Спосіб визначення концентрації тіолів в біологічній рідині

Спосіб визначення концентрації ТІОЛІВ В біологічній рідині, який полягає у тому, що окислені тіоли в біологічній рідині відновлюють трибутилфо Винахід відноситься аналітичних методів в біохімії, а саме до методів визначення ТІОЛІВ (цистеїну, гомоцистешу, глутатюну тощо) методом високоефективної рідинної хроматографії Існує значна КІЛЬКІСТЬ методів визначення концентрації ТІОЛІВ в крові, вагома частка серед яких належить до методів високоефективної рідинної хроматографії Речовини типа цистеша, гомоцистеїна слабо поглинають в середньому та ближньому ультрафіолеті, що ускладнює їх безпосереднє оптичне визначення й спонукає проводити деріватизацію - прививания флуоресцентної мітки або функциональної групи, яка має оптичну активность Також існує група методів, заснованих на електрохімічній детекцм Оскільки електрохімічні детектори є досить складними приладами, які у використанні є значно складнішими порівняно з УФ- або флуоресцентним детекторами Стабільність і точність аналізів залежать від ретельності пробопідготовки, націленої на запобігання забруднення проточної камери та псування Au-Hg-електрода, що взагалі є великою вадою електрохімічних детекторів (Methodological aspects of total plasma homocysteine measurement [technical note] /1 Fermo, E De Vecchi, С Arcelloni et al // Haematologica - 1997 - № 82 - P 246 250) Взагалі роботи з їх використанням присвячені усуненню тих чи інших суто технічних проблем можна дійти висновку, що на цей час внаслідок технічної недосконалості електрохімічні детектори не можуть за своєю поширеністю укласти конкуре сфіном, осаджують білки ацетонітрилом, переводять тіоли в оптично активну сполуку і визначають їх методом високоефективної рідинної хроматографії з використанням спектрофотометричного детектування, який відрізняється тим, що з метою підвищення СТІЙКОСТІ утворюваного оптично активного комплексу залишки трибутилфосфіну та ацетонітрилу видаляють із розчину екстрагуванням хлороформом, а оптично активний комплекс ТІОЛІВ утворюють додаванням до проби розчину розчинної солі парахлормеркуробензойної кислоти нцію УФ або флуоресцентним детекторам Флуоресцентний детектор дозволяє проводити визначення з високою чутливістю, але існуючі ціни на поширені флуоресцентні модифікатори SBD-F (7-benzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfomc acid), ABD-F (7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonamide), NDB (N-[4-(6-dimethylammo-2benzofuranyl)phenyl]maleimide), DBD-F (4-(N,NDimethylaminosulphonyl)-7-fluoro-2,1,3benzoxadiazole)) монобромбіман або йодацетамидофлуоресцеїн складають сотні доларів США за ЮОмг, тобто витрати лише на модифікатор на кожен аналіз доходять до декількох доларів (каталог SIGMA, 1999) Да і вартість флуоресцентного детектора перевищує вартість УФ-детектора Крім того, всі флуоресцентні ПОХІДНІ ТІОЛІВ є нестійкими сполуками, що розкладаються за час від декількох хвилин до декількох годин навіть в темряві (Assay of plasma homocysteine light sensitivity of the fluorescent 7-benzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulfomc acid derivative, and use of appropriate calibrators / N P Dudman, X W Guo, R Crooks et all I Clm Chem 1996 -Dec,42(12) -P 2028-2032) В останні роки чутливість УФ-детекторів досягла такого рівня, що за їх допомогою стало можливим визначати концентрації біогенних ТІОЛІВ З достатнім ступенем чутливості Причому методи, що базуються на після колонковій дериватизацм, потребують відносно сложного апаратурного оформлення, тому вони малопридатні для серійних визначень Реагенти, що застосовуються у цих ю (О 47645 ти реакцію модифікування у проточному варіанті, методах, мають відповідати низці суворих вимог, в безпосередньо в хроматографі т ч мати високу спорідненість до ТІОЛІВ та надзвиВ основу винаходу поставлено задачу підвичайно малий час реакції Все це робить метод дощити СТІЙКІСТЬ оптично активної сполуки, що утворогим Тому більше поширення набули методи з рюється із ТІОЛІВ без зниження чутливості та без перед колонковою дериватизацією В роботі підвищення вартості визначення порівняно з про(Automated high-performance liquid chromatographic тотипом Це дасть можливість спростити процес method for the determination of homocysteme in визначення ТІОЛІВ за рахунок застосування простіplasma samples / С Carducci, M Birarelh, M Nola, шого обладнання I J Antonozzi//Chromatogr A -1999 - Jun, 846 1 - 2 - P 93 - 100) як хромофор використано оТаке підвищення СТІЙКОСТІ стає можливим внафталевий діальдепд Чутливість методу становислідок заміни хромофора - замість о-фталевого ла 1 пмоль в колонці, а в перерахунку на концентдіальдепду застосовується п-хлормеркурібензоат рацію у плазмі - 0,5 мкмоль/л натрію Оптично активні сполуки, що утворюються при реакції між п-хлормеркурібензоатом натрію та Описана (Urinary excretion measurement of тіолами, не розкладаються протягом декількох cysteme and homocysteme in the form of their Sднів При цьому необхідно перед додаванням до pyridimum derivatives by high-performance liquid проби розчину хромофору видалити залишки відchromatography with ultraviolet detection / E новника та білокосаджуючого реагента Це є можKamowska, G Chwatko, R Glowacki et al // J ливим за умови використання у якості відновника і Chromatogr A - 1998 - Mar 6, 798 (1 - 2) - P 27 у якості білокосаджуючого реагента таких речовин, 35) деріватизація цистеїну та гомоцистешу сечи 2які можуть бути проекстраговані у органічний розхлор-1-метилпірідшія йодидом чинник Оптично активні сполуки, що утворюються із наведеними вище речовинами, є нестійкими Це Ця задача вирішується використанням трибувисуває додаткові вимоги до проведення аналізу тилфосфшу як відновника та ацетонітрилу як білосуворе дотримання тотожності часових інтервалів косаджуючої речовини Обидві ці рідини у подапри визначенні кожної проби в серії, а також контльшому повністю видаляються екстракцією рольних проб Це не завжди зручно - будь-яка захлороформом, причому за умов екстрагування тримка в проведенні аналіза стає загрозою щодо тіоли (цистеїн, гомоцистеш, глутатюн) практично точності визначення подальших проб Перерив в не переходять до хлороформу електропостачанні на декілька годин під час виміКрім того, обробка хлороформом дозволяє рювань взагалі псує достовірність всього циклу видалити з розчину додаткову КІЛЬКІСТЬ білку, здадосліджень тного негативно впливати на хроматографічну колонку З іншого боку відомо використання для визначення ТІОЛІВ специфічного та чутливого реактиву До 1,0мл біологічної рідини додають 0,1 мл на сульфгідрильні групи пара10% трибутілфосфшу в N.N-діметилформаміді, хлормеркурібензоату натрію [Кочетов Г А Пракретельно перемішують та залишають на 60 хвитическое руководство по энзимологии - 2-е изд , лин Після ЦЬОГО ДО суміші додають 3,0мл ацетоніМ Высш школа, 1980 -272 с ] Оптично активна трилу Суміш ретельно перемішується стряхувансполука, що утворюється за його участю, є стабіням протягом ЗО - 60 секунд Суміш льною протягом декількох діб Але використовуцентрифугують при 1000 - 1500 об/хв протягом 10ють цей реактив лише для визначення вільних 20 хвилин Рідина зливається у чисту пробірку, ТІОЛІВ, тому що в присутності залишків ВІДНОВНИКІВ куди до неї додається Юмл хлороформу Після оптично активна сполука не утворюється ретельного стряхування протягом ЗО - 60 секунд суміш центрифугують при 1500 об/хв протягом 15 Також не використовується цей реактив в ЗО хвилин хроматографії, тому що реактиви, які застосовуються для видалення білків з реакційного середоПісля ЦЬОГО ВМІСТ пробірки розділяється на З вища перед додаванням парашари хлормеркурібензоату натрію (а саме - трихлороцнижній - суміш хлороформа з ацетонітрилом това кислота, ацетонітрил, сульфосаліцилова киста залишками трибутілфосфшу, лота, солі важких металів тощо) перешкоджають середній - штерфаза, утворена залишковою реакції утворення хромофору КІЛЬКІСТЮ білків, Найбільш близьким за сукупністю ознак до виверхній - водний, об'єм якого не перевищує находу є метод визначення ТІОЛІВ у біологічних 0,9мл рідинах з використанням о-фталевого діальдепду У водному шарі практично відсутні білкові мо(Automated high-performance liquid chromatographic лекули, але концентрація гідрофільних речовин, у method for the determination of homocysteme in тому числі і ТІОЛІВ, які не екстрагуються у хлороplasma samples / С Carducci, M Birarelh, M Nola, форм, практично не відрізняється від їх початкової I Antonozzi//J Chromatogr A -1999 - Jun, 846 1 концентрації у біологічній рідині - 2 - P 93 - 100) Як відновник використовується До аліквоти водного шару додають 1мл 0,3 М трибутилфосфін Але цей метод має той недолік, ацетатного буферу (рН = 4,60), та, після переміщо оптично активні сполуки, які утворюються внашування, 0,2мл водного розчину параслідок реакції між тіолами та о-фталевим діальдехлормеркурібензоату натрію (2мг/мл) Розчин пепдом, є нестійкими та розкладаються протягом ремішується та витримується протягом не менше хвилин або десятків хвилин Тому такий метод є 15 хвилин В подальшому хроматограма розчину придатним за умов застосування досить складного не змінюється протягом кількох діб Перед хромаапаратурного оформлення, що дозволяє проводитографічним визначенням розчин фільтрується 5 47645 6 через ультрафільтр (пори 0,4мкм) або центрифумоцистешу, глутатюну складав ВІДПОВІДНО 4,9, 6,1, гується (6000об/хв, 60 хвилин) 8,7 хвилини 0,02мл розчину вводиться до колонки (Hypersil Площа ПІКІВ виявилася пропорційною вмісту BDS C18, 125 х 4mm, 5мкм) Елюент - 0,02 М ацеречовин, що визначалися Відношення площі піку татний буфер (рН 4,6) ацетонітрил (945 55) до молярної концентрації речовин є величиною Елюювання ізократичне Швидкість протікання сталою та не залежить від виду речовини елюенту - 1мл/хв, детектування велося при довЧутливість методу склала Іпмоль в колонці, жині хвилі світла 250нм Час виходу цистеїну, гоабо 0,5мкмоль/л в біологічній рідині ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71