Спосіб визначення спектра похідних білірубіну та білівердину в біологічній рідині

1. Спосіб визначення похідних білірубіну та білівердину в біологічних рідинах, який включає підготовку проб, екстракцію суми пігментів з досліджуваного матеріалу, хроматографічний розподіл і спектрофотометричну кількісну оцінку за допомогою діазореакції, який відрізняється тим, що відібрану пробу адсорбують на обеззоленому фільтрувальному чи хроматографічному папері з позбавленням води, екстракцію загальних пігмен U 2 (19) 1 3 41602 4 логічних рідинах за допомогою хроматографічних певних плям на хроматограмах супроводжується методів. В цілому це не забезпечує об'єктивної частковим розкладом та втратою пігментів і закількісної оцінки перебігу фізіологічно-біохімічних ймає при проведенні аналізу значний час - до 12 процесів в печінці людей та тварин, які лежать в годин. основі біосинтезу та метаболічних перетворень і 7. Загальноприйнята діазореакція, яка застотранслокації через мембрани клітин похідних білісовується для кількісної оцінки при малих конценрубіну та білівердину. траціях пігментів в біорідинах є недостатньо ефекЗа сукупністю ознак найбільш близьким до зативною. пропонованої корисної моделі є спосіб, який вклю8. Процес аналізу біологічної рідини, яка викочає процес підготовки проб біорідини та стабілізаристовується в цьому способі, супроводжується цію похідних білірубіну з можливим попереднім їх значним розкидом даних і знижує достовірність перерозподілом в різних фазах комбінованого отриманих результатів. розчинника та наступним хроматографічним розВ основу даної корисної моделі поставлена поділом на різних носіях і кількісною спектрофотозадача удосконалити спосіб визначення спектру метричною оцінкою вмісту окремих метаболітів похідних білірубіну та білівердину в біологічній пігментного обміну. Процес підготовки полягає у рідині шляхом оптимізації підготовки проб та умов тому, що протягом доби необхідно кількісно відіекстракції даних метаболітів з певних біорідин, брати і підготувати певну біологічну рідину та стабілізації та інтенсифікації, як природного, так і швидко провести екстракцію суміші пігментів. Для забарвлення після реакції зі специфічними барвекстракції пігментів з біологічної рідини використониками пігментів після більш ефективнішого хровують етанол, який сприяє денатурації наявних в матографічного розподілу на доступних носіях з ній білків і, разом з тим, інактивує можливий ферметою виходу на пряму денситометричну кількісну ментативний гідроліз певних кон'югованих похідоцінку, виключаючи етап елювання плям окремих них білірубіну. Окрім того, в досліджувану біорідипохідних для спектрофотометричної оцінки. Однону попередньо вносять сульфат амонію від 3% до часно спосіб оптимізує умови для масового відбо5% для послаблення зв'язків пігментів з ліпопротеру проб. їдним комплексом жовчі та аскорбінову кислоту від Поставлена задача вирішується тим, що у 0,1% до 0,5% для зменшення фото - та хімічно способі, який включає підготовку проб, екстракцію індукованого розщеплення зв'язків у структурі мосуми пігментів з досліджуваного матеріалу, хромалекул похідних білірубіну і білівердину. тографічний розподіл і спектрофотометричну кільДля оцінки якісного і кількісного вмісту окремих кісну оцінку за допомогою традиційної діазореакції, похідних білірубіну та білівердину проводять хрозгідно з даною корисною моделлю, відібрану пробу матографічний аналіз екстрагованої суміші пігменадсорбують на обезболеному фільтрувальному чи тів в тонких шарах силікагелю фабричного виготохроматографічному папері з позбавленням води, влення (Silufol, ЧССР) за допомогою системи екстракцію загальних пігментів проводять депротерозчинників фенол: вода 41:9 за об'ємом. Вміст їнізуючою сумішшю органічних розчинників - ацеокремих похідних білірубіну кількісно визначають тону з бутанолом в об'ємному співвідношенні 4:1 з протягом 12 год після елюції їх з хроматографічдодаванням 5% карбаміду, а для хроматографічних плям за допомогою спектрофотометричного ного розподілу складових екстракту використовуметоду використовуючи при цьому діазореакцію ють комбінацію органічних та неорганічних розсульфанілової кислоти, нітропрусіду натрію [9]. чинників -амілового ефіру оцтової кислоти, Проте, на відміну від запропонованого нами, концентрованої льодяної оцтової кислоти, пропацей спосіб має такі недоліки: нолу, води та етиленгліколю в наступному об'єм1. Потрібно протягом доби аналізувати відіному співвідношенні 21:10:5:5:3, фарбування хробрану біологічну рідину, що різко обмежує кількість матограм здійснюють модифікованим відібраних проб для аналізу. діазореактивом з додаванням 1% мурашиного 2. В екскрагуючій суміші використовують етаальдегіду та наступним проявленням окремих нол, який повільно упарюється, що затрудняє анафракцій похідних білірубіну і білівердину при 45°С, ліз проб біорідин з низьким рівнем пігментів, а таспектрофотометричну оцінку окремих жовчних кож є недостатньо ефективним депротеїнізуючим пігментів проводять прямою денситометрією без чинником. елюції проб з хроматограм та порівнюють отрима3. Для послаблення зв'язків пігментів з ліпопні фракції чи проби із заданими кількостями станротеїдним комплексом біологічних рідин застосодарту білірубіну. вують сульфат амонію в слідових кількостях, який Суттєвими ознаками даної корисної моделі є негативно впливає на якість розподілу похідних те, що при підготовці проб замість сульфату амобілірубіну як в тонких шарах сілікагелю, так і на нію використовують карбамід, який ефективніше хроматографічному папері. послаблює зв'язки пігментів з ліпопротеїдними 4. В розчинниках для хроматографії викорискомплексами біорідин та не впливає на розділення товуються гепатотоксичні розчинники, зокрема, похідних білірубіну на хроматограмах. фенол. При екстракції загальних пігментів із підготов5. Застосовується попередня діазореакція, яка лених проб застосовують комбінований розчинник, призводить до появи значної кількості дериватів, в якому етанол замінено ацетоном з невеликою що ускладнює ідентифікацію вихідних форм похідчасткою бутанола, що підсилює депротеїнізуючі них білірубіну та білівердину. властивості розчинника з паралельним полегшен6. Необхідна для кількісної спектрофотометням випарювання основної частини розчинника та ричної оцінки елюція окремих похідних білірубіну з одночасним концентруванням окремих похідних 5 41602 6 білірубіну та білівердину в різних фазах залишків, рожево-червоний відтінок, а верхній бутаноловий які розділились при екстрагуванні. шар забарвлюється в зеленувато-синій колір, тобХроматографічний аналіз сконцентрованих піто маємо наглядний перерозподіл похідних біліругментів в різних шарах розчинника сприяє кращій біна між різними складовими комбінованого розідентифікації окремих похідних білірубіну та білічинника. вердину і відтворюється на доступних носіях, тобХроматографічне розділення екстрагованих піто хроматографічному папері FN-16 та на пластигментів проводять на пластинах «Silufol» і «Сорнах: Silufol і Сорбфіл. В якості розчинника філ», а також на хроматографічному папері FN-16 застосовується гомогенна система, яка включає фірми «Filtrak». Для кращого насичення хроматогаміловий ефір оцтової кислоти, концентровану рафічної камери бокові поверхні стінок обкладальодяну оцтову кислоту, пропанол, воду та етилеють фільтрувальним папером і наливають комбінгліколь в оптимальному співвідношенні по об'єму новану суміш розчинників для хроматографії, яка 21:10:5:5:3. В своїй основі ця система є безпечвключає: аміловий ефір оцтової кислоти, концентною, ніж ті, що включають фенол у вищезгаданому ровану оцтову кислоту, пропанол, воду та етиленметоді визначення пігментів. Включення мурашигліколь в наступному співвідношенні по об'єму ного альдегіду до традиційних барвників на пігме21:10:5:5:3. нти (сульфанілової кислоти, нітропрусіду натрію) На розмічений папір та пластини наносять по сприяє підвищенню чутливості та інтенсифікує і декілька разів в залежності від біорідини, яка анастабілізує забарвлення більшості похідних білірулізується (від 5 до 40мкл) екстракту, невеликими біну та білівердину на хроматограмах, що дозвоаліквотами по 5мкл окремо з верхнього та нижньоляє провадити пряму денситометричну оцінку безго шарів розділеного розчинника для екстракції. посередньо на хроматограмах. Процес Фронт розділяючого розчинника на хроматогпроявлення окремих фракцій похідних білірубіну і рамах різної природи рухається до верхньої межі з неоднаковими швидкостями і тому процес хромабілівердину є оптимальним при 45°С Окрім цього, тографічного розділення займає різні проміжки відпрацьовані умови для масового відбору проб та часу від 45-55 хвилин на пластинах до 115-145хв їх довготривале зберігання шляхом адсорбції дона вказаному папері. сліджуваних біорідин на обезболеному фільтруваПісля видалення у витяжній шафі розчинника з льному чи хроматографічному папері з паралельхроматограм, їх попередньо аналізують у видимій ним позбавленням води. Наш підхід до підготовки та ультрафіолетовій зоні світла при спеціальному проб біорідини для аналізу спектру похідних біліосвітленні, яке підсилює чи активує флюоресценрубіну та білівердину виключає застосування барцію основних груп в молекулах похідних білірубіну, вників до хроматографічного розподілу і спрямовикористовуючи ультра хромоскоп та лампу типу ваний на отримання природних складових з A-FC-301. досліджуваних біоматеріалів у вигляді окремих Фарбування хроматограм проводять за допоплям на хроматограмі. могою скляного лабораторного обприскувача, заТаким чином, сукупність суттєвих ознак запростосовуючи модифікований діазореактив, який понованої корисної моделі усуває недоліки відомоотримують після злиття першої (10мл) та другої го способу і забезпечує можливість відтворення частини (0,25мл) і збагачують добавкою мурашиметоду визначення окремих похідних білірубіну та ного альдегіду (1,0мл). білівердину в умовах більшості лабораторій, в Денситометричну кількісну оцінку окремих тому числі експедиційних, при цьому знімає обмефракцій похідних білірубіну і білівердину провоження в кількості відібраних проб при обстеженні дять, як в ультрафіолетовому діапазоні хвиль, так певних популяцій тварин чи великих груп людей, і у видимій зоні світла із залученням денситометзайнятих на шкідливих виробництвах, або які мешрів ДО-1М та «Саmас-2». кають в екологічно забруднених районах. Побудова калібрувальної кривої (Фіг.1) безпоСпосіб відтворюється таким чином: середньо по вільному білірубіну, як на Silufol, так і Варіант А на папері FM-16 з прямою денситометричною оціВідібрану традиційним способом біологічну рінкою виявляє діапазон прямопропорційної залеждину з організму людини чи тварини змішують чи ності між кількістю білірубіну та екстинцією і відповносять у стабілізуючий водний розчин, який місвідною площею піка в інтервалі від 5 до 25мкг при тить 5,0% карбаміду та 0,5% аскорбінової кислоти. максимальному поглинанні світла плямою (λ Останньої беруть від 0,05 до 0,2мл (чи 50-200мкл), в залежності від специфіки біорідини, яку відібра450нМ). ли для подальшого аналізу. При безпосередньому Остання закономірність відкриває можливість аналізі до отриманої суміші, яка складає дві часдля кількісної оцінки сумарних жовчних пігментів у тини додають бутанол рівний по об'єму цим двом жовчі та інших біорідинах за допомогою прямої частинам та семикратний об'єм ацетону, який в денситометрії. кінечному веде до співвідношення 2:2:7. Після Варіант В. старанного інтенсивного перемішування скляною У випадку масового відбору проб отриману паличкою центрифугують впродовж 10 хвилин при суміш біорідини із стабілізуючим розчином адсор3000об/хв на лабораторній центрифузі ОПН-8. бують на хроматографічному чи обезболеному В екстрагованих пробах після випаровування фільтрувальному папері за допомогою напівавтоацетону утворюються два чітко сформованих шаматичних піпеток аліквотами по 20-50мкл, починари рідини з різними відтінками, які найбільш контючи із середини наміченого простим олівцем кварастно відрізняються між собою при аналізі жовчі драту розміром 35×35мм. При нанесенні папір тварин та людини. Так, нижній водний шар має кладуть на сітчасту підставку, щоб прискорити 7 41602 8 випаровування рідини як з верхньої, так і з нижньої Завдячуючи таким методичним підходам чітко площини. Бажано, щоб цей сітчастий каркас стояв виявлена різниця у спектрах похідних білірубіну в у місці, де немає прямих сонячних променів, і на різних шарах чи фазах розчинника, який розділивпротязі повітряних мас чи з підключенням вентися після екстракції пігментів. лятора або під витяжною шафою, що значно скоНа Фіг.2 представлена денситограма - з двома рочує час випаровування води. В залежності від основними фракціями похідних білірубіну (Rf - 0,83 вмісту пігментів в досліджуваній біологічній рідині, і Rf - 0,97) отримані з верхньої бутанолової фази в плямі концентрують 40-500мкл матеріалу. Відіекстракту із жовчі собак, які дали позитивну реакбрані для аналізу проби зручно зберігати у водоцію на барвники (сульфанілова кислота, нітропрунепроникних поліетиленових планшетах в моросід натрію,парадіметиламінобензальдегід) активно зильному відділенні побутового холодильника і взаємодіючих з пірольною складовою метаболітів поступово відбирати для аналізу в лабораторних пігментного обміну. умовах. Згідно Walter R. Eberlein (10) до бутанолу має Досліджувану пробу у вигляді плями на папері більшу спорідненість моноглюкуронід білірубіну, подрібнюють ножицями на невеликі шматочки що знаходить підтвердження і в кольоровій реакції на глюкуронову складову в даній сполуці, тоді як (2×3мм2) і зсипають у пробірку з притертою пробменша фракція не дає такої чіткої реакції і на закою. Екстракцію загальних пігментів проводять стосування параамінодиетиланілінсульфату та однофазною системою комбінації наступних розкарбазолу. Не виключено, що ця фракція являє чинників у співвідношенні: вода-бутанол-ацетон собою ефір глюкози із білірубіном також має певну 2:2:7. Кількість суміші розчинників екстрагентів спорідненість до верхнього бутанольного шару. беруть у співвідношенні до об'єму проби 20:1. Так, У водній фазі екстракту при хроматографії як наприклад, на 0,1мл (100мкл) взятої біорідини пона пластинах, так і на папері, виявляється значно трібно взяти 2мл (2000мкл) суміші розчинників. більша кількість фракцій похідних білірубіну (Фіг.3), Для більш повної екстракції загальних пігментів ця окрім очікуваного диглюкуроніду білірубіну (Rf суміш додається до проби частинами. Так в наве0,37 і R f- 0,38). Кількість останнього є домінуючою деному варіанті спочатку в пробірку до подрібнепри оцінці, як по пірольній, так і по глюкуроновій ної проби додають 1мл суміші розчинника і на 45 складовій даної молекули. хвилин ставлять в коливальний апарат. Потім злиЗгідно з даними літератури попередніх років вають в конусоподібну пробірку, а до проби ще [5, 10] були припущення про наявність у жовчі судва рази додають по 0,5мл суміші з 5-хвилинним льфокон'югатів білірубіну, котрі також мають більінтервалом перебування в коливальному апараті. шу спорідненість до водної фази. В останні роки У випадку безпосередньої екстракції із біорідини окремі автори [2, 3] вказують на можливість кон'юдо проби додають весь об'єм суміші розчинника і гації вільного та моноглюкуроніду білірубіну в пенадосадову рідину також зливають в конусоподібчінці тварин та людини із глюкозою з утворенням ну центрифужну пробірку. відповідних похідних. Однак у вище зазначених Після упарювання ацетону, як і в першому ваджерелах не приведено характеристик їх хроматоріанті прямої екстракції білірубіну та білівердину графічного розподілу і їх частки в загальній сумі так і в випадку екстракції цих метаболітів з адсорпігментів. бованих проб біорідин на папері утворюються таПри застосуванні нашого способа показано, кож два шари розчинника з різними відтінками і що в екстрактах жовчі інших тварин та людини у подальший аналіз іде по аналогічній схемі. Завдяводній фазі виявляється широкий спектр похідних чуючи даним методичним підходам вдалося чітко білірубіну та білівердину за допомогою як паперовиявити різницю у спектрах похідних білірубіну та вої так і тонкошарової хроматографії. Особливо білівердину в біорідинах різного походження. важливим є те, що у тварин, в яких відсутній ферАпробація запропонованих нами схем підготомент перетворюючий білівердин на білірубін, зоквки та екстракції різних проб жовчі щура, собак та рема, у птахів, в тому числі і курки (Фіг.4) та рослюдини в порівнянні зі схемою рекомендованою в линоїдних - кролика (Фіг.5), виявляється також прототипі показала явні переваги нашого способу ціла гама похідних білівердину, що вказує на можуже на цьому етапі проведення аналізу. Так, з ливу його кон'югацію не тільки з глюкуроновою таблиці видно, що заміна в екстрагуючій системі кислотою. розчинників етанолу (прототип) на суміш бутанолу Нанесений в якості свідка вільний білірубін, з ацетоном з додаванням карбаміду замість сульмайже, не рухається в застосованій нами системі фату амонію підвищила вихід загального білірубірозчинників для хроматографії і залишається не ну із проб жовчі тварин та людини на 20-21% далеко від лінії старту (Rf - 0,04). Поряд з ним ви(р