Спосіб визначення концентрації ловастатину в біологічній рідині

Спосіб визначення концентрації ловастатину в біологічній рідині, що полягає в екстрагуванні ловастатину в біологічній рідині в органічний розчинник методом рідинної хроматографії з використанням спектрофотометричного детектування, який відрізняється тим, що як екстрагент використовують ацетонітрил, який безпосередньо вводять до хроматографічної колонки Поставлене завдання досягається способом визначення концентрації ловастатину в біологічних рідинах, що передбачає екстрагування ловастатину в біологічній рідині в органічний розчинник, рідинну хроматографію з використанням спектрофотометричного детектування, в якому згідно з корисною моделлю як екстрагент використовують ацетонітрил, який безпосередньо вводять до хроматографічної колонки. Метод значно спрощуються завдяки заміні міжфазної екстракції у двофазних системах (рідина-рідина або у твердофазному патроні) на однофазну екстракцію у ацетонітрил Використання однофазної екстракції є набагато дешевшою процедурою у порівнянні з екстракцією на дорогих твердофазних патронах, що особливо відчутно при проведенні багатосерійних рутинних досліджень. Завдяки тому, що ацетонітрил є ефективним білокосаджуючим агентом, його застосування дозволяє уникнути цілої низки операцій - екстрагування, видалення розчинника, реелюювання. Виключення цієї низки операцій, у свою чергу, зводить втрати ловастатину під час пробопідготовки практично до нуля. При проведенні однофазної екстракції ацетонітрил додають до біологічної рідини, після чого суміш рідин ретельно перемішують Після перемішування білковий осад відокремлюють центрифугуванням. 10174 Одержаний розчин ловастатину вводять безпосередньо до хроматографічної колонки із зворотньофазною насадкою. Зниження концентрації ловастатину у рідині, яку вводять в колонку, у порівнянні з традиційними методами хроматографічної пробопідготовки не є критичним, чому сприяють достатня чутливість сучасних хроматографічних детекторів Натомість значно скорочується час виконання аналізу у порівнянні з традиційними хроматографічними методами. Склад елюенту у порівнянні з відомими методами змінювати практично не доводиться, тим більше, що він практично співпадає із складом рідини, що вводиться після етапу однофазної' екстракції до хроматографічної колонки. Так само залишається незмінною довжина хвилі світла, при якій проводять детектування. Спосіб здійснюється таким чином. До 0,2мл сироватки крові додають 0,02мл 1н розчину соляної кислоти та 0,6мл ацетонітрилу. Пробу енергійно струшують протягом однієї хвилини. Після цього пробу центрифугують при 1000 об/хв протягом 15 хвилин. Верхній рідкий шар відбирають і фільтрують на мембранному фторопластовому фільтрі МФФКГ-3 (НПФ "БІохром") з розміром пор 0,45мкм Кількісне визначення ловастатину проводятьна високоефективному рідинному хроматографі НР-1100 "Леонардо" на колонці розмірами 125x14,0мм заповненій твердою фазою Hypersil. BflS-C18 з розміром гранул 5мкм. Для захисту колонки використовують передколонку розмірами 12,5х4мм, яку наповнюють такою ж насадкою В колонку вводять 20мкл відфільтрованого екстракту. Застосовують ізократичне елюювання зі складом мобільної фази (за об'ємом) - 40% 0,04М фосфатного буферу рН=4,0 та 60% ацетон нітрилу. Швидкість елюювання - 1 мл/хв., температура ко Комп'ютерна верстка Н Лисенко лонки 20°С Детектування ловастатину проводять при довжині хвилі 237нм. За цих умов час виходу ловастатину а колонки складав 6,57хв. При зміні концентрації ловастативу у рідині, що вводиться до колонки, від 0,03 до 3,0мкг/мл зберігається пропорційна залежність між площею хроматографічного піку та кількістю препарату в пробі. Концентрація препарату визначається методом зовнішнього стандарту Як стандарт використовуються зразки сироватки крові, до яких додається певна кількість препарату. Стандартні зразки піддаються такій самій обробці, як і зразки, що підлягали визначене вмісту ловастатину Оскільки певна частина ловастатина могла переходити до осаду, який утворюється в сироватці після додавання ацетвнітрилу, додатково визначають рівень втрат ловастатину в процесі пробопідготовки Для цього рівні кількості розчину ловастатину додають до певних об'ємів сироватки та води. Частину водних розчинів піддають повному циклу пробопід готовки (як і розчини ловастатину в сироватці), а частину водних розчинів вводять до колонки безпосередньо (лише після фільтрування з метою запобігти пошкодженню колонки). Було продемонстровано, що втрати ловастатину в процесі пробопідвотовки не перевищили 1-2%. Нами були досліджені також метрологічні параметри визначення ловастатину. Виявилось, що запропонований метод відрізняється точністю, достатньою відтворюваністю та високою чутливістю. Так, при визначенні повастатину, доданого до сироватки у концентраціях від 0,20 до 2,00мгг/мл (в серіях по 5 паралельних проб), величина відносної похибки середнього результату не перевищувала 4,2% для довірчого інтервалу Р=0,95. Нижня межа визначення ловастатину складала 25нг/мл (відношення "сигнал/шум">10). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальне» власності, аул. Урицькогс, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ-42, 01601