Спосіб одержання стабільного соматотропіну, стабільний соматотропін і композиція стабільного соматотропіну

1. Способ получения стабильного соматотропина, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что включает стадии селективного восстановления дисульфидной связи малой петли соматотропина органическим меркаптосоединением общей формулы RSH для получения двух меркаптогрупп, где R представляет углеводородную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, необязательно замещенную гидрокси- или меркаптогруппой, взаимодействия в полученном соединении двух меркаптогрупп из дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом, имеющим 1-7 атомов углерода. 2. Способ по п. 1, в котором исходный соматотропин представляет собой свиной соматотропин. 3. Способ по п. 1, в котором дисульфидную связь малой петли соматотропина восстанавливают дитиотреитолом или 2-меркаптоэтанолом. 4. Способ по п. 1,в котором меркаптогруппы дисульфидной связи малой петли соматотропина подвергают взаимодействию с йодацетамидом. 5. Стабильный соматотропин, полученный селективным восстановлением дисульфидной связи малой петли соматотропина органическим меркаптосоединением общей формулы R-SH для получения двух меркаптогрупп, где R представляет углеводородную группу, имеющую 16 атомов углерода, необязательно замещенную гидрокси- или меркаптогруппой, и последующим взаимодействием в полученном соединении двух меркаптогрупп из дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом, имеющим t-7 атомов углерода. 6. Соматотропин по п. 5, в котором соматотропин представляет собой свиной соматотропин. 7. Соматотропин по п. 5, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что дисульфидная связь малой петли соматотропина восстановлена дитиотреитолом или 2меркаптоэтанолом. 8. Соматотропин по п. 5, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что меркаптогруппы дисульфидной связи малой петли соматотропина были подвергнуты взаимодействию с йодацетамидом. 9. Композиция стабильного соматотропина, содержащая соматотропин и фармацевтически приемлемый носитель, о тличающаяся тем, что в качестве соматотропина она содержит соматотропин, полученный селективным восстановлением дисульфидной связи малой петли соматотропина органическим меркаптосоединением общей формулы R-SH для получения двух меркаптогрупп, где R представляет углеводородную группу, (20) (21) (22) (24) (31) (32) (33) (85) (86) (46) (56) с > ю 09 W g О 26853 имеющую 1-6 атомов углерода, необязательно замещенную гидрокси- или меркаптогруппой, и последующим взаимодействием в полученном соединении двух меркаптогрупп дисульфидной связи малой петли соматотропина с карбамоилалкилгалогенидом, имеющим 1-7 атомов углерода в эффективном количестве. 10. Композиция по п. 9, в которой соматотропин представляет собой свиной соматотропин. 11. Композиция по п. 9, о т л и ч а ю щ а я с я тем, что дисульфидная связь малой петли соматотропина восстановлена дитиотреитолом или 2-меркаптоэтанолом. 12. Композиция по п. 9, о т л и ч а ющаяся тем, что меркаптогруппы малой петли соматотропина модифицированы с помощью йодацетамида. Это изобретение относится, в основпресоматотропина из 217 аминокислот; ном, к соматотропинам, и, в частности, к при этом, сигнальную последовательность стабильному и биоактивному соматотроиз 26 аминокислот удаляют от N-концевопину, а также к способам получения стаго положения во время синтеза и выдебильных и биоактивных соматотропинов. ления, например, Lingapa et al., Известный уровень техники Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74, 2432-36 (1977). Выделение, очистка и свойства сомаПолучение бычьего соматотропина хототропинов известны в данной области рошо известно в данной области. Напритехники. Соматотропин, иногда называемер, бычий соматотропин экстрагируют из мый гормоном роста, и получают из гибычьих желез крупного рогатого скота или пофиза на протяжении жизни животного. получают по технологии рекомбийантной Известно, что соматотропин ускоряет рост ДНК в .соответствующих хозяевах, наприскелета, фиксацию азота, синтез белка и мер, Miller et al., F.Biol. Chem, 255, 7521воздействует на метаболизм глюкозы и 24 (1980). Патент США N 4443539, Frazur липидов. Таким образом, соматотропин из- | 5 et al., раскрывает способ получения бывестен как анаболический агент. чьего соматотропина путем использоваСоматотропин может быть выделен пуния методологии рекомбинантной ДНК, потем иссечения ткани гипофиза. Смотри, мещая структурный ген бычьего соматотнапример, Li, F.Biol.Chem, 211, 55 (1954). ропина в дрожжевые клетки. Пат. США N Соматотропин может быть также получен 2Q 4371462 раскрывает способ очистки пепутем генной инженерии из микрооргаредних гипофизных пептидов. Заявка на низмов, содержащих рекомбинантную ДНК, Евр. Пат. N 83304574.3, поданная 8 августа которая определяет получение (произ1983, с номером публикации 103 395; водство) соматотропина. Смотри, наприN 82304880.6, поданная 16 сентября 1982, мер, Seeburg, et ai., Nature, 276, 795-798 с номером публикации 075444; N (1978); Seebutg et ai., Nature, 270, 48681303824.7, поданная 21 августа 1981, с 494 (1978); Martial Science, 205, 602-607 номером публикации 047 600; заявка на (1979); Seeburg, et al., DNA, 2, 37-45 (1983). Лат. Великобритании N 2073245 А раскрывают способы продуцирования бычьего Соматотропины отдельных видов изусоматотропина с высокими выходами. чены и охарактеризованы. Известно, напШтаммы E.Coli, которые продуцируют быример, что бычий соматотропин представчий соматотропин, имеются в American ляет собой полипептид, синтезированный Type Culture Collection под регистрируевнутри и выделенный из передней доли гипофиза. О нуклеотидной кодированной т е мыми номерами АТСС 31826, 31840, 31841, 31842 и 31843, последовательности и последовательности аминокислот природного бычьего соАналогично получение природного и матотропина сообщалось, например. Miller рекомбинантного свиного и человеческоet al., S.Biol.Chem, 255, 7521-24 (1980); го соматотропина хорошо известно. НапWalHs, FEBS Lett, 35, 11-14 (1973). Бычий ример, в дополнение к вышеупомянутым соматотропин представляет собой белок публикациям, которые раскрывают спосоиз 191 аминокислот и, по-видимому, синбы получения свиного и человеческого тезируется первоначально в виде бычьего соматотропина, Пат. США N 4604359 раек 26853 рывает способы микробиологической экспдлительного хранения, легко приготовлятьрессии человеческого соматотропина; Пат. ся в дозах и легко применяться. США N 4332717 раскрывает способы Эти и другие цели достигаются путем очистки человеческого соматотропина; использования способа, который включает заявка на Евр. Пат. N 83305717.7, подан- 5 селективное восстановление дисульфидная 26 сентября 1983, с номером публиных связей в малой петле соматотропина, кации 104 920, раскрывают способы прочтобы получить меркаптогруппы, и замедуцирования рекомбинантного свиного сощение меркаптогрупп в малой петле. Заматотропина с высокими выходами. Пат. мещение меркаптогрупп в малой петле США N 4604359 раскрывает способы син- 10 препятствует меркаптогруппам образовытеза биоактивного человеческого сомавать внутримолекулярные дисульфидные тотропина, включая способы синтеза биоаксвязи, которые вызывают образование дитивного тетра-в-карбамидометил производмеров соматотропина, олигомеров и агного. Многие такие публикации и спосорегатов и инактивируют соматотропин. Собы для различных соматотропинов хоро- 15 матотропин, полученный с использованием шо известны специалисту в данной обэтого способа, стабилен в течение длиласти, например, Пат. США N 4645755 тельного срока хранения и имеет биолораскрывает способ продуцирования рыгическую активность, равную или больбьего соматотропина. шую, чем биологическая активность неза20 мещенного соматотропина. Замещенный Хотя способы продуцирования сомасоматотропин выделяют и, при необходитотропинов хорошо известны, способы храмости, подвергают дальнейшей обработнения соматотропина в течение длительке, чтобы получить форму соматотропина, ного периода между получением соматотпригодную для длительного хранения и ропина и его использованием развиты пло- 25 последующего введения животному. хо. Соматотропины имеют тенденцию обДругие цели, преимущества и новые разовывать бионеактивные димеры, олипризнаки настоящего изобретения должгомеры и нерастворимые агрегаты во ны стать очевидными из последующего время хранения. Эти бионеактивные форподробного описания изобретения. мы соматотропина понижают количество 30 Подробное описание изобретения. соматотропина, пригодного для использоСоматотропины, выделенные от развания, и вызывают проблемы во время личных видов животных, имеют высокую приема, в частности, когда нераствористепень гомологии последовательности мые агрегаты образуют осадки в раство(около 96 процентов); однако соматотрорах соматотропина. 35 пины от различных видов все же отлиПоэтому существует потребность в чаются количеством и последовательносспособах получения стабильного и биоактью аминокислот, присутствующих в цепи тивного соматотропина, который не будет соматотропина. Например, природный чеобразовывать бионеактивные димеры, олиловеческий соматотропин (nhST) предсгомеры и агрегаты во время хранения. 40 тавляет собой полипептид, состоящий из Сущность изобретения. 188 аминокислот. Молекула соматотропиПоэтому целью настоящего изобретена имеет две дисульфидные связи; одна ния является разработка стабильного и между 179 и 186 аминокислотами и одна биоактивного соматотропина, который не между 68 и 162 аминокислотами. Эти дидолжен образовывать бионеактивные ди- 45 сульфидные связи образуют "малую петмеры, олигомеры и агрегаты в течение лю" из шести аминокислот и "большую хранения. петлю" из 94 аминокислот соответственно. Сложная последовательность и струкДругой целью настоящего изобрететура человеческого соматотропина, дения является разработка способа получения стабильного и биоактивного соматот- 50 монстрирующие "малую петлю" и "больропина, который не должен образовывать шую петлю" иллюстрируются в Пат. США бионеактивные димеры, олигомеры и агN 3853832, включенном здесь ссылкой. регаты во время хранения. Аналогично природный свиной сомаСледующей целью настоящего изобтотропин (npST) представляет собой поретения является разработка композиции, 55 липептид из 190 аминокислот, имеющий содержащей стабильный и биоактивный две дисульфидные связи, образующие хасоматотропин, который не будет образорактерные "малую петлю" и "большую петвывать бионеактивные димеры, олигомелю", одна между 180 и 188 аминокислоры и агрегаты во время хранения. Компотами и одна между 163 и 52 аминокисзиция должна быть пригодной в течение лотами соответственна? ~ ^кже природный 26853 бычий соматотропин (nbST) представляет собой полипептид из 191 аминокислот, имеющий две дисульфидные связи, образующие характерные "малую петлю" и "большую петлю", одна между 181 и 189 аминокислотами и одна между 53 и 164 аминокислотами соответственно. Многочисленные синтетические и рекомбинантные соматотропины имеют различное число и различные последовательности аминокислот. Однако биоактивные соматотропины имеют третичную конформацию с характерными малой петлей и большой петлей. Термин "соматотропин", используемый здесь, заключает в себе любые соматотропины, имеющие "малую петлю" и включает не только "природные соматотропины", но также и "синтетические соматотропины" и "рекомбинантные соматотропины'1, имеющие аминокислотную последовательность природного соматотропина, аминокислотные последовательности, в основном сходные с ней, или форму ее укороченной последовательности, и их аналоги и мутеины, имеющие замещенные, изъятые, удлиненные, восстановленные или другим способом модифицированные последовательности. В частности, используемый здесь соматотропин включает рекомбинантный белок той же самой последовательности, как и природный соматотропин, но имеющий аминокислоты, изъятые из аминного и/или карбоксильного конца. Примеры таких белков включают (но не ограничиваются) дельта-7 рекомбинантный свиной соматотропин, дельта-4 рекомбинантный бычий соматотропин, природные соматотропины, имеющие 7 и 4 остатков, изъятых из аминного конца соответственно, и тому подобное. Термин "соматотропин с замещенной малой петлей", используемый здесь, описывает "соматотропины", которые имеют "большую петлю", образованную дисульфидной связью, но не имеют "малую петлю"; причем меркаптогруппы "малой петли" замещают, чтобы предотвратить образование дисульфидных связей "малой петли". Соматотропин с замещенной "малой петлей" идентичен в аминокислотной последовательности незамещенному соматотропину за исключением присутствия замещающих групп на меркаптогруппах цистеина, которые обычно образуют дисульфидную связь, ответственную за "малую петлю". Согласно настоящему изобретению способ предусматривает получение стабильного и биоактивного соматотропина. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 Способ включает селективное восстановление дисульфидных связей "малой петли" соматотропина с получением меркаптотрупп и замещение меркаптогрупп "малой петли". Замещение меркаптогрупп "малой петли" препятствует меркаптогруппам образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи, которые являются причиной образования димеров соматотропина, олигомеров и агрегатов и инактивируют соматотропин. Соматотропин, полученный с использованием этого способа, стабилен при длительном хранении и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. Замещенный соматотропин выделяют и, при необходимости, подвергают дальнейшей обработке для того, чтобы получить форму соматотропина, пригодную для длительного срока хранения и последующего введения животному. Используемый здесь соматотропин может быть получен из любого подходящего источника. Способы получения, выделения и очистки природных, синтетических и рекомбинантных соматотропинов хорошо известны в данной области. Соматотропин из любого вида животного может быть использован здесь; эти соматотропины включают (но не ограничиваются) человеческий, бычий, свиной, собачий, кошачий, лошадиный, птичий, рыбий и овечий соматотропины. Дисульфидную связь малой петли соматотропина селективно восстанавливают взаимодействием соматотропина с соответствующим восстанавливающим агентом в условиях, при которых восстанавливаются дисульфидные связи "малой петли", но не восстанавливаются дисульфидные связи "большой петли". Любые пригодные восстанавливающие агенты, которые взаимодействуют с меркаптогруппами белка, могут быть использованы. Обычно восстанавливающий агент представляет собой любое органическое меркаптосоединение, представленное формулой R-SH, где R есть органический углеводородный радикал, имеющий около 1-30 углеродных атомов. Предпочтительные восстанавливающие агенты включают (но не ограничиваются) 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол. Обычно раствор, содержащий около 1-20 миллиграммов на миллилитр (мг/ мл) соматотропина, смешивают с достаточным количеством восстанавливающего агента, чтобы довести концентрацию восстанавливающего агента до около 15-300 миллимоля (мМ), рН раствора доводят до 26853 около 6-10 и восстанавливающий агент подвергают взаимодействию с соматотропином в течение около 0,5-3 часов при температуре около 15-50"С. Избыток восстанавливающего агента удаляют любым подходящим способом, предпочтительно диализом, и образующийся восстановленный соматотропин с "малой петлей", содержащий две меркаптогруппы в "малой петле", подвергают замещению, как описано ниже. В одном варианте осуществления изобретения, подходящее количество соматотропина растворяют в карбонатном буфере СВ- (СВ- содержит 25 мМ NaCO3, 18 мМ Na2CO3, pH около 9,5), чтобы получить около 5 мг/мл раствора. Добавляют дитиотреит в количестве, достаточном для получения 20 мМ раствора, доводят рН до около 8 и осуществляют восстановление в темноте в течение около 1 часа при около 37*С. В другом варианте осуществления изобретения, СВ- раствор (рН около 9,8) соматотропина с его концентрацией около 5 мг/мл, содержащий 2-меркаптоэтанол при концентрации около 50 мМ, подвергают взаимодействию в темноте в течение около 1 часа при около 20-37*С. Избыток восстанавливающего агента удаляют и соматотропин подвергают замещению, чтобы получить стабильный и биоактивный соматотропин. Меркаптогруппы "малой петли", которые являются результатом восстановления» замещают путем взаимодействия восстановленного соматотропина с соответствующим замещающим агентом. Замещающим агентом, используемым для замещения восстановленных меркаптогрупп "малой петли", может быть любой пригодный замещающий агент, который взаимодействует с меркаптогруппами. Специалисту в данной области известны многие классы замещающих групп, которые реагируют с меркаптотруппами. Примеры таких классов включают, но не ограничиваются, замещающие агенты, такие как этиленимин, акрилонитрил, Nэтилимид малеиновой кислоты, 3-бромпропионовая кислота, 3-бромпропионамид, иодацетамид, иодуксусная кислота, М(иодэтил)-трифтораце7амид, 4-винилпиридин, метил метантиосульфонат. Наиболее предлог ительно, когда замещающим агентом яаляется алкилирующий агент, имеющий формулу R-X, где X есть галоид, предпочтительно S, BR или СІ, и R является алкильной цепью, разветвленной или линейной, имеющей около 1-30 углеродных 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 атомов, предпочтительно около 1-12 углеродных атомов. Обычно 1-200 мг/мл раствор восстановленного соматотропина с "малой петлей" смешивают с подходящим замещающим агентом до доведения концентрации замещающего агента до около 50-800 миллимолярной (мМ), рН раствора доводят до около 6-10 и замещающий агент подвергают взаимодействию с соматотропином в течение около 0,5-3 часов при температуре около 15-50*С. Избыток замещающего агента удаляют любым подходящим способом, предпочтительно диализом, и образующийся соматотропин с замещенной "малой петлей", содержащий две замещенные меркаптогруппы, подвергают обработке, чтобы получить соматотропин в форме, пригодной для длительного срока хранения и введения животному, обычно в лиофилизованной форме. В предпочтительном варианте осуществления СВ- раствор с содержанием около 5 мг/мл соматотропина, восстановленного в малой петле, содержащий иодацетамид при концентрации около 200 мМ при рН около 8,5-9 подвергают вза-имодействию в темноте в течение около 1 часа при около 20-37"С. Избыток йодацетамида удаляют диализом против 2% СВ\ Образующийся замещенный соматотропин в дальнейшем очищают обычным способом, если необходимо, и лиофилизуют с получением соматотропина, который является стабильным в течение длительного срока хранения и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается соматотропин с замещенной "малой петлей", который является стабильным в течение длительного срока хранения и имеет биоактивность, равную или большую, чем биоактивность незамещенного соматотропина. Замещенный соматотропин отличается от незамещенного соматотропина тем, что меркаптогруппы на цистеинах, которые образуют дисульфидную связь "малой петли", замещены, а меркаптогруппы на цистеинах, которые обычно образуют дисульфидную связь "большой петли", не замещены. Поэтому соматотропин с "малой петлей" имеет "большую петлю", типичную для незамещенного соматотропина, но не имеет "малой петли", поскольку замещенные меркаптогруппы не могут образовывать дисульфидные связи. Соматотропин с замещенной "малой петлей" неожиданно имеет биоактивность, 26353 равную или большую, чем биоактивность незамещенного сомаготропина. Кроме того, соматотропин с "малой петлей" имеет дополнительное преимущество в том, что он не может образовывать внутримолекулярные дисульфидные связи между меркаптогруппами "малой петли", которые являются причиной образования димеров соматотропина, олигомеров и агрегатов и инактивации соматотропина. Поэтому соматотропин с замещенной малой петлей более стабилен в течение длительного срока хранения. В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается разработка композиции, включающей смесь соматотропина с замещенной малой петлей в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как различные разбавители и связующие. Носитель может быть любым биосовместимым и носителем, совместимым с соматотропином с замещенной малой петлей, предпочтительно фосфат буферный солевой, Трис-НСІ, аргинин, гистидин и тому подобное. В общем, любой биосовместимый раствор или носитель с рН между б и 11 должен функционировать в настоящем изобретении в качестве носителя для соматотропина с замещенной "малой петлей". Соматотропин с замещенной "малой петлей" смешивают с фармацевтически приемлемыми носителями с образованием композиции, которая является стабильной в течение длительного срока хранения и позволяет легко препарироваться в дозах и легко приниматься. Композиция предпочтительно является лиофилизованной формой соматотропина с замещенной "малой петлей" и носителя. Настоящее изобретение, в основном, описано, следующие примеры иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения и демонстрируют использование и преимущества его. Рекомбинантный свиной соматотропин (RpST), используемый в примерах ниже, получают, используя E.coli микроорганизм, депонированный в American Type Culture Collection, Rockville MD, с регистрационным N 53031. Полное описание микроорганизма представлено в Пат. США N 4656255, включенном здесь ссылкой. Понятно, что данные примеры даны с целью иллюстрации, и подразумевается, что они не ограничивают описание изобретения или формулу изобретения каким-либо способом. П р и м е р 1. Пять (5) мг/мл растворы рекомбинантного свиного соматот 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 ропина (RpST) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3, 18 мМ Na2CO3, рН 9,8) восстанавливают в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии 0, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100 мМ 2меркаптоэтанола (МЭ). Вслед за восстановлением каждый образец подвергают взаимодействию при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа с 200 мМ йодацетамида (ИА), чтобы заместить меркаптогруппы, полученные из восстановительных цистинов. Образцы анализируют методом SDS-PAGE. Анализ SDS-PAGE геля показывает, что полное восстановление дисульфидных связей "малой петли" достигается при инкубации с 50 мМ МЭ, в то время как дисульфидные связи "большой петли" остаются незатронутыми. Поскольку "малая петля" восстанавливается, имеется небольшое (1-2 мм) уменьшение в подвижности RpST, обусловленное "растяжением" Сконцевой части петли. Такие изменения подвижности для сшитых белков по отношению к несшитым белкам по данным SDS-PAGE ранее сообщались Griffith, Biochem.S., 126, 553-560 (1972). Когда добавляют больше восстановителя, большая петля также восстанавливается, приводя к даже более сильному уменьшению подвижности (10-12 мм). Материал с восстановленной большой петлей существенно нерастворим, так как, когда материал, восстановленный в 30 мМ МЭ, центрифугируют, только материал с незатронутой "большой петлей" остается в супернатанте. Эти результаты показывают, что приблизительно 40-50 мМ МЭ дает оптимальный выход восстанов/енного в "малой петле" карбамидометилированного RpST. П р и м е р 2. Селективное восстановление дисульфидных связей малой петли дитиотреитолом. Пять (5) мг/мл растворы рекомбинантного свиного соматотропита (RpST) в карбонатном буфере (25 мМ NaHCO3, 18 мМ Na2COv рН 9,25) восстанавливают в течение 1 часа в присутствии 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 100 мМ дитиотреитола ЩТТ) в атмосфере азота при 37'С. После восстановлен ч каждый образец подвергают взаимодействию при 37*С между рН 8,5-9,0 в темноте в течение 1 часа с 150 мМ ИА, чтобы заместить меркаптогруппы, полученные из восстановленных цистинов. Избыточный/непрореагировавший ИА гасят небольшим молярным избытком ДТТ над ИА и диализуют в течение ночи против 0,1 М NH4HC0,, рН 7,88,2. Диализованный RpST анализируют пептидным картированием после 2 часового 13 26853 гидролиза с ТРСК-обработанным трипсином. Результаты показаны в табл. 1. В табл. 1 использованы следующие сокращения: время удержания (ВУ) каждой HPL С дано в минутах; /Т-Х/ = каждую зону анализируют и обозначают как трипсиновый пептид согласно положению, начиная от амино-концевой части последовательности; /Т-Х+Т-У/ = два трипсиновых пептида связаны ковалентно дисульфидным мостиком; в немодифицированном pST "малая петля" состоит из двух трипсиновых пептидов Т-23 и Т-25, которые ковалентно связаны дисульфидной связью, аналогично в большой петле связаны Т-5 и Т-18; х = Т-1 зона также элюируется в этом положении; хх = восстановленные цистеины замещают ИА; разделение 100 ид трипсинового продукта варки RpST достигается на Аквапоре С-8 колонке RP-HPL С (Brown-Lee), которую предварительно уравновешивают 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФК) и элюируют при 0,5 мл/мин 50% 2-пропанолом в 0,1% ТФК. Согласно табл. 1 результаты показывают, что полное восстановление дисульфидных связей "малой петли" достигается инкубацией с 20 мМ ДТТ, в то время как дисульфидные связи "большой петли" остаются незатронутыми. Это далее подтверждается, как показано в Примере 3. П р и м е р 3. Характеристика соматотропина с замещенной "малой петлей" Незамещенный RpST и RpST с замещенной малой петлей, полученный согласно способу Примера 1, варят в течение двух часов, используя трипсин. Продукты варки с трипсином анализируют, используя жидкостную хроматографию под высоким давлением с обращенной фазой (RP-HPL С). Результаты показывают зоны HPL С с временами удерживания 40,4 и 98 минут, соответствующие "малой петле" и "большой петле" соответственно. Однако после селективного восстановления и карбамидометилирования "малой петли", HPL С зона с временем удерживания 40,4 минут полностью исчезает с сопутствующим появлением двух зон с временами удерживания 3,6 и 50,9 минут. Анализы новых HPL С зон с помощью автоматизированного разложения по Edman подтверждают, что модифицированный RpST образец, содержит RpST с замещенной "ма 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 14 лой петлей", как предсказано. Данные для аминокислотной последовательности для незамещенных и замещенных в малой петле трипсиновых пептидов представлены в табл. 2. Дополнительное доказательство для карбамидометилирования двух цистеинов модифицированного RpST получено с помощью аминокислотного анализа. Значение 1,6 карбоксиметил цистеинов (CMC) вместо 2 для теоретического замещения в одной петле получено. Эти результаты представлены в табл. 3. П р и м е р 4. Биоактивность замещенного соматотропина. Биоактивность незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного согласно способу Примера 1, определяют с помощью проб по связыванию pST, используя мембраны печени беременного кролика и RpST, меченый 1 г 5 1. Модифицированная версия пробы, раскрытая Tsushima et al., Radioreceptor Assay for Growth Hormone, F: Clin. Endocrinol. Metab. 37:334-337 (1973), использована: Образец RpST инкубируют при ЗО'С в течение 3,5 часов с 1z5l-RpST с числом распадов 16000 в минуту. Область концентрации, используемой для кривой замещения RpST стандарта и RpST, замещенного в малой петле, находится между 0,38-200 нг/мл. Дополнительная информация для пробы по связыванию pST описана Tsushima et ah, Radioreceptor Assay for Growth Hormone, F. C!in. Endocrinol. Metab. 37:334-337 (1973). Результаты показывают, что рассчитанная концентрация иода при 50% (IC-50) pST, карбамидометилированного в малой петле, составляла 1,24 нг/ 0,5 мл эквивалента связывания, тогда как незамещенный и диализованный образцы давали значение 3,0 нг/мл и 2,9 нг/0,5 мл соответственно. Стандарт дает Ю50 2,35 нг/0,5 мл. Из этих данных, как рассчитано, процент 181%, в противоположность значению около 75% для незамещенного соматотропнна. П р и м е р 5. Биоактивность замещенного соматотропина. Биоактивность незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного согласно способу Примера 1, определяют, используя связывающую активность в мембранах печени свиньи согласно модификации способа Наго et al., Homologous Somatotropin Radioreceptor Assay Utilizing Recombinant Bovine Growth Hormone, Мої. Cell Endocnnol, 38:109-116 (1985). Результаты показывают, что рассчитанное IC-50 pST, карбамидометилированного в малой петле, составляет I 15 26853 1,29 нг/0,5 мл по сравнению 1,61 нг/0,5 мл для незамещенного pST и RpST стандарта. Результаты показывают, что замещенный RpST имеет 125% активность по сравнению с 100% .для немодифицированного (незамещенного) RpST. Эти ре' зультаты показывают неожиданно высокое связывание, что соматотропины, полученные согласно настоящему изобретению, не только более стабильны, но и более биологически активны, чем их немодифицированные предшественники соматотропинов. П р и м е р 6. Биоактивность и биопотенция замещенного соматотропина. Относительная биоактивность и биопотенция незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле, полученного по способу Примера 1, определяют путем измерения прироста веса тела у гипофизэктомизированных {гипокс) крыс. Четыре (4) группы, по 10 гипокс крыс в группе получали 24 ug pST/день стандартный pST, диализованный Zn-RpST, Zn-RpST, замещенный в "малой петле", или незаме. щенный Zn-RpST в течение 9 дней. Крыс контролировали ежедневно и приросты веса их тела записывали на протяжении периода 10 дней. Прирост веса измеряли и рассчитывали относительную биоактивность в процентах, как процент от стандарта. Результаты показаны в табл. 4. Согласно табл. 4, данные показывают, что замещенный RpST дает значение прироста веса в процентах 13,5% по сравнению с 14,4% для незамещенного RpST. Кроме того, данные демонстрируют, что карбоксиконцевая часть "малой петли" не требуется для соматотропина, чтобы ускорять рост. П р и м е р ' 7. Стабильность раствора замещенного соматотропина. Растворы 8 мг/мл незамещенного RpST и RpST, замещенного в малой петле (полученного с ИА согласно Примеру 1), содержащие 0,5% азида натрия, приготавливают либо в 46 мМ карбонатном буфере (рН 9,8), либо в фосфатном буфере (рН 7,4). Аликвотные пробы по 1,25 мл инкубируют в микроід/ентрифужньгх труб 16 ках Eppendorf в течение 0,6, 4,6, 8,8, 22 и 120 дней при 37'С. В конце каждого инкубационного периода аликвотные пробы удаляют и ана5 лизируют на RpST мономер, используя Superose-12 Size - вытеснитопьную хроматографию с подвижной фазой 46 мМ карбонатного буфера (рН 9,8). Относительч ное количество мономера, димера и обра10 ч зуемых агрегатов с более высокой молекулярной массой показывает, что имеется более высокое процентное содержание мономера, выделяемого при восстановлении и замещении малой петли. 15 П р и м е р 8. Стабильность замещенного соматотропи-а во влажном состоянии Незамещенный RpST и RpST с замещенной "малой петлей" (полученный с ИА 20 согласно Примеру 1), содержащий 5 мг/мл, диапизуют против 0,46 мМ карбонатного буфера и лиофилизуют, получая сухие RpST образцы для дальнейшего испытания. Пять мг сухих замещенного в малой петле и 25 незамещенного RpST увлажняют 0,01 мл 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 0,05% азида натрия или 46 мМ карбонатного буфера, рН 9,8, 0,05% азида натрия. Пасты подвергают инкубации в течение 14 дней при 30 37*С. По окончании этого времени RpST разбавляют до конечной концентрации около 1,8 мг/мл в 46 мМ карбонатном буфере, рН 9,8, гомогенизируют в ультразвуковом гомогенизаторе Branisonic 220 в тече35 ние нескольких минут и центрифугируют при 15000 X G в течение 5 минут. Супернатант анализируют на содержание мономера методом хроматографии, описанным в Примере 6. Результаты показывают, что 40 выделение RpST мономера было много больше для RpST, замещен: юго в "малой петле", независимо от рН при увлажнении, по сравнению с незамещенным RpST. Очевидно возможны многие модифи45 кации и вариации настоящего изобретения в свете вышеупомянутых указаний. Поэтому следует понимать, что не выходя за рамки объема формулы изобретения изобретение может быть осуществлено 50 иначе, чем, в частности, описано. 18 26853 17 Т а б л и ц п f Поведение удерживания трипсиновых пептидов, ассоциированных с малой и Голы пои петлями pST Малая петля (ВУ мин) немодифицированный (Т-5+Т-18) восстановленный (Малая петля только) (Т-5+Т-18) восстановленный (Т-5), (Малая и большая петли) (Т-18) замещенный** (Малая петля только) (Т-5+Т-18) замещенный** (Т-5), (Малая и большая петли) (Т-18) Большая петля (ВУ мин) 40,4 (Т-23-Т-25) 3,6 (Т-23), 45,0 (Т-25) Образец 98,0 98,0 80,6* 3,6 (Т-23) 60,0 45,0 (Т-25) 98,0 3,6 (Т-23) 50,9 (Т-25) 85,6 3,6 (Т-23) 74,3 50.9 (Т-25) Т а б л и ц а 2 Аминокислотная композиция + немодифицированного и модифицированного RpST Аминокислота Немодифицированный образец, моль/моль ASP THR SER GiU PRO CLY ALA CYS* VAt MET ILE LEU TYR PHE LYS HIS APG CMC** Всего 16.5 7,6 12,3 26,8 6,1 8,0 17,0 3,8 7,6 1.8 5,5 23,3 6,7 11.6 10,3 5,0 12,6 0 182 Модифицированный образец, моль/моль Теоретическое значение 17,0 7,7 12,6 27,7 5,7 8,0 15.7 2,4 5,3 16 8 14 25 5 8 16 4 8 22 24 24 7 12 11 3 13 СМ.СУ 182 и 5,5 23,2 6,8 11.7 12,6 5,0 12.6 1.6 182 + - Определенная аминокислотным анализом после 24-часового гидролиза. CYS*- Это значение получают как цистин и умножают на фактор 2, чтобы получить значение цистеина (выраженное как моль/моль). C M C " - Значение карбоксиметилированного цистеина рассчитывают путем использования соответствующего стандарта. 20 26853 19 Т а б л и ц а 3 Анализы аминокислотной последовательности HPL С зон, представляющих пептиды малой петли и карбамидометилированного Т-23 Цикл РТН-остаток Количество (пМол)ДпМол) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 РНЕ VAI GLU SER SEP 609 638 243 223 154 CYSTINE(-S-S-) ALA РНЕ Пропуск РТН-остаток Пропуск ARG ARG Пропуск Пропуск Пропуск Пропуск Пропуск Пропуск (++)* 214 116 — Количество v .Мол) 113 109 *Цистин-РТН элюирует при 14,8 минутах. Точное количество не рассчитано из-за недоступности цистин-РТН стандарта. Поскольку два РТН-остатка освобождаются во время 2-ого и 3-его циклов Эдмана, также установлено, что после 2 часов гидролиза трипсином карбокси-конечная часть ARg-ARg аминокислот не расщепляется. Трипсин не может гидролизовать эти связи. Представляется также, что Cystine-ARg связь устойчива к гидролизу трипсином. (A) ВУ HPL С зоны: 40,5 из пептидной карты немодифицированного RpsT. (B) BY HPL С зоны: 50,9 из пептидной карты модифицированного в малой петле RpST. Продолжение табл. 3 Цикл РТН-остаток 1 РНЕ VAI GLU SER SEP 2 3 4 5 6 7 8 9 Количество (пМол) 114 54 44 ++ ++ CAM-CYSTEJNE* ALA РНЕ Пропуск 56 37 'Появление новой РТН зоны при ВУ: 9,24 обусловлено карбамидометилцистеином. "Количество не рассчитано из-за недоступности САМ-Су РТН стандарта. 26853 21 22 Т а б л и ц а Определение биоактивности свиного соматотропина Соматотропин (ST) pST стандарт Диализованный Zn-RpST Замещенный в малой петле Zn-RpST Не замещенный Zn-RpST Доза % весового значения Прирост СО % относительн. биоактивности* 24 24 23,1** 14,4** 2,9 2,5 55*** 62 24 13,5** 2,8 58 24 17,1** 2,2 4 74 'Относительно гипофизарно полученного pST стандарта, испытанного при аналогичной концентрации. "Значительно более высокий (Р