Спосіб виділення комплексу факторів viii та фон віллебранда від інших білків плазми крові методом рідинної хроматографії, яка розподіляє за розміром

Реферат: Винахід належить до способу виділення комплексу факторів VIII і фон Віллебранда з плазми крові, що їх містить, з використанням колонкової хроматографії з розподілом за розміром, у якому зазначену плазму крові підготовлюють, вводять в колонку з адсорбентом, елююють буфером та збирають цільову фракцію білків, причому підготовка плазми включає обробку агентом, який сприяє зв′язуванню фактора VIII з фактором фон Віллебранда, зокрема агентом, що зв′язує двовалентні катіони, таким як етилендіамінтетраацетат натрію (ЕДТА), як адсорбент використовують хроматографічний гель, інертний відносно білків плазми, який має 6 максимальну межу фракціонування за молекулярною масою для декстрану 2×10 , а для 6 глобулярних білків 4×10 , та ведення плазми здійснюють з низькою швидкістю, що становить від 0,15-0,25 об′єму колонки за 1 год. UA 110920 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до способу виділення біологічно активних речовин, наприклад складних білків, і, зокрема, комплексу фактора коагуляції VIII і фактора фон Віллебранда з плазми крові, з використанням на першій стадії виділення методу рідинної хроматографії, яка розподіляє за розміром. Фактор VIII є найважливішим фактором згортання у крові людини, який може бути відсутнім або дефектним з частотою 1 на ~5000 чоловіків [1, 2]. Лікування хворих гемофілією А та пацієнтів з хворобою фон Віллебранда в сучасних умовах проводиться концентратами, що містять фактор згортання VIII і фактор фон Віллебранда. Таке лікування значно підвищує життєздатність, працездатність та тривалість життя цих пацієнтів [3-5]. Фактор VIII (FVIII) і фактор фон Віллебранда (vWF) циркулюють в плазмі у вигляді нековалентно зв'язаного білкового комплексу [6]. Обидва білки відіграють важливу роль у процесах гемостазу. Тромбін активує FVIII до FVIIIa, який як кофактор серинової протеази FIXa бере участь в активації фактора X до FXa [7], збільшуючи швидкість реакції практично в 5 разів [4]. vWF є посередником в адгезії тромбоцитів до пошкодженої поверхні судини [8] і переносником FVIII [6]. FVIII синтезується у вигляді єдиного поліпептидного ланцюга з молекулярною масою 260 кДа [6]. Завдяки обмеженому протеолізу, він є наявним в плазмі у вигляді серії гетеродимерів, які складаються з варіабельного N-кінцевого "важкого" ланцюга (50-180 кДа), що включає домени А1, А2 і В, та стабільного С-кінцевого "легкого" ланцюга (80 кДа), що включає домени A3, С1 і С2 [6]. Регуляція активності FVIII включає протеолітичне розщеплення тромбіном, фактором Ха і активованим протеїном С [7]. vWF - мультимерний білок, що експресується у вигляді препрополіпептиду і складається з 2813 амінокислотних залишків, із яких 22 є сигнальним пептидом, 741 - пропептидом, а 2050 зрілою субодиницею. Перед секрецією після відщеплення сигнального пептиду про-vWF зазнає інтенсивних пост-трансляційних модифікацій, які виражаються у високому ступені глікозування та високомолекулярній мультимеризації [6]. Спочатку про-vWF димеризується за допомогою утворення дисульфідного зв'язку у його С-кінцевій області, димер слугує протомером для мультимеризації, яка обумовлена утворенням дисульфідних зв'язків між N-кінцями. Об'єднання протомерів в мультимер відбувається за протеолітичним видаленням прополіпептиду, яке, зрештою, не завжди відбувається до кінця [8]. Таким чином, у плазмі крові циркулює зрілий 5 6 мультимер vWF з молекулярною вагою від 5×10 до 20×10 кДа [9]. Вміст FVIII і vWF у плазмі крові людини широко варіює в межах норми (приблизно 0,5-2,0 -1 МО×мл ) у відповідності до групи крові, віку, статі та фізичних навантажень. Вважається, що співвідношення активних субодиниць обох факторів у крові рівне 1:1, хоча молярні концентрації -1 дуже відрізняються. Типова концентрація FVIII у плазмі - 100-250 нг×мл (приблизно 1 нМ), -1 концентрація vWF - біля 8 мкг×мл (приблизно 50 нМ), що дає 50-ти кратне перевищення концентрації vWF над FVIII, тобто не всі мультимери vWF зв'язані з FVIII [6]. Утворення комплексу між FVIII і vWF є виключно важливим етапом в обслуговуванні нормального перебігу процесів гемостазу, так як було показано, що відхилення при взаємодії зазначених факторів, викликаних структурними дефектами FVIII і/або vWF, спричиняли спонтанні кровотечі у пацієнтів [10]. Утворення комплексу факторів значно збільшує швидкість асоціації легкого та важкого ланцюгів FVIII [11], стабільність гетеродимеру FVIII і, таким чином, період півжиття FVIII у циркулюючій крові [12] шляхом протекції від протеолітичної деградації [13]. Ранні дослідження, проведені з факторами, виділеними з плазми крові, показали, що 1649-1689 фрагмент легкого ланцюга FVIII, який включає амінокислотні залишки [14], і, в тому числі, 1680 тирозин виявляється відповідальним за взаємодію з vWF [7]. На факторі фон Віллебранда 1-272 цей сайт зв'язується в області N-кінця зрілої субодиниці, яка включає амінокислотні залишки [6]. Утворення достатньо стійкого комплексу FVIII/vWF стало також методичною основою для розробки способів виділення цих факторів із плазми крові чи деяких концентратів із плазми, наприклад із кріопреципітату [15, 16]. Проте попередня обробка плазми для отримання концентрату FVIII/vWF шляхом зниження температури чи обробки основами барію/алюмінію з наступним центрифугуванням зумовлювала значну, до 70 %, втрату активності FVIII. Перші спроби виділити фактор VIII безпосередньо з плазми крові методом рідинної хроматографії показали безперечну доцільність цього методу [17, 18]. Завдяки використанню хроматографії, яка розподіляє за розміром (раніше - гель-фільтрація), було досягнуто достатньо високого ступеня очищення і підвищеного виходу активності фактора VIII з 30 до 40-50 %. Подальше вдосконалення виявилося у створенні технології очищення комплексу FVIII/vWF, де безпосередньо на першій стадії очищення використовували хроматографію, яка розподіляє за 1 UA 110920 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розміром, і її модифікацію для групового розділення [19]. Було показано, що практично будь4 7 який інертний гельпроникний адсорбент з діапазоном фракціонування в інтервалі 1×10 -8×10 може бути використаним для безпосереднього нанесення плазми (15-40 % від об'єму адсорбенту) з високою швидкістю (0,5-2,0 об'єму адсорбенту) і високим виходом активності FVIII (до 70-86 %) на першому етапі [19]. Після цього виконували декілька спроб вдосконалити перший етап хроматографічного очищення комплексу FVIII/vWF, проте ці спроби зосереджувалися на хроматографії частково очищених фракцій плазми крові (повторно розчиненого кріопреципітату і потім його очищених фракцій). Всі дослідження проводили при використанні або малих навантажень на набивні колонки, або при низьких швидкостях потоків, або їх комбінації, що не принесло суттєвого виграшу в активності і виході препарату, який очищали. Пізніше було показано, що утворення/дисоціація комплексу FVIII/vWF суттєво залежить від + 2+ концентрації в середовищі одно- і двовалентних катіонів, і, в тому числі, Na і Са [20-22]. До того ж 0,35 М концентрація СаСl2 в середовищі спричиняє практично повну дисоціацію комплексу таким чином, що FVIII можна хроматографічно відділити від фактора фон Віллебранда [23]. Крім того, було встановлено, що для найбільш ефективної взаємодії факторів важливі їх концентрації [22]. Згодом було показано, що відщеплення в процесі дозрівання vWF про-фрагмента помітно збільшувало афінність взаємодії факторів, але сам відщеплений профрагмент інгібував утворення комплексу [24]. Видалення пропептиду із середовища інкубації було необхідно для експонування сайту зв'язування фактора VIII на факторі фон 6 Віллебранда і більшою мірою утворення комплексу FVIII з високомолекулярними (>5-7×10 кДа) мультимерами vWF [25]. Відповідно, задачею винаходу було створення ефективного і швидкого способу відокремлення факторів коагуляції VIII і фон Віллебранда від інших білків плазми крові на початковому етапі хроматографічного очищення зі збільшенням виходу активності FVIII. + Неочікувано було виявлено, що зниження концентрації катіонів Са і про-фрагмента vWF у підготовленій до хроматографії плазмі або на старті хроматографічного розділення та, як 6 наслідок, накопичення високомолекулярних (MW≥4×10 ) мультимерів фактора фон Віллебранда і наступне активне комплексоутворення з фактором VIII сприяло ефективному очищенню вказаного комплексу факторів і більшому виходу активності FVIII. Зазначена задача вирішується способом, відповідно до якого виділення комплексу факторів VIII і фон Віллебранда з плазми крові, здійснюють за допомогою колонкової хроматографії плазми крові з розподілом за розміром в умовах групового розділення, з наступним очищенням і виділенням, який характеризується тим, що перед хроматографією плазму крові обробляють агентом, що сприяє зв'язуванню фактора VIII з фактором фон Віллебранда, хроматографію здійснюють при навантаженні адсорбенту, плазмою у кількості від 15 до 40 % відносно об'єму колонки, причому використовують адсорбент-хроматографічний гель, інертний відносно білків плазми, який має максимальну межу фракціонування за молекулярною масою для 6 6 декстрану/глобулярних білків від 2×10 до 4×10 . У одному варіанті здійснення винаходу плазма крові являє собою свіжорозморожену плазму, оброблену від спонтанної коагуляції білків гепариномза 30 хв. до хроматографії. У ще одному варіанті здійснення винаходу за 30 хв. до хроматографії у плазму крові вводять агент, що зв'язує двовалентні катіони, до концентрації від приблизно 0,20 до приблизно 0,40 М, бажано агент, який зв'язує двовалентні катіони, являє собою етилендіамінтетраацетат натрію (ЕДТА). У ще одному варіанті здійснення винаходу висота шару адсорбенту в колонці становить не менше 90 см. У додатковому варіанті здійснення винаходу адсорбент має величину частинок/гранул у діапазоні від 45 до 165 мкм, в оптимальному варіанті 90 мкм. У ще одному варіанті здійснення винаходу введення плазми крові здійснюють з низькою, а елюцію - спочатку з низькою, а потім зі стандартною швидкістю, бажано початкова швидкість потоку плазми та буфера елюції становить 0,15-0,25 об'єму колонки за 1 годину. У ще одному варіанті здійснення винаходу зібрану фракцію білків, після колонкової хроматографії з розподілом за розміром, у вільному об'ємі буфера, що містить комплекс факторів VIII і фон Віллебранда, піддають іонообмінній та/або афінній хроматографії з наступною формуляцією. У додатковому варіанті реалізації, винахід стосується композиції, що містить комплекс факторів VIII і фон Віллебранда, одержаний із застосуванням заявленого способу та фармацевтично прийнятний носій. У ще одному варіанті здійснення винаходу композиція представлена у ліофілізованій формі. 2 UA 110920 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб, відповідно до винаходу, полягає в тому, що свіжоотримана від донорів чи розморожена (заморожена при донації протягом 1-2 годин і що зберігалася не вище, ніж при 30 °C) плазма крові спеціально обробляється агентом, що зв'язує двовалентні катіони, до досягнення кінцевої концентрації від 0,20 до 0,40 М у зразку. Потім зразок піддається хроматографії, яка розподіляє за розміром, методом групового розділення (раніше гельфільтрація) при відповідному навантаженні хроматографічного адсорбенту як по кількості білка, що наноситься (не більше 5-10 % у зразку), так і об'єму плазми, що наноситься (15-40 % об'єму колонки - Vc) в залежності від розмірів частинок адсорбенту. При нанесенні зразка на набивну колонку, заповнену хроматографічним адсорбентом на висоту від 60, та бажано не менше 90 см, у відповідності з механізмом групового хроматографічного розділення всі сполуки з молекулярною масою нижче межі виключення адсорбенту проникали в пори адсорбенту і при цьому затримувалися у верхніх його шарах. Сполуки з молекулярною масою вище межі виключення адсорбенту не проникали у пори і рухалися з фронтом буфера у вільному об'ємі колонки. Нанесення зразка (плазми крові з вмістом факторів VIII і фон Віллебранда) проводили -1 з мінімальною швидкістю 0,15-0,25 Vc×годину , яка не допускала радіальну дифузію. Таким + способом забезпечували: а) видалення зв'язаних агентом надлишкових катіонів Са шляхом компартменталізації в порах адсорбенту, б) видалення про-пептиду vWF з пулу білків шляхом компартменталізації в порах адсорбенту, в) переважне утворення високомолекулярного мультимерного vWF після компартменталізації його пропептиду, г) достатній час для повної взаємодії FVIII з високомолекулярними мультимерами vWF, д) достатній вертикальний простір в адсорбенті для групового розділення білків після повного нанесення зразка. Початок елюції комплексу FVIII/vWF (15-30 % Vc) проводили зі швидкістю, рівній швидкості нанесення зразка -1 0,15-0,25 Vc×годину , а потім зі стандартною для цього адсорбенту швидкістю (0,5-2,0 -1 Vc×годину ). Крім того, у винаході використовується хроматографічний адсорбент, який має таку жорсткість, яка допускає високу швидкість елюції, наприклад Sepharose з 6 % прошивкою, а також з величиною частинок/гранул в середньому близько 90 мкм (45-165 мкм), що забезпечує задовільні швидкості потоку плазми та буфера при постійному спонтанному утворенні дрібних фібрилярних структур. Короткий опис фігур. Цей винахід додатково пояснюється фігурами, що описують спосіб хроматографічного розділення. На Фігурах 1 і 2 представлено графіки зміни поглинання УФ-світла з довжиною хвилі 280 нм розчином плазми крові в буфері елюції, який витікає із хроматографічної колонки, наповненої адсорбентом для хроматографії, яка розподіляє за розміром, методом групового розділення. Інтенсивність поглинання УФ-світла відображає концентрацію білка у фракції, що витікає з колонки, у даний момент часу, повний запис якої прийнято позначати як "профіль елюції білка". На профіль елюції накладений профіль активності фактора VIII, виміряний у відповідних фракціях (а-б, б-в, в-г, г-д), що витікають з колонки. На фігурі 1, представлений профіль елюції плазми крові в оптимальних умовах за методом, що описаний в прототипі [19] "Спосіб 1" (плазма додатково не оброблена ЕДТА), а саме: 1) хроматографічний адсорбент Sepharose 4 Fast Flow, діапазон фракціонування в інтервалі 4 7 6×10 -3×10 , інертний для білків, розмір частинок 90 мкм (45-165 мкм), висота шару 60 см, 2) об'єм зразка плазми 0,20 Vc, концентрація білка 7,20 %, -1 3) швидкість нанесення зразка 0,50 Vc×година , -1 4) швидкість елюції (потоку буфера) 1,00 Vc×година . На фігурі 2 представлений профіль елюції плазми крові в оптимальних умовах за методом, що описаний в цьому винаході "Спосіб 2" (плазма додатково оброблена ЕДТА до кінцевої концентрації не менше 0,40 М), а саме: 1) хроматографічний адсорбент Sepharose 6 Fast Flow, діапазон фракціонування в інтервалі 4 6 1×10 -4×10 , межа фракціонування по молекулярній масі для декстрану/глобулярних білків 6 6 2×10 /4×10 , інертний для білків, розмір частинок 90 мкм (45-165 мкм), висота шару 90 см, 2) об'єм зразка плазми 0,20 Vc, концентрація білка 7,20 %, -1 3) швидкість нанесення зразка 0,20 Vc×година , -1 4) швидкість елюції потоку буфера об'ємом 0,25 Vc складала 0,20 Vc×година , решта 0,55 -1 Vc-1,00 Vc×година . На фігурі 3 представлена Таблиця 1, в якій зазначені загальноприйняті методи визначення вмісту/активності аналізованих білків плазми крові чи фракцій - фактора VIII:C/VIII:Ag, vWF:CBA/vWF:Ag, фактора IX, фактора X, протеїну С, альбуміну, альфа-2-макроглобуліну, 3 UA 110920 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитромбіну III, імуноглобулінів G (IgG), A (IgA) і М (IgM), фібриногену, фібронектину, високомолекулярного кініногену (HMWK), калікреїну і плазміногену/плазміну. На фігурі 4 представлена Таблиця 2, в якій систематизовані і представлені результати відповідно до прикладів 1-3. Приклади В експериментальних роботах використовували набивні пілотні колонки BPG 100/950 і хроматограф АКТAbasic 100 з програмним забезпеченням UNICORN 5,0 (GE Healthcare АВ, Швеція, Уппсала). Колонки пакували, як вказано в інструкціях виробника, хроматографічним адсорбентом Sepharose 4 Fast Flow або Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare АВ, Швеція, Уппсала), які відрізняються ступенем прошивки агарози (4 або 6 %) і, відповідно, різною межею 6 7 6 6 фракціонування для декстрану та глобулярних білків (6×10 /3×10 і 2×10 /4×10 ). Вихід фактора VIII оцінювали в процентному відношенні отриманої активності (фактор VIII:C) до його загальної активності в плазмі до обробки агентом, який зв'язує двовалентні катіони. Також оцінювали незворотну денатурацію фактора VIII відносно виходу його активності (фактор VIII:С) і виходу його кількості (фактор VIII:Ag). Такі ж розрахунки проводили і для фактора фон Віллебранда. Зразки плазми і отриманих фракцій (а-б, б-в, в-г, г-д у відповідності з ФІГ. 1-2) відбирали і визначали концентрацію загального білка методом Бредфорда [26-27]. Приклад 1. Порівняльний аналіз очищення комплексу FVIII/vWF методом групового розділення з плазми, обробленої або необробленої агентом зв'язування двовалентних катіонів ЕДТА, на набивній колонці, наповненій адсорбентом з різною межею фракціонування для 6 7 6 6 декстрану/глобулярних білків (6×10 /3×10 і 2×10 /4×10 ). Колонки BPG 100/950 наповнювали хроматографічними адсорбентами Sepharose 4 Fast Flow або Sepharose 6 Fast Flow на висоту 60 см. Заморожену плазму, яка зберігалася при -40 °C, стандартно отриману від донорів, подрібнювали в міксері, швидко розморожували до температури 25 °C на водяній бані великого -1 об'єму. Після додавання гепарину 1000 МЕ×л плазму, яку обережно перемішували, відфільтровували через фільтр із порами 4-5 мм. Потім в плазму вносили 2 М ЕДТА (етилендіамінтетраацетату натрію) до досягнення кінцевої концентрації не менше 0,40 М і залишали при обережному перемішуванні і температурі 25 °C на 30 хв. 700 мл (0,15 Vc) плазми через "in line-фільтр" з порами 40 мкм наносили на еквілібровану 0,02 М Na-цитратним буфером, який містить 0,15 М NaCl і 0,0026 М СаСl2, рН 7,4, колонку з -1 -1 висотою шару адсорбенту 60 см зі швидкістю 38 мл×хв (0,50 Vc×година ) та елюювали білкові фракції з тією ж швидкістю потоку Na-цитратного буфера. Фракції збирали, як показано на Фіг. 1 та 2, і аналізували. Із даних, представлених на Фіг. 1 та 2 і в Таблиці 2, випливає, що при застосуванні методу групового розділення хроматографії, яка розділяє за розміром, на адсорбенті з середнім розміром частинок 90 (45-165) мкм відбувається розділення білків плазми крові на дві основні фракції. За даними нативного гель-електрофорезу ці фракції містять високомолекулярні (фракція A: MW≥4000 кДа) і середньо-низькомолекулярні (фракція Б: MW