язування рибосом і послідовність термінації транскрипції; у еукаріот, як правило, такі послідовності контролю включають промотори і послідовність термінатора транскрипції. Термін "послідовності контролю" включає компоненти, наявність яких необхідно для експресії і процесингу, і також він може включати додаткові компоненти, наявність яких є переважним, наприклад, лідерні послідовності і послідовності партнера по злиттю. "Трансформація", як визначають у рамках винаходу, стосується будь-якого процесу, за допомогою якого ДНК проникає в клітину-хазяїна. Трансформація може відбуватися в природних або штучних умовах з використанням різних способів, добре відомих у даній галузі, для вбудовування послідовностей чужорідних нуклеїнових кислот, наприклад, у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна. Спосіб вибирають, виходячи з трансформованої клітинихазяїна, і він може включати, але не обмежуватися ними, вірусну інфекцію, електропорацію, ліпофекцію і бомбардування частками. Такі "трансформовані" клітини включають стабільно трансформовані клітини, у яких убудована ДНК здатна реплікуватися або як плазміди, що аутосомно репліфікуються, або як частина хромосоми хазяїна. Також вони включають клітини, що тимчасово експресують убудовану ДНК або РНК протягом обмежених періодів часу. Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") стосується клітини, у яку вводять екзогенну ДНК. Варто розуміти, що такі терміни стосуються не тільки конкретної розглянутої клітини, але також нащадків такої клітини. Оскільки в наступних поколіннях можуть відбуватися визначені модифікації внаслідок або мутації, або впливів навколишнього середовища, такі нащадки, у дійсності, можуть не бути ідентичними батьківській клітині, однак 11 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вони, проте, включені в об'єм терміну "клітина-хазяїн". В одному з варіантів здійснення клітинихазяїни включають прокаріотичні і еукаріотичні клітини, вибрані з кожного з царств живих організмів. В одному варіанті здійснення еукаріотичні клітини включають одноклітинні організми, клітини грибів, рослин і тварин. В одному варіанті здійснення клітини-хазяїни включають, але не обмежуються ними, лінію прокаріотичних клітин Escherichia coli; клітинні лінії ссавців CHO, HEK 293 і COS; клітинну лінію комах Sf9; і клітини грибів Saccharomyces cerevisiae. Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів і культивування тканин і трансформації (наприклад, електропорація, ліпофекція) можна використовувати стандартні способи. Ферментативні реакції і способи очищення можна проводити відповідно до вказівок виготівника або як звичайно проводять у даній галузі, або як описано в даному описі. Вказані вище способи і процеси можна виконувати, головним чином, відповідно до загальноприйнятих способів, добре відомих в даній галузі, і як описано в різних загальних і більш конкретних посиланнях, що цитовані і розглянуті протягом даного опису. Див. наприклад, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Термін "трансгенний організм" стосується організму, що має клітини, які містять трансген, де трансген, введений в організм (або батьківський організм), експресує поліпептид, що не експресується в організмі в природі. "Трансген" являє собою конструкцію ДНК, що стабільно і функціонально убудована в геном клітини, з якої розвивається трансгенний організм, напрямну експресію кодованого продукту гена в одному або декількох типах клітин або тканин трансгенного організму. Терміни "регулює" і "модулює" використовують взаємозамінно, і вони стосуються переключення або зміни активності молекули, що представляє інтерес, (наприклад, біологічної активності hTNF-α). Модулювання може являти собою підвищення або зниження інтенсивності визначеної або активності функції молекули, що представляє інтерес. Ілюстративні види активності і функції молекули включають, але не обмежуються ними, характеристики зв'язування, ферментативну активність, активацію клітинного рецептора і передачу сигналу. Відповідно, термін "модулятор" являє собою сполуку, здатну переключати або змінювати активність або функцію молекули, що представляє інтерес, (наприклад, біологічну активність hTNF-α). Наприклад, модулятор може викликати підвищення або зниження інтенсивності визначеної активності або функції молекули в порівнянні з інтенсивністю або активності функції, що спостерігається за відсутності модулятора. У визначених варіантах здійснення модулятор являє собою інгібітор, що знижує інтенсивність щонайменше одного виду активності або функції молекули. Ілюстративні інгібітори включають, але не обмежуються ними, білки, пептиди, антитіла, пептидні антитіла, вуглеводи або низькомолекулярні органічні сполуки. Пептидні антитіла описані, наприклад, у публікації WO01/83525. Термін "агоніст" стосується модулятора, що при контактуванні з молекулою, що представляє інтерес, викликає підвищення інтенсивності визначеного виду або активності функції молекули в порівнянні з інтенсивністю виду або активності функції, що спостерігається під час відсутності агоніста. Конкретні представляючі інтерес агоністи можуть включати, але не обмежуватися ними, поліпептиди TNF-α або поліпептиди, нуклеїнові кислоти, або вуглеводи будь-які інші молекули, що зв'язуються з hTNF-α. Терміни "антагоніст" або "інгібітор" стосуються модулятора, що при контактуванні з молекулою, що представляє інтерес, викликає зниження інтенсивності визначеного виду або активності функції молекули в порівнянні з інтенсивністю виду або активності функції, що спостерігається під час відсутності антагоніста. Конкретні антагоністи, що представляють інтерес, включають антагоністи, що блокують або модулюють біологічну або імунологічну активність hTNF-α. Антагоністи й інгібітори hTNF-α можуть включати, але не обмежуватися ними, білки, нуклеїнові кислоти, вуглеводи або будь-які інші молекули, що зв'язуються з hTNF-α. Термін "ефективна кількість" стосується кількості лікарського засобу, що є достатнім для зниження або зм'якшення ваги і/або зменшення тривалості або порушення одного або декількох його симптомів, запобігання прогресування порушення, забезпечення регресії порушення, запобігання рецидиву, розвитку, виникнення або прогресування одного або декількох симптомів, асоційованих з порушенням, виявлення порушення, або посилення або поліпшення профілактичного або терапевтичного ефекту(-ів) іншої терапії (наприклад, профілактичного або терапевтичного засобу). Термін "біологічний зразок" включає, але не обмежується ними, будь-яка кількість матеріалу з живої істоти або раніше живої істоти. Такі живі істоти включають, але не обмежуються ними, людей, мишей, щурів, мавп, собак, кроликів і інших тварин. Такі матеріали включають, але не 12 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обмежуються ними, кров, сироватку, сечу, синовіальну рідину, клітини, органи, тканини, кістковий мозок, лімфатичні вузли і селезінку. Антитіла, що зв'язують TNF-α людини Один аспект стосується виділених моноклональних антитіл миші або їх антигензв'язувальних частин, що зв'язуються з TNF з високою афінністю, низькою швидкістю дисоціації і високою нейтралізуючою здатністю. Другий аспект стосується химерним антитіл, що зв'язують TNF-α. Третій аспект стосується антитіл з пересадженими CDR або їх антиген-зв'язувальних частин, що зв'язують TNF-α. Четвертий аспект стосується гуманізованих антитіл або їхніх антиген-зв'язувальних частин, що зв'язують TNF-α. В одному варіанті здійснення антитіла або їхні частини являють собою виділені антитіла. В одному варіанті здійснення антитіла являють собою нейтралізуючі антитіла проти TNF-α людини. A. Спосіб одержання антитіл проти TNF-α антитіла Антитіла можна одержувати кожним з ряду способів, відомих у даній галузі. 1. Одержання моноклональних антитіл проти TNF-α с використанням технології гібридом Моноклональні антитіла можна одержувати з використанням широкої множини способів, відомих у даній галузі, включаючи застосування гібридом, рекомбінантні технології і технології фагового дисплею або їхнє поэднання. Наприклад, моноклональні антитіла можна одержувати з використанням способів гібридом, що включає способи, відомі в даній галузі й описані, nd наприклад, у Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2 ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al. eds., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" In Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, General Editor) (Elsevier, N.Y., 1981). Термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, продукованими технологією гібридом. Термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла, що отримано з одного клону, що включає будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, а не способу, за допомогою якого воно отримано. Способи продукування і скринінгу специфічних антитіл з використанням технології гібридом є загальноприйнятими і добре відомі в даній галузі. Один варіант здійснення стосується способів одержання моноклональних антитіл, а також антитіл, що продукується способом, який включає культивування клітини гібридоми, що секретує антитіло, де, в одному варіанті здійснення, гібридома отримана злиттям спленоцитів, виділених з миші, імунізованої антигеном, із клітинами мієломи, а потім скринінг гібридом, отриманих злиттям, відносно клонів гібридоми, що секретують антитіло, здатне зв'язувати поліпептид. У короткому викладі, мишей можна імунізувати антигеном TNF-α. В одному варіанті здійснення для стимуляції імунної відповіді антиген TNF-α уводять з ад'ювантом. Такі ад'юванти включають повний або неповний ад'ювант Фрейнда, RIBI (мурамілдипептиди) або ISCOM (імуностимулюючі комплекси). Такі ад'юванти можуть захищати поліпептид від швидкого розсіювання шляхом ізоляції в локальному депо, або вони можуть містити речовини, що стимулюють секрецію хазяїном факторів, що є хемотаксичними факторами для макрофагів і інших компонентів імунної системи. В одному варіанті здійснення, якщо вводять поліпептид, схема імунізації включає два або більше уведення поліпептиду, розосереджених на декількох тижнів. Після імунізації тварини антигеном TNF-α, із тварини можна одержувати антитіла і/або антитілопродукуючі клітини. Сироватку, що містить антитіло проти TNF-α, одержують із тварини шляхом забору крові або умертвіння тварини. Сироватку можна використовувати в такому вигляді, як її одержують із тварини, із сироватки можна одержувати фракцію імуноглобулінів або із сироватки можна очищати антитіла проти TNF-α. або Сироватка імуноглобуліни, отримані таким чином, є поліклональними, таким чином, що мають гетерогенний набір властивостей. Після виявлення імунної відповіді в сироватці миші виявляють, наприклад, антитіла, специфічні до антигену TNF-α, селезінку мишей витягають і виділяють спленоцити. Потім спленоцити піддають злиттю добре відомими способами з будь-якими придатними клітинами мієломи, наприклад, клітинами з клітинної лінії SP20, доступної від ATCC. Гібридоми піддають селекції і клонують способом лімітуючи розведень. Потім клони гібридоми оцінюють способами, відомими в даній галузі, відносно клітин, що секретують антитіла, здатні зв'язувати TNF-α. Асцитну рідину, що, як правило, містить високі рівні антитіл, можна одержувати імунізацією мишей позитивними клонами гібридом. В іншому варіанті здійснення з імунізованої тварини можна одержувати антитілопродукуючі іморталізовані гібридоми. Після імунізації тварину умертвляють і B-клітини селезінки піддають злиттю з іморталізованими клітинами мієломи, як добре відомо в даній галузі. Див., наприклад, Harlow and Lane, вище. В одному варіанті здійснення клітини мієломи не секретують поліпептиди імуноглобулінів (несекретуюча клітинна лінія). Після злиття і селекції на антибіотику, гібридоми піддають скринінгу з використанням TNF-α або його частини, або 13 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини, експресуючі TNF-α. В одному варіанті здійснення вихідний скринінг проводять з використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) або радіоімунного аналізу (RIA). Приклад скринінгу за допомогою ELISA наданий у публікації міжнародної заявки № WO 00/37504. Гібридоми, які продукують антитіло проти TNF-α, піддають селекції, клонують і далі піддають скринінгу відносно необхідних ознак, включаючи активний ріст гібридоми, високу продукцію антитіл і необхідні характеристики антитіла, як додатково розглянуто нижче. Гібридоми можна культивувати і розмножувати in vivo у сингенних тварин, у тварин, що позбавлені імунної системи, наприклад, у мишей nude, або в клітинній культурі in vitro. Способи селекції, клонування і розмноження гібридом добре відомі фахівцям у даній галузі. В одному варіанті здійснення гібридоми являють собою гібридоми миші, як описано вище. В іншому кращому варіанті здійснення одержують гібридоми видів не людини і не миші, таких як щура, вівці, свині, кози, велика рогата худоба або коні. В іншому варіанті здійснення, гібридоми являють собою гібридоми людини, у яких несекретуючу мієлому людини піддають злиттю з клітиною людини, експресуючою антитіло проти TNF-α. Фрагменти антитіл, що розпізнають визначені епітопи, можна одержувати відомими способами. Наприклад, Fab- і F(ab')2-фрагменти можна одержувати протеолітичним розщепленням молекул імуноглобулінів з використанням ферментів, таких як папаїн (для одержання Fab-фрагментів) або пепсин (для одержання F(ab') 2-фрагментів). F(ab')2-фрагменти містять варіабельну область, константну область легкого ланцюга і CH1-домен важкого ланцюга. 2. Одержання моноклональних антитіл проти TNF-α с використанням SLAM В іншому аспекті одержують рекомбінантні антитіла з одиничних виділених лімфоцитів з використанням способу, називаного в даній галузі способом одержання антитіл з підданих селекції лімфоцитів (SLAM), як описано в патенті США № 5627052; публікації PCT № WO 92/02551 і Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. У цьому способі окремі клітини, секретуючі антитіла, що представляють інтерес, наприклад, лімфоцити, отримані з імунізованих тварин, піддають скринінгу з використанням аналізу антигенспецифічних гемолітичних бляшок, де антиген TNF-α, субодиницю TNF-α або їхній фрагмент зв'язують з еритроцитами вівці з використанням лінкера, такого як біотин, і використовують для ідентифікації окремих клітин, що секретують антитіла зі специфічністю до TNF-α. Після ідентифікації представляючих інтерес секретуючих антитіло клітин з цих клітин одержують кДНК варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів за допомогою ПЛР зі зворотною транскриптазою, і ці варіабельні ділянки потім можна експресувати зв'язаними з відповідними константними ділянками імуноглобулінів (наприклад, константними ділянками людини) у клітинах-хазяїнах ссавців, таких як клітини COS або CHO. Потім клітини-хазяїни, трансфіковані ампліфікованими послідовностями імуноглобулінів, отриманих з підданих селекції in vivo лімфоцитів, можна піддавати подальшому аналізу і селекції in vitro, наприклад, за допомогою пенінгу трансфікованих клітин для виділення клітин, експресуючих антитіла до TNF-α. Ампліфікованими послідовностями імуноглобулінів можна далі маніпулювати in vitro, наприклад, способами дозрівання афінності in vitro, такими як способи, описані в публікаціях PCT № WO 97/29131 і WO 00/56772. 3. Одержання моноклональних антитіл проти TNF-α с використанням трансгенних тварин В іншому варіанті здійснення антитіла одержують імунізацією тварини, що не є людиною, що містить частину або весь локус імуноглобулінів людини, антигеном TNF-α. В одному варіанті здійснення тварина, що не є людиною, являє собою трансгенну мишу XENOMOUSE, отриману способами інженерії лінію мишей, що містить великі фрагменти локусів імуноглобулінів людини і є дефіцитною по продукції антитіл миші. Див., наприклад, Green et al. (1994) Nature Genet. 7:1321, і патенти США № 5916771; 5939598; 5985615; 5998209; 6075181; 6091001; 6114598 і 6130364. Також див. публікації PCT № WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO 98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031 WO 99/53049; WO 00/09560 і WO 00/37504. У трансгенній миші XENOMOUSE® продукується набір цілком людських антитіл, подібний до набору дорослої людини, і утворюються антгенспецифічні моноклональні антитіла людини. Трансгенна миша XENOMOUSE® містить приблизно 80 % набору антитіл людини унаслідок уведення фрагментів YAC розміром, що складає мільйони пар основ, з ембріональною конфігурацією локусів важкого ланцюга людини і локусів легкого ланцюга людини. Див. Mendez et al. (1997) Nature Genet. 15: 146-156 і Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495. 4. Одержання моноклональних антитіл проти TNF-α с використанням бібліотек рекомбінантних антитіл 14 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також для одержання антитіл можна використовувати способи in vitro, де бібліотеку антитіл піддають скринінгу для ідентифікації антитіла, що має необхідну специфічність зв'язування. Способи такого скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл добре відомі в даній галузі і включають способи, описані, наприклад, у патенті США № 5223409; публікаціях PCT № WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; WO 97/29131; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1369-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4133-4137; і Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982, і публікації патенту США № 2003/0186374. Бібліотека рекомбінантних антитіл може бути з будь-якого індивідуума, імунізованого TNF-α або частиною TNF-α. Альтернативно, бібліотека рекомбінантних антитіл може бути з наївного індивідуума, тобто індивідуума, якого не імунізували TNF-α, така як бібліотека, отримана від людини, яку не імунізували TNF-α людини. Антитіла відбирають скринінгом бібліотеки рекомбінантних антитіл за допомогою пептиду, що містить TNF-α людини, для селекції тим самим антитіл, що розпізнають TNF-α. Способи проведення такого скринінгу і селекції добре відомі в даній галузі, як описано в посиланнях у попередньому абзаці. Для добору антитіл, що мають конкретну афінність зв'язування відносно hTNF-α, таких як антитіла, що дисоціюють від TNF-α людини з конкретною константою швидкості k off, можна використовувати відомий у даній галузі спосіб поверхневого плазмонного резонансу для відбору антитіл, що мають бажану константу швидкості koff. Для відбору антитіл, що мають конкретну нейтралізуючу активність відносно hTNF-α, таких як антитіла з конкретною IC50, можна використовувати стандартні відомі в даній галузі способи оцінки інгібування активності hTNF-α. Один аспект стосується виділеного антитіла або його антиген-зв'язувальній частині, що зв'язує TNF-α людини. В одному варіанті здійснення антитіло являє собою нейтралізуюче антитіло. У різних варіантах здійснення антитіло являє собою рекомбінантне антитіло або моноклональне антитіло. Наприклад, антитіла також можна одержувати з використанням різних способів фагового дисплея, відомих у даній галузі. У способах фагового дисплея функціональні домени антитіла експонують на поверхні фагових частинок, що мають полінуклеотидні послідовності, що кодують їх. Зокрема, такий фаг можна використовувати для експонування антигензв'язувальних доменів, експресованих з бібліотеки набору антитіл або комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші). Фаг, експресуючий антиген-зв'язувальний домен, що зв'язує антиген, що представляє інтерес, можна піддавати селекції й ідентифікувати за допомогою антигену, наприклад, з використанням міченого антигену або антигену, зв'язаного або фіксованого на твердій або поверхні гранулах. Фаг використовуваний у цих способах, як правило, являє собою нитковидний фаг, що включає fd і M13, що зв'язує домени, які експресуються з фага з доменами антитіла Fab, Fv або стабілізованого дисульфідом Fv, рекомбінантно злитими з фаговим білком гена III або гена VIII. Приклади способів фагового дисплея, які можна використовувати для одержання антитіл, включають способи, описані в Brinkmann et al. (1995) J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al. (1995) J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al. (1997) Gene 187 9-18; Burton et al. (1994) Adv. Immunol. 57:191-280; заявці PCT № PCT/GB91/01134; публікаціях PCT № WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; і патентах США № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 і 5969108. Після селекції фага кодуючі області антитіла з фага можна виділяти і використовувати для одержання цілих антитіл, включаючи антитіла людини, або будь-якого іншого бажаного антигензв'язувального фрагмента, і експресувати у будь-якому бажаному хазяїні, включаючи клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин, дріжджі і бактерії, наприклад, як докладно описано в даному описі. Наприклад, також можна використовувати технології рекомбінантної продукції Fab-, Fab'- і F(ab')2-фрагментів з використанням способів, відомих у даній галузі, таких як способи, описані в публікації PCT № WO 92/22324; Mullinax et al. (1992) BioTechniques 12(6):864869; Sawai et al. (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34; і Better et al. (1988) Science 240: 10411043. Приклади технологій, які можна використовувати для одержання одноланцюжкових Fv і антитіл включають способи, описані в патентах США № 4946778 і 5258498; Huston et al. (1991) Methods Enzymol. 203: 46-88; Shu et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; і Skerra et al. (1988) Science 240: 1038-1041. 15 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно скринінгу бібліотек рекомбінантних антитіл за допомогою фагового дисплея для ідентифікації антитіл з подвійною специфічністю, можна використовувати інші відомі в даній галузі способи скринінгу великих комбінаторних бібліотек. Одним типом альтернативної експресуючої системи є система, у якій бібліотека рекомбінантних антитіл експресується як злиті конструкції РНК-білок, як описано в публікації PCT № WO 98/31700 і в Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302. У цій системі проводять ковалентне злиття між мРНК і пептидом або білком, які вона кодує, за допомогою трансляції in vitro синтетичних мРНК, що мають пуроміцин, пептидильний акцепторним антибіотиком, на їх 3'-кінці. Таким чином, комплексну суміш мРНК (наприклад, комбінаторну бібліотеку) можна збагачувати конкретною мРНК, виходячи з властивостей конкретного пептиду або білка, наприклад, антитіла або його частини, таких як зв'язування антитіла або його частини, з антигеном з подвійною специфічністю. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують антитіла або їхні частини, виділені шляхом скринінгу таких бібліотек, можна експресувати рекомбінантними способами, як описано вище (наприклад, у клітинах-хазяїнах ссавців), і, більше того, їх можна піддавати подальшому дозріванню афінності або за допомогою додаткових раундів скринінгу злитих конструкцій мРНК-пептид, у яких у вихідно відібрану послідовність(-і) були внесені мутації, або іншими способами дозрівання афінності in vitro для рекомбінантних антитіл, як описано вище. В іншому підході антитіла також можна одержувати з використанням способів дріжджового дисплея, відомих у даній галузі. У способах дріжджового дисплея використовують способи генетики для зв'язування доменів антитіл із клітинною стінкою дріжджів і експонування їх на поверхні дріжджів. Зокрема, такі дріжджі можна використовувати для дисплея антигензв'язувальних доменів, експресованих з бібліотек наборів або антитіл комбінаторних бібліотек антитіл (наприклад, людини або миші). Приклади способів дріжджового дисплея, які можна використовувати для одержання антитіл, включають способи, описані в патенті США № 6699658. B. Продукування рекомбінантних антитіл проти TNF-α Антитіла можна одержувати кожним з множини способів, відомих у даній галузі, наприклад, експресією з клітин-хазяїнів, де експресуючий вектор(-и), що кодує важкий і легкий ланцюги трансфікований(-і) у клітину-хазяїна стандартними способами. Мають на увазі, що різні форми терміна "трансфекція" включають широку множину способів, звичайно використовуваних для введення екзогенної ДНК у прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїна, наприклад, електропорацію, осадженням фосфатом кальцію, трансфекцію DEAE-декстраном і т. п. Хоча можна експресувати антитіла як у прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах-хазяїнах, в одному варіанті здійснення в клітинах-хазяїнах ссавців як таких еукаріотичних клітин (і зокрема, клітин ссавців) з більшою імовірністю, ніж у прокаріотичних клітинах, збереться і буде секретуватися належним чином згорнуте і імунологічно активне антитіло. Клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл включають клітини яєчника китайського хом'яка (клітини CHO) (включаючи клітини dhfr-CHO, описані в Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, використовувані із селективним маркером DHFR, наприклад, як описано в Kaufman and Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621)), клітини мієломи NSO, клітини COS і клітини SP2. Коли рекомбінантні експресуючі вектори, що кодують гени антитіла, вводять у клітини-хазяїни ссавців, антитіла одержують культивуванням клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для забезпечення експресії антитіла в клітинах-хазяїнах, або секреції антитіла в культуральне середовище, у якій клітини-хазяїни вирощують. Антитіла можна виділяти з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білка. Також клітини-хазяїни можна використовувати для одержання функціональних фрагментів антитіла, таких як Fab-фрагменти або молекули scFv. Зрозуміло, що варіанти вказаного вище способу знаходяться в обсязі варіантів здійснення. Наприклад, може бути бажаною трансфекція клітини-хазяїна ДНК, що кодує функціональні фрагменти або легкого ланцюга, і/або важкого ланцюга антитіла. Також можна використовувати технологію рекомбінантних ДНК для видалення деякої частини або всієї ДНК, що кодує будь-який або обидві з легкого ланцюга і важкого ланцюга, що не є необхідною для зв'язування антигенів, що представляють інтерес. Молекули, експресовані з таких укорочених молекул ДНК, також охоплюються антитілами. Крім того, можнаодержувати біфункціональні антитіла, у яких один важкий й один легкий ланцюг являють собою антитіло, а інший важкий і легкий ланцюг є специфічними до антигену, відмінному від антигенів, що представляють інтерес, шляхом поперечного зшивання антитіла з другим антитілом стандартними способами хімічного зшивання. В ілюстративній системі для рекомбінантної експресії антитіла або його антигензв'язувальної частини рекомбінантний експресуючий вектор, що кодує як важкий ланцюг 16 UA 108912 C2 5 10 15 антитіла, так і легкий ланцюг антитіла, вводять у клітини dhfr-CHO опосередковуваною фосфатом кальцію трансфекцією. У рекомбінантному експресуючому векторі кожний з генів важкого і легкого ланцюгів антитіла функціонально зв'язаний з регуляторними елементами енхансер CMV/промотор AdMLP для забезпечення високих рівнів транскрипції генів. Також рекомбінантний експресуючий вектор має ген DHFR, що дозволяє селекцію клітин CHO, що трансфіковані вектором, з використанням селекції/ампліфікації за допомогою метотрексату. Відібрані трансформовані клітини-хазяїни культивують для забезпечення експресії важкого і легкого ланцюгів антитіла, і інтактне антитіло виділяють з культурального середовища. Для одержання рекомбінантного експресуюючого вектора, трансфекції клітин-хазяїнів, селекції трансформантів, культивування клітин-хазяїнів і виділення антитіла з культурального середовища використовують стандартні способи молекулярної біології. Крім того, передбачається спосіб синтезу рекомбінантного антитіла культивуванням клітини-хазяїна в придатному середовищі, доти, доки не синтезується рекомбінантне антитіло. Крім того, спосіб може включати виділення рекомбінантного антитіла з культурального середовища. 1. Антитіла проти hTNF-α У таблиці 5 представлений перелік амінокислотних послідовностей VH- і VL-областей антитіл проти hTNF-α миші. Таблиця 5 Перелік амінокислотних послідовностей VH- і VL-областей антитіл проти hTNF-α миші SEQ Область ID білка NO: 31 VH mak199 32 Залишки VH 31-35 MAK199 SEQ ID CDR-H1 NO:31 Залишки VH 50-66 MAK199 SEQ ID CDR-H2 NO:31 Залишки VH 99-113 MAK199 SEQ ID CDR-H3 NO:31 vl MAK199 Залишки VL 24-34 MAK199 SEQ ID CDR-L1 NO:32 Залишки VL 50-56 MAK199 SEQ ID CDR-L2 NO:32 Залишки VL 89-97 MAK199 SEQ ID CDR-L3 NO:32 Послідовність 123456789012345678901234567890 Qiqlvqsgpelkkpgetvmisckasgytftnygmnwvkqapgkglkwmgwintytgeptyaddfkgrf afsletsastaylqinnlknedtatyfcarkflttvvvtdyamdywgqgtsvtvss nygmn wintytgeptyaddfkg kflttvvvtdyamdy Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdisnylnwyqqkpdgtvklliyytsrlqsgvpsrfsgsgsgtdysltis nleqediatyfcqqgntlpptfgvgtklelk rasqdisnyln ytsrlqs qqgntlppt 123456789012345678901234567890 20 2. Химерні антитіла проти hTNF-α Химерне антитіло являє собою молекулу, у якій різні частини антитіла отримані з різних видів тварин, таку як антитіла, що мають варіабельну область, утворену з моноклонального антитіла миші, і константну область імуноглобуліну людини. Способи одержання химерних 17 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 антитіл відомі в даній галузі і докладно розглянуті в прикладах. Morrison (1985) Science 229:1202; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods 125:191202; і патенти США № 5807715; 4816567 і 4816397. Крім того, можна використовувати способи, розроблені для одержання "химерних антитіл" за допомогою сплайсингу генів молекули антитіла миші з відповідною антигенною специфічністю з генами молекули антитіла людини з відповідною біологічною активністю (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454). В одному з варіантів здійснення химерні антитіла одержують, заміняючи константну область важкого ланцюга моноклональних антитіл миші проти TNF-α людини, описаних у розділі 1, константною областю Ig1 людини. 3. Антитіла проти TNF-α з пересадженими CDR Антитіла з пересадженими CDR містять послідовності варіабельних областей важкого і легкого ланцюга з антитіла людини, де одна або декілька з областей CDR VH і/або VL замінена послідовностями CDR антитіл миші. Матрицею для пересадження CDR може служити каркасна послідовність з будь-якого антитіла людини. Однак пряма заміна ланцюгів у такій каркасній області часто приводить до деякої втрати афінності зв'язування з антигеном. Чим більш гомологічним є антитіло людини вихідному антитілу миші, тим менш ймовірним є те, що об'єднання CDR миші з каркасною областю людини внесе перекручування в CDR, що можуть знизити афінність. Таким чином, в одному варіанті здійснення каркасна область варіабельної області людини, що вибрана для заміни каркасної області варіабельної області миші, за винятком CDR, має щонайменше приблизно 65 %, щонайменше приблизно 70 %, щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, щонайменше приблизно 95 %, приблизно 100 %, ідентичність послідовності з каркасною областю варіабельної області антитіла миші. Способи одержання антитіл з пересадженими CDR відомі в даній галузі і докладно описані разом з гуманізацією таких антитіл з пересадженими CDR у прикладах (також див. патент EP № EP 0 239 400; публікацію PCT № WO 91/09967; патенти США № 5225539; 5530101 і 5585089); гіперхимеризацією або зміною поверхні (патенти EP № EP 0 592 106 і EP 0 519 596; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7(6):805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973), і шафлінгом ланцюгів (патент США № 5565352). У конкретному варіанті здійснення передбачені антитіла з пересадженими CDR з ланцюгами VH і/або VL, як описано в таблиці 6. Таблиця 6 Антитіла з пересадженими CDR SEQ ID Область білка NO: 33 34 hMAK199VL.1 36 40 hMAk199VH.2z 35 35 hMAK199VH.1z hMAK199VL.2 Послідовність 123456789012345678901234567890 Qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglewmgwintytgeptyaddfkgrfvfs ldtsvstaylqisslkaedtavyycarkflttvvvtdyamdywgqgttvtvss Qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglewmgwintytgeptyaddfkgrvtm ttdtststaymelrslrsddtavyycarkflttvvvtdyamdywgqgttvtvss Diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdisnylnwyqqkpgkapklliyytsrlqsgvpsrfsgsgsgtdftltissl qpedfatyycqqgntlpptfgqgtkleik Dvvmtqspaflsvtpgekvtitcrasqdisnylnwyqqkpdqapkllikytsrlqsgvpsrfsgsgsgtdftftissl eaedaatyycqqgntlpptfgqgtkleik 4. Гуманізовані антитіла проти hTNF-α Гуманізовані антитіла являють собою молекули антитіл, що мають одну або декілька визначальних комплементарність областей (CDR) не є людиною виду і каркасні області з молекули імуноглобуліну людини. Відомі послідовності Ig людини описані, наприклад, на www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; 18 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.Uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Такі імпортні послідовності можна використовувати для зниження імуногенності або зниження, підвищення або модифікації зв'язування, афінності, константи асоціації, константи дисоціації, авідності, специфічності, часу або напівжиття будь-якої іншої прийнятної характеристики, як відомо в даній галузі. Каркасні залишки в каркасних областях людини можна заміняти відповідним залишком з антитіла, що є донором CDR, для зміни, наприклад, підвищення, зв'язування антигену. Ці заміни в каркасній області ідентифікують способами, добре відомими в даній галузі, наприклад, за допомогою моделювання взаємодій залишків CDR і каркасної області для ідентифікації залишків каркасної області, важливих для зв'язування антигену, і порівняння послідовностей для ідентифікації незвичайних залишків каркасної області в конкретних положеннях. (Див., наприклад, патент США № 5585089; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327). Тривимірні моделі імуноглобулінів широко доступні і відомі фахівцям у даній галузі. Доступні комп'ютерні програми, що ілюструють і виводять на екран можливі тривимірні конформаційні структури вибраних послідовностей імуноглобулінів-кандидатів. Дослідження цих виведених на екран структур дозволяє аналіз можливої ролі залишків у функціонуванні послідовності імуноглобуліну-кандидата, тобто аналіз залишків, що впливають на здатність імуноглобулінукандидата зв'язувати його антиген. Таким чином, можна відбирати і комбінувати залишки FR з консенсусної і імпортної послідовностей, щоб досягати бажаних характеристик антитіла, таких як підвищена афінність до антигену(-ів)-мішені. Як правило, залишки CDR прямо і найбільше істотно залучені до впливу на зв'язування антигену. Антитіла можна гуманізувати з використанням різних способів, відомих у даній галузі, таких як, але не обмежуючи ними, способи, описані в Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), Sims et al. (1993) J. Immunol. 151: 2296-2308; Chothia і Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632; Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Eng. 7(6):805-814; Roguska. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973; публікаціях PCT № WO 91/09967, WO 99/06834 (PCT/US98/16280), WO 97/20032 (PCT/US96/18978), WO 92/11272 (PCT/US91/09630), WO 92/03461 (PCT/US91/05939), WO 94/18219 (PCT/US94/01234), WO 92/01047 (PCT/GB91/01134), WO 93/06213 (PCT/GB92/01755), WO 90/14443, WO 90/14424, і WO 90/14430; публікаціях Європи № EP 0592106, EP 0519596 і EP 0239400; патентах США № 5565332; 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539 і 4816567. 5. Одержання антитіл і продукуючих антитіла клітинних ліній В одному варіанті антитіла проти TNF-α виявляють високу здатність знижувати або нейтралізувати активність TNF-α, наприклад, при оцінці кожним з декількох аналізів in vitro і in vivo, відомих у даній галузі. В іншому варіанті здійснення антитіла проти TNF-α виявляють високу здатність знижувати або нейтралізувати активність TNF-α. У конкретних варіантах здійснення виділене антитіло або його антиген-зв'язувальна частина зв'язують TNF-α людини, де антитіло або його антиген-зв'язувальна частина дисоціюють від -1 TNF-α людини з константою швидкості k off приблизно 0,1 с або менше, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або вони інгібують активність TNF-α людини з -6 IC50 приблизно 1×10 M або менше. Альтернативно, антитіло або його антиген-зв'язувальна -2 -1 частина можуть дисоціювати від TNF-α людини з константою швидкості k off приблизно 1×10 с або менше, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або можуть -7 інгібувати активність TNF-α людини з IC50 приблизно 1×10 M або менше. Альтернативно, 19 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіло або його антиген-зв'язувальна частина можуть дисоціювати від TNF-α людини з -3 -1 константою швидкості koff приблизно 1×10 с або менше, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або можуть інгібувати TNF-α людини з IC50 приблизно -8 1×10 M або менше. Альтернативно, антитіло або його антиген-зв'язувальна частина можуть -4 -1 дисоціювати від TNF-α людини з константою швидкості k off приблизно 1×10 с або менше, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або можуть інгібувати -9 активність TNF-α людини з IC50 приблизно 1×10 M або менше. Альтернативно, антитіло або його антиген-зв'язувальна частина можуть дисоціювати від TNF-α людини з константою -5 -1 швидкості koff приблизно 1×10 с або менше, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або можуть інгібувати активність TNF-α людини з IC50 приблизно 1×10 10 M або менше. Альтернативно, антитіло або його антиген-зв'язувальна частина можуть -5 -1 дисоціювати від TNF-α людини з константою швидкості k off приблизно 1×10 с або менше при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу, або можуть інгібувати -11 активність TNF-α людини з IC50 приблизно 1×10 M або менше. У визначених варіантах здійснення антитіло містить константну область важкого ланцюга, таку як константна область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM або IgD. В одному варіанті здійснення константна область важкого ланцюга являє собою константну область важкого ланцюга Ig1 або константну область важкого ланцюга Ig4. Більше того, антитіло може містити константну область легкого ланцюга, або константну область легкого ланцюга каппа, або константну область легкого ланцюга лямбда. В іншому варіанті здійснення антитіло містить константну область легкого ланцюга каппа. Альтернативно, частина антитіла може являти собою, наприклад, Fab-фрагмент або одноланцюжковий Fv-фрагмент. Заміни амінокислотних залишків у Fc-ділянці для зміни ефекторної функції антитіла відомі в даній галузі (патенти США № 5648260 і 5624821). Fc-ділянка антитіла опосередковує декілька важливих ефекторних функцій, наприклад, індукцію цитокінів, антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (ADCC), фагоцитоз, комплементзалежну цитотоксичність (CDC) і час напівжиття/швидкість виведення антитіла і комплексів антиген-антитіло. У деяких випадках ці ефекторні функції є бажаними для терапевтичного антитіла, але в інших випадках вони можуть бути необов'язковими або небажаними, залежно від терапевтичних цілей. Визначені ізотипи IgG людини, зокрема IgG1 і IgG3, опосередковують ADCC і CDC через зв'язування з FcγR і компонентом комплементу C1q, відповідно. Неонатальні Fc-рецептори (FcRn) є основними компонентами, що визначають час напівжиття антитіл у кровотоці. В іншому варіанті здійснення в константній області антитіла, наприклад, Fc-області антитіла, замінений щонайменше один амінокислотний залишок, для зміни ефекторних функцій. Один з варіантів здійснення стосується міченого зв'язувального білка, де антитіло або його антиген-зв'язувальна частина перетворені в похідне або зв'язані з іншою функціональною молекулою (наприклад, іншим пептидом або білком). Наприклад, мічений зв'язувальний білок може бути отриманий функціональним зв'язуванням антитіла або його антиген-зв'язувальної частини (шляхом хімічного зв'язування, генетичного злиття, нековалентної асоціації або іншим способом) з однією або декількома іншими молекулярними групами, такими як інше антитіло (наприклад, біспецифічне антитіло або діантитіло), агент, що піддається виявленню, цитотоксичний агент, фармацевтичний засіб і/або білок або пептид, що може опосередковувати зв'язування антитіла або його антиген-зв'язувальної частини з іншою молекулою (такий як центральна область стрептавідину або полігістидинова мітка). Придатні агенти, що піддаються виявленню, за допомогою яких може бути перетворене антитіло або його антиген-зв'язувальна частина, включають флуоресцентні сполуки. Ілюстративні флуоресцентні агенти, що піддаються виявленню, включають флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, родамін, 5-диметиламін-1-нафталінсульфонілхлорид, фікоеритрин і т. п. Також антитіло може бути перетворене в похідне з ферментами, що піддаються виявленню, такими як лужна фосфатаза, пероксидаза хрону, глюкозооксидаза і т. п. Коли антитіло перетворене в похідне з ферментом, що піддається виявленню, його виявлення проводять додаванням додаткових реагентів, які фермент використовує для утворення продукту реакції, що піддається виявленню. Наприклад, коли є агент, що піддається виявленню, пероксидаза хрону, додавання пероксиди водню і діамінобензидину приводить до зафарбованого продукту реакції, який є таким, що піддається виявленню. Також антитіло може бути перетворене в похідне з біотином і виявлено шляхом опосередкованого вимірювання зв'язування авідину або стрептавідину. Інший варіант здійснення стосується кристалізованого зв'язувального білка. Інший варіант здійснення стосується кристалів цілих антитіл проти TNF-α і їхніх фрагментів, як описано в даному описі, і складів і композицій, що містять такі кристали. В одному з варіантів здійснення 20 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кристалізований зв'язувальний білок має час напівжиття in vivo, що перевищує час напівжиття in vivo розчинного аналога зв'язувального білка. В іншому варіанті здійснення зв'язувальний білок зберігає біологічну активність після кристалізації. Кристалізований зв'язувальний білок можна одержувати способами, відомими в даній галузі, і як описано в публікації PCT № WO 02/072636. Інший варіант здійснення стосується глікозилованого зв'язувального білка, де антитіло або його антиген-зв'язувальна частина містить один або декілька вуглеводних залишків. Білковий продукт, що утворюється in vivo, може піддаватися подальшому процесингу, відомому як посттрансляційна модифікація. Зокрема, можуть бути ферментативно додані залишки цукру (глікозильні залишки) шляхом процесу, відомого як глікозилювання. Утворені білки, що мають ковалентно зв'язані з ними олігосахаридні бічні ланцюги, відомі як глікозиловані білки або глікопротеїни. Глікозилування білків залежить від амінокислотної послідовності білка, що представляє інтерес, а також від клітини-хазяїна, у якій експресується білок. Різні організми можуть продукувати різні ферменти глікозилування (наприклад, глікозилтрансферази і глікозидази), і мають різні доступні субстрати (цукру нуклеотидів). Внаслідок таких факторів, паттерн глікозилування білка і склад глікозильних залишків можуть відрізнятися, залежно від системи хазяїна, у якій експресується конкретний білок. Придатні глікозильні залишки включають, але не обмежуються ними, глюкозу, галактозу, манозу, фукозу, н-ацетилглюкозамін і сіалову кислоту. В одному з варіантів здійснення глікозильований зв'язувальний білок містить глікозильні залишки, так що паттерн глікозилування є людським. Фахівцям у даній галузі відомо, що різне глікозилювання білка може приводити до різних характеристик білка. Наприклад, ефективність терапевтичного білка, продукованого в мікроорганізмі-хазяїні, такому як дріжджі, і глікозильованого з використанням ендогенного каскаду дріжджів, може бути знижена в порівнянні з глікозилюванням того ж білка, експресованого в клітині ссавця, такій як клітинна лінія CHO. Такі глікопротеїни також можуть бути імуногенними в людини і можуть демонструвати знижений час напівжиття in vivo після введення. Визначені рецептори в людини й інших тварин можуть розпізнавати визначені глікозильні залишки і забезпечувати швидке виведення білка з кровотоку. Інші несприятливі ефекти можуть включати зміну згортання білка, його розчинності, чутливості до протеазам, кругообігу, транспорту, компартменталізації, секреції, розпізнавання іншими білками або факторами, антигенності або алергенності. Таким чином, практикуючий фахівець може віддати перевагу терапевтичному білку з визначеним складом і паттерном глікозилування, наприклад, складом і паттерном глікозилування, ідентичними або щонайменше подібними, зі складом і паттерном глікозилування в клітинах людини або у видоспецифічних клітинах передбачуваної тварини. Експресії глікозилованих білків, відмінних від білків клітини-хазяїна, можна досягати генетичною модифікацією клітини-хазяїна для експресії гетерологічних ферментів глікозилування. З використанням способів, відомих у даній галузі, що практикує фахівець може одержати антитіла або їх антиген-зв'язувальні частини, що виявляють глікозилювання білків людини. Наприклад, штами дріжджів генетично модифікували для експресії ферментів глікозилування, що не зустрічаються в природі, так щоб глікозиловані білки (глікопротеїни), продукування в цих штамах дріжджів, виявляли глікозилювання білка, ідентичне глікозилуванню клітин тварин, особливо клітин людини (патенти США № 7449308 і 7029872). Крім того, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що білок, який представляє інтерес, може бути експресованим з використанням бібліотеки клітин-хазяїнів, створених способами генетичної інженерії для експресії різних ферментів глікозилування, так що клітини-хазяїни, що є членами бібліотеки, продукують білок, що представляє інтерес, з варіантами паттернів глікозилування. Потім практикуючий фахівець може проводити селекцію і виділення білка, що представляє інтерес, з конкретними новими паттернами глікозилування. В одному з варіантів здійснення білок, що має конкретний вибраний новий паттерн глікозилування, виявляє поліпшені або змінені біологічні властивості. D. Застосування антитіл проти TNF-α З огляду на здатність зв'язуватися з TNF-α людини, зв'язувальні білки, наприклад, антитіла проти TNF-α людини або їх антиген-зв'язувальні частини можна використовувати для виявлення TNF-α (наприклад, у біологічному зразку, такому як зразок цільної крові, сироватки, плазми, сечі, слини або тканини), з використанням кожної із широкої множини систем імунодетекції на основі антитіл, доступних у даній галузі. Такі системи імунодетекції включають, але не обмежуються ними, імунопреципітацію, імуноблотинг (вестерн-блотинг), твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімунний аналіз (RIA), імуногістохімію тканин, поверхневий плазмонний резонанс (SPR), сендвіч-імуноаналіз, афінні способи на основі антитіл (наприклад, афінні 21 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гранули, афінні стовпчика), конкурентний імуноаналіз, імуноаналіз на чіпах (зв'язувальний білок, зв'язаний із силіконовим чіпом) і активовану флуоресценцією сортування клітин (FACS). Для деяких систем імунодетекції білок, що зв'язує TNF-α, (або його зв'язувальну частину) (або його частину) зв'язують із твердим субстратом з використанням доступних у даній галузі способів приєднання молекули антитіл до тим самих твердих субстратів, так щоб зв'язаний білок зберігав свою здатність зв'язувати TNF-α людини в ході використання в конкретній системі імунодетекції. Такі тверді субстрати включають, але не обмежуються ними, фільтрувальний папір на основі целюлози (наприклад, целюлоза, нітроцелюлоза, ацетат целюлози), нейлоновий фільтр, пластмасову поверхню (наприклад, мікропланшет для титрування, вимірювальний стрижень з антитілом), скляний субстрат (наприклад, фільтри, гранули, предметні стекла, скляна вата), полімерні частинки (наприклад, агароза, поліакриламід) і кремнієвий чіп. Наприклад, систему імунодетекції можна використовувати в способі виявлення наявності TNF-α у зразку in vitro (наприклад, біологічний зразок, такий як цільна кров, сироватка, плазма, тканина, сеча, слина, біоптат тканини). Такий спосіб можна використовувати для діагностики або захворювання порушення, наприклад, асоційованого з імунними клітинами порушення. Спосіб включає: (i) контактування досліджуваного зразка або контрольного зразка з білком, що зв'язує TNF-α, або його частиною, що зв'язує TNF-α, як описано в даному описі; і (ii) визначення утворення комплексу між зв'язувальним білком проти TNF-α (або його зв'язувальною частиною) і TNF-α у досліджуваному зразку або в контрольному зразку, де статистично значима зміна утворення комплексу в досліджуваному зразку щодо контрольного зразка (або щодо утворення комплексу в іншому досліджуваному зразку, узятому в більш ранній момент часу) указує на присутність TNF-α у зразку. Як інший приклад спосіб можна використовувати для виявлення наявності TNF-α людини in vivo (наприклад, візуалізації in vivo в індивідуума). Спосіб можна використовувати для діагностики захворювання або порушення, наприклад, асоційованого з TNF-α порушення. Спосіб включає: (і) уведення зв'язувального TNF-α білка або його частини, що зв'язує TNF-α, як описано в даному описі, досліджуваному індивідууму або контрольному індивідууму в умовах, що забезпечують зв'язування зв'язувального білка або його частини, що зв'язує TNF-α, з TNF-α; і (ii) виявлення утворення комплексу між зв'язувальним білком або його частиною і TNF-α, де статистично значима зміна утворення комплексу в досліджуваного індивідуума щодо контрольного індивідуума або щодо утворення комплексу в досліджуваного індивідуума в більш ранній момент часу вказує на присутність TNF-α. Способи виявлення TNF-α у зразку (наприклад, біологічному зразку) включають контактування зразка з білком, що зв'язує TNF-α (або його частиною, що зв'язує TNF-α), описаним у даному описі, і виявлення або зв'язувального білка (або його зв'язувальної частини), зв'язаного з TNF-α, або незв'язаного зв'язувального білка (або його незв'язаної зв'язувальної частини), тим самим, виявляючи TNF-α у зразку. Зв'язувальний білок (або його частина) прямо або опосередковано мітять агентом, що піддається виявленню, для полегшення виявлення зв'язаного або незв'язаного зв'язувального білка (або його частини). Такі агенти, що піддаються виявленню, відомі в даній галузі і, як необмежуючий приклад, включають різні ферменти, простетичні групи, флуоресцентні матеріали, люмінесцентні матеріали і радіоактивні матеріали. Приклади придатних ферментів включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, βгалактозидазу або ацетилхолінестеразу. Приклади придатних комплексів простетичних груп включають стрептавідин/біотин і авідин/біотин. Приклади придатних флуоресцентних матеріалів включають умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, дансилхлорид або фікоеритрин. Приклад люмінесцентного матеріалу включає 3 14 35 90 99 111 люмінол. Приклади прийнятного радіоактивного матеріалу включають H, C, S, Y, Tc, In, 125 131 177 166 153 I, I, Lu, Ho або Sm. Альтернативно міченню білка, що зв'язує TNF-α людини, можна аналізувати в зразку, наприклад, біологічної рідини, за допомогою конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів рекомбінантного TNF-α людини (rh), мічених агентом, що піддається виявленню, і неміченого зв'язувального TNF-α. У цьому аналізі біологічний зразок, мічені стандарти rhTNF-α і білок, що зв'язує TNF-α, поєднують і визначають кількість міченого стандарту rhTNF-α, зв'язаного з неміченим зв'язувальним білком. Кількість TNF-α людини в зразку зворотно пропорційно кількості міченого стандарту rhTNF-α, зв'язаного зі зв'язувальним білком проти TNF-α. Аналогічно, TNF-α людини також можна аналізувати в зразку за допомогою конкурентного імуноаналізу з використанням стандартів rhTNF-α, мічених агентом, що піддається виявленню, і неміченого зв'язувального білка проти TNF-α людини. В одному варіанті здійснення антитіла й антиген-зв'язувальні частини здатні нейтралізовувати активність TNF-α людини як in vitro, так і in vivo. Таким чином, такі зв'язувальні 22 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 білки можна використовувати для інгібування активності TNF-α, наприклад, у клітинній культурі, що містить hTNF-α, у людей або в інших ссавців, що мають TNF-α, з якими антитіло перехресно реагує. Один варіант здійснення стосується способу інгібування активності hTNF-α, що включає контактування hTNF-α з антитілом або його антиген-зв'язувальною частиною, так щоб інгібувалась активність hTNF-α. Наприклад, у клітинній культурі, що містить або приблизно містить hTNF-α, антитіло або його антиген-зв'язувальну частину можна додавати в культуральне середовище для інгібування активності hTNF-α у культурі. Інший варіант здійснення стосується способу зниження активності hTNF-α в індивідуума, переважно в індивідуума, що страждає на захворювання або порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою. Передбачено способи зниження активності TNF-α в індивідуума, що страждає на таке захворювання або порушення, що включають введення індивідууму антитіла або його антиген-зв'язувальної частини, так щоб активність TNF-α в індивідуума знижувалася. В іншому варіанті здійснення TNF-α являє собою TNF-α людини й індивідуумом є людина. Альтернативно, індивідуумом може бути ссавець, експресуючий TNF-α, з яким антитіло здатне зв'язуватися. Більше того, індивідуумом може бути ссавець, якому введений TNF-α (наприклад, за допомогою введення TNF-α або за допомогою експресії трансгена TNF-α). Зв'язувальний білок можна вводити людині для терапевтичних цілей. Більше того, зв'язувальний білок можна вводити ссавцю, що не є людиною, у якого експресується TNF-α, з яким зв'язувальний білок здатний зв'язуватися, для ветеринарних цілей або як модель захворювань людини на тварин. Відносно останнього, такі моделі на тваринах можуть бути придатні для оцінки терапевтичної ефективності антитіл (наприклад, тестування дозувань і часу введення). Термін "порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою", включає захворювання й інші порушення, при яких, як показано, наявність TNF-α в індивідуума, що страждає на порушення, що є або вважається відповідальним за патофізіологію або порушення являє собою фактор, що приводить до погіршення стану при порушенні. Таким чином, порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою, являє собою порушення, при якому очікується, що зниження активності TNF-α пом'якшить деякі або всі симптоми прогресування і/або порушення. Про такі порушення може свідчити, наприклад, підвищення концентрації TNF-α у біологічній рідині індивідуума, що страждає на порушення (наприклад, підвищення концентрації TNF-α у сироватці, плазмі, синовіальній рідині і т. д. індивідуума), яких можна виявляти, наприклад, з використанням зв'язувального білка проти TNF-α, як описано в даному описі. Необмежуючі приклади порушень, які можна лікувати зв'язувальними білками, включають порушення, розглянуті в представленому нижче розділі, що стосується фармацевтичних композицій зв'язувальних білків. D. Фармацевтичні композиції Передбачаються фармацевтичні композиції, що містять зв'язувальний білок, наприклад, антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, і фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції, що містять антитіла, призначені для застосування, але не обмежуючи цим, у діагностиці, виявленні або моніторингу, у профілактиці, інгібуванні, лікуванні, керуванні перебігом або зм'якшенні або порушенні одного або декількох його симптомів, і/або в дослідженнях. У конкретному варіанті здійснення композиція містить один або декілька зв'язувальних білків. В іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція містить один або декілька зв'язувальних білків і один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів, відмінних від антитіл, для лікування порушення, при якому активність TNF-α є шкідливою. В іншому варіанті здійснення профілактичні або терапевтичні засоби являють собою засоби, що відомі як прийнятні або які раніше використовували або в даний час використовують для профілактики, лікування, керування перебігом або пом'якшення або порушення одного або декількох його симптомів. Відповідно до цих варіантів здійснення композиція може додатково містити носій, розріджувач або ексципієнт. Зв'язувальні білки можна включати у фармацевтичні композиції, прийнятні для введення індивідууму. Як правило, фармацевтична композиція містить зв'язувальний білок, наприклад, антитіло або його антиген-зв'язувальну частину, і фармацевтично прийнятний носій. Термін "фармацевтично прийнятний носій" включає будь-які і всі розчинники, диспергуючі середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні і уповільнюючі усмоктування засоби і т. п., що є фізіологічно сумісними. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають одне або декілька з води, фізіологічного розчину, фосфатно-сольового буфера, декстрози, гліцерину, етанолу і т. п., а також їх комбінації. Може бути переважним додавання ізотонічних засобів, наприклад, цукрів, поліспиртів, таких як маніт, сорбіт або хлорид натрію. Крім того, фармацевтично прийнятні носії можуть містити невеликі кількості допоміжних речовин, таких як змочувальні засоби або емульгатори, консерванти або буфери, що 23 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підвищують термін збереження або ефективність антитіла або його антиген-зв'язувальної частини. Відомі різні системи для доставки і їх можна використовувати для доставки одного або декількох зв'язувальних білків або комбінації одного або декількох антитіл і профілактичного засобу або терапевтичного засобу, прийнятного для профілактики, керування перебігом, лікування або пом'якшення або порушення одного або декількох його симптомів, наприклад, інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати антитіло або фрагмент антитіла, опосередковуваний рецептором ендоцитоз (див., наприклад, Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструювання нуклеїнової кислоти як частини ретровірусного або іншого вектора, і т. д. Способи введення профілактичного або терапевтичного засобу включають, але не обмежуються ними, парентеральне введення (наприклад, внутрішньошкірне, внутрішньом'язове, внутрішньоочеревинне, внутрішньовенне і підшкірне), епідуральне введення, внутрішньопухлинне введення і введення через слизову оболонку, патенти США № 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; і 4880078; і публікації PCT № WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 і WO 99/66903. В одному з варіантів здійснення зв'язувальний білок, комбіновану терапію або композицію вводять з використанням технології для легеневої доставки лікарського засобу Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusetts). Профілактичні або терапевтичні засоби можна вводити будь-яким зручним способом, наприклад, інфузією або болюсною ін'єкцією, за допомогою усмоктування через епітеліальні або шкірно-слизові вистилки (наприклад, слизові оболонки порожнини рота, прямої кишки, кишечнику і т. д.) і їх можна вводити разом з іншими біологічно активними засобами. Уведення може бути системним або місцевим. У конкретному варіанті здійснення може бути бажаним уведення профілактичних або терапевтичних засобів локально в область, що потребує лікування; наприклад, шляхом локальної інфузії, або ін'єкції за допомогою імплантату. Імплантат може являти собою пористий або непористий матеріал, що включає мембрани і матриці, такі як силастикові мембрани, полімери, фіброзні матриці (наприклад, Tissuel®) або колагенові матриці. В одному з варіантів здійснення ефективну кількість одного або декількох антитіл-антагоністів уводять локально в уражену область індивідууму для профілактики, лікування, керування перебігом і/або пом'якшення або порушення його симптому. В іншому варіанті здійснення ефективна кількість одного або декількох антитіл уводять локально в уражену область індивідуума в комбінації з ефективною кількістю одного або декількох лікарських засобів (наприклад, одного або декількох профілактичних або терапевтичних засобів), відмінних від зв'язувального білка для профілактики, лікування, керування перебігом і/або зм'якшення або порушення одного або декількох його симптомів. В іншому варіанті здійснення профілактичний або терапевтичний засіб можна доставляти в системі для контрольованого вивільнення або уповільненого вивільнення. В одному з варіантів здійснення для досягнення контрольованого або уповільненого вивільнення можна використовувати насос (див. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Sefton (1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507-516; Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574-579). В іншому варіанті здійснення для досягнення контрольованого або уповільненого вивільнення лікарських засобів можна використовувати полімерні матеріали (див., наприклад, Medical Applications of Controlled Release, (Langer and Wise, eds.) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (Smolen and Ball, eds.) (Wiley, New York, 1984); Langer and Peppas (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys. C23:61-126; також див. Levy et al. (1985) Science 228:190-192; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105-112); патенти США № 5679377; 5916597; 5912015; 5989463 і 5128326; і публікації PCT № WO 99/15154 і WO 99/20253. Приклади полімерів, використовуваних для складів з уповільненим вивільненням, включають, але не обмежуються ними, полі(2-гідроксіетилметакрилат), поліметилметакрилат, поліакрилову кислоту, співполімер етилену і вінілацетату, поліметакрилову кислоту, полігліколіди (PLG), поліангідриди, полі(N-вінілпіролдон), полівініловий спирт, поліакриламід, поліетиленгліколь, полілактиди (PLA), співполімер лактидів і гліколідів (PLGA) і складні поліортоефіри. В одному варіанті здійснення полімер, використовуваний у складі з уповільненим вивільненням, є інертним, що не містять домішок, які вимиваються, стабільним при збереженні, стерильним і біодеградованим. В іншому варіанті здійснення поблизу профілактичної або терапевтичної мішені можна поміщати систему з контрольованим або уповільненим вивільненням, що, таким чином, робить необхідною тільки частину системної дози (див., наприклад, Goodson, J.M., 24 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications і Evaluation, (Langer and Wise, eds.)(CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), pp. 115-138). Системи з контрольованим вивільненням розглянуті в огляді Langer (1990) Science 249: 1527-1533. Для одержання складів з уповільненим вивільненням, що включають один або декілька лікарських засобів, можна використовувати будь-який спосіб, відомий фахівцю в даній галузі. Див., наприклад, патент США № 4526938; і публікації PCT № WO 91/05548 і WO 96/20698; і Ning et al. (1996) Radiother. Oncol. 39: 179-189; Song et al. (1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50:372-377; Cleek et al. (1997) Proceed Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; і Lam et al. (1997) Proceed. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. У конкретному варіанті здійснення, де композиція являє собою нуклеїнову кислоту, що кодує профілактичний або терапевтичний засіб, нуклеїнову кислоту можна вводити in vivo для забезпечення експресії кодованого їй профілактичного або терапевтичного засобу, за допомогою конструювання її як частини відповідного експресуюючого нуклеїнову кислоту вектора і введення його так, щоб він став внутрішньоклітинним, наприклад, з використанням ретровірусного вектора (див. патент США № 4980286), або за допомогою прямої ін'єкції, або з використанням бомбардування мікрочастинками (наприклад, генна гармата; Biolistic®, Dupont), або покриття ліпідами або рецепторами клітинної поверхні або трансфікуючими агентами, або введення його у формі, зв'язаної з гомеобоксподібним пептидом, що, як відомо, проникає в ядро (див., наприклад, Joliot et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868). Альтернативно, нуклеїнову кислоту для експресії можна вводити усередину клітини і вбудовувати за допомогою гомологічної рекомбінації в ДНК клітини-хазяїна. Фармацевтичну композицію виготовляють так, щоб вона була сумісна з передбачуваним шляхом уведення. Приклади способів уведення включають, але не обмежуються ними, парентеральне, наприклад, внутрішньовенне, внутрішньошкірне, підшкірне, пероральне, інтраназальне (наприклад, інгаляційне), трансдермальне (наприклад, місцеве), трансмукозальне і ректальне введення. У конкретному варіанті здійснення композицію виготовляють відповідно до загальноприйнятих способів як фармацевтичну композицію, адаптовану для внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, перорального, інтраназального або місцевого введення людині. Як правило, композиції для внутрішньовенного введення являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері. Коли необхідно, композиція може включати солюбілізуючу речовину і місцевий анестетик, такий як лідокаїн, для зм'якшення болю в області ін'єкції. Якщо композиції призначені для місцевого введення, композиції можна виготовляти у формі мазі, крему, черезшкірного пластиру, лосьйону, гелю, шампуню, спрею, аерозолю, розчину, емульсії або іншої форми, добре відомої фахівцю в даній галузі. Див., наприклад, Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., (Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1995). Для не розпилювальних місцевих дозованих форм, як правило, використовують форми від в'язких до напівтвердих або твердих, що містять носій або один або декілька ексципієнтів, сумісних з місцевим застосуванням і мають динамічну в'язкість, що переважно перевищує в'язкість води. Інші прийнятні склади включають, але не обмежуються ними, суспензії, порошки, лініменти, бальзами і т. п. В одному варіанті здійснення такі склади є стерилізованими або змішаними з допоміжними засобами (наприклад, консервантами, стабілізаторами, змочувальними засобами, буферами або солями) для впливу на різні властивості, наприклад, такі як осмотичний тиск. Інші прийнятні місцеві дозовані форми включають розпилювальні аерозольні препарати, де активний інгредієнт, наприклад, у комбінації з твердим або рідким інертним носієм, упакований у суміші з леткою речовиною, що знаходиться під тиском, (наприклад, газоподібним пропелентом, таким як FREON®) або в здавлюваному бутилі. Також, якщо бажано, у фармацевтичні композиції і дозовані форми можна додавати зволожувачі або змочувальні речовини. Приклади таких додаткових інгредієнтів добре відомі в даній галузі. Якщо спосіб включає інтраназальне введення композиції, композицію можна виготовляти у формі аерозолю, спрею, рідини для розпилення або у формі крапель. Зокрема, профілактичні або терапевтичні засоби можна зручним чином доставляти у формі аерозольного спрею з пакетів, що знаходяться під тиском, або пристрою для розпилення, з використанням придатного пропеленту (наприклад, дихлордифторметану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану, діоксиду або вуглецю іншого придатного газу). У випадку аерозолю, що знаходиться під тиском, дозовану одиницю можна визначати за допомогою надання клапана для доставки дозованої кількості. Можна виготовляти капсули і касети (що складаються, наприклад, з желатину) для застосування в інгаляторі або інсуфляторі, що містять порошкову суміш сполуки і придатної порошкової основи, такої як лактоза або крохмаль. 25 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо спосіб включає пероральне введення, пероральні композиції можна виготовляти у формі таблеток, капсул, крохмальних капсул, желатинових капсул, розчинів, суспензій і т. п. або Таблетки капсули можна одержувати загальноприйнятими способами з використанням фармацевтично прийнятних ексципієнтів, таких як зв'язувальні речовини (наприклад, переджелатинізований кукурудзяний крохмаль, полівінілпіролідон або гідроксипропілметилцелюлоза); наповнювачі (наприклад, лактоза, мікрокристалічна целюлоза або гідрофосфат кальцію); змащувальні речовини (наприклад, стеарат магнію, тальк або діоксид кремнію); дезінтегруючі речовини (наприклад, картопляний крохмаль або натрію крахмалгліколят); або змочувальні речовини (наприклад, лаурилсульфат натрію). Таблетки можна покривати способами, добре відомими в даній галузі. Рідкі препарати для перорального введення можуть мати форму, але не обмежуючи ними, розчинів, сиропів або суспензій, або вони можуть бути представлені як сухий продукт для розчинення водою або іншим придатним носієм перед застосуванням. Такі рідкі препарати можна одержувати загальноприйнятими способами з використанням фармацевтично прийнятних добавок, таких як суспендуючі речовини (наприклад, сироп сорбіту, похідні целюлози, гідрогенізовані або харчові жири); емульгатори (наприклад, лецитин або гуміарабік); неводні носії (наприклад, мигдальна олія, масляні складні ефіри, етиловий спирт або фракціоновані рослинні олії); і консерванти (наприклад, метил- або пропіл-п-гідроксибензоат або сорбінова кислота). Також препарати можуть містити буферні солі, смакові добавки, барвники і підсолоджувачі, у відповідних випадках. Препарати для перорального введення можуть бути придатним чином виготовлені для повільного вивільнення, контрольованого вивільнення або безперервного вивільнення профілактичного або терапевтичного засобу(засобів). Спосіб може включати легеневе введення, наприклад, з використанням інгалятора або пристрою для розпилення, композиції, виготовленої із засобом, що утворює аерозоль. Див., наприклад, патенти США № 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; і 4880078; і публікації PCT № WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 і WO 99/66903. У конкретному варіанті здійснення антитіло, комбіноване лікарський засіб і/або композицію вводять з використанням технології легеневої доставки лікарського засобу Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusetts). Спосіб може включати введення композиції, виготовленої для парентерального введення, за допомогою ін'єкції (наприклад, за допомогою болюсної ін'єкції або безперервної інфузії). Склади для ін'єкції можуть бути надані в одиничній дозованій формі (наприклад, у ампулах або контейнерах для багаторазового дозування) з додаванням консерванту. Композиції можуть мати такі форми, як форми суспензій, розчинів або емульсій у масляних або водних носіях, і вони можуть містити засоби для виготовлення складу, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі засоби. Альтернативно, активний інгредієнт може знаходитися у формі порошку для розчинення придатним носієм (наприклад, стерильною водою, що не містить пірогенів) перед застосуванням. Крім того, способи можуть включати введення композицій, виготовлених як депо-препарати. Такі склади тривалої дії можна вводити за допомогою імплантації (наприклад, підшкірної або внутрішньом'язової) або за допомогою внутрішньом'язової ін'єкції. Таким чином, наприклад, композиції можна виготовляти з використанням придатних полімерних або гідрофобних матеріалів (наприклад, таких як емульсія в прийнятній олії) або іонообмінних смол, або як малорозчинних похідних (наприклад, малорозчинної солі). Способи включають уведення композицій, виготовлених як нейтральна форма або форма солі. Фармацевтично прийнятні солі включають солі, утворені з аніонами, такими як аніони хлористоводневої, фосфорної, оцтової, щавлевої, виннокам'яної кислот і т. д., і солі, утворені з катіонами, такими як катіони натрію, калію, амонію, кальцію, гідроксидів заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т. д. Як правило, інгредієнти композицій надають або окремо, або в суміші один з одним в одиничній дозованій формі, наприклад, як сухий ліофілізований порошок або концентрат, що не містить води, в герметично закритому контейнері, такому як ампула або саше, із вказуванням кількості активної речовини. Коли способом уведення є інфузія, композицію можна дозувати за допомогою сулії для інфузії, що містить стерильну воду для фармацевтичного застосування або фізіологічний розчин. Коли способом уведення є ін'єкція, може бути надана ампула зі стерильною водою для ін'єкції або фізіологічним розчином, так щоб інгредієнти можна було змішати перед уведенням. В одному варіанті здійснення один або декілька профілактичних або терапевтичних засобів, або фармацевтичних композицій за винаходом упаковані в герметично закритий контейнер, такий як ампула або саше, із вказуванням кількості активної речовини. В одному з варіантів 26 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій надають як сухий стерилізований ліофілізований порошок або концентрат, що не містить води, в герметично закритому контейнері, і їх можна відновлювати (наприклад, водою або фізіологічним розчином) до концентрації, придатної для введення індивідууму. В одному варіанті здійснення один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій надають як сухий стерильний ліофілізований порошок в герметично закритому контейнері в одиничному дозуванні, що складає щонайменше приблизно 5 мг, щонайменше приблизно 10 мг, щонайменше приблизно 15 мг, щонайменше приблизно 25 мг, щонайменше приблизно 35 мг, щонайменше приблизно 45 мг, щонайменше приблизно 50 мг, щонайменше приблизно 75 мг або щонайменше приблизно 100 мг. Ліофілізовані профілактичні або терапевтичні засоби або фармацевтичні композиції варто зберігати при температурі від 2 °C до 8 °C у їхньому вихідному контейнері, і профілактичні або терапевтичні засоби, або фармацевтичні композиції повинні бути введені в межах приблизно 1 тижня, переважно в межах приблизно 5 діб, у межах приблизно 72 годин, у межах приблизно 48 годин, у межах приблизно 24 годин, у межах приблизно 12 годин, у межах приблизно 6 годин, у межах приблизно 5 годин, у межах приблизно 3 годин або у межах приблизно 1 години після відновлення. В альтернативному варіанті здійснення один або декілька з профілактичних або терапевтичних засобів або фармацевтичних композицій надають у рідкій формі в герметично закритому контейнері, на якому вказана кількість і концентрація речовини. В одному варіанті здійснення рідку форму композиції, що вводиться, надають у герметично закритому контейнері в концентрації щонайменше приблизно 0,25 мг/мл, щонайменше приблизно 0,5 мг/мл, щонайменше приблизно 1 мг/мл, щонайменше приблизно 2,5 мг/мл, щонайменше приблизно 5 мг/мл, щонайменше приблизно 8 мг/мл, щонайменше приблизно 10 мг/мл, щонайменше приблизно 15 мг/кг, щонайменше приблизно 25 мг/мл, щонайменше приблизно 50 мг/мл, щонайменше приблизно 75 мг/мл або щонайменше приблизно 100 мг/мл. Рідку форму варто зберігати при температурі від 2 °C до 8 °C у її вихідному контейнері. Зв'язувальні білки можуть бути включені у фармацевтичну композицію, придатну для парентерального введення. В одному аспекті зв'язувальні білки одержують як ін'єктований розчин, що містить від приблизно 0,1 до приблизно 250 мг/мл антитіла. Ін'єктований розчин може складатися з рідкої, або з ліофілізованої або дозованої форми в безбарвному або бурштиновому флаконі, ампулі або попередньо заповненому шприці. Буфер може являти собою L-гістидин (від приблизно 1 до приблизно 50 мм), оптимально від приблизно 5 до приблизно 10 мм, при pН від 5,0 до 7,0 (оптимально при приблизно pН 6,0). Інші придатні буфери включають, але не обмежуються ними, сукцинат натрію, цитрат натрію, фосфат натрію або фосфат калію. Для модифікації токсичності розчину можна використовувати хлорид натрію в концентрації від приблизно 0 до приблизно 300 мм (наприклад, приблизно 150 мм для рідкої дозованої форми). Для ліофілізованої дозованої форми можна додавати кріопротектор, головним чином, від приблизно 0 до приблизно 10 % сахарозу (наприклад, від приблизно 0,5 до приблизно 1,0 %). Інші придатні кріопротектори включають трегалозу і лактозу. Для ліофілізованої дозованої форми можна додавати наповнювачі, головним чином, від приблизно 1 до приблизно 10 % маніт (наприклад, від приблизно 2 до приблизно 4 %). Як у рідких, так і в ліофілізованих дозованих формах можна використовувати стабілізатори, головним чином, від приблизно 1 до приблизно 50 мм L-метіонін (оптимально від приблизно 5 до приблизно 10 мм). Інші придатні наповнювачі включають гліцин, аргінін, і можна додавати від приблизно 0 до приблизно 0,05 % полісорбат-80 (оптимально від приблизно 0,005 до приблизно 0,01 %). Додаткові поверхневоактивні речовини включають, але не обмежуються ними, полісорбат 20 і поверхнево-активні речовини BRIJ. Композиції можуть мати різні форми. Вони включають, наприклад, рідкі, напівтверді і тверді дозовані форми, такі як рідкі розчини (наприклад, ін'єктовані і інфузовані розчини), дисперсії або суспензії, таблетки, пігулки, порошки, ліпосоми і супозиторії. Форма залежить від передбачуваного шляху введення і терапевтичного застосування. Типові композиції мають форму ін'єктованих або інфузованих розчинів, таких як композиції, подібні до композицій, використовуваних для пасивної імунізації людини іншими антитілами. Переважним способом уведення є парентеральний (наприклад, внутрішньовенний, підшкірний, внутрішньоочеревинний, внутрішньом'язовий). В одному варіанті здійснення антитіло вводять за допомогою внутрішньовенної інфузії або ін'єкції. В іншому варіанті здійснення антитіло вводять за допомогою внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції. Терапевтичні композиції, як правило, повинні бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і збереження. Композицію можна виготовляти як розчин, мікроемульсії, дисперсії, 27 UA 108912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ліпосом або іншої упорядкованої структури, придатної для високої концентрації лікарського засобу. Стерильні ін'єктовані розчини можна одержувати включенням активної сполуки (наприклад, антитіла або його антиген-зв'язувальної частини) у необхідній кількості у відповідний розчинник з одним або з комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, при необхідності, з наступною стерилізацією фільтрацією. Як правило, дисперсії одержують додаванням активної сполуки в стерильний носій, що містить основне дисперсійне середовище й інші необхідні інгредієнти з тих, що перераховано вище. У випадку стерильних ліофілізованих порошків для готування стерильних ін'єктованих розчинів, ілюстративними способами виготовлення є вакуумне сушіння і розпилювальне сушіння, що дають порошок активного інгредієнта з будь-якими додатковими бажаними інгредієнтами з їхнього попередньо стерилізованого фільтрацією розчину. Належну текучість розчину можна підтримувати, наприклад, з використанням покриття, такого як лецитин, підтриманням необхідного розміру частинок у випадку дисперсії, і з використанням поверхнево-активних речовин. Пролонгованого усмоктування ін'єктованих композицій можна досягати включенням у композицію засобу, що сповільнює усмоктування, наприклад, солей моностеарату і желатину. Антитіла або їх антиген-зв'язувальні частини можна вводити множиною способів, відомих у даній галузі, хоча для багатьох терапевтичних застосувань ілюстративним шляхом/способом уведення є підшкірна ін'єкція, внутрішньовенна ін'єкція або інфузія. Як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі, шлях і/або спосіб уведення може варіювати, залежно від бажаних результатів. У визначених варіантах здійснення активна сполука можна виготовляти з носієм, що запобігає швидке вивільнення сполуки, таким як склад з контрольованим вивільненням, що включає імплантати, черезшкірні пластири і мікроінкапсульовані системи для доставки. Можна використовувати біодеградовані біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколева кислота, колаген, складні поліортоефіри і полімолочна кислота. Для одержання таких сполук запатентовано або, головним чином, відома фахівцям у даній галузі множина способів. Див., наприклад, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. У визначених варіантах здійснення антитіло або його антиген-зв'язувальну частину можна вводити перорально, наприклад, з інертним розріджувачем або засвоюваним харчовим носієм. Сполуку (і інші інгредієнти, якщо бажано) також можна укладати в желатинову капсулу з твердою або м'якою оболонкою, пресувати в таблетки або включати безпосередньо в раціон індивідуума. Для перорального терапевтичного введення сполуки можна включати з ексципієнтами і використовувати у формі проковтуваних таблеток, таблеток для трансбукального введення, коржів, капсул, еліксирів, суспензій, сиропів, пластинок і т. п. Для введення сполуки способом, відмінним від парентерального введення, може бути необхідним покриття сполуки матеріалом для запобігання його інактивації, або введення сполуки разом з ним. Також у композиції можна включати додаткові активні сполуки. У визначених варіантах здійснення зв'язувальний білок (наприклад, антитіло або його антиген-зв'язувальну частину) спільно складають і/або спільно вводять з одним або декількома додатковими терапевтичними засобами, що придатні для лікування порушень, при яких активність TNF-α є шкідливою. Наприклад, антитіло проти hTNF-α або його антиген-зв'язувальну частину можна спільно включати до складу і/або спільно вводити з одним або декількома додатковими антитілами, що зв'язують інші мішені (наприклад, антитіла, що зв'язують інші цитокіни або які зв'язують молекули клітинної поверхні). Більше того, одне або декілька антитіл можна використовувати в комбінації з двома або більше із вказаних вище лікарських засобів. Такі комбіновані лікарські засоби можна переважно використовувати з нижчими дозуваннями лікарських засобів, що вводяться, таким чином, уникаючи можливої токсичності або ускладнень, асоційованих з різними способами монотерапії. У визначених варіантах здійснення антитіло проти TNF-α або його фрагмент зв'язані з носієм, що подовжує час напівжиття, відомим у даній галузі. Такі носії включають, але не обмежуються ними, Fc-домен, поліетиленгліколь і декстран. Такі носії описані, наприклад, у патенті США № 6660843 і опублікованій публікації PCT № WO 99/25044. У конкретному варіанті здійснення молекули нуклеїнових кислот, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують один або декілька поліпептидів зв'язувального білка або інший профілактичний або терапевтичний засіб, уводять для лікування, профілактики, керування перебігом або зм'якшення або порушення одного або декількох його симптомів за допомогою генної терапії. Генна терапія стосується терапії, проведеної шляхом введення індивідууму експресованої або нуклеїнової кислоти, що експресується. У цьому варіанті здійснення нуклеїнові кислоти продукують кодований ними зв'язувальний поліпептид(-и) зв'язувального 28