Спосіб моделювання хронічних неспецифічних захворювань легень та гіпертензії малого кола кровообігу

МЗК6 G- ОЭ В 23/28 Спосіб моделювання хронічних неспецифічних захворювань легень і гіпертензії малого кола кровообігу . Винахід відноситься до області експериментальної медицини і може бути використаний для одержання моделі хронічних неспе цифічних захворювань легень (ХНЗЛ) і гіпертензії малого кола кровообігу (ГМКК) на дрібних лабораторних тваринах (щурі). Доцільність створення моделі ХНЗЛ і ГМКК на щурах обумовлена широким розповсюдженням цього захворювання і необхідністю вивчення ефективності нових лікарських препаратів з метою корекції даного патологічного стану . Відомий спосіб моделювання хронічного бронхіту (1), заключається в тому, що кролів імунізують гемогенатом із слизової оболонки бронхів серця і печінки з ад"ювантом Фрейнда що при, , водить до виникнення на ЗО день панбронхіту Однак, даному спо. собу властиві недоліки спосіб не дає можливості створити ХНЗЛ з : усіма його структурними ознаками і ГМКК За прототип взято . спосіб моделювання хронічної пневмонії (2), що заключається в тому, що піддослідним собакам здійснюють мікроемболізацію судин малого кола кровообігу шляхом внутрішньовенного введення мл/кг 8 маси тварини 50% - 60% суспензії курячих еритроцитів на фізио логічному розчині , потім через 1,5 міс. вводять ту ж саму суспензію курячих еритроцитів в дозі 1-5 мл/кг маси. Зростання хронічного процесу здійснювали шляхом повторного введення суспензії курячих еритроцитів в дозі 1-5 мл/кг маси тіла тварин через 3; 4,5; 6 міс, що дає можливість одержати мо дель через 6 місяців від початку моделювання . Однак, даний спосіб є трудомістким і дорогоцінним , тому що потребує значну кількість безпородних собак. Метою нашого винахіду було спрощення скорочення строків одержання моделі і її , здешевлення шляхом використання дрібних лабораторних тварин , яким проводить ся імунізац ія гомогенатом із тканини легень з ад"ювантом Фрейнда підшкірним введенням в пахвину передніх та задніх кінцівок і потім через20 днів одноразово внутрішньовен ним введенням у хвостову вену 25% суспензії курячих еритроцитів з гомогенатом із тканини легень у співвідношенні(1:1), оброблених таніном в кількості 0,1-0,15 мл на 100 гр маси тіла. Порівняння заявленого способу з прототипом , який відтворює 2 хронічну пневмонію на собаках шляхом повторного внутрішньовенно го введення 50%-60% суспензії курячих еритроцитів через кожні 1,5 міс. дає можливість зробити висновок про наявність "новизни" Відзначною ознакою заявленого способу є використання більш доступного стандартизованого об"єкту- білих щурів, та введення їм сумісно з еритроцитами антигена тканини легень , що дозволяє одержати модель ХНЗЛ з ГМКК через 3 місяці, тобто в 2 рази швид ше, ніж в прототипі, а також скорочення кількості введень до 1 разу (в прототипі - 4 рази). Внутрішньовенне введення курячих еритроцитів з гомогенатом із тканини легень застосоване вперше . Спосіб здійснюється таким чином щурам лінії Вістар в пах : винну область підшкірно вводять 0,1 - 0,15 мл ад"ювантом Фрейн да. Через 20 днів вводять 25% суспензію курячих еритроцитів з гомогенатом із тканини легень , оброблених таніном з розрахунку (1:1) в кількості 0,1 - 0,15 мл на 100 гр маси тіла. Заявлений спосіб дозволяє через 3 міс. від початку моделю вання одержати модель ХНЗЛ з чітко вираженими ознаками хронічно го пневмоніту, поєднаного з емфізематозними змінами, ознаками хронічного бронхіту і гіпертензії малого кола кровообігу , що свідчить про скорочення строку одержання моделі ХНЗЛ Підвищення . точності моделювання досягається за рахунок використаняя стан дартизованих ліній тварин (маса, вік, стать та ін .), можливості збільшення кількості тварин у досліді і динамічного спостережен ня (вибірково) за процесом моделювання а також використання ан , тигенів (гомогената з тканини легень ). Приклад 1. (З місяці спостереження). При обстеженні 15 щурів, в яких відтворювали ХНЗЛ з ГМКК установлено: Результати патоморфологічного вивчення легень щурів через З місяці від початку досліду свідчать про розвиток в них комплексу структурних змін, які стосуються респіраторного відділу , бронхіальне дерево і судини системи легеневої артерії. В цей строк спостереження домінуючим в респіраторному відділі є ознаки хронічного пневмоніту , щільність поширення яких складає в середньому 41,3%. Звертає на себе увагу значна гетерогенність ура ження у плані поширення цих змін : від осередка - до субтотональ ної і тональної зміни легеневої тканини . з Мікроскопічні міжальвеолярні перетинки представляються нерівномірно потовщеними набряком, інфільтрованими лімфовидними , елементами, плазмацитами, макрофагами, нейтрофільними гранулоци тами. Паралельно виявляється осередкове накопичення плазми і фібрину в просвітах альвеол еритроцитів . На цих дільницях виявляю тьс я о зн аки ва ску лі тів р ео лог іч них по руш ен ь у ви гля ді , стаз і в, феномена сладжа, м і кротромбозу . Структурні ознаки хронічного пневмоніту поєднуються з роз витком емфізематозних змін , проявленими потоншеннями міжальвео лярних септ , зменшенням в них кількості клітинних елементів . Щільність осередку емфіземи складає 19,3% площі зрізу. У всіх щурів є ознаки хронічного деструктивного і деформуючого бронхіту різного ступеню вираженості, виявленного переважно в бронхах великого і середнього розміру і займаючого 9,8% площини зрізу. Мікроскопічне вивчення препаратів виявило також зміни су дин системи легеневої артерії Відповідно різним генераціям . бронхів в судинах малого , середнього та великого калібрів вияв ляється потовщення і склероз стінок . Створюється потовщення се редн ьої об оло нки а рте ріо л і арте рій поч инаю чи з рі вня , термінальних бронхіол . Патологічним змінам підлягає еластичний каркас таких судин - в них відмічається гіперплазія і розшару вання внутрішніх еластичних мембран При морфометричному аналізі . статистично достовірно збільшується товщина стінок великих і се редніх гілок легеневої артерії ; в дрібних гілках статично достовірно зменшується діаметр просвіту (табл. 1). Ультраструктурний аналіз тканини легень тварин через З місяці після утворення моделі показав наявність значних змін з боку бар"єра повітря - кров. Таблиця і. Морфометричні показники товщини стінки та діаметра просвіту судин легеневої артерії усіх калібрів в динаміці відтворення у білих щурів "імунологічної моделі" ураження легеневої тканини . судини дрібного калібру групи І судини велико- І судини середнього наг ля ду іг о ка ліб ру І к ал іб ру І товщ . І стін . І судин І ТОВЩ. І стінки І судин І просвіт 10,40 ± І судин 10,02 міс. конт 0,9 ± п=30І0,50± і 0,04 0,02 0,56 ± 0,02 ІПОСВ1Т І судин І товщ. І стін. І судин просвіт судин 0,58 ± 0,02 10,32 ± 10,02 0,32 ± 0,03 10,76 ± і 0.05 10,35 ± 10,01 0,17 ± 0,01 Імод. 10,70і 11,08 ± п-4010,0 3 10,0 5 t 15,53* 12,81* Іко нтІ І 15,66* ІЗ, 34* 11,34 (4,74: І іп ± ± 10, 2 Ю 05 ± Ю. 3 10. 01 10, 02 Ю 03 6 І -- 1 --- 1----- 1 ------1 ------1 ----- 1 - і ± ЗОІО, 65 10,98 І0.5 10 , 0 3 1 0, 0 3 10 , 02 ± І міс. Імод. 10,7 ± 10,8 ± 10,5 ± Іп- ЗО ІО, 0 3 10 ,04 1 0, 02 І t 13,3** 10,6 12,05 10,5 ± 1 0,0 3 10,2 10,3 ± 1 0,0 2 ІО І0.2 ± 1 0,0 2 ІЗ,5** * - достовірність між контролем та дослідом - 3 міс. * * - достовірність між контролем та дослідом - 6 міс. 5 В просвіті альвеол нерідко виявляють хлопкоподібний ма теріал, еритроцити , нитки фібріну, часто зустрічаються альвео лярні макрофаги . Звертає на себе увагу підвищення кількості ве лик их аль ве оло ци тів О ст анн і з на ход ять ся . в акт ив ном у функціональному стані , про що свідчить наявність значної кількості мікроворсинок на поверхні клітин , підвищений вміст пластинних осмифільних тілець в цитоплазмі . Для капілярів притаманно витончення ендотеліального шару в певних дільницях та явища набряку цитоплазми- в інших, відшарування базальної плазмолеми ендотеліоцитів зміни реологічних по , казників крові . В просвітах гемокапілярів спостерігаються ерит роцити зміненої форми з різними ступенями лізису скупчення , тромбоциторних елементів. В альвеолярних перетинках явища набряку , новоутворення колагенових волокон, явища клітинної проліферації. Серед фібробластів, лімфоцитів , дегранульованих тучних клітин переважають плазматичні клітини Зміна ультраструктури останніх передумовлю . ють участь місцевої імунної системи в розвитку запального процесу в легенях. Таким чином, в респіраторному відділі легень через3 місяці від початку експерименту при наявності ряду показників запально го процесу спостерігається активація імунних процесів , а також підвищення активності альвеолоцитів II типу. В міокарді правого шлуночка в цей період експерименту вияв ляє тьс я г ете ро ген ні сть ул ьт рас тру кт урн ої ор ган із аці ї кардіоміоцитів. Це проявляється чергуванням змінених та незміне них клітин , різним ступенем прояву уражень кардіоміоцитів та їх органел, наявністю ультраструктурних перебудов компенсаторнопристосувальних та деструктивного характеру. Останні переважаю ть в це й стр ок с по сте ре же. П о бі льш ій ч ас тин і в нь кардіоміоцитах спостерігаються явища довколоядерного та підсар колемного набряку, порушення довколишньої організації міофібрил , осередковий лізис саркомерів . Зустрічаються дільниці перескоро чення міофібрил. Значна частина мітохондрій набрякла спос, терігається вимивання внутрішньомітохондріального матрикса . Морфологічні дослідження підтверджуються стереологічним аналізом . Спостерігається достовірне , в порівнянні з контролем , зменшення об"ємної та чисельної щільності мітохондрій , а також 6 об"ємної щільності міофібрил. Поряд з цим підвищується площа мітохондрій в порівнянні з контрольною групою . Порівняння розподілу мітохондрій по площині у контрольних та експериментальних тварин за допомогою критерію Колмогорова-Смірнова з високою дос тов ірн іс тю сп ро сту вал о Н - гі по тез у пр о схі дн іст ь ви бор ок о 2 2 (а -11,97 при с£ 01=2, 65). Для кап іляр і в характерна наявн і сть набряклих ендо теліоцитів, чергування світлих та темних ендотеліальних клітин . Частина капі лярів зна ходить ся в зап алому стан,і в інш их просвіт заповнений електроннощільним хлопковидним вмістом, що свідчить про їхній гіпоксичний стан . В інтерстиції міокарду в значній кількості зустрічаються макрофаги, тканинні базофіли. Таким чином, через 3 місяці експеримента в міокарді правого шлуно чка пер еваж ають ди стро фічн о-де стру ктив ні змін и які , свідчать про наявність ультраструктурних ознак розвитку серцевої недостатності. На 20 щурах вивчені показники, внутрішньосерцевої гемоди наміки (правий шлуночок), системного артеріального тиску і біоелектричної активності міокарда в динаміці ХНЗЛ через 3,5 місяці. Стан гемодинаміки в малому колі визначався по рівню сис толічного тиску в правому шлуночку серця . Узагальнені результати дослідження представлені в таблиці N2. 7 Таблиця 2 Показники внутрішньосерцевоі гемодинаміки (правий шлуночок) системного артер і ального тиску і б і оелектрично ї активност і міокарда щурів в динаміці "імунологічної моделі " ХНЗЛ. Умо ви І Пр ави й шлу но чок се рц я І СА Д /мм р т.с т./ І досліду І ------------ 1-----------1--------- 1--------- 1 ----- 1 ----- 1 ----- 1 -------1 --------------------------- 1 І Р мах ІР розв. l+otp/ottl-otp/ottl JC 1 ! JP 2 і І мм рт .І мм рт . І мм рт .І мм рті І с т. І ст . І ст ./с І с т/с І І І І І і Іс истідіастіпул ьс І І І І І 1 -- 1 -- 1-- 1 - 1—І—І—І--- 1 ---- 1 --------- Контроль і 15,0 18,0 1390 1239 150 132 1114 196 118 І і і і і і І* І± I I I I І± I І± п-7 І 0 ,9 11,3 163 168 І2.2 І2.5 і 18,0113,5 U, 5 І ---------- 1 ----1 ---- 1 --- 1 ---1-- 1 --1 -- 1 -- 1 ----- і Модель 116,8 18,7 1387 1256 146 ІЗ, 1 1140 1112 128 І ХНЗЛ, |± 3,5 мі І2,6 |± 11,5 Iі 153,2 |± 138,5 |± |± |± 1 - JC - індекс скорочення 2 - JP - індекс розслаблення |± 12,8 11,5 119,0114,8 15,6 п-13 І і І І І І І ____ і _______ і________ і ______ і_______і ____ і ____ і __________і |± І І ____і _____ і І І І 8 Продовження таблиці 2 Показники ЕКГ ЧСС І Висота зубців, mv І Ширина зубців, с І Інтервали,с уд/ хв i lm v=1 0m v І І І і ІР і І І R І Т І Р і і IR І ІТ і і PQ QT І ____1 _______І ______ І _______ 1 _____ 1______І ______ і _______ І Контроль і і і і і і І і і QRS І RR ______І ______і ______ і і і і 336 Ю, 11 10,5 10,19 І0. 021І0.018І0.07 10, 05 10,09 І0.018І0. 24 |± |± |± |± |± |± |± І І І |± |± І І ± |± 21,4 10,01 10.03 10,019 10,00210,00110,00910,002 10,00310,00310,02 ___ і _______і ______ і _______ і _____ і ______і ______ і _______ і ______\ ______і ______ модель ХНЗЛ І І І ! І 283 10,11 10,45 10,19 І0,022І0,02 10,09 10,059 10,12* 10, 02710, 22 ± |± |± |± |± |± о , | ± |± |± І± * |± 15,8 10,012 10,02810,019 10,00310016 10,00910,002 і 0, 002 і 0, 00310, 013 _______ і________і ______ і _______ і______ і ______і ______ і _______ і ______і ______і ______ * - достовірна різниця між контролем і групою"модель ХНЗЛ" Показано, що тиск в ПШ на цей період підвищився в середнь ому на 20%. Зростання тиску відмічено у 37% тварин. Рівень підвищеного тиску рівнявся 22-30 MM Hg, перевищуючи вихідну ве личину (15,0 ± 0,97 MM Hg) на 47,8-100%. Приклад 2. (6 місяців спостереження ) Аналіз проведених досліджень дозволяє констатувати що че, рез 6 місяців від початку моделювання патології легень у піддослідних тварин спостерігаються структурні ознаки ХНЗЛ Вони . проявляються осередковим розвитком хронічного пневмоніту з нерівномірним потовщенням міжальвеолярних перетинок , їх набряком, круглоклітинною інфільтрацією і незначним локальним фібро зом. В інфільтратах на цей період переважають лімфоцити і плаз 9 моцити, в помірній кількості зустрічаються тканинні базофіли ; нейтрофільні гранулоц ити нечисельні. Щільність по ширення хронічного пневмоніту в цьому терміні спостережень зменшується до 32,2%, хоча у деяких щурів відмічається тотальне враження ле геневої тканини. У всіх долях легень виявляються також ознаки панацинарної емфіземи , яка не відрізняється достовірно по ступеню поширення від попереднього строку спостереження (18,7%). Осередок емфіземи чергується з локусами хронічного пневмоніту і проявляється різким потоншенням міжальвеолярних перетинок зменшенням у них , кількості клітинних елементів і тенденцією до редукції капіляр ного русла. У всіх щурів відмічаються морфологічні ознаки хронічного бронхіту, частіше катарального (9,5%) і (2,2%) рідшедеструктивного. Особлива увага була приділена вивченню становища кровонос них судин системи легеневої артерії Дослідження показали розви. ток змін в артеріях всіх калібрів в яких виникає фіброз і міое , ластофіброз стінок судин, що веде до звуження їх просвітів . Морфометричні дослідження виявили достовірність змін показ ників товщини стінок судин і діаметра їх просвітів(табл. і), що свідчить про наявність в легенях піддослідних щурів структурних ознак прекапілярної форми гіпертонії малого кола кровообігу . Ультраструктурний аналіз респіраторного відділу різних ділянок легень через 6 місяців після іммунізації тварин також показав наявність структурних змін у легеневій тканиніДля . капі ляр ів хар акт ерн і по руш енн я е ндо тел іал ьни х к літ ин : відмічається повсюдне потоншення ендотеліальної вистилки з послідуючим міхурцевоподібним відшаруванням зустрічаються наб ; ряклі і локально лізировані площини ендотелію В просвіті судин . є еритроцити зміненої форми з різним ступенем виразу лізису мембран, накопичення тромбоцитів , що свідчить про зміни рео логічних властивостей крові. Більша частина альвеолоцитів II типу містить збільшену кількість пластинчастих осьміофільних тілець в цитоплазмі, що свідчить про активний функціональний стан цих клітин . Це 10 підтверджує і наявність структур сурфактанта в просвітах альве ол. В деяких тварин відмічене збільшення числа плазматичних клітин в септальному просторі Поряд з непошкодженими клітинами . зустр і чають ся зруйнован і плазмоцити Спостер і гається велика . кількість макрофагів , які містять підвищену кількість фагоцитів і лізосом, що свідчить про активацію фагоцітарних процесів На. копичення плазматичних клітин і макрофагів передбачає участь місцевої імунної системи в розвитку запального процесу . Структура міокарду правого шлуночка характеризується гете рогенністю ультраструктурної організації кардіоміоцитів В енер. гетичному і скоротливому апараті міокарда тварин поряд з дест руктивними розвиваються компенсаторно-пристосувальні процеси. Слід відмітити перевагу останніх в порівнянні з 3-х місячним строком експерименту Це проявляється в збільшенні кількості . мітохондрій, рідше зустрічаються мітохондрії з ознаками деструкції. Мітохондрії круглої та овальної форми їх матрикс гіпе , росмирований. Гіпертрофічні і набрячні мітохондрії зустрічаються рідше, ніж в 3-х місячному строці експерименту. Стереологічні дослідження кардіоміоцитів в свою чергу пока зали, що всі вивчені параметри, які характеризують стан мітохондрій та міофібрил , хоча і достовірно відрізняються від таких у контрольній групі, мають тенденцію до покращення. Зокрема збільшується число мітохондрій в одиниці об"єму а також об"єм, , займаючий мітохондріями і міофібрилами в кардіоміоцитах в порівняні з попереднім строком експеримента (табл. 2). Основна частина міофібрил розміщена паралельними рядками , зрідка відмічаються дільниці з порушенням просторової ор ганізації саркомерів , лізосом міофібрил. Є дільниці перескорочення міофобрил різного ступеню прояву Саркоплазматична мембра . на має поодинокі враження які супроводжуються виходом органел в , міжклітинному просторі (мал. 54). Рідше ніж в 3-х місячному строці відмічаються випадки підсарколемального набряку . и Зміни в серці нерозривно пов язані зі станом ультраструктури капілярів - загальних компонентів системи які забезпечують , мікроциркуляцію в тканині. Частина гемомікросудин зберігають ультраструктурну організацію типову для контрольних тварин. В цей час деякі капіляри спазмовані, просвіт інших - заповнений и хлопковидним вмістом Для ендотелія притаманне чергування темних . кліт ин, час тин а ен дот елі оци тів наб ряч на Іно ді в сті нці , капілярів спостерігаються різноманітні за своєю інтенсивністю дистрофічні процеси, які мають нерівномірний оседкових характер . Беручи до уваги вищезгадане можна зробити висновок що че, , рез 6 місяц ів п ісля відтв оренн я "ім уноло гічно ї мод елі" в міокарді тварин переважають процеси компенсації . Вивчення (дослідження) гемодинаміки через 6 місяців виконано на 7-ми тваринах. При цьому встановлено достовірне зниження ряду показників : ± скоротливої активності міокарду (dp/dt max 215,0 17,9 проти ± 390,0 63 мм рт. ст/с -45%), індекса скоротливості (37,4 ±5 , 0 проти 50,0 ± 2,2, - 25%), амплітуди зубця R (0,37 ± 0,02 проти 0, 5 ± 0,03, - 26%) (табл.2). Поряд з цим достовірно підвищився рівень систолічного та діастолічного артеріального тиску (189,2 ± 17,7 проти 114,0 ± 18,0 та 162,3 ± 1 1 , 8 проти 96,0 ± 13,5 мм рт. ст., + 66% та 69% відповідно). Встановлено зміни пульсового тиску (26,9 t 3,8 проти 18,0 ± 4,5 мм рт. ст.). Спостерігалось збільшення довжини зубця R (0,023 ± 0,001 проти 0,018 ± 0,001 с, + 27%) та інтервала QT( 0,12 ± 0.005 проти 0,09 ± 0,003 с, + 33%). Відхилення електрокардіографічних показників мають достовірний характер і обумовлені очевидно, гіпоксичним фактором , , що призводить до дифузних змін міокарду. Всі ці дані свідчать про те, що у тварин з шестимісячним строком ХНЗЛ зберігається розлад кровообігу, який супроводжується пригніченням серцевої діяльності. Запропонований спосіб був застосований для моделювання ХНЗЛ та ГМКК на 40 щурах; 20 щурів правили за контроль Спостережен. ням встановлено що запропонований спосіб забезпечує досить ви , сокий рівень відтворення процесу щодо патогенезу цього захворю , вання, наближається до клінічного варіанту і дає можливість вив чення особливостей функціонування життєвоважливих органів при зазначеній патології, а також створює можливості для випробуван ня фармакологічних засобів. 12 Джерела інформації 1. Осипов Ю.А . Экспериментальный воспалительный процесе в бронхах . Депонирование в ВИНИТИ 03.0- 2.92 N 248— 139 Самаркандский и- , 1993. стр. 4-6. 2. Андреенко Т. В., Антоненко Л. I., В. Г., Быченко И. Колесова Н. А., Корчак В. И, * Кречковский .А , Радловская З.Т Рытикова Л. И., Стеченко Л. А., Федуров В. В. Французова СБ Киселева А.Ф., Сахарчук И. И. Способ моделирования хроническо пневмонии. Авт. свидтельство N 8264401 4. 01 1981 (51) М. Кл8 С 09 В 23/28, 16, 1981. Бюлл.