Трансгенна рослина, яка має підвищену резистентність до патогену рослин

Реферат: Винахід належить до трансгенної рослини, що експресуює полінуклеотид для посилення резистентності рослин до патогенів Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis або Puccinia recondita f. sp. tritici. UA 106729 C2 (12) UA 106729 C2 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід належить до полінуклеотидів, які кодують білки резистентності дорослих рослин стосовно патогенів. Також забезпечуються трансгенні рослини, які експресують ці полінуклеотиди для підвищення резистентності рослин до патогенів. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Численні гени, що додають резистентності до патогенів, були ідентифіковані і використані при селекції рослин. Однак обумовлена єдиним геном резистентність до патогенну в рослин часто стає неефективною внаслідок появи нових вірулентних рас збудника хвороби. На відміну від цього вважають, що стійка резистентність до хвороби в рослин, як правило, контролюється множиною генів. Локус полігенної ознаки в пшениці (Triticum aestivum), Lr34, забезпечує стійку резистентність дорослих рослин до біотрофних грибів, що викликають хвороби: листяну іржу, жовту іржу злаків, стеблову іржу пшениці і справжню борошнисту росу (Dyck, 1977 і 1987; German and Kolmer, 1992; Bossolini et al. 2006; Spielmeyer et al. 2008). І це незважаючи на обмеження, яке полягає в тому, що він не ефективний на стадії сходів у нормальних польових умовах. Сорти з локусом резистентності Lr34, такі як Frontana, мали ефективну стійку резистентність до гриба Puccinia triticina Eriks, що викликає листяну іржу (Dyck et al., 1966; Singh and Rajaram, 1994). Дотепер не були виявлені ізоляти PН. triticina з повним ступенем здатності заражати рослини, що мають Lr34 (Kolmer et al., 2003). Резистентність на основі Lr34 залишалася генетично невіддільною від Yr18, що додає резистентності до жовтої іржі злаків (PН. striiformis) (Singh, 1992a; McIntosh, 1992). Була підтверджена косегрегація Lr34/Yr18 з іншими ознаками, такими як некроз верхівки листка (Ltn1), справжня борошниста роса (недавно названа Pm38), стійкість до вірусу (Bdv1), що викликає жовту карликовість ячменю, і гельмінтоспоріозу коріння злакових (Bipolaris sorokiniana) (Singh, 1992a, b; McIntosh, 1992; Joshi et al., 2004; Spielmeyer et al., 2005; Liang et al., 2006). Ці ознаки резистентності до множини патогенів зробили локус Lr34/Yr18 однією із найбільш корисних ділянок генів для селекції резистентності до хвороб у пшениці. Були виділені і клоновані нечисленні гени резистентності до іржастих грибів із пшениці (Feuillet et al., 2003; Huang et al., 2003; Cloutier et al., 2007) і інших хлібних злаків (Collins et al., 1999; Brueggeman et al., 2002) і, головним чином, класу основних генів резистентності (R) нуклеотидзв'язувальних багатих лейцином повторів (NB-LRR). Єдиним відомим виключенням є ген резистентності до іржастих грибів Rpg1 у ячменю, що кодує протеїнкіназу. Ці гени кодують обумовлену взаємовідношенням "ген-на-ген" резистентність до єдиних патогенів і звичайно спричиняють реакції гіперчутливості після інфікування в тканинах рослин. Навпаки, Lr34 додає резистентності широкого спектра до облігатних біотрофних патогенів, що включає гриби з Ascomycetes і Basidiomycetes. Rubiales і Niks (1995) представили дані про те, що є зв'язок Lr34 зі зменшенням росту міжклітинних гіфів, але не з реакцією гіперчутливості або утворенням сосочків. Отже, залишається невідомою молекулярна основа типу полігенної, не специфічної для раси резистентності до патогенів у дорослих рослин або часткової резистентності, кодованої генетичними системами, такими як, наприклад, Lr34. КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Авторами даного винаходу ідентифіковані гени і поліпептиди, що додають дорослим рослинам підвищеної резистентності до патогенну рослин. Відповідно, даним винаходом забезпечується трансгенна рослина, у геном які був інтегрований екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин, і/або екзогенний полінуклеотид, що підвищує транскрипцію ендогенного гена, що кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин. У переважному варіанті здійснення рослина характеризується прискореним старінням верхівок криючого листя у порівнянні з ізогенною рослиною, у якій відсутній екзогенний полінуклеотид. В іншому переважному варіанті здійснення рослина має підвищену резистентність до патогенну рослин у порівнянні з ізогенною рослиною, у якій відсутній екзогенний полінуклеотид. У ще іншому переважному варіанті здійснення поліпептид включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, що ідентична SEQ ID NO:1, принаймні, на 40 %, більш переважно, принаймні, на 80 %, більш переважно, принаймні, на 90 % і ще більш переважно, принаймні, на 95 %. Більш переважно, поліпептид включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1. 1 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В іншому переважному варіанті здійснення полінуклеотид включає нуклеотиди, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, послідовність, яка ідентична SEQ ID NO:2, принаймні, на 40 %, і/або послідовність, яка гібридизується з SEQ ID NO:2. В іншому варіанті здійснення екзогенним полінуклеотидом, який підвищує транскрипцію ендогенного гена, що кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин, є генетичний елемент, такий як промотор, що підсилює функціонування промотору ендогенного гена. Альтернативно, екзогенний полінуклеотид, який підвищує транскрипцію ендогенного гена, що кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин, кодує транскрипційний фактор, який підсилює експресію ендогенного гена. Переважно, рослиною є хлібний злак. Приклади трансгенних хлібних злаків за даним винаходом включають, але не обмежуються ними, пшеницю, ячмінь, кукурудзу, рис, овес і тритикале. В особливо переважному варіанті здійснення рослиною є пшениця. Приклади патогенів рослин включають, але не обмежуються ними, віруси, бактерії і гриби. У переважному варіанті здійснення патогеном є біотрофний гриб. Приклади біотрофних грибів включають, але не обмежуються ними, Fusarium graminearum (який викликає фузаріоз колосів), Erysiphe graminis f. sp. tritici (який викликає справжню борошнисту росу), Bipolaris sorokiniana (який викликає гельмінтоспоріоз коріння злакових), Puccinia graminis f. sp. tritici (який викликає стеблову іржу пшениці), Puccinia striiformis (який викликає жовту іржу злаків) і Puccinia recondite f. sp. tritici (який викликає листяну іржу). У варіанті здійснення патогеном є вірус, що викликає жовту карликовість ячменю (BYDV). У варіанті здійснення рослина включає один або більше додаткових екзогенних полінуклеотидів, що кодують поліпептид резистентності до патогенну рослин. Приклади таких генів включають, але не обмежуються ними, Lr1, Lr3, Lr2a, Lr3ka, Lr11, Lr13, Lr16, Lr17, Lr18, Lr21 і LrВ. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб ідентифікації полінуклеотиду, який кодує поліпептид резистентності до патогенну рослин, що включає: (і) одержання функціонально зв'язаного з промотором полінуклеотиду, який кодує поліпептид, що включає амінокислоти, які мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка ідентична SEQ ID NO:1, принаймні, на 40 %, (ii) уведення полінуклеотиду в рослину, (iii) визначення того, чи змінений рівень резистентності до патогенну рослин щодо такого у ізогенної рослини, у якій відсутній полінуклеотид, і (iv) необов'язково, відбір полінуклеотиду, який при його експресії підсилює резистентність до патогенну рослин. Переважно, полінуклеотид включає нуклеотиди, які мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, послідовність, яка ідентична SEQ ID NO:2, принаймні, на 40 %, і/або послідовність, яка гібридизується з SEQ ID NO:2. Переважно, рослиною є хлібний злак. Переважно, хлібним злаком є пшениця. У переважному варіанті здійснення поліпептидом є поліпептид рослини або його мутантна форма. В іншому варіанті здійснення стадія (ii) додатково включає стійку інтеграцію функціонально зв'язаного з промотором полінуклеотиду в геном рослини. У ще одному аспекті даним винаходом забезпечується по суті очищений і/або рекомбінантний поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин. У переважному варіанті здійснення поліпептид включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, яка ідентична SEQ ID NO:1, принаймні, на 40 %, більш переважно, принаймні, на 80 %, більш переважно, принаймні, на 90 % і ще більш переважно, принаймні, на 95 %. У переважному варіанті здійснення в поліпептиді відсутній залишок фенілаланіну або будьяка амінокислота в положенні, що відповідає номеру амінокислоти 546 у SEQ ID NO:4. В іншому переважному варіанті здійснення поліпептид має амінокислоту, відмінну від залишку тирозину в положенні, що відповідає номеру амінокислоти 634 у SEQ ID NO:4. Більш переважно, поліпептид включає залишок гістидину в положенні, що відповідає номеру амінокислоти 634 у SEQ ID NO:4. Також забезпечується злитий білок, що додатково включає послідовність, принаймні, одного відмінного поліпептиду. Принаймні, одним відмінним поліпептидом може бути, наприклад, 2 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поліпептид, що підвищує стабільність поліпептиду за даним винаходом, або поліпептид, який сприяє очищенню або виявленню злитого білка. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується виділений і/або екзогенний полінуклеотид, що включає нуклеотиди, які мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, послідовність, яка ідентична SEQ ID NO:2, принаймні, на 40 %, послідовність, яка кодує поліпептид за даним винаходом, і/або послідовність, яка гібридизується з SEQ ID NO:2. Переважно, полінуклеотид включає послідовність нуклеотидів, яка гібридизується з SEQ ID NO:2 у жорстких умовах. Переважно, полінуклеотид гібридизується по всій довжині полінуклеотиду, що складається з нуклеотидів, які мають послідовність SEQ ID NO:2. Переважно, полінуклеотид кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується химерний вектор, який включає полінуклеотид за даним винаходом. Переважно, полінуклеотид функціонально зв'язаний із промотором. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується рекомбінантна клітина, що включає екзогенний полінуклеотид за даним винаходом і/або вектор за даним винаходом. Клітиною може бути будь-який тип клітини, такий як, але без обмеження, клітина рослини, бактеріальна клітина, клітина тварини або дріжджова клітина. Переважно, клітиною є клітина рослини. Більш переважно, клітиною рослини є клітина хлібного злаку. Ще більш переважно, клітиною хлібного злаку є клітина пшениці. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання поліпептиду за даним винаходом, що включає експресію в клітині або безклітинній експресійній системі полінуклеотиду за даним винаходом. Переважно, спосіб додатково включає виділення поліпептиду. У ще одному аспекті даним винаходом забезпечується трансгенний організм, що не належить людині, який включає екзогенний полінуклеотид за даним винаходом, вектор за даним винаходом і/або рекомбінантну клітину за даним винаходом. Переважно, трансгенним організмом, що не належить людині, є рослина. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання клітини за даним винаходом, що включає стадію введення полінуклеотиду за даним винаходом або вектора за даним винаходом в клітину. Переважно, клітиною є клітина рослини. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання трансгенної рослини, що включає регенерацію трансгенної рослини з клітини за даним винаходом. Також забезпечується застосування полінуклеотиду за даним винаходом або вектора за даним винаходом для одержання рекомбінантної клітини. Крім того, забезпечується застосування полінуклеотиду за даним винаходом або вектора за даним винаходом для одержання трансгенної рослини. Переважно, трансгенна рослина характеризується прискореним старінням верхівок криючого листя у порівнянні з ізогенною рослиною, у якій відсутній екзогенний полінуклеотид і/або вектор, і/або має підвищену резистентність до патогенну рослини в порівнянні з ізогенною рослиною, у якій відсутній екзогенний полінуклеотид і/або вектор. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується трансгенна рослина або її потомство, отримана з використанням способу за даним винаходом. У додатковому аспекті даним винаходом забезпечується частина рослини за даним винаходом. Приклади таких частин включають, але не обмежуються ними, листя, коріння, стебла і/або насіння. У переважному варіанті здійснення частиною рослини є насіння, що включає екзогенний полінуклеотид, що кодує поліпептид резистентності до патогену дорослих рослин. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання частини рослини, що включає a) вирощування рослини за даним винаходом і b) збирання частини рослини. У ще одному аспекті даним винаходом забезпечується спосіб одержання борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту, одержуваного з насіння, що включає a) одержання насіння за даним винаходом і b) одержання борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується продукт, який одержується з рослини за даним винаходом і/або частини рослини за даним винаходом. 3 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному варіанті здійснення продуктом є харчовий продукт. Приклади включають, але не обмежуються ними, борошно, крохмаль, хліб з тіста на опарі або хліб з тіста, приготовленого безопарним способом, пасту, локшину, зоокорми, страви з зернового продукту для сніданку, закусочні харчові продукти, торти, солод, пиво, кондитерські вироби і харчові продукти, що містять соуси на борошняній основі. В іншому варіанті здійснення продуктом є нехарчовий продукт. Приклади включають, але не обмежуються ними, плівки, покриття, клеї, будівельні матеріали і пакувальні матеріали. У додатковому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб приготування харчового продукту за даним винаходом, що включає змішування або насіння борошна, непросіяного борошна або крохмалю із зазначеного насіння з іншим інгредієнтом. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб приготування солоду, що включає стадію пророщення насіння за даним винаходом. В іншому варіанті здійснення даним винаходом забезпечується композиція, що включає поліпептид за даним винаходом, полінуклеотид за даним винаходом, вектор за даним винаходом і/або рекомбінантну клітину за даним винаходом й один або більше прийнятних носіїв. В іншому аспекті даним винаходом забезпечується по суті очищене антитіло, або його фрагмент, що специфічно зв'язується з поліпептидом за даним винаходом. Також забезпечується спосіб ідентифікації сполуки, що зв'язується з поліпептидом, що включає амінокислоти, які мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, що ідентична SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:4, принаймні, на 40 %, що включає і) приведення поліпептиду в контакт зі сполукою-кандидатом і ii) визначення того, чи зв'язується сполука з поліпептидом. Крім того, забезпечується спосіб ідентифікації сполуки, що переноситься через клітинну мембрану поліпептидом, що включає амінокислоти, які мають послідовність, приведену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, що ідентична SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:4, принаймні, на 40 %, що включає і) приведення поліпептиду, що присутній у клітинній мембрані, у контакт зі сполукоюкандидатом, ii) визначення того, чи переносить поліпептид сполука через клітинну мембрану. Переважно, поліпептид експресується в клітині. Переважно, клітиною є клітина рослини. У варіанті здійснення спосіб додатково включає порівняння зв'язування, і/або перенесення, сполуки з першим поліпептидом, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, з таким із другим поліпептидом, що включає амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:4. У додатковому аспекті даним винаходом забезпечується виділений і/або екзогенний полінуклеотид, що, у випадку його присутності в клітині рослини, знижує експресію, принаймні, одного гена, що гібридизується в жорстких умовах з молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, що ідентична SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:4, принаймні, на 40 %, при цьому зазначена експресія є зниженою щодо експресії в іншій ізогенній клітині рослини, у якої відсутній зазначений полінуклеотид. У варіанті здійснення полінуклеотид кодує поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин. Переважно, полінуклеотид по цьому аспекту функціонально зв'язаний із промотором, здатним керувати експресією полінуклеотиду в клітині рослини. Переважно, полінуклеотид по цьому аспекту є антисмисловим полінуклеотидом, смисловим полінуклеотидом, каталітичним полінуклеотидом, штучної мікроРНК або молекулою двоспіральної РНК. У додатковому аспекті даним винаходом забезпечується спосіб ідентифікації рослини, що включає ген, який кодує поліпептид резистентності до патогену дорослих рослин, що включає і) ампліфікацію і/або секвенування, на основі зразка рослини, принаймні, частини полінуклеотиду, який кодує поліпептид, який включає амінокислоти, що мають послідовність, представлену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:4, його біологічно активний фрагмент або амінокислотну послідовність, що ідентична SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:4, принаймні, на 40 %, ii) визначення того, чи включає рослина полінуклеотид, що кодує поліпептид резистентності до патогену дорослих рослин. 4 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як це буде очевидно, переважні ознаки і характеристики одного аспекту даного винаходу застосовні до багатьох інших аспектів даного винаходу. Мається на увазі, що по всьому опису даного винаходу слово "включати" або його варіації, такі як "включає" або "що включає", припускає включення зазначеного елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, а не виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій. Нижче даний винахід описаний за допомогою наступних не обмежуючих прикладів і з використанням посилання на прикладені фігури. КОРОТКИЙ ОПИС ПРИКЛАДЕНИХ КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1. Консенсусна генетична карта хромосоми 7D, що включає Lr34, основана на трьох популяціях для картирування з високою дозволяючою здатністю установила цільову зону, що складає 0,15 cМ (сантиморганід), для Lr34 між XSWSNP3 і XcsLVE17. Відносні положення молекулярних маркерів показані разом з рекомбінаційними відстанями, що спостерігаються, у cМ. Фіг. 2. Схема в розгорнутому вигляді частини хромосоми 7DS пшениці між XSWSNP3 і XcsLVE17, що демонструє відносні положення відкритих рамок зчитування. Секвенована в +Lr34 сорті 'Chinese Spring' відповідна фізична зона містила десять генів-кандидатів, дев'ять з який представлені на цій фігурі стрілками. Числа належать до відповідних положень нуклеотидів у підданій секвенуванню зоні розміром 420 т. п. о. Скорочення: Gly, глікозилтрансфераза; Cyst, цистеїнпротеїназа, Cyt, цитохром P450; LecК, кіназа рецепторів лектинів; ABC, ABC-транспортер; Hex, переносник гексоз. Фіг. 3. Структура гена Lr34. Незаповнені прямокутники означають екзони, тоді як інтрони показані як прилеглі лінії. Маркіруваннями відзначені положення сайтів мутацій у мутантах, позначених 2B, 2F, 2G, 3E, 4C, 4D, m19 і m21. Зазначено три розходження в послідовності між чутливим і резистентним алелями Lr34: +Lr34 резистентний алель із сорту Chinese Spring, -Lr34 чутливий алель із сорту Renan. Фіг. 4. Послідовність білка Lr34 і поліморфізми між резистентними і чутливими сортами. Амінокислотна послідовність білка Lr34 (чутливий алель) із сорту 'Renan'. Виділено дві амінокислоти, змінені в резистентному алелі. Інші прямокутники вказують на положення висококонсервативних мотивів у нуклеотидзв'язувальних доменах. Мотиви: "мотив Уокера типу А" GPPGCGKS (амінокислоти 168-175) (SEQ ID NO:50) і GVSGAGKT (амінокислоти 847-854) (SEQ ID NO:51); "ABC-розпізнавальний мотив" ISGGQKKRLTTA (амінокислоти 307-318) (SEQ ID NO:52) і LSMEQRKRLTIA (амінокислоти 954-965) (SEQ ID NO:53); "мотив Уокера типу В" AYFMD (амінокислоти 327-331) (SEQ ID NO:54) і IILMD (амінокислоти 974-978) (SEQ ID NO:55). Амінокислотними змінами в резистентному алелі Lr34 в озимому сорті пшениці Chinese Spring є делеція амінокислоти в положенні 546 (Phe (F)) і заміна амінокислоти в положенні 634 (тирозину (Y)) на гістидин. Підкресленими частинами є два трансмембранні домени (амінокислоти 502-750 і 1152-1392). Фіг. 5. Представлення в схематичному вигляді білка Lr34, що демонструє два нуклеотидзв'язувальних домени (NBD) і два трансмембранних домени. Два діагностичних поліморфізми між резистентним і чутливим алелями в першому трансмембранному домені показані зірочками. Фіг. 6. Сполучення з амінокислотною послідовністю Lr34. Сполучення Lr34 сорту Renan з PDR23 рису (Os12g0512700) (SEQ ID NO:47) і PDR5 (At3g53480) (SEQ ID NO:48) і PDR9 (At2g37280) (SEQ ID NO:49) Arabidopsis. Відзначено залишки, ідентичні у всіх чотирьох транспортерах. PDR23 рису був недавно анотований відповідно до кДНК Lr34 пшениці. Фіг. 7. Аналіз експресії Lr34. Напівкількісна ЗТ-ПЛР із використанням зонда з 5’-кінця гена. Листи майже ізогенних ліній 'Thatcher' і 'Thatcher Lr34' збирали на стадії сходів через 14 днів, а листи дорослих криючих рослин - на рослинах віком 53 і 63 дні. Листя дорослих рослин ділили навпіл для окремого дослідження рівнів експресії у основі листа і верхівці листа. Позначення: TH = 'Thatcher'; TH Lr34 = 'Thatcher Lr34'; GAPDH = гліцеральдегід-3-фосфат-дегідрогеназа. Фіг. 8. Lr34 регулює старіння криючого листя. Нозерн-блотинг із використанням HvS40 на криючих листах рослин віком 63 дня майже ізогенних ліній 'Thatcher' і 'Thatcher Lr34' і індукованих азидом мутантах Lr34:2B, 2F, 2G, 3E, 4C і 4E. TH = 'Thatcher'; TH Lr34 = 'Thatcher Lr34". РОЗ'ЯСНЕННЯ ДО СПИСКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO:1 - Амінокислотна послідовність білка Lr34 (резистентного алеля) з Triticum aestivum (м'якої пшениці) сорту Chinese spring. SEQ ID NO:2 - Нуклеотидна кодуюча послідовність для Lr34 з Triticum aestivum сорту Chinese spring. 5 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:3 - Нуклеотидна послідовність гена Lr34 (геномна послідовність) з Triticum aestivum сорту Chinese spring. Присутні 24 екзони, що кодують білок Lr34: екзон 1 починається за нуклеотидом 3042 і закінчується на нуклеотиді 3316; екзон 2 починається за нуклеотидом 3416 і закінчується на нуклеотиді 3539; екзон 3 починається за нуклеотидом 3693 і закінчується на нуклеотиді 3778; екзон 4 починається за нуклеотидом 3934 і закінчується на нуклеотиді 4018; екзон 5 починається за нуклеотидом 6527 і закінчується на нуклеотиді 6686; екзон 6 починається за нуклеотидом 6784 і закінчується на нуклеотиді 6860; екзон 7 починається за нуклеотидом 7119 і закінчується на нуклеотиді 7172; екзон 8 починається за нуклеотидом 7271 і закінчується на нуклеотиді 7361; екзон 9 починається за нуклеотидом 7439 і закінчується на нуклеотиді 7740; екзон 10 починається за нуклеотидом 7833 і закінчується на нуклеотиді 8108; екзон 11 починається за нуклеотидом 8187 і закінчується на нуклеотиді 8497; екзон 12 починається за нуклеотидом 8583 і закінчується на нуклеотиді 8743; екзон 13 починається за нуклеотидом 8825 і закінчується на нуклеотиді 8928; екзон 14 починається за нуклеотидом 9015 і закінчується на нуклеотиді 9168; екзон 15 починається за нуклеотидом 9606 і закінчується на нуклеотиді 9513; екзон 16 починається за нуклеотидом 9808 і закінчується на нуклеотиді 9581; екзон 17 починається за нуклеотидом 9985 і закінчується на нуклеотиді 10317; екзон 18 починається за нуклеотидом 10427 і закінчується на нуклеотиді 10717; екзон 19 починається за нуклеотидом 12159 і закінчується на нуклеотиді 12242; екзон 20 починається за нуклеотидом 12711 і закінчується на нуклеотиді 12844; екзон 21 починається за нуклеотидом 12995 і закінчується на нуклеотиді 13222; екзон 22 починається за нуклеотидом 13318 і закінчується на нуклеотиді 13489; екзон 23 починається за нуклеотидом 13569 і закінчується на нуклеотиді 13823; і екзон 24 починається за нуклеотидом 14613 і закінчується на нуклеотиді 14939. SEQ ID NO:4 - Амінокислотна послідовність білка Lr34 (чутливого алеля) з Triticum aestivum "Renan". SEQ ID NO:5 - Нуклеотидна кодуючи послідовність для Lr34 (чутливого аллеля) з Triticum aestivum "Renan". SEQ ID NO:6 - Геномна ДНК для еквівалента Lr34 з Aegilops tauschii. Кодуючи ділянка починається за нуклеотидом 2426 і закінчується на нуклеотиді 14212. SEQ ID NO:7-EST (маркерна експресована послідовність) Lr34 Triticum aestivum (№ доступу в GenBank-CJ669561). SEQ ID NO:8-EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступу в GenBank-DR733734). SEQ ID NO:9-EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступу в GenBank-CJ562397). SEQ ID NO:10-EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступу в GenBank-CV773074). SEQ ID NO:11-EST Lr34 Triticum aestivum (№ доступу в GenBank-BU991506). SEQ ID NO:12-46 - Олігонуклеотидні праймери. SEQ ID NO:47-ABC-транспортер PDR23 рису. SEQ ID NO:48-ABC-транспортер PDR5 Arabidopsis thaliana. SEQ ID NO:49-ABC-транспортер PDR9 Arabidopsis thaliana. SEQ ID NO:50 - Послідовність N-кінцевого боксу Уокера типу А Lr34. SEQ ID NO:51 - Послідовність С-кінцевого боксу Уокера типу А Lr34. SEQ ID NO:52 - Послідовність N-кінцевого АВС-розпізнавального мотиву Lr34. SEQ ID NO:53 - Послідовність С-кінцевого АВС-розпізнавального мотиву Lr34. SEQ ID NO:54 - Послідовність N-кінцевого боксу Уокера типу В Lr34. SEQ ID NO:55 - Послідовність С-кінцевого боксу Уокера типу В Lr34. SEQ ID NO:56 - Консенсусна послідовність боксу Уокера типу А ABC-транспортерів. SEQ ID NO:57 - Консенсусна послідовність боксу Уокера типу В ABC-транспортерів. SEQ ID NO:58 - Консенсусна послідовність АВС-розпізнавального мотиву ABCтранспортерів. SEQ ID NO:59-PDR-розпізнавальна послідовність 1. SEQ ID NO:60-PDR-розпізнавальна послідовність 2. SEQ ID NO:61-PDR-розпізнавальна послідовність 3. SEQ ID NO:62-PDR-розпізнавальна послідовність 4. SEQ ID NO:63 - Поліпептид, кодований гомологом Lr34 на хромосомі 7В пшениці. SEQ ID NO:64 - Відкрита рамка зчитування, що кодує гомолог Lr34 на хромосомі 7В пшениці. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Загальні методи 6 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Якщо конкретно не визначено інше, то варто вважати, що усі використовувані в описі технічні і наукові терміни мають таке ж значення, як і значення, у якому вони розуміються фахівцем із середнім рівнем компетентності в даній галузі техніки (наприклад, у культивуванні клітин, молекулярній генетиці, молекулярній біології рослин, хімії білків і біохімії). Якщо не зазначено інше, то одержання рекомбінантного білка, культивування клітин і імунологічні методи, використовувані в даному винаході, є стандартними процедурами, добре відомими фахівцям у даній галузі. Такі методи описані і пояснені по всій літературі в таких джерелах, як J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 14, IRL Press (1995 and 1996), і F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включаючи всі зміни відповідно до нових даних до теперішнього часу), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), і J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включаючи всі зміни відповідно до нових даних до теперішнього часу). Поліпептиди/пептиди Під виразом "по суті очищений поліпептид" або "очищений поліпептид" у даному описі мається на увазі поліпептид, що звичайно відділений від ліпідів, нуклеїнових кислот, інших пептидів і інших забруднюючих молекул, з якими він зв'язаний у своєму природному стані. Переважно, по суті очищений поліпептид позбавлений, принаймні, на 90 % інших компонентів, з якими він зв'язаний у природі. Термін "рекомбінантний" відносно поліпептиду належить до поліпептиду, коли він продукується клітиною або в безклітинній експресійній системі, у зміненій кількості або в зміненому ступені в порівнянні з його природним станом. В одному варіанті здійснення клітиною є клітина, що не продукує поліпептид у природі. Однак клітиною може бути клітина, що включає неендогенний ген, що приводить до зміненої кількості продукованого поліпептиду. Рекомбінантний поліпептид за даним винаходом включає поліпептиди, що не були відділені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або безклітинної експресійної системи, у якій він продукується, і продуковані в таких клітинах або безклітинних системах поліпептиди, що по суті очищені, принаймні, від деяких інших компонентів. У варіанті здійснення "рекомбінантним поліпептидом" є поліпептид, отриманий при експресії рекомбінантного полінуклеотиду в клітині, переважно, в клітині рослини і більш переважно, у клітині хлібного злаку. Терміни "поліпептид" і "білок" звичайно використовуються взаємозамінно. Використовуваний в описі термін "поліпептид резистентності до патогенну дорослих рослин" належить до білка, кодованого геном, що звичайно додає дорослій рослині підвищеної резистентності до патогенну рослин у порівнянні з ізогенною рослиною, у якій цей ген відсутній, і який додає сходам тієї ж рослини значно меншої резистентності до того ж патогенну або не додає такої резистентності, коли рослину вирощують у нормальних польових умовах. Цей термін також належить до продукованого в природі білка (або білка дикого типу, з якого походить мутантний білок), кодованого геном, що додає дорослій рослині (наприклад, сорту пшениці Frontana), але не сходам, при вирощуванні в нормальних польові умови, підвищеної резистентності до патогенну рослин. Звичайно поліпептиди резистентності до патогенну дорослих рослин не забезпечують реакцію гіперчутливості в рослин у присутності патогенну, і резистентність є стійкою в польових умовах протягом тривалого періоду. Як використовується в описі, "доросла рослина" належить до рослини, що ввійшла в репродуктивну фазу росту і розвитку. У варіанті здійснення менше половини білка продукується на грам сухої ваги в листах сходів у порівнянні з листами дорослої рослини. Приклади патогенів рослин, до яких підвищується резистентність, включають, але не обмежуються ними, Fusarium graminearum, Erysiphe graminis f. sp. tritici, Bipolaris sorokiniana, Puccinia graminis f. sp. tritici, Puccinia striiformis і Puccinia recondite f. sp. tritici. Відсоток ідентичності поліпептиду визначають за допомогою аналізу GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (програми GCG) з використанням штрафу за включення пропуску=5 і штрафу за подовження пропуску=0,3. Довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 150 амінокислот, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 150 амінокислот. Більш переважно, довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 500 амінокислот, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 500 амінокислот. Більш переважно, довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 7 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1000 амінокислот, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 1000 амінокислот. Ще більш переважно, довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 1250 амінокислот, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 1250 амінокислот. Ще більш переважно, в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по всій їхній довжині. Як використовується в описі, "біологічно активний" фрагмент являє собою частину поліпептиду за даним винаходом, що зберігає визначену активність повнорозмірного поліпептиду. Біологічно активні фрагменти можуть бути будь-якого розміру за умови, що вони зберігають визначену активність, але, переважно, їхній розмір складає, принаймні, 1000 або, принаймні, 1200 амінокислотних залишків. Переважно, біологічно активний фрагмент зберігає, принаймні, 10 % активності повнорозмірного білка. Вираз "підвищена резистентність до патогенну рослин" використовується в описі як відносний термін, так, що рослина за даним винаходом має підвищений рівень резистентності до патогенну рослин у порівнянні з генетично ідентичною рослиною, у якій відсутній екзогенний полінуклеотид. Підвищену резистентність можна визначити з використанням ряду відомих у даній галузі способів, таких як дослідження рослин відносно ступеня патогенну і/або дослідження росту рослин або ступеня пошкодження, що наноситься рослині в присутності патогену. Використовуваний в описі термін "характеризується прискореним старінням верхівок криючого листя" належить до старіння з раннім початком краю самого нижнього листа на стеблі рослини. В описі він використовується як відносний термін, так, що рослина за даним винаходом характеризується прискореним старінням верхівок криючого листя у порівнянні з генетично ідентичним криючим листом, у якому відсутній екзогенний полінуклеотид. Прискорене старіння верхівок криючого листя можна визначити будь-яким способом, відомим у даній галузі, таким як спосіб, що описаний у прикладі 5. Відносно визначеного поліпептиду буде зрозуміло, що цифрові дані відсотка ідентичності, що перевищують приведені вище цифрові дані, будуть включені в переважні варіанти здійснення. Таким чином, де застосовно, з урахуванням цифрових даних мінімального відсотка ідентичності, переважно, коли поліпептид включає амінокислотну послідовність, що ідентична відповідній SEQ ID NO з визначеною назвою, принаймні, на 60 %, більш переважно, принаймні, на 65 %, більш переважно, принаймні, на 70 %, більш переважно, принаймні, на 75 %, більш переважно, принаймні, на 76 %, більш переважно, принаймні, на 80 %, більш переважно, принаймні, на 85 %, більш переважно, принаймні, на 90 %, більш переважно, принаймні, на 91 %, більш переважно, принаймні, на 92 %, більш переважно, принаймні, на 93 %, більш переважно, принаймні, на 94 %, більш переважно, принаймні, на 95 %, більш переважно, принаймні, на 96 %, більш переважно, принаймні, на 97 %, більш переважно, принаймні, на 98 %, більш переважно, принаймні, на 99 %, більш переважно, принаймні, на 99,1 %, більш переважно, принаймні, на 99,2 %, більш переважно, принаймні, на 99,3 %, більш переважно, принаймні, на 99,4 %, більш переважно, принаймні, на 99,5 %, більш переважно, принаймні, на 99,6 %, більш переважно, принаймні, на 99,7 %, більш переважно, принаймні, на 99,8 % і ще більш переважно, принаймні, на 99,9 %. Використовуваний в описі вираз "у положенні, що відповідає номеру амінокислоти", або його варіації, належить до положення амінокислоти щодо оточуючих амінокислот. У цьомвідносно в деяких варіантах здійснення поліпептид за даним винаходом може мати делеційні мутації або мутації зі заміщенням, що змінюють відносне положення амінокислоти при сполученні, наприклад, з SEQ ID NO:1 і/або SEQ ID NO:4. Наприклад, поліпептид з послідовністю, представленою в SEQ ID NO:1, має делецію однієї амінокислоти в порівнянні з поліпептидом з послідовністю, представленою в SEQ ID NO:4, а саме, фенілаланін у положенні 546 SEQ ID NO:4 відсутній у SEQ ID NO:1 і не замінений іншою амінокислотою. Внаслідок цього, кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що номер 634 амінокислоти в SEQ ID NO:4 (Y) відповідає номеру 633 амінокислоти в SEQ ID NO:4 (H). Мутанти по амінокислотній послідовності поліпептидів за даним винаходом можна одержати шляхом введення прийнятних змін нуклеотидів у нуклеїновій кислоті за даним винаходом або шляхом in vitro синтезу бажаного поліпептиду. Такі мутанти включають, наприклад, делеції, інсерції або заміни залишків усередині амінокислотної послідовності. Для досягнення кінцевої конструкції можна виконати комбінацію з делеції, інсерції і заміни за умови, що кінцевий пептидний продукт має бажані характеристики. Переважні мутанти по амінокислотній послідовності мають тільки одну, дві, три, чотири або менше 10 змін амінокислот щодо вихідного поліпептиду дикого типу. 8 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Мутантні (змінені) пептиди можна одержати, використовуючи будь-який метод, відомий у даній галузі техніки. Наприклад, полінуклеотид за даним винаходом можна піддати in vitro мутагенезу. Методи такого in vitro мутагенезу включають субклоновання полінуклеотиду в прийнятний вектор, трансформацію вектора в штам "мутатора", такий як E. coli XL-1 red (Stratagene), і розмноження трансформованих бактерій, повторюване протягом прийнятного ряду поколінь. В іншому прикладі полінуклеотиди за даним винаходом піддають методам перетасування ДНК, широко описаним Harayama (1998). Продукти, отримані з мутованої/зміненої ДНК, можна без зусилля піддати скринінгу, використовуючи описані в даному документі методи для визначення того, чи мають вони резистентність до патогенну і/або активність АВС-транспортера. При створенні мутантів по амінокислотній послідовності місцезнаходження точки мутації і природа мутації будуть залежати від характеристики (характеристик), що піддається зміні. Точки мутації можна змінити окремо або одну за іншою, наприклад, за допомогою (1) заміщення спочатку консервативними амінокислотними варіантами, а потім більш радикальними вибраними елементами, виходячи з отриманих результатів, (2) делеції цільового залишку (3) або інсерції інших залишків поруч з визначеним сайтом. Делеції в амінокислотній послідовності звичайно знаходяться в межах від приблизно 1 до 15 залишків, більш переважно, від приблизно 1 до 10 залишків і звичайно від приблизно 1 до 5 послідовних залишків. Мутанти із заміщенням характеризуються видаленням, принаймні, одного амінокислотного залишку в молекулі поліпептиду і вставкою на його місце іншого залишку. Представляючі найбільший інтерес сайти для мутагенезу із заміщенням включають сайти, ідентифіковані як активний(і) сайт(и). Іншими представляючими інтерес сайтами є сайти, у яких специфічні залишки, що існують у різних штамах або видах, є ідентичними. Ці положення можуть бути важливі для біологічної активності. Ці сайти, особливо ті, котрі зустрічаються усередині послідовності, принаймні, трьох відмінних, в однаковій мірі консервативних сайтів, переважно, заміщають відносно консервативним чином. Такі консервативні заміни представлені в таблиці 1 під заголовком "заміни, що приводяться як приклади". У переважному варіанті здійснення мутант/варіант поліпептиду має одну або дві, або три, або чотири консервативні амінокислотні заміни в порівнянні з природним поліпептидом. Відомості про консервативні амінокислотні заміни приведені в таблиці 1. У переважному варіанті здійснення заміни не знаходяться в одному або більше мотивах, що є висококонсервативними між різними поліпептидами, забезпечуваних цим винаходом. Як, можливо, відомо кваліфікованому фахівцю, з достатньою підставою можна чекати, що такі незначні зміни не приведуть до зміни активності поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині. Таблиця 1 Заміни, що приводяться як приклади Заміни, що приводяться як приклади Вихідний залишок 9 UA 106729 C2 Таблиця 1 Заміни, що приводиться як приклади Вихідний залишок Замши, що приводяться як приклади val; leu; ile; gly lys gin; his glu ser asn; his asp pro, ala asn; gin leu; val; ala ile; val; met; ala; phe arg leu; phe leu; val; ala gly thr ser tyr trp;phe ile; leu; met; phe, ala Ala (A) Arg(R) Asn(N) Asp (D) Cys(C) Gln(Q) Glu (E) Gly(G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V) 5 10 15 20 25 30 У варіанті здійснення білок за даним винаходом являє собою ABC-транспортер - PDR (гомолог плейотропної лікарської резистентності) і включає два нуклеотидзв'язувальних домени (NBD) і два трансмембранних домени, скомпонованих, як продемонстровано на Фіг. 5. Первинну амінокислотну послідовність Lr34 можна використовувати для створення її варіантів/мутантів на основі порівнянь із близькоспорідненими ABC-транспортерами. Як це буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, висококонсервативні серед близькоспоріднених ABCтранспортерів - PDR залишки з меншою імовірністю можуть бути змінені, особливо з використанням неконсервативних замін, зі збереженням активності, ніж менш консервативні залишки. Такі консервативні ділянки і можливі заміни описані Rae (2007), van den Brule and Smart (2002) і Verrier et al. (2008). Поліпептид звичайно включає два бокси Уокера типу А (GX4GK[ST]) (SEQ ID NO:56) (яка відповідає SEQ ID NO:50 і 51 Lr34), два бокси Уокера типу В ((гідрофобна ділянка)4[DE]) (SEQ ID NO:57) (яка відповідає SEQ ID NO:54 і 55 Lr34) і два ABCпізнавальних мотиви ([LIVMFY]S[SGM][GE]X3[RKA][LIVMYA]X[LIVFMT][AG]) (SEQ ID NO:58) (яка відповідає SEQ ID NO:52 і 53 Lr34), при цьому кожен NBD включає, по порядку від N-кінця, бокс Уокера типу А, ABC-розпізнавальний мотив і бокс Уокера типу В (див., наприклад, Фіг. 4). У вищенаведених послідовностях X може бути будь-якою амінокислотою і може бути незалежно однаковою або різною. Крім того, поліпептид звичайно включає PDR-розпізнавальний мотив 1 (LLLGPP) (SEQ ID NO:59), що є безпосередньо N-кінцевим стосовно N-кінцевого бокса Уокера типу А та злегка перекривається з ним; PDR-розпізнавальний мотив 2 (GLDSST) (SEQ ID NO:60), що починається за чотирма залишками, що є C-кінцевими стосовно N-кінцевого боксу Уокера типу В; PDR-розпізнавальний мотив 3 (GLD[AT]R[AS]AAIV[MI]R) (SEQ ID NO:61), що починається за чотирма залишками, які є C-кінцевими стосовно C-кінцевого боксу Уокера типу В; і PDRрозпізнавальний мотив 4 (VCTIHQPS) (SEQ ID NO:62), що починається за 86 залишками, які є С-кінцевими стосовно PDR-розпізнавального мотиву 3. У варіанті здійснення поліпептид за даним винаходом включає один або більше амінокислотних мотивів, представлених у SEQ ID NO:56-58, переважно, дві копії усіх трьох послідовностей. Більш переважно, поліпептид за даним винаходом включає один або більше амінокислотних мотивів, представлених у SEQ ID NO:50-55, переважно всі шість послідовностей. 10 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, у ще іншому варіанті здійснення поліпептид за даним винаходом включає один або більше амінокислотних мотивів, представлених у SEQ ID NO:59-62, переважно, всі чотири послідовності. Джерела природних варіантів SEQ ID NO:1, що додають описуваної в даному документі резистентності, перераховані в таблиці 5. На основі наданої в описі інформації кваліфікований фахівець може легко визначити амінокислотну послідовність цих природних варіантів, а також полінуклеотидів, що їх кодують. В обсяг даного винаходу також включені поліпептиди за даним винаходом, які диференціально модифіковані під час або після синтезу, наприклад, шляхом біотинілування, бензилування, глікозилування, ацетилування, фосфорилування, амідування, дериватизації з використанням відомих захисних/блокуючих груп, протеолітичного розщеплення, сполучення з молекулою антитіла або іншим клітинним лігандом і т. д. Поліпептиди можуть бути посттрансляційно модифіковані в клітині, наприклад, шляхом фосфорилування, що може модулювати їхню активність. Ці модифікації можуть служити для збільшення стабільності і/або біоактивності поліпептиду за даним винаходом. Поліпептиди за даним винаходом можна одержати різними способами, що включають продукцію і витягання природних поліпептидів, продукцію і витяг рекомбінантних поліпептидів і хімічний синтез поліпептидів. В одному варіанті здійснення виділений поліпептид за даним винаходом одержують шляхом культивування клітини, здатної експресувати поліпептид, в умовах, ефективних для продукції поліпептиду, і витягання поліпептиду. Переважною для культивування клітиною є рекомбінантна клітина за даним винаходом. Ефективні умови культивування включають, але не обмежуються ними, ефективні середовища, біореактор, температурні умови, умови pН і насичення киснем, що уможливлюють продукцію поліпептиду. Ефективне середовище належить до будь-якого середовища, у якому культивують клітину для продукування поліпептиду за даним винаходом. Таке середовище звичайно включає водяне середовище, що містить джерела засвоюваного вуглецю, азоту і фосфату, і відповідні солі, мінеральні речовини, метали й інші поживні речовини, такі як вітаміни. Клітини за даним винаходом можна культивувати в звичайних ферментаційних біореакторах, струшуваних колбах, пробірках, мікротитрувальних планшетах і чашках Петрі. Культивування можна здійснювати при температурі, pН і вмісті кисню, що підходять для рекомбінантної клітини. Слідування таким умовам культивування знаходиться в межах компетентності звичайного фахівця в даній галузі техніки. Переважним засобом для продукування поліпептидів є трансгенна рослина, переважно, трансгенний хлібний злак. Полінуклеотиди і гени Даний винахід належить до різних полінуклеотидів. Як використовується в даному описі, "полінуклеотид" або "нуклеїновая кислота", або "молекула нуклеїнової кислоти" означає полімер з нуклеотидів, що може являти собою ДНК або РНК, або їхнє поєднання і включає мРНК, кРНК, кДНК, тРНК, міРНК (siRNA) (малу (коротку) інтерферуючу РНК), мшРНК (shRNA) (малу (коротку) шпилькову РНК) і шРНК (hpRNA) (шпилькову РНК). Він може являти собою ДНК або РНК клітинного, геномного або синтетичного походження, наприклад, може бути отриманий на автоматизованому синтезаторі, і може бути об'єднаний з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами, міченими флуоресцентними або іншими групами, або прикріплений до твердої підкладки для виконання конкретної, визначеної в описі дії, або включати один або більше модифікованих нуклеотидів, які не зустрічаються в природі, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Полімер може бути одноланцюжковим, в основному дволанцюжковим або частково дволанцюжковим. Прикладом молекули частково дволанцюжкової РНК є шпилькова РНК (hpRNA), коротка шпилькова РНК (shRNA) або самокомплементарна РНК, що включають дволанцюжкову ніжку, утворену в результаті спарювання основ між нуклеотидною послідовністю і її комплементом, і послідовність петлі, що ковалентно з'єднує нуклеотидну послідовність і її комплемент. Як використовується в даному описі, спарювання основ належить до звичайного спарювання основ між нуклеотидами, що включає пари основ G:U. Під "комплементарними" маються на увазі два полінуклеотида, здатні до спарювання основ (гібридизації) по частині їхніх довжин або по всій довжині одного або обох полінуклеотидів. Під "гібридизованим полінуклеотидом" мається на увазі полінуклеотид, що дійсно піддався спарюванню основ зі своїм комплементом. Термін "полінуклеотид" використовується в описі взаємозамінно з терміном "нуклеїнова кислота". Під "виділеним полінуклеотидом" розуміється полінуклеотид, що звичайно відділений від полінуклеотидних послідовностей, з якими він зв'язаний у своєму природному стані. Переважно, виділений полінуклеотид позбавлений, принаймні, на 90 % інших компонентів, з якими він зв'язаний у природі. 11 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід включає модифікування активності гена і конструювання і використання химерних генів. Використовуваний в описі термін "ген" включає будь-яку дезоксирибонуклеотидну послідовність, що включає кодуючу білок ділянку або яка транскрибується в клітині, але не піддається трансляції, а також зв'язані некодуючі і регуляторні ділянки. Такі зв'язані ділянки звичайно знаходяться поблизу кодуючої ділянки або транскрибованої ділянки як на 5'-кінці, так і на 3'-кінці на відстані, що складає приблизно 2 т. п. о., по обидва боки. У цьомвідносно ген може включати регулюючі сигнали, такі як промотори, енхансери, сигнали термінації і/або поліаденілування, що у природі зв'язані з конкретним геном, або гетерологічні регулюючі сигнали, у випадку присутності яких ген називають "химерним геном". Послідовності, що розташовані в напрямку 5" від кодуючої ділянки і які присутні на мРНК, називають 5' нетрансльованими послідовностями. Послідовності, що розташовані по ходу транскрипції кодуючої ділянки або знаходяться в напрямку 3' від нього і які присутні на мРНК, називаються 3' нетрансльованими послідовностями. Термін "ген" охоплює як кДНК, так і геномні форми гена. Як використовується в даному описі, "ген Lr34" належить до нуклеотидної послідовності, що гомологічна виділеному гену Lr34 (SEQ ID NO:3) або кДНК Lr34 (SEQ ID NO:2), описуванії в даному документі, який(а) кодує білок, що додає резистентності до патогену, переважно, грибного патогену, рослині, переважно, хлібному злаку і, більш переважно, пшениці. Переважно, білок додає резистентності до більше ніж одного грибного патогену. Гени Lr34 включають природні алелі або варіанти, що існують у хлібних злаках, таких як пшениця, включаючи ті, котрі кодуються D-геномами гексаплоїдної пшениці і диплоїдними прабатьками Dгенома або його родичами, а також варіанти, що не зустрічаються в природі, які можуть бути отримані фахівцями в галузі генної модифікації. Молекули нуклеїнових кислот, що мають нуклеотидну послідовність, представлену в описі як SEQ ID NO:2 (кДНК) або SEQ ID NO:3 (геномна послідовність), що кодують білок з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:1, є прикладами гена Lr34. У переважному варіанті здійснення ген Lr34 належить до молекули нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотиди, що мають послідовність, ідентичну SEQ ID NO:2, принаймні, на 90 %. Геномна форма або клон гена, що містять транскрибовану ділянку, можуть бути перервані некодуючими послідовностями, що називаються "інтронами" або "ділянками або послідовностями, що знаходяться між екзонами". Як використовується в даному описі, "інтрон" являє собою сегмент гена, що транскрибується у вигляді частини первинного РНК-транскрипта, але не присутній у молекулі зрілої мРНК. Інтрони видаляються або вирізаються з ядерного або первинного транскрипта; отже, інтрони відсутні в інформаційній РНК (мРНК). Інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі як енхансери. Як використовується в даному описі, "екзони" належать до ділянок ДНК, що відповідають послідовностям РНК, що присутні в зрілій мРНК або молекулі зрілої РНК у тих випадках, коли молекула РНК не піддається трансляції. Під час трансляції мРНК функціонує для визначення послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. Термін "ген" включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує білки за даним винаходом, описувані в даному документі, або повнісю їхню частину, і нуклеотидну послідовність, комплементарну будь-якійт з зазначених вище молекул. Ген можна вбудувати у відповідний вектор для позахромосомної підтримки в клітині або для інтеграції в геном хазяїна. Як використовується в даному описі, "химерний ген" належить до будь-якого гена, що не є нативним геном у своєму природному місцезнаходженні. Звичайно химерний ген включає регуляторні і транскрибовані або кодуючи білок послідовності що не зустрічаються разом у природі. Відповідно, химерний ген може включати регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з того самого джерела, але з розташуванням, відмінним від розташування, що зустрічається в природі. Термін "ендогенний" використовується в описі для посилання на речовину, що звичайно присутня або продукується в немодифікованій рослині в тій же стадії розвитку, що і досліджувана рослина. "Ендогенний ген" належить до нативного гена в його природному місцезнаходженні в геномі організму. Як використовується в даному описі, "рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти", "рекомбінантний полінуклеотид" або їхні варіації належать до молекули нуклеїнової кислоти, що була сконструйована або модифікована з використанням технології рекомбінантних ДНК. Терміни "чужорідний полінуклеотид" або "екзогенний полінуклеотид", або "гетерологічний полінуклеотид" і т. п. належать до будь-який нуклеїнової кислоті, що введена в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій. Наприклад, авторами даного винаходу ідентифікований гомолог Lr34 на хромосомі 7В пшениці (див. SEQ ID NO:63 і 64). Кваліфікований фахівець може використовувати цю інформацію для мутування гомолога гена Lr34 у твердій пшениці таким чином, щоб він кодував білок за даним 12 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 винаходом, у якому відсутній залишок фенілаланіну або будь-яка амінокислота в положенні, що відповідає номеру амінокислоти 546 у SEQ ID NO:4, і є амінокислота, відмінна від залишку тирозину, у положенні, що відповідає номеру амінокислоти 634 у SEQ ID NO:4. Такий мутований ген, а також кодовану мРНК, можна було б вважати "екзогенним" полінуклеотидом за даним винаходом. Чужорідними або екзогенними генами можуть бути гени, що введені в ненативний організм, нативні гени, введені в нове місце усередині нативного хазяїна, або химерні гени. "Трансген" являє собою ген, що був введений у геном за допомогою процедури трансформації. Термін "генетично модифіковані" включає введення генів у клітини за допомогою трансформації або трансдукції, мутовані генів у клітинах і зміна або модулювання регуляції гена в клітині або організмі, відносно якої(ого) ці дії були здійснені, або їхньому потомстві. Крім того, термін "екзогенний" відносно полінуклеотиду (нуклеїнової кислоти) належить до полінуклеотиду, якщо він присутній у клітині або в безклітинній експресійній системі, у зміненій мірі в порівнянні з його природним станом. У варіанті здійснення клітиною є клітина, що у природі не включає полінуклеотид. Однак клітиною може бути клітина, що включає неендогенний полінуклеотид, що приводить до зміненої міри продукції кодованого поліпептиду. Екзогенний полінуклеотид за даним винаходом включає полінуклеотиди, що були відділені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або безклітинної експресійної системи, у якій він присутній, і полінуклеотиди, продуковані в таких клітинах або безклітинних системах, що по суті очищені, принаймні, від деяких інших компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути безперервною ділянкою нуклеотидів, що існує в природі, або включати дві або більше безперервних ділянок нуклеотидів з різних джерел (природних і/або синтетичних), з'єднаних з утворенням одного полінуклеотиду. Звичайно такі химерні полінуклеотиди включають, принаймні, відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид за даним винаходом, функціонально зв'язаний із промотором, прийнятним для керування транскрипцією відкритої рамки зчитування в клітині, що представляє інтерес. Відсоток ідентичності полінуклеотиду визначають за допомогою аналізу GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (програми GCG) з використанням штрафу за включення пропуску=5 і штрафу за подовження пропуску=0,3. Довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 450 нуклеотидів, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 450 нуклеотидів. Переважно, довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 1500 нуклеотидів, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 1500 нуклеотидів. Ще більш переважно, довжина запитуваної послідовності складає, принаймні, 3000 нуклеотидів, і в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по ділянці, що складає, принаймні, 3000 нуклеотидів. Ще більш переважно, в аналізі GAP сполучаються дві послідовності по всій їхній довжині. Відносно визначених полінуклеотидів буде зрозуміло, що цифрові дані % ідентичності, що перевищують приведені вище цифрові дані, будуть включені в переважні варіанти здійснення. Таким чином, де прийнятно, з обліком цифрових даних мінімального % ідентичності, переважно, коли полінуклеотид включає полінуклеотидну послідовність, що ідентична відповідній SEQ ID NO з певною назвою, принаймні, на 60 %, більш переважно, принаймні, на 65 %, більш переважно, принаймні, на 70 %, більш переважно, принаймні, на 75 %, більш переважно, принаймні, на 80 %, більш переважно, принаймні, на 85 %, більш переважно, принаймні, на 90 %, більш переважно, принаймні, на 91 %, більш переважно, принаймні, на 92 %, більш переважно, принаймні, на 93 %, більш переважно, принаймні, на 94 %, більш переважно, принаймні, на 95 %, більш переважно, принаймні, на 96 %, більш переважно, принаймні, на 97 %, більш переважно, принаймні, на 98 %, більш переважно, принаймні, на 99 %, більш переважно, принаймні, на 99,1 %, більш переважно, принаймні, на 99,2 %, більш переважно, принаймні, на 99,3 %, більш переважно, принаймні, на 99,4 %, більш переважно, принаймні, на 99,5 %, більш переважно, принаймні, на 99,6 %, більш переважно, принаймні, на 99,7 %, більш переважно, принаймні, на 99,8 % і ще більш переважно, принаймні, на 99,9 %. У переважному варіанті здійснення полінуклеотид за даним винаходом не є послідовністю нуклеотидів, представленою в будь-якій з SEQ ID NO:7-11. В іншому варіанті здійснення даний винахід належить до полінуклеотидів, що по суті ідентичні полінуклеотидам, конкретно описаним в даному документі. Використовуваний в описі термін "по суті ідентичний" з посиланням на полінуклеотид означає заміщення одного або невеликого числа (наприклад, 2, 3 або 4) нуклеотидів при збереженні, принаймні, однієї активності нативного білка, кодованого полінуклеотидом. Крім того, цей термін включає додавання або делетування нуклеотидів, що приведе до збільшення або зменшення розміру 13 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кодованого нативного білка на одну або невелике число (наприклад, 2, 3 або 4) амінокислот при збереженні, принаймні, однієї активності нативного білка, кодованого полінуклеотидом. Даний винахід належить до застосування олігонуклеотидів. Використовувані в даному описі "олігонуклеотиди" являють собою полінуклеотиди довжиною аж до 50 нуклеотидів. Мінімальним розміром таких олігонуклеотидів є розмір, необхідний для утворення стабільного гібрида між олігонуклеотидом і комплементарною послідовністю в молекулі нуклеїнової кислоти за даним винаходом. Вони можуть являти собою РНК, ДНК або їхнє поєднання, або прохідні будь-якої з них. Олігонуклеотиди звичайно являють собою відносно короткі одноланцюжкові молекули довжиною 10-30 нуклеотидів, звичайно, 15-25 нуклеотидів. При використанні як зонда або як праймера в реакції ампліфікації мінімальним розміром такого олігонуклеотида є розмір, необхідний для утворення стабільного гібрида між олігонуклеотидом і комплементарною послідовністю в цільовій молекулі нуклеїнової кислоти. Переважно, довжина олігонуклеотидів складає, принаймні, 15 нуклеотидів, більш переважно, принаймні, 18 нуклеотидів, більш переважно, принаймні, 19 нуклеотидів, більш переважно, принаймні, 20 нуклеотидів, ще більш переважно, принаймні, 25 нуклеотидів. Олігонуклеотиди за даним винаходом, що використовуються як зонд, звичайно кон'юговані з міткою, такою як радіоактивний ізотоп, фермент, біотин, флуоресцентна молекула або хемілюмінесцентна молекула. Даний винахід включає олігонуклеотиди, що можуть бути використані як, наприклад, зонди для ідентифікації молекул нуклеїнових кислот або як праймери для продукування молекул нуклеїнових кислот. Зонди і/або праймери можна використовувати для клонування гомологів полінуклеотидів за даним винаходом з інших видів. Крім того, відомі в даній галузі методи гібридизації можна також використовувати для скринінгу бібліотек геномної ДНК або кДНК для таких гомологів. Полінуклеотиди й олігонуклеотиди за даним винаходом включають ті, котрі гібридизуються в жорстких умовах з послідовністю, представленою в SEQ ID NO:2 і/або 3. Використовуваними в даному описі жорсткими умовами є такі умови, при яких (1) використовується низька іонна сила і висока температура для промивання, наприклад, 0,015 M NaCl/0,0015 M цитрат натрію/0,1 % ο NaDOdSO4 при 50 C; (2) під час гібридизації використовується денатуруючий агент, такий як формамід, наприклад, 50 % (в об'ємномвідносно) формамід з 0,1 % бичачого сироваткового альбуміну, 0,1 % фіколу, 0,1 % полівінілпіролідону, 50 мМ натрій-фосфатним буфером при pН 6,5 з 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрію при 42C; або (3) використовується 50 % формамід, 5SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (pН 6,8), 0,1 % фосфату натрію, 5  розчин Денхардта, оброблена ультразвуком ДНК із молочка лососевих (50 г/мл), ο 0,1 % SDS і 10 % сульфату декстрану при 42 C у 0,2SSC і 0,1 % SDS. Полінуклеотиди за даним винаходом можуть мати, у порівнянні природними молекулами, одну і кілька мутацій, що являють собою делеції, інсерції або заміни нуклеотидних залишків. Мутанти можуть бути або природними (тобто, виділеними з природного джерела) або синтетичними (наприклад, у результаті здійснення сайт-спрямованого мутагенезу на нуклеїновій кислоті). Варіант полінуклеотиду або олігонуклеотиду за даним винаходом включає молекули, що мають розміри, які варіюють близько розміру вихідних молекул полінуклеотидів або олігонуклеотидів, обумовлених в описі, і/або здатні до гібридизації з геномом пшениці. Наприклад, варіанти можуть включати додаткові нуклеотиди (наприклад, 1, 2, 3, 4 або більше) або менше число нуклеотидів за умови, що вони усе ще гібридизуються з ділянкою-мішенню. Крім того, невелике число нуклеотидів може бути заміщене без здійснення впливу на здатність олігонуклеотида до гібридизації з ділянкою-мішенню. Крім того, можуть бути легко створені варіанти, що гібридизуються приблизно, наприклад, у межах 50 нуклеотидів, ділянки генома рослин, з яким гібридизуються конкретні олігонуклеотиди, визначені в даному описі. Зокрема, вони включають полінуклеотиди, що кодують той же поліпептид або амінокислотну послідовність, але які відрізняються по нуклеотидній послідовності завдяки надмірності генетичного коду. Терміни "варіант полінуклеотиду" і "варіант" також включають природні алельні варіанти. Конструкції нуклеїнових кислот Даний винахід включає конструкції нуклеїнових кислот, що містять полінуклеотиди за даним винаходом, і вектори, що містять, і клітини-хазяїни, способи їхнього одержання і використання й галузі їхнього застосування. Даний винахід належить до елементів, що функціонально з'єднані або зв'язані. Терміни "функціонально з'єднані" або "функціонально зв'язані" і т. п. належать до сполуки полінуклеотидних елементів у функціональномвідносно. Звичайно функціонально з'єднані послідовності нуклеїнових кислот є зв'язаними при зіткненні і, при необхідності сполучення двох кодуючих білки ділянок такими, що стикаються і знаходяться в рамці зчитування. Кодуюча послідовність "функціонально з'єднана" з іншою кодуючою послідовністю, 14 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 коли РНК-полімераза буде транскрибувати дві кодуючі послідовності у єдину РНК, що, у випадку її трансляції, потім транслюється в єдиний поліпептид, що має амінокислоти, що походять з обох кодуючих послідовностей. Не потрібно, щоб кодуючі послідовності були дотичними одна з одною за умови, що експресовані послідовності піддаються, у кінцевому рахунку, процесингу з утворенням бажаного білка. Варто вважати, що використовуваний в описі термін "діюча в цис-положенні послідовність", "діючий у цис-положенії елемент" або "цис-регуляторна ділянка", або "регуляторна ділянка", або аналогічний термін означає будь-яку послідовність нуклеотидів, що, при її відповідному розташуванні і з'єднані відносно експресованої генетичної послідовності, здатна регулювати, принаймні частково, експресію генетичної послідовності. Кваліфіковані в даній галузі техніки фахівці знають, що цис-регуляторна ділянка може бути здатна до активації, глушіння, посилення, пригнічення або іншої зміни рівня експресії і/або специфічності відносно типу клітин і/або специфічності відносно стадії розвитку послідовності гена на транскрипційному або посттранскрипційному рівні. У переважному варіанті здійснення даного винаходу діючою в цисположенні послідовністю є послідовність активатора, що підсилює або стимулює експресію експресованої генетичної послідовності. "Функціональна сполука" елемента промотору або енхансера з транскрибованим полінуклеотидом означає поміщення транскрибованого полінуклеотиду (наприклад, кодуючого білок полінуклеотиду або іншого транскрипта) під регуляторний контроль промотору, що у такому випадку контролює транскрипцію цього полінуклеотиду. При конструюванні сполучень гетерологічний промотор/структурний ген, як правило, переважним є поміщення промотору або його варіанта на відстані від місця початку транскрипції транскрибованого полінуклеотиду, що є приблизно однаковим з відстанню між цим промотором і кодуючою білок ділянкою, яку він контролює, у його природній установці; тобто, гені, від якого походить промотор. Як це відомо в даній галузі техніки, деяка зміна цієї відстані може бути забезпечена без втрати функції. Аналогічно, переважне розташування елемента регуляторних послідовностей (наприклад, оператора, енхансера і т. д.) відносно транскрибованого полінуклеотиду, що поміщається під його контроль, визначається розташуванням елемента в його природній установці; тобто, генах, від яких він походить. Як використовується в даному описі, "промотор" або "промоторна послідовність" належить до галузі гена, звичайно розташованої проти ходу транскрипції (5') РНК-кодуючої ділянки, що контролює ініціацію і рівень транскрипції в клітині, що представляє інтерес. "Промотор" включає регулюючі транскрипцію послідовності класичного гена в геномі, такі як послідовності у вигляді TATA-боксу і CCAAT-боксу, а також додаткові регуляторні елементи (тобто, розташовані проти ходу транскрипції активуючої послідовності, енхансери і сайленсери), що змінюють експресію гена у відповідь на пов'язані з розвитком стимули і/або стимули навколишнього середовища, або тканиноспецифічним або специфічним відносно типу клітин чином. Промотор звичайно, але не обов'язково (наприклад, у випадку промоторів для полімерази III) розташований у напрямку 5' від структурного гена, експресію якого він регулює. Крім того, регуляторні елементи, що включають промотор, звичайно розташовуються в межах 2 т. п. о. від місця початку транскрипції гена. Промотори можуть містити додаткові специфічні регуляторні елементи, розташовані дистальніше від місця початку транскрипції, для додаткового посилення експресії в клітині і/або зміни вибору або часу індуцибельності експресії структурного гена, з яким він функціонально з'єднаний. "Конститутивний промотор" належить до промотору, що керує експресією функціонально зв'язаної з ним транскрибованої послідовності в багатьох або всіх тканинах організму, такого як рослина. Використовуваний в описі термін "конститутивний" необов'язково означає, що ген експресується на однаковому рівні у всіх типах клітин, а означає, що ген експресується в широкому діапазоні типів клітин, хоча часто виявляється деяка варіація в рівні експресії. Як використовується в даному описі, "виборча експресія" належить до експресії майже винятково в специфічних органах, наприклад, рослини, таких як, наприклад, ендосперм, зародок, листя, фрукт, пилкові трубки або корінь. У переважному варіанті здійснення промотор регулює експресію вибірково або переважно в листі і/або стеблах рослини, переважно, хлібного злаку. Отже, виборчу експресію можна порівняти з конститутивною експресією, що належить до експресії в багатьох або всіх тканинах рослини в більшій частині або у всіх умовах, що переносяться рослиною. Виборча експресія може також приводити до компартменталізації продуктів експресії генів у специфічних тканинах, органах рослини або на стадіях розвитку рослини. Досягти компартменталізації в специфічних субклітинних місцях, таких як пластид, цитозоль, вакуоль або апопластичний простір, можна за допомогою включення в структуру генного продукту 15 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідних сигналів, наприклад, сигнального пептиду, для перенесення в необхідний клітинний компартмент, або у випадку напівавтономних органел (пластид і мітохондрій) за допомогою інтеграції трансгена з відповідними регуляторними послідовностями безпосередньо в геном органели. "Тканиноспецифічним промотором" або "органоспецифічним промотором" є промотор, що, переважно, регулює експресію в одній тканині або органі щодо багатьох інших тканин або органів, переважно більшої частини, якщо не всіх інших тканин або органів, наприклад, рослини. Звичайно експресія з промотору в специфічній тканині або органі відбувається на рівні, що перевищує в 10 разів рівень в інших тканинах або органах. Передбачувані даним винаходом промотори, можуть бути нативними щодо рослини-хазяїна, що трансформується, або можуть походити з альтернативного джерела, причому промоторна ділянка є функціональною в рослині-хазяїні. Інші джерела включають гени Т-ДНК Agrobacterium, такі як промотори генів для біосинтезу нопаліну, октапіну, манопіну або інші промотори опінів, тканиноспецифічні промотори (див., наприклад, патент США № 5459252 і WO 91/13992); промотори з вірусів (включаючи специфічні для хазяїна віруси) або частково або повністю синтетичні промотори. Численні промотори, що є функціональними в однодольних і дводольних рослинах, включаючи різні промотори, виділені з рослин і вірусів, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV 35S, 19S), широко відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Greve, 1983; Salomon et al, 1984; Garfinkel et al, 1983; Barker et al, 1983). Не обмежуючі способи оцінки активності промоторів описані Medberryet al. (1992, 1993), Sambrook et al. (1989, вище) і в патенті США № 5164316. Альтернативно або додатково, промотор може бути індуцибельним промотором або регульованим у процесі розвитку промотором, що здатний до керування експресією введеного полінуклеотиду на відповідній стадії розвитку, наприклад, рослини. Інші діючі в цис-положенні послідовності, що можуть бути використані, включають енхансери транскрипції і/або трансляції. Енхансерні ділянки добре відомі кваліфікованими в даній галузі техніки фахівцям і можуть включати кодон ініціації трансляції - ATG і послідовності, що примикають до нього. При включенні, кодон ініціації повинний бути синфазним з рамкою зчитування кодуючої послідовності, що має відношення до чужорідного або екзогенного полінуклеотиду, для забезпечення трансляції повної послідовності, якщо вона повинна бути трансльована. Ділянки ініціації трансляції можуть бути надані з джерела ділянки ініціації транскрипції або з чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. Послідовність може також походити з джерела промотору, вибраного для керування транскрипцією, і може бути специфічним чином модифікована для збільшення трансляції мРНК. У варіанті здійснення промотор, принаймні, здатний до експресії поліпептиду в листі рослини, переважно, листі дорослої рослини. Приклади специфічних для листя промоторів, що можуть бути використані, включають промотори, що описані Yamamoto et al. (1994 and 1997), Kwon et al. (1994), Gotor et al. (1993), Orozco et al. (1993), Matsuoka et al. (1993) і Stockhaus et al. (1987 and 1989). Конструкція нуклеїнової кислоти за даним винаходом може включати 3" нетрансльовану послідовність із приблизно 50-1000 пар нуклеотидних основ, що може включати послідовність термінації транскрипції. 3" нетрансльована послідовність може містити сигнал термінації транскрипції, що може включати або може не включати сигнал поліаденілування і будь-які інші регуляторні сигнали, здатні до впливу на процесування мРНК. Сигнал поліаденілування функціонує з метою додавання ділянок з поліаденілової кислоти до 3’-кінця попередника мРНК. Сигнали поліаденілування звичайно розпізнаються по наявності гомології з канонічною формою 5’-AATAAA-3", хоча не рідкими є варіації. Послідовності термінації транскрипції, що не включають сигнал поліаденілування, включають термінатори для РНК-полімерази I або III, що містять відрізок з чотирьох або більше тимідинів. Прикладами прийнятних 3" нетрансльованих послідовностей є 3" транскрибовані, нетрансльовані ділянки, що містять сигнал поліаденілування з гена октопінсинтази (ocs) або гена нопалінсинтази (nos) Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983). Прийнятні 3' нетрансльовані послідовності можуть також походити з генів рослин, таких як ген рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази (ssRUBISCO), хоча також можуть бути використані інші 3' елементи, відомі кваліфікованим в даній галузі техніки фахівцям. Тому що послідовність ДНК, вбудована між сайтом ініціації транскрипції і початком кодуючої послідовності, тобто, нетрансльована 5" лідерна послідовність (5’UTR), може впливати на експресію гена, якщо він транслюється, а також транскрибується, може також використовуватися конкретна лідерна послідовність. Прийнятні лідерні послідовності включають ті, що містять послідовності, вибирані для приведення в дію оптимальної експресії чужорідної 16 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або ендогенної послідовності ДНК. Наприклад, такі лідерні послідовності включають переважну консенсусну послідовність, що може збільшувати або підтримувати стабільність мРНК і запобігати неприйнятній ініціації трансляції, як, наприклад, описано Joshi (1987). Вектори Даний винахід включає використання векторів для маніпуляції з генетичними конструкціями або їхнього перенесення. Під "химерним вектором" мається на увазі молекула нуклеїнової кислоти, переважно, молекула ДНК, що походить, наприклад, із плазміди, або бактеріофага вірусу рослин, у яку була вбудована або клонована послідовність нуклеїнової кислоти. Вектор, переважно, є дволанцюжковою ДНК і містить один або більше унікальних сайтів рестрикції і може бути здатним до автономної реплікації в заданій клітині-хазяїні, включаючи цільову клітину або тканину, або клітину або тканину, що є її попередником, або здатним до інтеграції в геном заданого хазяїна, так що клонована послідовність репродукується. Відповідно, вектор може бути вектором, що автономно реплікується, тобто, вектором, що існує у вигляді позахромосомної молекули, реплікація якої не залежить від реплікації хромосом(и), наприклад, лінійної або замкнутої кільцевою плазмідою, позахромосомним елементом, мініхромосомою або штучною хромосомою. Вектор може містити будь-який засіб для забезпечення самореплікації. Альтернативно, вектором може бути вектор, що після введення в клітину інтегрується в геном реципієнтної клітини і реплікується разом із хромосомою(ами), у яку він був інтегрований. Векторна система може включати один вектор або плазміду, два або більше або вектори плазмід, що разом містять сумарну ДНК, яку необхідно ввести в геном клітини-хазяїна, або транспозон. Вибір вектора буде, як правило, залежати від сумісності вектора з клітиною, у яку повинний бути уведений вектор. Вектор може також включати селектований маркер, такий як ген резистентності до антибіотика, ген резистентності до гербіциду або інші гени, які можна використовувати для відбору прийнятних трансформантів. Приклади таких генів добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям. Конструкцію нуклеїнової кислоти за даним винаходом можна вмонтувати в такий вектор, як плазміда. Плазмідні вектори звичайно включають додаткові послідовності нуклеїнових кислот, що забезпечують легкість відбору, ампліфікації і трансформації експресійної касети в прокаріотичні і еукаріотичні клітини, наприклад, pUC-похідні вектори, pSK-похідні вектори, pGEM-похідні вектори, pSP-похідні вектори, pBS-похідні вектори або бінарні вектори, що містять одну або більше ділянок T-ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають оріджини реплікації для забезпечення автономної реплікації вектора, гени селектованих маркерів, що, переважно, кодують резистентність до антибіотиків або гербіцидів, унікальні множинні сайти для клонування, що передбачають множину сайтів для вбудовування послідовностей нуклеїнових кислот або генів, кодованих у конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовності, що сприяють трансформації прокаріотичних і еукаріотичних клітин (особливо клітин рослин). Під "маркерним геном" мається на увазі ген, що додає експресуючим маркерний ген клітинам фенотип, що відрізняється, і, отже, дозволяє відрізнити такі трансформовані клітини від клітин, що не мають такого маркера. Селектований маркерний ген додає характерної властивості, через наявність якої можна провести "відбір", ґрунтуючись на резистентності до селективного агента (наприклад, гербіциду, антибіотика, опромінення, нагрівання або іншої обробки, шкідливої для нетрансформованих клітин). Селектований маркерний ген (або репортерний ген) додає характерної властивості, яку можна ідентифікувати за допомогою спостереження або дослідження, тобто, за допомогою "скринінгу" (наприклад, βглюкуронидазну, люциферазну, GFP- або іншу ферментативну активність, що не присутня у нетрансформованих клітинах). Маркерний ген і нуклеотидну послідовність, що представляє інтерес, не повинні бути зв'язаними. Для полегшення ідентифікації трансформантів бажано, щоб конструкція нуклеїнової кислоти включала селектований або який піддається скринінгу маркерний ген у вигляді, або крім, чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. Фактичний вибір маркера не є вирішальним за умови, що він є функціональним (тобто, селектований) у поєднанні з переважними клітинами рослини. Маркерний ген і чужорідний або екзогенний полінуклеотид, що представляє інтерес, не повинні бути зв'язаними, оскільки котрансформація незв'язаних генів, описана, наприклад, у патенті США № 4399216, також є ефективним способом при трансформації рослин. Прикладами бактеріальних селектованих маркерів є маркери, що додають резистентності до антибіотиків, такої як резистентність до ампіциліну, еритроміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну, переважно, резистентність до канаміцину. Селектовані маркери, що приводяться як приклади, для відбору трансформантів рослин включають, але не обмежуються ними, ген hyg, що кодує резистентність до гігроміцину В; ген неоміцин-фосфотрансферази (nptII), що 17 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 додає резистентності до канаміцину, паромоміцину, G418; ген глутатіон-S-трансферази з печінки щура, що додає резистентності до гербіцидів - похідних глутатіону, описаний, наприклад, у EP 256223; ген глутамінсинтетази, що додає, при надекспресії, резистентності до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, описаний, наприклад, у WO 87/05327, ген ацетилтрансферази з Streptomyces viridochromogenes, що додає резистентності до селективного агента - фосфінотрицину, описаний, наприклад, у EP 275957, ген, що кодує 5енолшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), що додає стійкість до N-фосфонометилгліцину, описаний, наприклад, Hincheeet al. (1988), ген bar, що додає резистентності до біалафосу, описаний, наприклад, у WO91/02071; ген нітрилази, такий як bxn з Klebsiella ozaenae, що додає резистентності до бромоксинілу (Stalker et al., 1988); ген дигідрофолатредуктази (DHFR), що додає резистентності до метотрексату (Thillet et al., 1988); мутантний ген ацетолактатсинтази (ALS), що додає резистентності до імідазолінону, сульфонілсечовини або інших ALS-інгібуючих хімічних речовин (EP 154204); мутований ген антранілатсинтази, що додає резистентності до 5метилтриптофану; або ген далапон-дегалогенази, що додає резистентності до гербіциду. Переважні маркери, що піддаються відбору, включають, але не обмежуються ними, ген uid, що кодує фермент β-глюкуронідазу (GUS), для якого відомі різні хромогенні субстрати, ген βгалактозидази, що кодує фермент, для якого відомі різні хромогенні субстрати, ген екворину (Prasher et al., 1985), що може використовуватися при кальцій-чутливому біолюмінесцентному виявленні; ген зеленого флуоресцентного білка (Niedz et al., 1995) або його похідні; ген люциферази (luc) (Ow et al., 1986), що уможливлює біолюмінесцентне виявлення, і інші, відомі в даній галузі техніки. Під "репортерною молекулою", як використовується в описі даного винаходу, мається на увазі молекула, що, завдяки своїй хімічній природі, забезпечує аналітично ідентифікований сигнал, що сприяє визначенню активності промотору на основі білкового продукту. Переважно, конструкція нуклеїнової кислоти стійко включена в геном, наприклад, рослини. Відповідно, нуклеїнова кислота включає відповідні елементи, що уможливлюють включення молекули в геном, або конструкцію поміщають у прийнятний вектор, що може бути включений у хромосому клітини рослини. Один варіант здійснення даного винаходу включає рекомбінантний вектор, що включає, принаймні, одну молекулу полінуклеотиду за даним винаходом, вбудований у будь-який вектор, здатний доставляти молекулу нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна. Такий вектор містить гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот, що є послідовностями нуклеїнових кислот, що не зустрічаються в природі поблизу молекул нуклеїнових кислот за даним винаходом і які переважно походять від видів, відмінних від виду, від якого походить молекула(и) нуклеїнової кислоти. Вектором може бути або РНК, або ДНК, або прокаріотична, або еукаріотична, і звичайно він являє собою вірус або плазміду. Ряд векторів, прийнятних для стабільної трансфекції клітин рослин або для створення трансгенних рослин, описаний, наприклад, у Pouwels et al, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; і Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Як правило, вектори для експресії в клітинах рослин включають, наприклад, один або більше клонованих генів рослин під транскрипційним контролем 5' і 3' регуляторних послідовностей і домінантний селектований маркер. Такі вектори для експресії в клітинах рослин також можуть містити регулюючу промотор ділянку (наприклад, регуляторну ділянку, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану факторами навколишнього середовища або в процесі розвитку, або клітинно- або тканиноспецифічну експресію), сайт початку ініціації транскрипції, сайт зв'язування рибосоми, сигнал для процесування РНК, сайт термінації транскрипції і/або сигнал поліаденілування. Рівень білка, наприклад, білка Lr34, можна модулювати за допомогою збільшення рівня експресії нуклеотидної послідовності, що кодує білок у клітині рослини, або зниження рівня експресії гена, що кодує білок у рослині, що приводить до зміни резистентності до патогену. Рівень експресії гена можна модулювати шляхом зміни числа копій у кожній клітині, наприклад, шляхом уведення синтетичної генетичної конструкції, що включає кодуючи послідовність і контролюючий транскрипцію елемент, що функціонально з'єднаний з нею і який є функціонуючим у клітині. Множина трансформантів можна вибрати і піддати скринінгу для трансформантів із прийнятним рівнем і/або специфічністю експресії трансгена, що обумовлені ефектами ендогенних послідовностей поблизу сайта інтеграції трансгена. Прийнятним рівнем і картиною експресії трансгена є ті, котрі приводять до значної зміни резистентності до патогену або іншого фенотипу. Альтернативно, сукупність підданого мутагенезу насіння або популяцію 18 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рослин із селекційної програми можна піддати скринінгу для окремих ліній зі зміненою резистентністю до патогену або іншим фенотипом, зв'язаним з резистентністю до патогену. Рекомбінантні клітини Інший варіант здійснення даного винаходу включає рекомбінантну клітину, що містить клітину-хазяїна, трансформовану однією або більше рекомбінантними молекулами за даним винаходом, або клітинах, що являються їхніми нащадками. Трансформацію молекули нуклеїнової кислоти в клітину можна виконати будь-яким способом, за допомогою якого молекула нуклеїнової кислоти може бути вставлена в клітину. Методи трансформації включають, але не обмежуються ними, трансфекцію, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, абсорбцію і злиття протопластів. Рекомбінантна клітина може залишатися одноклітинною або може розростатися в тканину, орган або багатоклітинний організм. Трансформовані молекули нуклеїнових кислот за даним винаходом можуть залишатися позахромосомними або можуть інтегруватися в один або більше сайтів усередині хромосоми трансформованої (тобто, рекомбінантної) клітини таким чином, що їхня здатність бути експресованими зберігається. Переважними клітинами-хазяїнами є клітини рослини, більш переважно, клітини хлібного злаку, більш переважно, клітини ячменю або пшениці і ще більш переважно клітина пшениці. Трансгенні рослини Термін "рослина", використовуваний в описі як іменник, належить до цілісних рослин і належить до будь-якого члена царства рослин, але при використанні як прикметника належить до будь-якої речовини, що присутня у рослині, отриманій з нього, походить від його або належить до нього, такого як, наприклад, органи рослини (наприклад, листки, стебла, коріння, квіти), одиночні клітини (наприклад, пилок), насіння, клітини рослини і т. п. Проростки і пророслі насіння, з яких вийшли корінці і паростки, також включені в значення "рослина". Використовуваний в описі термін "частини рослини" належить до однієї або більше тканин або органів рослини, що отримані з рослини і які містять геномну ДНК рослини. Частини рослини включають вегетативні структури (наприклад, листя, стебла), коріння, квіткові органи/структури, насіння (включаючи зародок, сім'ядолі і насінну оболонку), тканину рослини (наприклад, судинну тканину, основну паренхіму і т. п.), клітини і їхнє потомство. Використовуваний в описі термін "клітина рослини" належить до клітини, отриманої з або такої, що знаходиться в рослині, і включає протопласти або інші клітини, що походять від рослин, продукуючі гамети клітини і клітини, що регенеруються в цілісні рослини. Клітинами рослин можуть бути клітини в культурі. Під "тканиною рослини" мається на увазі диференційована тканина, що присутня у рослині або отримана з рослини ("експлант"), або недиференційована тканина, що походить від незрілих або зрілих зародків, насіння, коріння, проростків, фруктів, пилкових трубок, пилка, пухлинної тканини, такої як коренева пухлина, і різні форми агрегацій клітин рослини в культурі, такі як калюси. Тканинами рослин, що приводяться як прикладів, у насінні або з них є сім'ядоля, зародок і рубчик. Відповідно, даний винахід включає рослини і частини рослин і продукти, що їх містять, зокрема, насіння, що містить модифіковану масляну композицію. Використовуваний в описі термін "насіння" належить до "зрілого насіння" рослини, що або готове для збирання, або було зібрано з рослини, наприклад, насіння, що звичайно збирають з комерційною метою в полі, або « насіння, що розвивається", що зустрічається в рослини після запилення і до встановлення спокою насіння, а також після його збирання. Як використовується в даному описі, "трансгенна рослина" належить до рослини, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що не зустрічається в рослини дикого типу того ж виду, різновиди або сорти. Тобто, трансгенні рослини (трансформовані рослини) містять генетичний матеріал (трансген), який вони не містили до трансформації. Трансген може включати генетичні послідовності, отримані з клітини рослини або що походять від його або іншої клітини рослини, або нерослинного джерела, або синтетичну послідовність. Як правило, трансген введений у рослину за допомогою виробленою людиною маніпуляції, такий як, наприклад, трансформація, але може бути використаний будь-який спосіб, як це зрозуміло кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю. Генетичний матеріал, переважно, стійко інтегрований у геном рослини. Генетичний матеріал, що вводиться, може включати послідовності, що зустрічаються в природі в того ж виду, але в порядку з перестановками або в різному розташуванні елементів, наприклад, антисмислову послідовність. Рослини, що містять такі послідовності, включені в описі в термін "трансгенні рослини". "Нетрансгенна рослина" являє собою рослину, що не була генетично модифікована за допомогою введення генетичного матеріалу з використанням методів рекомбінантних ДНК. У переважному варіанті здійснення трансгенні рослини є гомозиготними по кожному і будь-якому гену, що був уведений (трансгену), так що їхнє потомство не розщеплюється відносно бажаного фенотипу. 19 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як використовується в даному описі, термін "у порівнянні з ізогенною рослиною" належить до рослини, що є ізогенною відносно трансгенної рослини, але без транс гена, що представляє інтерес. Переважно, відповідна нетрансгенна рослина є рослиною того ж сорту або різновиду, що і прабатько трансгенної рослини, що представляє інтерес, або родинною лінією рослин, у якій відсутня конструкція, що часто називається "сегрегантом", або рослиною того ж сорту або різновиду, трансформованим конструкцією - "порожнім вектором", і може бути нетрансгенною рослиною. Як використовується в даному описі, "дикий тип" належить до клітини, тканини або рослини, що не були модифіковані відповідно до даного винаходу. Клітини, тканина або рослина дикого типу можуть бути використані як контролі для порівняння рівнів експресії екзогенної нуклеїнової або кислоти ступені і природи модифікації ознаки з клітинами, тканиною або рослинами, модифікованими, як описується в даному документі. Трансгенні рослини, обумовлені в зв'язку з даним винаходом, включають потомство рослин, що були генетично модифіковані з використанням рекомбінантних методів, причому потомство включає транс ген, що представляє інтерес. Таке потомство може бути отримане за допомогою самозапилення первинного трансгенного або рослини за допомогою схрещування таких рослин з іншою рослиною того ж виду. Звичайно це повинно було б приводити до модуляції продукції, принаймні, одного описуваного тут білка в бажаній рослині або органі рослини. Частини трансгенних рослин включають усі частини і клітини зазначених рослин, що містять трансген, такі як, наприклад, піддані культивуванню тканини, калюс і протопласти. Рослини, призначені для застосування на практиці даного винаходу, включають як однодольні, так і дводольні рослини. Цільові рослини включають, але не обмежуються ними, наступні рослини: хлібні злаки (наприклад, пшеницю, ячмінь, жито, овес, рис, кукурудзу, сорго і родинні зернові культури); буряк (цукровий буряк і кормовий буряк); плід зерняткових, кісточковий плід і ягоду (яблука, груші, сливи, персики, мигдаль, вишню, полуницю, малину й ожину); рослини сімейства бобових (боби, сочевицю, горох, сою); олійні культури (рапс або інші Brassicas, гірчицю, мак, маслину, соняшник, сафлор, льон, кокосову пальму, рослини, з яких одержують рицинову олію, боби какао, арахіс); рослини сімейства гарбузових (кабачок, огірок, диню); волокнисті рослини (бавовна, льон, коноплі, джут); цитрусові (апельсини, лимони, грейпфрут, мандарини); овочі (шпинат, салат-латук, спаржу, капусту, моркву, цибулю, помідори, картоплю, паприку); лаврові (авокадо, корицю, камфорний лавр); або такі рослини, як кукурудза, тютюн, горіх, кавове дерево, цукрову тростину, чай, виноград, хміль звичайний, дерен, банан і каучуконосні рослини, а також декоративні рослини (квіти, чагарники, широколисті дерева і вічнозелені рослини, такі як хвойні дерева). Переважно, рослина являє собою хлібний злак, більш переважно, пшеницю, рис, кукурудзу, тритикале, овес або ячмінь, ще більш переважно пшеницю. Використовуваний в описі термін "пшениця" належить до будь-яких видів роду Triticum, включаючи їхніх прабатьків, а також до їхнього потомства, отриманого при схрещуваннях з іншими видами. Пшениця включає "гексаплоїдну пшеницю", що характеризується геномною організацією AABBDD, складеною з 42 хромосом, і "тетраплоїдну пшеницю", що характеризується геномною організацією AABB, складеною з 28 хромосом. Гексаплоїдна пшениця включає T. aestivum, T. spelta, T. macha, T. compactum, T. sphaerococcum, T. vavilovii і їхні міжвидові гібриди. Переважним видом гексаплоїдної пшениці є T. aestivum ssp aestivum (що також називається "пшеницею звичайною"). Тетраплоїдна пшениця включає T. durum (згадується також в описі як тверда пшениця або Triticum turgidum ssp. durum), T. dicoccoides, T. dicoccum, T. polonicum і їхні міжвидові гібриди. Крім того, термін "пшениця" включає можливих прабатьків гексаплоїдного або тетраплоїдного Triticum sp., таких як T. uartu, T. monococcum або T. boeoticum, відносно А-генома, Aegilops speltoides відносно В-генома і T. tauschii (також відомого як Aegilops squarrosa або Aegilops tauschii) відносно D-генома. Особливо переважними прабатьками є джерела A-генома, ще більш переважно, джерелом A-генома є T. monococcum. Сорт пшениці для застосування в даному винаході може належати, але цим не обмежуючи, до кожного з перерахованих вище видів. Також охоплюються рослини, що одержують загальноприйнятими методами з використанням Triticum sp. як батька при статевому схрещуванні з видом, що не є Triticum (таким як жито [Secale cereale]), включаючи, але цим не обмежуючи, Triticale. Використовуваний в описі термін "ячмінь" належить до будь-яких видів роду Hordeum, у тому числі їхніх прабатьків, а також їхнього потомства, отриманого при схрещуваннях з іншими видами. Переважно, коли рослиною є рослина виду Hordeum, що обробляють з комерційною метою, така як, наприклад, лінія або сорт, або різновид Hordeum vulgare, або прийнятна для промислового виробництва зерна. 20 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансгенні рослини, обумовлені в зв'язку з даним винаходом, включають рослини (а також частини і клітини зазначених рослин) і потомство рослин, що були генетично модифіковані з використанням рекомбінантних методів, що викликає продукцію, принаймні, одного поліпептиду за даним винаходом в бажаній рослині або органі рослини. Трансгенні рослини можна одержати, використовуючи відомі в даній галузі методи, такі як ті, що в загальному описані в публікації A. Slater et al., Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), і PН. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004). У переважному варіанті здійснення трансгенні рослини є гомозиготними по кожному і будьякому гену, що був уведений (трансгену), так що їхнє потомство не розщеплюється відносно бажаного фенотипу. Трансгенні рослини можуть також бути гетерозиготними по введеному трансгену(ам), такими як, наприклад, у потомстві F1, що було вирощено з гібридного насіння. Такі рослини можуть дати переваги, такі як гібридна сила, що добре відомо в даній галузі техніки. Були описані чотири основних способи безпосередньої доставки гена в клітини: (1) хімічні способи (Graham et al., 1973); (2) фізичні способи, такі як мікроін'єкція (Capecchi, 1980); електропорація (див., наприклад, WO 87/06614, патент США № 5472869, патент США № 5384253, WO 92/09696 і WO 93/21335); і генна гармата (див., наприклад, патент США № 4945050 і патент США № 5141131); (3) вірусні вектори (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et al., 1988); і (4) рецептор-рецептор-опосередковані механізми (Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992). Способи збільшення швидкості, що можуть бути використані, включають, наприклад, бомбардування мікрочастинками і т. п. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот у клітини рослини є бомбардування мікрочастинками. Огляд цього способу був представлений Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небіологічні частинки (мікрочастинки) можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини за допомогою реактивної сили. Частинки, що приводяться як приклади, включають частинки, складені з вольфраму, золота, платини і т. п. Особливою перевагою бомбардування мікрочастинками, крім того, що вона є ефективним способом відтвореної трансформації однодольних рослин, є те, що не потрібно ні виділення протопластів, ні чутливості до інфікування Agrobacterium. Системою доставки частинок, що підходить для застосування в даному винаході, є гелева гармата для збільшення швидкості PDS-1000/He, доступна від Bio-Rad Laboratories. Для бомбардування незрілі зародки або похідні клітини-мішені, такі як щиток зародка або калюс з незрілих зародків, можна розмістити на твердому культуральному середовищі. В іншому альтернативному варіанті здійснення можна стабільно трансформувати пластиди. Описані способи трансформації пластид у вищих рослин включають доставку з використанням гармати для частинок ДНК, що містить селектований маркер, і напрямок ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (патент США № 5451513, патент США № 5545818, патент США № 5877402, патент США № 5932479 і WO 99/05265). Agrobacterium-опосередковане перенесення є широко застосовною системою для введення генів у клітини рослин, оскільки ДНК можна ввести в тканини цілісних рослин, обходячи тим самим необхідність у регенерації інтактного рослини з протопласта. Використання Agrobacterium-опосередкованої інтеграції в рослини векторів для введення ДНК у клітини рослин добре відомо в даній галузі техніки (див., наприклад, патент США № 5177010, патент США № 5104310, патент США № 5004863, патент США № 5159135). Крім того, інтеграція T-ДНК є відносно точним способом, що приводить до невеликого числа перестановок. Область ДНК, що піддається перенесенню, визначається прикордонними послідовностями, і ДНК, що знаходиться між ними, звичайно вбудовується в геном рослини. Вектори для трансформації Agrobacterium здатні до реплікації в E. coli, а також Agrobacterium, що дозволяє робити прийнятні маніпуляції, як описано (Klee et al., Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, (editors), Springer-Verlag, New York, (1985): 179-203). Крім того, технологічні переваги у векторах для Agrobacterium-опосередкованого перенесення генів поліпшили розташування генів і сайтів рестрикції у векторах, полегшуючи конструювання векторів, здатних експресувати різні гени, що кодують поліпептиди. Описані вектори мають зручні багатолінкерні ділянки, фланковані промотором і сайтом поліаденілування для керування експресією вбудованих генів, що кодують поліпептиди, і підходять для цілей даного винаходу. Крім того, для трансформацій можна використовувати Agrobacterium, що містить як готові до дії, так і не готові до дії гени Ti-плазмід. Для сортів рослин, відносно яких Agrobacteriumопосередкований спосіб трансформації є ефективним, він є переважним способом унаслідок легкості виконання і заданого характеру перенесення генів. 21 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Трансгенна рослина, створена способами трансформації з використанням Agrobacterium, звичайно містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можна назвати гемізиготними по доданому гену. Більш переважною є трансгенна рослина, що є гомозиготною по доданому структурному гену; тобто, трансгенна рослина, що містить два доданих гени, один ген у тому самому локусі на кожній хромосомі хромосомної пари. Гомозиготну трансгенну рослину можна одержати за допомогою статевого схрещування (самозапилення), що представляє собою незалежний сегрегант трансгенної рослини, що містить єдиний доданий ген, пророщення деяких з отриманого насіння і аналізу отриманих рослин на наявність гена, що представляє інтерес. Також повинно бути зрозуміло, що дві різні трансгенні рослини можна також схрестити з одержанням потомства, що містить два незалежно сегрегуючих екзогенних гени. Самозапилення відповідного потомства може дати рослини, що є гомозиготними по обох екзогенних генах. Також передбачається зворотне схрещування з батьківською формою рослини й ауткросинг із нетрансгенною рослиною, як і вегетативне розмноження. Описи інших способів селекції, що звичайно використовуються для різних ознак і зернових культур, можна знайти в публікації Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (editor) American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987). Трансформації рослинних протопластів можна домогтися, використовуючи способи, основані на преципітації фосфатом кальцію, обробці поліетиленгліколем, електропорації і комбінаціях цих обробок. Застосування цих систем для різних сортів рослин залежить від здатності до регенерації цієї конкретної лінії рослин із протопластів. Ілюстративні способи регенерації хлібних злаків із протопластів описані (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al, 1986). Інші способи трансформації клітин можуть також використовуватися і включають, але не обмежуються ними, уведення ДНК у рослини прямим перенесенням ДНК у пилок, прямою ін'єкцією ДНК у репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих зародків з наступною регідратацією зневоднених зародків. Регенерація, розвиток і вирощування рослин із трансформантів у вигляді одиничних рослинних протопластів або з різних трансформованих експлантів добре відомо в даній галузі техніки (Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988)). Цей процес регенерації і вирощування звичайно включає стадії відбору трансформованих клітин, культивування цих окремих клітин із проходженням звичайних стадій ембріонального розвитку через стадії паростка з коренями. Трансгенні зародки і насіння регенерують аналогічно. Згодом отримані трансгенні проростки з коренями висаджують у прийнятне середовище для росту рослин, таке як земля. Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомі в даній галузі техніки. Переважно, регенеровані рослини самозапилюються для забезпечення гомозиготних трансгенних рослин. У протилежному випадку, пилок, отриманий від регенерованих рослин, переправляють у вирощені з насіння рослини агрономічно важливих ліній. І навпаки, пилок від рослин цих важливих ліній використовують для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину за даним винаходом, що містить бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, вирощують, використовуючи способи, добре відомі кваліфікованому в даній галузі техніки фахівцю. Способи трансформації дводольних рослин, головним чином, за допомогою використання Agrobacterium tumefaciens, і одержання трансгенних рослин були опубліковані для бавовни (патент США № 5004863, патент США № 5159135, патент США № 5518908); сої (патент США № 5569834, патент США № 5416011); Brassica (патент США № 5463174); арахісу (Cheng et al, 1996) і гороху (Grant et al, 1995). Способи трансформації хлібних злаків, таких як пшениця і ячмінь, для внесення генетичної варіації в рослину за допомогою введення екзогенної нуклеїнової кислоти і регенерації рослин з протопластів або незрілих зародків рослин добре відомі в даній галузі техніки, див., наприклад, CA 2092588, AU 61781/94, AU 667939, патент США 6100447, WO 97/048814, патент США 5589617, патент США 6541257, а інші способи викладені в WO 99/14314. Переважно, трансгенну пшеницю або ячмінь одержують за допомогою способів трансформації з використанням Agrobacterium tumefaciens. Вектори, що несуть бажану конструкцію нуклеїнової кислоти, можна вводити в клітини регенерованої пшениці - вирощуваних із тканин рослин або експлантів, або в прийнятні рослинні системи, такі як протопласти. Клітини регенерованої пшениці є переважно клітинами з щитка незрілих зародків, зрілих зародків, калюса, що походить з них, або меристеми. 22 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для підтвердження присутності трансгенів у трансгенних клітинах і рослинах можна виконати ампліфікацію з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз з використанням блотингу по Саузерну, використовуючи способи, відомі кваліфікованої в даній галузі техніки фахівцям. Продукти експресії трансгенів можна виявити будь-яким з множини способів, у залежності від природи продукту, і вони включають Вестерн-блотинг або ферментний аналіз. Одним особливо придатним способом кількісного аналізу експресії білків і виявлення реплікації в різних тканинах рослин є використання репортерного гена, такого як GUS. Після одержання трансгенних рослин їх можна вирощувати для одержання тканин або частин рослин, що мають бажаний фенотип. Можна зібрати тканину рослини або частини рослини, і/або зібрати насіння. Насіння може служити як ресурс для вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що мають бажані характеристики. Відбір за допомогою маркера Відбір за допомогою маркера є загальновизнаним способом відбору гетерозиготних рослин, необхідних при зворотному схрещуванні з рекурентним батьком у класичній селекційній програмі. Популяція рослин у кожному поколінні бекросів буде гетерозиготною по гену, що представляє інтерес, що звичайно присутній у співвідношенні 1:1 у популяції бекросів, і молекулярний маркер можна використовувати для проведення відмінностей двох алелей гена. За допомогою екстракції ДНК, наприклад, з молодих проростків, і перевірки з використанням специфічного маркера на інтрогресовану бажану ознаку здійснюють ранній відбір рослин для подальшого зворотного схрещування при концентруванні енергії і ресурсів на меншому числі рослин. Для додаткового прискорення виконання програми зворотного схрещування зародки з незрілих насіння (через 25 днів після цвітіння) можна видалити і вирощувати на поживному середовищі у стерильних умовах, замість того, щоб дати можливість повного дозрівання насіння. Цей спосіб, що називається "зародковим порятунком", використовуваний у сполученні з екстракцією ДНК на стадії трьох листів і аналізом, принаймні, одного гена або алеля Lr34, що додає рослині підвищеної резистентності до патогенів, уможливлює швидкий відбір рослин, що несуть бажану ознаку, який можна вирощувати до повного розвитку в теплиці або полі для наступного додаткового зворотного схрещування з рекурентним батьком. У способах за даним винаходом може бути використаний будь-який молекулярнобіологічний метод, відомий у даній галузі техніки. Такі методи включають, але не обмежуються ними, використання ампліфікації нуклеїнових кислот, секвенування нуклеїнових кислот, гібридизацію нуклеїнових кислот із прийнятним чином міченими зондами, аналіз одноланцюжкового конформаційного поліморфізму (SSCA), денатуруючий градієнтний гельелектрофорез (DGGE), гетеродуплексний аналіз (HET), аналіз хімічного розщеплення (CCM), каталітичне розщеплення нуклеїнових кислот або їхньої комбінації (див., наприклад, Lemieux, 2000; Langridge et al, 2001). Даний винахід також включає застосування методів з використанням молекулярного маркера для виявлення поліморфізмів, зчеплених з алелями (наприклад) гена Lr34, що додає підвищеної резистентності до патогенів рослин. Такі способи включають виявлення або аналіз поліморфізмів довжин рестрикційних фрагментів (RFLP), RAPD, поліморфізмів довжин ампліфікованих фрагментів (AFLP) і поліморфізмів мікросателіта (простого повтору послідовності, SSR). Міцно зчеплені маркери можна без зусилля одержати способами, добре відомими в даній галузі техніки, такими як аналіз сегрегантів підвищеної об'ємності, огляд якого приведений Langridge et al., (2001). "Полімеразна ланцюгова реакція" ("ПЛР") є реакцією, у якій на основі полінуклеотиду-мішені створюються ідентичні копії з використанням "пари праймерів" або "сукупності праймерів", що складає з "прямого" і "зворотного" праймера, і каталізатора полімеризації, такого як ДНКполімераза, і, як правило, ферменту термостабільної полімерази. Способи ПЛР відомі в даній галузі техніки і повідомляються, наприклад, у "PCR" (M.J. McPherson and S.G Moller (editors), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, (2000)). ПЛР можна виконати на кДНК, отриманої на основі підданої зворотній транскрипції мРНК, виділеної з клітин рослин, експресуючих ген або алель Lr34, що додає підвищеної резистентності до патогенів рослин. Однак, як правило, легше виконати ПЛР на геномній ДНК, виділеної з рослини. Праймером є послідовність олігонуклеотида, що здатна до гібридизації специфічним відносно послідовності чином з послідовністю-мішенню і подовження під час ПЛР. Амплікони або продукти ПЛР, або фрагменти ПЛР, або продукти ампліфікації являють собою продукти подовження, що включають праймер і знову синтезовані копії послідовностей-мішеней. Системи множинних ПЛР містять множину наборів праймерів, що приводить до одночасної продукції більше одного амплікона. Праймери можуть повністю відповідати послідовності-мішені, або вони можуть містити внутрішні неспівпадаючі основи, що можуть привести до введення сайтів розпізнавання/розщеплення рестрикційним ферментом або каталітичною нуклеїновою кислотою 23 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в специфічні послідовності-мішені. Праймери можуть також містити додаткові послідовності і/або містити модифіковані або мічені нуклеотиди для полегшення збирання або виявлення ампліконів. Повторювані цикли термічної денатурації ДНК, відпалу праймерів до комплементарних їм послідовностей і подовження підданих відпалу праймерів за допомогою полімерази приводять до експонентної ампліфікації послідовності-мішені. Терміни "мішень" або "послідовність-мішень" або "матриця" належать до послідовностей нуклеїнових кислот, що піддаються ампліфікації. Способи прямого секвенування нуклеотидних послідовностей добре відомі кваліфікованим у даній галузі техніки фахівцям, і їх можна знайти, наприклад, у публікації Ausubel et al., (вище) і Sambrook et al., (вище). Секвенування можна виконати будь-яким прийнятним способом, наприклад, дидезокси-секвенуванням, хімічним секвенуванням або їх варіантами. Пряме секвенування має перевагу визначення варіації в будь-якій парі основ конкретної послідовності. TILLING Рослини за даним винаходом можна одержати, використовуючи спосіб, відомий як TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes - виявлення індукованих локальних пошкоджень у геномах). На першій стадії в популяції рослин індукують мутації, що вводяться, такі як нові зміни єдиної пари основ, за допомогою обробки насіння (або пилка) хімічним мутагеном, а потім розвитку рослин до покоління, у якого мутації будуть стабільно успадковуватися. ДНК екстрагують, а насіння зберігають від усіх членів популяції для створення ресурсу, повторний доступ до якого може бути протягом тривалого періоду. У випадку аналізу з використанням TILLING конструюють ПЛР-праймери для специфічної ампліфікації однієї гена-мішені, що представляє інтерес. Специфічність особливо важлива, якщо мішенню є член сімейства або генів частина поліплоїдного генома. Ще можна використовувати мічені барвником праймери для ампліфікації продуктів ПЛР на основі об'єднаної ДНК від множини індивідуумів. Ці продукти ПЛР піддають денатурації і повторному відпалу для того, щоб забезпечити можливість утворення неспівпадаючих пар основ. Помилкові спарювання, або гетеродуплекси, представляють як природні однонуклеотидні поліморфізми (SNP) (тобто, кілька рослин з популяції, очевидно, несуть той самий поліморфізм), так і індуковані SNP (тобто, лише рідкісні окремі рослини, очевидно, демонструють мутацію). Після утворення гетеродуплекса використання ендонуклеази, такої як Cel I, що розпізнає і розщеплює помилково спарену ДНК, є ключем до виявлення нових SNP у підданій TILLING популяції. Використовуючи цей підхід, можна скринувати багато тисяч рослин для ідентифікації будьякого індивідуума зі зміною однієї основи, а також невеликими інсерціями або делеціями (1-30 п. о.) у будь-якому гені або конкретній ділянці генома. Розмір досліджуваних геномних фрагментів може знаходитися в діапазоні десь від 0,3 до 1,6 т. п. о. При використанні 8-кратного об'єднання, фрагментів розмірів 1,4 т. п. о. (без урахування кінців фрагментів, на яких виявлення однонуклеотидного поліморфізму є проблематичним внаслідок шуму) і 96 доріжок у кожному дослідженні, це сполучення уможливлює скринування аж до мільйона пар основ геномної ДНК в одному аналізі, що робить TILLING способом з високою пропускною здатністю. TILLING додатково описаний у Slade і Knauf (2005) і Henikoff et al. (2004). На додаток до можливості ефективного виявлення мутацій, технологія TILLING з високою пропускною здатністю є ідеальною для виявлення природних поліморфізмів. Отже, детальне дослідження невідомої гомологічної ДНК по утворенню гетеродуплекса з відомою послідовністю виявляє число і розташування поліморфних сайтів. Ідентифікують як зміни нуклеотидів, так і невеликі інсерції і делеції, включаючи, принаймні, деякі поліморфізми числа повторів. Цей спосіб був названий Ecotilling (Comai et al., 2004). Кожен SNP реєструють відповідно до його приблизного розташування усередині невеликого числа нуклеотидів. Таким чином, кожен гаплотип можна заархувати на основі його мінливості. Дані про послідовності можна одержати за допомогою відносно невеликого покрокового зусилля, використовуючи аліквоти тієї ж самої ампліфікованої ДНК, що і ДНК, що використовують для аналізу розщеплення помилкових спарювань. Прямий або зворотний секвенуючий праймер для єдиної реакції вибирають відповідно до його близькості до поліморфізму. Програмне забезпечення Sequencher виконує множинне сполучення і виявляє зміна основи, що у кожному випадку підтверджує смуга в гелі. Ecotilling можна виконати легше, ніж повне секвенування, спосіб, у даний час використовуваний для виявлення найбільшої частини SNP. Можна скринувати пластинки, що містять ранжовану екотипічну ДНК, а не пули ДНК із підданих мутагенезу рослин. Оскільки виявлення проводять на гелях з дозволом майже на рівні пари основ, а фонові картини є однорідними по всіх доріжках, можна зіставити смуги однакового розміру, виявляючи і генотипуючи, таким чином, SNP в одну стадію. У цьому способі простим і ефективним є 24 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 остаточне секвенування SNP, зроблене ще в більшому ступені такою тією обставиною, що аліквоти тих же самих продуктів ПЛР, що використовувалися для скринування, можна піддати ДНК-секвенуванню. Антитіла Використовуваний у даному винаході термін "антитіло" включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла, біспецифічні антитіла, діатіла, триатіла, антитіла-гетерокон'югати, химерні антитіла, що включають інтактні молекули, а також їхні фрагменти, такі як Fab, F(ab") 2 і Fv, що здатні до зв'язування антигенної детермінанти, і інші антитілоподібні молекули. Термін "специфічно зв'язується" належить до здатності антитіла до зв'язування, принаймні, з одним поліпептидом за даним винаходом, але не в значній мірі з відомими білками в досліджуваному зразку/організмі. Використовуваний в описі термін "епітоп" належить до галузі поліпептиду за даним винаходом, що зв'язується антитілом. Епітоп можна увести тварині для вироблення антитіл проти епітопа, однак переважно, коли антитіла за даним винаходом специфічно зв'язуються з ділянкою епітопа в рамках повного поліпептиду. Якщо вимагаються поліклональні антитіла, то вибраний ссавець (наприклад, мишу, кролика, козу, коня і т. д.) імунізують імуногенним поліпептидом за даним винаходом. Сироватку від імунізованої тварини збирають і обробляють відповідно до відомих процедур. Якщо сироватка, що містить поліклональні антитіла, містить антитіла до інших антигенів, то поліклональні антитіла можна очистити методом імуноафінної хроматографії. Методи одержання й обробки поліклональної антисироватки відомі в даній галузі техніки. Для створення таких антитіл даним винаходом також забезпечуються поліпептиди за даним винаходом або їхні фрагменти, гаптенізовані іншим поліпептидом, для застосування як імуногенів у тварин. Моноклональні антитіла, спрямовані проти поліпептидів за даним винаходом, можуть також бути легко отримані кваліфікованим у даній галузі фахівцем. Загальна методологія одержання моноклональних антитіл за допомогою гібридом добре відома. Іморталізовані антитілопродукуючі лінії клітин можна створити шляхом злиття клітин, а також за допомогою інших методів, таких як безпосередня трансформація B-лімфоцитів онкогенної ДНК або трансфекція вірусом Епштейн-Барра. Отримані панелі моноклональних антитіл можна скринувати на різні властивості; тобто, на ізотип і спорідненість до епітопу. Альтернативний метод включає скринінг бібліотек фагового дисплея, у яких, наприклад, фаги експресують на поверхні своїх оболонок scFv-фрагменти з великою множиною гіперваріабельних ділянок (CDR). Цей метод добре відомий у даній галузі техніки. У даній галузі техніки відомі інші методи продукування антитіл за даним винаходом. Антитіла за даним винаходом можна зв'язати з твердою підкладкою і/або упакувати усередину наборів у прийнятному контейнері разом із придатними реагентами, контролями, інструкціями і т. п. У варіанті здійснення антитіла за даним винаходом є помітно міченими. Помітні мітки, що приводяться як приклади, що дозволяють прямо визначити зв'язування антитіл, включають радіоактивні мітки, флуорофори, барвники, магнітні кульки, хемілюмінесцентні речовини, колоїдні частинки і т. п. Приклади міток, що дозволяють прямо визначити зв'язування антитіл, включають ферменти, субстрати для який можуть передбачати пофарбований або флуоресцентний продукт Додаткові, що приводяться як приклади помітні мітки включають ковалентно зв'язані ферменти, здатні забезпечити помітний сигнал - продукт після додавання прийнятного субстрату. Приклади ферментів, що підходять для використання в кон'югатах, включають пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, малатдегідрогеназу і т. п. Якщо кон'югати антитіло-фермент не є комерційно доступними, то їх легко одержати з використанням методик, відомих кваліфікованим у даній галузі фахівцям. Крім того, помітні мітки, що приводяться як приклади, включають біотин, що зв'язується з високою спорідненістю з авідином або стрептавідином; флуорохроми (наприклад, фікобіліпротеїни, фікоеритрин і алофікоцианіни; флуоресцеїн і техаський червоний), що можуть бути використані в клітинному сортері з активацією флуоресценції; гаптени і т. п. Переважно, помітна мітка, наприклад біотин, дає можливість прямого вимірювання в люмінометрі для планшетів. Такі мічені антитіла можна використовувати в методах, відомих у даній галузі, для виявлення поліпептидів за даним винаходом. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Матеріали і методи Мікроскопічний аналіз інфікування сходів іржастим грибом Рослини вирощували в камері штучного клімату, підтримуваного при 4-8°C, у 12-годинному режимі світла і темряви. Сходи заражали на стадії двох листів, використовуючи культуру 467 25 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 збудника листяної іржі, переносили у вологу камеру (з температурним діапазоном, що складає ° 16-20 C) на 24 години і повертали в камеру штучного клімату, підтримуваного при 4-8°C. Для візуалізації під мікроскопом внутрішніх інфікованих структур тканину першого листа піддавали автоклавуванню в 1 М KOH, промивали в 50 мМ KPO4 і фарбували 50 мМ розчином KPO4 (pН 7,8), що містить 20 мкг/мл аглютиніну зародку пшениці (WGA), кон'югованого з флуорофором alexa 488 (Invitrogen, USA). Усю пофарбовану WGA-alexa тканину досліджували при збудженні синім квантом світла. Виділення РНК для напівкількісної ПЛР і Нозерн-блотингу Загальну РНК екстрагували з листя, використовуючи розчин тризолу (38 % фенолу, 0,8 M тіоціанат гуанідину, 0,4 M тіоціанат амонію, 0,1 M ацетат натрію, pН 5, і 10 % гліцерину). Перший ланцюг кДНК для ЗТ-ПЛР синтезували, використовуючи зворотну транскриптазу Superscript II (Invitrogen). Специфічний фрагмент у випадку напівкількісної ЗТ-ПЛР 5’-кінця PDR ампліфікували, використовуючи праймери Lr34_RT_fl: 5’-catcaagatttcaccgcctgtgc-3" (SEQ ID NO:12) і Lr34_RT_rl: 5’-gaagcctagcaacttcacgaggc-3" (SEQ ID NO:13) при температурі відпалу, що складає 70C. Для гібридизаційного аналізу з використанням Нозерн-блотингу 15 мкг загальної РНК у кожному зразку блоттували на мембрану (Hybond-XL, Amersham Biosiences). Зонд Hv40 32 (Spielmeyer et al, 2002) позначали P при 65C, використовуючи набір NEBlot (New England BioLabs). Мембрани промивали розчином, що містить 0,5SSC, 0,1 % SDS, при 65C і експонували на гіперчутливі рентгенівські плівки (BioMax MS film, Kodak). Швидка ампліфікація кінців кДНК (RACE) + Для точного визначення початку кДНК використовували підхід з 5" RACE. Полі-A РНК очищали з 300 мкг загальної РНК, використовуючи мінінабір для мРНК Oligotex (Qiagen). Зворотну транскрипцію проводили, використовуючи набір для ампліфікації кДНК у випадку RACE SMART (Clonetech Laboratories), причому адаптер був лігований до 5’-кінця кДНК. Ампліфікацію 5’-кінця проводили, використовуючи специфічний для адаптера праймер і специфічний для гена праймер ABC_5RACE_r2:5'-gcggggcccacaatcatctcggc-3" (SEQ ID NO:14). Приклад 2. Генетичне картирування Lr34 Рослинні матеріали Три популяції бекросів були отримані і використані для генетичного картування Lr34. У таблиці 2 підсумовані дані, що стосуються батьківських форм рослин для зворотного схрещування, оцінних фенотипів, розміру популяцій і маркерів, каптованих у випадку кожної популяції. 35 26 UA 106729 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Популяція 'ArinaForno' з точним картуванням була створена за допомогою схрещування у високому ступені резистентного швейцарського озимого сорту пшениці 'Forno' з чутливим швейцарським озимим сортом пшениці 'Arina'. Наступне зворотне схрещування з "Arina" і декілька поколінь, отриманих шляхом самозапилення, дали в результаті 103 рослини, що були "F4 при використанні двох зворотних схрещувань" (BC2F4), що містять Lr34 і в середньому 12,5 % генома 'Forno' в іншому генетичному фоні "Arina". Ці рослини аналізували на наявність хромосомного сегмента Lr34 з 'Forno', використовуючи два фланкуючих RFLP маркери BE493812 і BF473324. Одну з цих рослин, що містить ділянку Lr34, знову схрещували з 'Arina', і потомство самозапилювалося з одержанням 1728 рослин BC3F2, що мають у середньому 6,25 % генома 'Forno'. Рекомбінанти відбирали, використовуючи два фланкуючих маркери BE493812 і SWM10. Фенотиповані популяції 'ArinaForno' проводили в Agroscope Reckenholz, Zurich, Швейцарія, протягом 2006 (BC3F3) і 2007 (BC3F4). Зараження серіями інфекцій, що містять суміш чуттєвих сортів, здійснювали з використанням урединіоспор швейцарських ізолятів збудників листяної іржі з № 90035, 91047, 93003, 93012, 94015, 95001, 95012, 95028, 95037, 95039, 95219, 95251, 96002, 96004, 96209 і 96257. Оцінку хвороби проводили в двох повторах. Ряд картувань ThatcherRL6058 (Thatcher Lr34) і AvocetAvocet Lr34 з високою дозволяючою здатністю оцінка хвороби в Австралії й у CIMMYT, Мексика, були описані Lagudah і ін. (2006) і Spielmeyer і ін. (2002). Інші генетичні лінії, використані в цій роботі, були майже ізогенними лініями 'Thatcher', 'Thatcher Lr34' (=RL6058, Thatcher*6/PI5848), 'Arina', 'Arina Lr34' (Arina*3/Forno). Розробка маркерів для генетичного картування Були створені нові молекулярні маркери для картування за допомогою використання інформації про синтенії в рису, модельного дерну Brachypodium sylvaticum і диплоїдного джерела D-генома Aegilops tauschii, як описано Bossolini і ін. (2006). Для одержання фізичної інформації про цільову зону для Lr34 скринували піддану частковому фінгерпринтінгу бібліотеку бактеріальних штучних хромосом (BAC) Aegilops tauschii (J. Dvorak, UC Davis), використовуючи EST (маркерні експресовані послідовності) пшениці, що належать до генів із синтенної ділянки рису і Brachypodium sylvaticum. Тринадцять клонів BAC із трьох різних контигів (HI057C6/HD036L7/HD102K14/HI056G21/HD062G18/HI031F14/HI135B2/RI004I15/RI042I4/HI148C 23/BB045B13/HB067N4/BB062G18) були секвеновані за допомогою низькопрохідного секвенування, використовуючи секвенатор ABI® 3730 (Applied Biosystems). Послідовності складали, використовуючи PHRAP, і досліджували на прості повтори послідовностей (SSR). SSR ампліфікували за допомогою конструйованих праймерів у фланкуючих ділянках (таблиця 3). Продукти ПЛР аналізували, використовуючи ДНК-секвенатор 4200 LiCOR®. Поліморфні SSR були ідентифіковані і позначені префіксами "SWM" або "cs". ДНК-маркуючі сайти були створені за допомогою конструювання праймерів на низькокопійних послідовностях. Специфічні для локусу зонди були секвеновані і досліджені на однонуклеотидні поліморфізми (SNP) і інсерції/делеції (InDel). Маркери на основі поліморфних SNP і InDel були позначені як Swiss Wheat SNP (SWSNP) (SNP, що належить до швейцарської пшениці) і Swiss Wheat Deletion (SWDEL) (делеція, що належить до швейцарської пшениці), відповідно. У таблиці 3 підсумована інформація, що стосується послідовностей праймерів для виявлення маркерів на основі ПЛР, картованих у популяціях. Додаткові низькокопійні зонди, csLVD2, csLVD13, csLVE17, для аналізу RFLP були виділені з загальних плазмідних бібліотек з контигів ВАС Ae tauschii за допомогою скринінгу загальної геномної ДНК із Ae tauschii. Як можливі низькокопійні зонди були вибрані рекомбінантні плазміди, у випадку, якщо не були виявлені ДНК-гібридизаційні сигнали після експонування протягом ночі. Використовуючи ці генетичні маркери і популяції для картирування Lr34, картовані з високою дозволяючою здатністю виявило цільову зону, що складає 0,15 cМ (сантиморганід), для Lr34, фланковану генетичними маркерами XSWSNP3 і XcsLVE17 (Фіг. 1). Була встановлена косегрегація декількох маркерів (Фіг. 1) з Lr34. Приклад 3. Мутагенез і виділення мутантів Lr34 60 Насіння ізолінії Lr34, 'Lalbahadur Lr34', опромінювали, використовуючи джерело Co у дозі, що складає 20 кілорад, і наступні покоління M1-M5 оцінювали в CIMMYT, Мексика, і в Австралії, як опубліковано в Spielmeyer et al. (2002). У гамма-опроміненій популяції було ідентифіковано вісім мутантів. Їх аналізували, використовуючи деякі з нових генетичних маркерів (приклад 2). З восьми мутантів шість були інтерстиціальними делеціями, що охоплюють локус Lr34/Yr18/Pm38/Ltn1, тоді як два мутанти, позначені m19 і m21, не продемонстрували втрату 27 UA 106729 C2 5 10 маркерів у згаданому вище генетичному локусі. Тому мутанти m19 і m21 були піддані додатковому аналізу з використанням знову ідентифікованих маркерів і генів, що косегрегуються. У випадку застосування азиду натрію були створені мутанти з використанням насіння від одного колосу рослини RL6058, вирощеного в оранжереї для розмноження чистих ліній насінних рослин для мутагенезу. Насіння попередньо замочували протягом 12 годин при 4 °C до обробки зерен у насиченому киснем розчині 7 мМ азиду натрію, при pН 3,0, протягом 2 годин. Зерна промивали і висаджували в поле. Нащадків M2 висаджували у вигляді рядів окремих колосів і оцінювали на інфікування збудником жовтої, листяної і стеблової іржі в полі в присутності патогенів. 28