Вектор доставки генів, здатний індукувати апоптоз у клітині

Винахід стосується векторів доставки генів, що містять молекули нуклеїнових кислот, які кодують білки VP2, що індукують апоптоз, і/або апоптин (VP3) із подібною активністю. Винахід також стосується протипухлинної терапії та діагностики раку. Інфікування клітин різноманітних пухлин людини векторами доставки генів згідно з винаходом призведе, в результаті, до індукції апоптозу пухлинних клітин і до значно зменшеного апоптозу нормальних диплоїдних нетрансформованих/незлоякісних клітин, якщо не до повної його відсутності. Експресія білку апоптину (VP3), що походить від вірусу анемії курок (CAV), in vitro у трансформованих курячих клітинах індукує апоптоз (Noteborn et al., 1994, Noteborn and Koch, 1995). Апоптоз характеризується стисненням клітин, сегментацією ядра, конденсацією та розщепленням ДНК на фрагменти, що приблизно відповідають розміру домену, із наступною, у більшості клітин, міжнуклеосомною деградацією. Нарешті, апоптозні клітини розпадаються на замкнені в оболонку апоптозні тільця, які швидко фагоцитуються сусідніми клітинами. Отже, апоптоз значно менше, ніж некроз, руйнує тканини, тому що є нефізіологічним типом загибелі клітин (Wyllie et al., 1980, Arends and Wyilie, 1991, та White, 1996). Апоптин являє собою недовгий білок протяжністю тільки в 121 амінокислоту, що є скоріше основою, з великим вмістом проліну, серину і треоніну (Noteborn et al., 1991). У аналізованих трансформованих курячих клітинах, усі з яких зазнають індукований апоптином апоптоз, апоптин локалізується суворо в межах ядра клітини. Процессування С-кінцевої основної ділянки апоптину призводить до зниженої локалізації в ядрі та істотно зниженої апоптозної активності (Noteborn et al., 1994). Апоптин та інші білки з апоптиноподібною активністю також можуть індукувати апоптоз у лініях людських злоякісних і трансформованих клітин, але не в лініях нетрансформованих клітин людини. Автори встановили, що апоптоз, індукований апоптином, існує у відсутності функціонального р53 (Zhuang et al., 1995a) і не може блокуватися Bcl-2, BCR-ABL (Zhuang et al., 1995), що зв'язує Bcl-2 білком BAG-1 і білком вірусу коров'ячої віспи CrmA (Noteborn, 1996). In vitro апоптин не в змозі індукувати запрограмовану загибель клітин у нормальних лимфоїдних, дермальних, епідермальних, ендотеліальних клітинах та у клітинах гладеньких м'язів. Проте, коли нормальні клітини стають трансформованими, вони стають сприйнятливими до апоптозу за участю апоптину або інших білків з апоптиноподібною активністю. Тривала експресія апоптину в нормальних людських фібробластах показує, що апоптин не має токсичну активність або активність, що трансформується, у цих клітинах. У нормальних клітинах апоптин виявлений переважно в цитоплазмі, у той час як у трансформованих або злоякісних клітинах, тобто таких, що характеризуються гіперплазією, метаплазіею або дисплазіею, він локалізується в ядрі, що наводить на думку, що локалізація апоптину пов'язана з його активністю (Danen-Van Oorschot et al., 1997, Noteborn, 1996). Апоптоз є запрограмованим фізіологічним процесом для елімінації надлишкових або злоякісних клітин, а також тих, що змінилися (Earnshaw, 1995). Процес апоптозу може бути ініційований різноманітними регуляторними стимулами (Wyllie, 1995, та White, 1996). Зміни рівня виживаності клітин грають важливу роль у патогенезі людини, наприклад, при розвитку раку, викликаного посиленою проліферацією клітин, але також зниженою загибеллю клітин (Kerr et al., 1994). Показано, що різноманітні хіміотерапевтичні сполуки та опромінення індукують апоптоз у пухлинних клітинах у багатьох випадках через дикий тип р53 (Thompson, 1995, Bellamy et al., 1995, Steller, 1995). Проте, багато пухлин набувають мутації у р53 під час свого розвитку, яка часто корелює з поганою реакцією на протиракову терапію (Hooper, 1994). У випадку деяких (лейкозних) пухлин високий рівень експресії протоонкогену ВсІ-2 асоціюється із сильним опором різноманітним хіміотерапевтичнм сполукам, що індукують апоптоз (Hockenberry, 1994, Kerr et al., 1994, та Sachs and Lotem, 1993). Отже, апоптин може стати потенційним кандидатом на роль способу для руйнації пухлинних клітин або інших клітин, що характеризуються гіперплазією, метаплзією або дисплазією, які стали стійкими до (хіміо)терапевтичної індукції апоптозу через втрату функціонального р53 і підвищеної експресії ВсІ-2 та інших факторів, що порушують апоптоз. Той факт, що апоптин не індукує апоптоз у нормальних нетрансформованих людських клітинах, щонайменше in vitro, наводить на думку, що токсична дія обробки апоптином in vivo повинна бути дуже слабкою. Проте, дотепер експресія апоптину в пухлинних клітинах здійснюється шляхом використання тимчасової трансфекції клітин культур тканин. Недоліком такого способу експресії є дуже низький відсоток клітин, що можуть експресувати апоптин в умовах in vitro. Використовувані способи трансфекції in vivo будуть громіздкими і неефективними, якщо взагалі будуть можливі, і не внесуть ніякого вкладу в ефективне лікування раку. Можна одержати аденовірус з аденовірусів людини (Ads), що є безоболонковими двадцятигранними ДНКвірусами. Геном складається з лінійної дволанцюгової молекули ДНК приблизно в 36 кілооснов, що містить інвертовані кінцеві повтори (Horvitz, 1990). Серотипи, використані для розвитку вектору (Ad2 і Ad5), не асоціюються з важкою патологією людини (Horvitz, 1990). Вірус ефективний виключно при введенні його ДНК у клітину-хазяїна. Ads можуть інфікувати безліч клітин, які діляться та не діляться, широкого ряду видів, і вірус можна отримати у великій кількості з відносною легкістю. На противагу ретровірусам, Ads не інтегрують у геном клітини-хазяїна. Всі використовувані в даний час Ads мають делецію в області Е1, куди можна ввести нову ДНК. У результаті делеції Е1 рекомбінантний вірус стає дефектним за реплікацією (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991). З одного боку, це забезпечує істотне збільшення безпеки: rAdV не може реплікуватися у клітинах людини у відсутності білків Е1А. Таким чином, rAdV може доставити свою генетичну інформацію в клітину людини у відсутності літичної або продуктивної інфекції. З іншого боку, з'являється проблема одержання цих векторів. Проте, для функцій Е1 немає необхідності в кодуванні самим вектором. Вони можуть забезпечитися in trans спеціальними хелперними клітинами, що експресують гени Е1. Після інфікування або трансфекції цих хелперних клітин Ad-вектором із делецією Е1 клітинні білки Е1 будуть комплементу-вати реплікацію rAdV, що призведе до продукування нащадків rAdV. Ad-хелперні клітини повинні бути людського походження, і вони повинні мати та експресувати область AdEI, тобто, Ad-трансформовані людські клітини, такі як клітинна лінія 293 (Graham and Prevec, 1991), клітинна лінія 911 (Fallaux et al., 1996) і клітинна лінія PER.C6 (Fallaux, 1996). Даний винахід стосується вектору доставки генів, котрий забезпечує можливість використання особливостей протипухлиного засобу апоптину або інших білків з апоптиноподібною активністю для лікування раку за допомогою застосування генної терапії або для лікування злоякісних перероджень, що характеризуються гіперплазією, метаплазією або дисплазією. Такий вектор доставки генів, що є незалежним інфекційним вектором, може представляти, наприклад, вірус або ліпосому, або полімер, або щось подібне, що само по собі може інфікувати або будь-яким іншим способом доставляти генетичну інформацію, наприклад, до пухлинних клітин, які можна обробити. Генетична інформація включає молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує апоптиноподібну активність. Винахід також стосується вектору доставки генів, у котрого істотно зросла спроможність експресувати апоптиноподібну активність. Несподівано було виявлено, що зміна некодуючих нуклеотидних послідовностей у зворотному напрямку, розташованих у межах сайту ініціації трансляції, що передують послідовностям, які кодують апопти-ноподібний білок, істотно збільшує експресію зазначеного білку в пухлинних клітинах. Винахід також стосується вектору доставки генів, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує VP-2-подібну активність. Несподівано було показано, що VP-2-подібна активність діє синергетично з апоптиноподібною активністю по відношенню до індукції апоптозу в пухлинних клітинах, VP-2-подібний білок самостійно також може діяти синергетично або адитивно, наприклад, у випадку (хіміо)терапевтичної індукції апоптозу. Винахід також стосується вектору доставки генів, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує VP-2подібну активність, у доповнення до молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує апоптиноподібну активність. Згідно з винаходом, наприклад, вектор доставки генів є вірусом. Крім того, винахід стосується вектору доставки генів, який сам є дефектним за реплікацією вірусом, але який може реплікуватися у хелперних клітинах або клітинах, що упаковують, для отримання самого вектору доставки генів. Так, вектор доставки генів згідно з винаходом може являти собою, наприклад, аденовірус або ретровірус, або будь-які інші ДНК-ові або РНК-ові рекомбінантні віруси, які можна використовувати в якості вектору або плазмовірусу. Крім того, винахід стосується вектору доставки генів, який додатково забезпечений специфічним лігандом або молекулой-мішенню або молекулами-мішенями, за допомогою яких вектор доставки генів може специфічно направлятися для доставки своєї генетичної інформації до обраної клітини-мішені. Така молекула-мішень може являти собою, наприклад, вірусний спайковий білок або рецепторну молекулу або антитіло, реакційно спроможне по відношенню до поверхневого рецептору або білку пухлинної клітини. Винахід також стосується вектору доставки генів, який можна використовувати при діагностиці, наприклад, раку. Такий вектор доставки генів може використовуватися для діагностики in vitro, коли у людини або тварини беруться зразки тканин або клітин або біоптату. Такі зразки потім оцінюються або випробовуються шляхом їхнього інфікування, у культурі або безпосередньо, зазначеним вектором доставки генів, здатним до експресії, тобто з апоптиноподібною активністю. Тільки трансформовані клітини або клітини, що показують різноманітні стадії гіперплазії, дисплазії або метаплазії, або пухлинні або ракові клітини експресують білок з апоптиноподібною активністю в межах ядра. Присутність зазначеного білку можна продемонструвати класичними (імуно) гістохімічними методами, тобто, методами світлової мікроскопії або методами автоматизованого клітинного сортування. З іншого боку, зазначені вище інфіковані клітини характеризуються апоптозом, і, таким чином, їх можна виявити за відомими характеристиками апоптозу. Винахід також стосується або описує всі стадії, необхідні для побудови ре-комбінантного дефектного за реплікацією аденовірусу, який експресує фактор апоптин, що індукує апоптоз. Високі титри рекомбінантного аденовірусу, що містить апоптин, можна одержати за допомогою ліній аденовірусних пакувальних клітин, таких як 293, 911 та PER.C6. Негативного впливу апоптину на всіх необхідних стадіях реплікації аденовірусу та інших подій циклу життя аденовірусу в умовах вирощування клітин виявлено не було. Крім того, у винаході описується побудова контрольного рекомбінантного аденовірусу, що містить усі послідовності, як і у рекомбінантного аденовірусу, що містить апоптин, але внаслідок орієнтації 3'-5' послідовності, що кодує апоптин, під контролем регулюючих промоторних елементів, нездатного до експресії апоптину. За допомогою цього контрольного аденовірусного вектору можна досліджувати специфічну дію експресії апоптину рекомбінантним аденовірусом. Рекомбінантний дефектний за реплікацією аденовірус експресує апоптин у великих кількостях у різноманітних пухлинних і/або трансформованих клітинах, результатом чого є індукція апоптозу. На противагу цьому, експресія апоптину за допомогою рекомбінантного аденовірусу в нормальних нетрансформованих людських клітинах не призводить у результаті до індукції апоптозу, який індукується апоптином. Зокрема, винахід стосується протипухлинної терапії. Лікування пухлинної клітини (клітин) буде відбуватися шляхом експресії апоптину за допомогою інфікування (пухлинних) клітин такими векторами доставки генів, як аденовірусні вектори, що містять кодуючу послідовність для білку з апоптиноподібною активністю. Отже, винахід стосується таких векторів доставки генів, як аденовірус, який експресує апоптин, що є дуже потужним протипухлинним засобом. Аденовірусна регуляція апоптину не індукує апоптоз, або щонайменше помітно не індукує апоптоз, у нормальних клітинах, що показує, що токсичність обробки in vivo рекомбінантним аденовірусом, що містить апоптин, буде низькою. За допомогою інфікування рекомбінантним аденовірусом, що містить апоптин, значно більша кількість (пухлинних) клітин буде експресувати апоптин. Це відкриття є основним поліпшенням у відношенні експресії апоптину в порівнянні з трансфекціями ДНК. Винахід також стосується побудови елемента експресії VP2 без синтезу апоптину і/або частини апоптину. Крім того, автори довели, що експресія білку VP2 вірусу анемії курок (CAV) посилює апоптоз, який індукується апоптином у клітинах пухлин людини. Точніше, VP2 та апоптин діють синергетично по відношенню до індукції апоптозу пухлинних клітин. Це відкриття показує, що співексп-ресія VP2 та апоптину дасть, у результаті, поліпшення при лікуванні, заснованому на апоптині. У винаході описується істотне поліпшення експресії апоптину за допомогою зміни напрямку його прямих послідовностей у протилежному напрямку від ініціюючого кодону ATG. Поліпшення експресії не потребує зміни амінокислот в апоптині, як це і передбачає правило Козака. Поліпшення послідовностей перед ініціюючим ATG-кодоном інших білків CAV також призведе до удосконалення їхнього синтезу. Винахід також стосується побудови ретровірусних векторів, які експресують апоптин у клітинах пухлин людини, результатом чого є індукція апоптозу. Дані по рекомбінантному ретровірусу, що містить апоптин, у поєднанні з даними по рекомбінантному аденовірусу, що містить апоптин, показують, що експресія апоптину не є токсичним фактором для реплікації ДНК-ових та РНК-ових вірусів. Експресія апоптину в (пухлинних) клітинах також може відбуватися при інфікуванні клітин іншими ДНКовими і/або РНК-овими вірусними векторами, крім аденовірусних та ретровірусних векторів, яка містять послідовність, що кодує апоптин. Крім того, для індукції апоптозу, який індукується апоптином, пухлинних клітин можна використовувати отримані на основі вірусів такі векторні системи, як плазмовіруси. Винахід буде пояснюватися докладніше за допомогою описаної далі експериментальної частини. Це робиться тільки з метою пояснення і не повинно інтерпретуватися як обмеження обсягу рамок винаходу. Експериментальна частина Клітини й умови Їхнього культивування Трансформовані El Ad5 лінії клітин первинної нирки людини (НЕК; 293) і первинної сітчатки людини (HER; 911 та PER. C6) вирощують у модифікованому способом Дульбекко середовищі Ігла (DMEM) із додаванням 10% фетальної телячої сироватки (FCS) в атмосфері з 5% СО2 при 37°С. Клітинна лінія 293 отримана з Американської колекції типових культур (АТСС CRL 1573). Клітинні лінії 911 та PER.C6 отримані за Fallaux et al. (1996). Середовища для вирощування клітин, реагенти і сироватки отримані від GIBCO Laboratories (Гранд Исланд, Нью-Йорк). Культуральні планшети отримані від Greiner (Нюртинген, Німеччина). Епідермальні керацити людини витягають із крайньої плоті і вирощують у присутності шару мишачих фібробластів ЗТЗ, опромінених летальною дозою 137-Cs. Первинні культури кератиноцитів (FSK-1) ініціюють у повному середовищі, так, як описано раніше (Rheinwald and Green, 1975), із незначними змінами. Онкогенні кератиноцити SCC-15 (Rheinvald and Beckett, 1981), отримані від плоскоклітинної карциноми, культивують у змішаному середовищі DMEM і F12 (3:1), яке містить 5% фетальної телячої сироватки, 0,4мкг гідрокортизону та 1мкМ ізопротеренолу. Клітини HepG2, отримані від гепатоми людини (Aden et al., 1979), та U20S та Saos-2, отримані від остеосаркоми людини (Diller et al., 1990), вирощують у DMEM (GIBCO/BRL) із додаванням 10% фетальної телячої сироватки. Штам спонтанно трансформованих кератиноцитів НаСаТ (Boukamp et al., 1988) подарований д-ром R. Fusenig, DKFZ, Гейдельберг, Німеччина. Клітини НаСаТ вирощують у DMEM із додаванням 10% фетальної телячої сироватки. Муринові клітинні лінії вирощують у модифікованому способом Дульбекко середовищі Ігла з високим вмістом глюкози (4,5г на літр) та 10% фетальної телячої сироватки в атмосфері з 5% СО2 при 37°С. Лінія екоторопних пакувальних клітин Psi-2 (Mann et al., 1983) та лінія амфотропних пакувальних клітин РА317 описані раніше (Miller, 1990 a,b). Методи роботи з вірусами Аналізи бляшкоутворення виконуються так, як описано раніше (Fallaux et al., 1996). Коротше, штами аденовірусів серійно розводять у 2мл DMEM, що містить 2% конячої сироватки, і добавляють до майже злитих клітин 911 у 6-коміркових планшетах. Після інкубації протягом 2 годин при 37°С середовище заміняють мінімальним підтримуючим середовищем F-15 (MEM), що містить 0,85% агарози (Sigma, США), 20мМ HEPES (рН 7,4), 12,3мМ MgCI2, 0,0025% L-глутамину і 2% конячої сироватки (інактивованої теплом при 56°С протягом 30 хвилин). Одержання невеликих кількостей аденовірусу здійснюють так, як описано раніше (Fallaux et al., 1996). Коротко, моношари клітин 911, що майже злилися, або PER.C6 інфікують приблизно 5 бляшкоутворюючими одиницями, (буо) на клітину в PBS, що містить 1% конячої сироватки. Після інкубації протягом 1 години при кімнатній температурі інокулят заміняють свіжим середовищем (DMEM/2% конячої сироватки). Через 48 годин клітини, що майже цілком відшарувалися, збирають і поміщають у 1мл PBS, що містить 1% конячої сироватки. Вірус виділяють із клітин-продуцентів за допомогою 3 циклів швидкого заморожування й відтавання. Лізати очищають центрифугуванням при 3000об/хв протягом 10 хвилин і зберігають при -20°С. Штами rAdV, які продуковані 911 і PER.C6, скринують на присутність рекомбінат-компетентного аденовірусу за допомогою PCR з праймерами, отриманими для області ITR Ad5 (5_GGGTGGAGTTTGTGACGTG-3_) і області, що кодує Е1А (5_-TCGTGAAGGGTAGGTGGTTC-3_), як описано в Noteborn and De Boer (1995), із використанням апарата для PCR Perkin Elmer. Присутність ампліфікованого фрагменту у 600 п.о. вказує, що в аналізованому штамі вірусу є реплікаційно-компетентний (який містить область Е1) аденовірус (Hoebon, неопубліковані результати), або (це підтверджується) серією дослідів із інфікуванням клітин HepG2 rAdV. Протягом щонайменше 10 днів клітини перевіряють на можливе цитопатогенну дію і за допомогою методу непрямої імунофлуоресценції з використанням специфічної моноклональної антисироватки до білку Е1А. Плазміди та ДНК-трансфекції Адапторна плазміда pMad5 була сконструйована з pMLPIO (Levrerno et al., 1991) так, як описано нижче. Плазміду pMLP10-lin одержують із pMLP10 шляхом клонування синтетичного ДНК-фрагменту з унікальними сайтами для рестрикцій-них ендонуклеаз Mlul, Spll, SnaBI, Spl, Asull та Muni у сайт Hindlll pMLP10. Bglll фрагмент аденовірусу від nt 3328 до 8914 геному Ad5 вбудовують у сайт Muni pMLP-lin. 3 плазміди, що утвориться в результаті, видаляють Sall-BamHI фрагмент для інактивації гена, стійкого до тетрацикліну. Отримана в результаті плазміда була охарактеризована за допомогою рестрикційного аналізу та названа pMad5. Експресія генів, вмонтованих у сайт множинного клонування, буде контролюватися основним пізнім промотором аденовірусу, який у цій конфігурації пов'язаний із енхансером негайного-раннього гена 1 (ЕІ) аденовірусу. Всі ДНК-послідовності CAV спочатку одержують із плазміди plc-20H/CAV-EcoRI (Noteborn and Boer, 1990). Плазміда pCMV-fs, що експресує, яка раніше названа pCMV-VP3 (Noteborn et al., 1994), містить ДНКпослідовності CAV, що кодують виключно апоптин (nt 427-868). Плазміда pCMV-VP2mu (Noteborn, неопубліковані результати) містить ДНК-послідовності CAV від 380 до 1512. Цей фрагмент ДНК CAV містить кодуючу область для VP2, фланковану 5'-некодуючої області ділянкою в 25 п.о. та 3-некодуючої області ділянкою в 484 п.о. ДНК-послідовності CAV. На 106 п.о. у прямому напрямку від стартового кодону для VP2 в іншій рамці зчитування розташовується стартовий кодон для апоптину. Для запобігання синтезу апоптину без зміни синтезу VP2 вводять мутацію в ініціюючий кодон апоптину (ATG заміняється на ACG) і, крім того, точкову мутацію в положенні 549 (Т заміняється на А), у результаті чого з'являється додатковий стоп-кодон у межах гена, що кодує апоптин. Тому, клонування послідовності CAV призведе до експресії тільки пов-норозмірного білку VP2. За допомогою непрямої імунофлуоресценції було показано, що VP2 може продукуватися, але апоптин не синтезується. Для клонування ампліфікованих PCR ДНК-фрагментів автори використовували плазміду pCR-3.1, яку одержали від InVitrogen (Карлсбад, Каліфорнія). Для створення рекомбінантного дефектного за реплікацією ретровірусу, який містить апоптин, використовували ретровірусний вектор pLXSN (Miller, 1990 a,b). Всі стадії клонування з плазмідними ДНК здійснюють, у принципі, методами, наведеними в Maniatis et al. (1992). Всі використовувані ферменти отримані від Boehringer Mannheim, Німеччина, і/або в BioLabs, США. Плазмідну ДНК очищають шляхом центрифугування з градієнтом CsCI та колоночною хроматографією на Сефакрилі S500 (Pharmacia, Упсала, Швеція). Лінії клітин людини НаСАТ, HepG2, SCC-15, 293, 911 та PER.C6 трансфекують пла-змідною ДНК методом осадження з фосфатом кальцію, як описано в Graham and Van der Eb (1973). Нормальні людські диплоїдні кератиноцити (FSK-1; другий пасаж), клітини U20S і Saos-2 трансфекують DOTAP (Fisher et al., 1996). Аналіз методом непрямої імунофлуоресценції Клітини фіксували 80% ацетоном і використовували для імунофлуоресцентних аналізів із специфічними до CAV або специфічного до Е1А аденовірусу моноклональними антитілами і протимишачим і/або протикролячим ІgС кіз, який кон'югує з флуоресцеїном (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., Уэст-Гров, Пенсільванія), як описано в Noteborn et al. (1990). Ядерну ДНК забарвлювали 2,4-діаміно-2-феніліндолом (DAPI) або пропідійіодидом (РІ). Результати й обговорення Створення адапторного вектору pMab Для того, щоб ввести сайт рестриктази ВатНІ в адапторну плазміду pMAd5, її розщеплювали СІаІ та обробляли лужною фосфатазою кишечнику теляти. Лінкер Clal-BamHI обробляли Т4-кіназою та лігували зі своїм з використанням Т-4-ДНК-лігази із наступним розщепленням СІаІ. Лінкер СІаІ/ВатНІ/СІаІ виділяли та лігували з лінійним вектором pMAd5. Бактеріальний штам JM109 трансформували продуктами лігування. Отриманий вектор рМАb характеризували за допомогою розщеплення рестрикційними ферментами. За допомогою вектору рМАb чужорідні гени можна клонувати в унікальний сайт BamHI під контролем аденовірусного головного пізнього промотору. Схема уявлення pMad5 і pMab наведена на фігурі 1. Створення рекомбінантного. що містить апоптин. і контрольного адапторного вектору Для того, щоб створити адапторний вектор для введення гена апоптину в аденовірус, pMab обробляли ВаmНІ, а потім фосфатазою кишечнику теляти. Потім pCMV-fs обробляли ВаmНІ, і виділяли ДНК-фрагмент у 0,45 кілооснов, що містить кодуючий апоптин послідовності. Фрагмент ДНК апоптину лігували в сайт BamHI лінійного адапторного вектору pMab. Продукти лігування клонували вбактеріальний штам JM109. Орієнтацію апоптину в pMab визначали за допомогою рестрікційного аналізу. Конструкція pMab, що містить ген апоптину в орієнтації 5-3', під контролем аденовірусного головного пізнього промотору буде експресувати ген апоптину. Цей адапторний вектор позначили pMAb-VP3 і використали для генерації аденовірусного вектору, що експресує апоптин. Плазміда ДНК pMab, що містить кодуючі апоптин послідовності, в орієнтації 3'-5' у прямому напрямку від аденовірусного головного пізнього промотору, не забезпечує експресії апоптину, і була використана для створення контрольного рекомбінантного аденовірусного вектору. Схема цих адапторних векторів наведена на фігурі 2. Індукція апоптозу плазмідою CMV ν порівнянні з рекомбінантним адапторним вектором, що містить апоптин, що експресує апоптин Спочатку автори перевірили, чи насправді ДНК-вектор pMAb-VP3 здатний експресувати апоптин у трансфекційних клітинах, у той час як рМАи-соn не має цієї здатності. Для цього людські клітини 293 та 911, трансформовані аденовірусом, трансфекували pMAb-VP3, рМАb-соn та, у якості позитивного контролю, pCMVVP3. Приблизно через дві доби після трансфекції клітини фіксували і перевіряли на експресію апоптину методом непрямої імунофлуоресценції. Клітинні культури, трансфековані pCMV-VP3 та pMAb-VP3, містили приблизно 1% клітин, що реагують з апоптинспецифічними моноклональними антитілами, у той час як клітинні культури, трансфековані рМАb-соn, їх не містили. Ці результати підтверджують, що pMAb-VP3 експресує апоптин, а рМАb-соn, як і очікувалося, його не експресує. У іншому експерименті по трансфекції автори аналізували індукцію апоптозу в клітинах 911 після трансфекції pMAb-VP3 у порівнянні з pCMV-VP3. Через три дня після трансфекції клітини 911 збирали і визначали експресію апоптину методом непрямої імунофлуоресценції. Крім цього, клітини забарвлювали DAPI або РІ; ці барвники інтенсивно забарвлюють інтактну ДНК, а апоптозну ДНК забарвлюють слабко і/або нерівномірно (Telford, 1992). Приблизно 60% апоптин-позитивних клітин 911, трансфекованих pMAb-VP3, були апоптозними, у той час як з апоптин-позитивних клітин 911, трансфекованих pCMV-VP3, апоптоз зазнавали приблизно 40%. Ці результати показують, що експресія апоптину, регульована pMAb-VP3, призводить до такого ж, а іноді - і до більш високого, рівню індукції апоптозу, у порівнянні з експресією апоптину, регульованою pCMV-VP3. Результати наведені на фігурі 3. Більш того, апоптин здатний індукувати апоптоз людських клітин, трансформованих аденовірусом, при цьому Е1В не інгібує апоптоз, індукований апоптином. На противагу цьому, Е1В здатний блокувати апоптоз, індукований багатьма хіміотерапевтичними засобами. Ці результати показують, що апоптин є дуже сильним протипухлинним засобом. Створення рекомбінантного аденовірусу, що містить апоптин Рекомбінантні аденовірусні вектори, що містять апоптин, одержують за допомогою співтрансфекції у хелперну клітинну лінію 911 адапторних плазмід pAMb-V/Р3, які несуть кодуючі послідовності для апоптину, а також деякі аденовірусні послідовності, та плазміди ДНК JM17, що містить повну ДНК аденовірусу за винятком області Е1 та ЕЗ (McGrory et al., 1988). Співтрансфекцію проводили кальцій-фосфатним методом відповідно до Graham and Van der Eb (1973). ДНК рекомбінантного аденовірусу утвориться шляхом гомологічної рекомбінації між гомологічними вірусними послідовностями, які присутні в плазміді pAMb-VP3, та аденовірусній ДНК із ДНК JM17. Таким чином здійснювали співтрансфекцію клітин 911 із рМАb-соn та ДНК pJM17 для отримання контрольного рекомбінантного аденовірусу, який не може експресувати апоптин, і який був використаний в якості контролю у випадку апоптозних ефектів, індукованих апоптином. Через кілька годин після трансфекції моношари клітин 911 покривали верхнім агарозним шаром і інкубували при 37°С до появи чітко помітних бляшок, утворених рекомбінантним аденовірусом. Вірус збирали з бляшок у вигляді культури, що зберігається в PBS із конячою сироваткою, як описано в Fallaux et al., (1996). Потім частину біомаси рекомбінантного вірусу добавляли в 24-коміркові планшети, що містять свіжі клітини 911. Через декілька днів ці інфіковані клітини 911 лізували, і збирали рекомбінантні віруси. Потім досліджували експресію апоптину рекомбінантними аденовірусами (rAd-VP3), що містять апоптин, або відсутність такої експресії у випадку контрольних рекомбінантних аденовірусів (rAd-con). Частина біомаси рекомбінантних вірусів, отриманої з інфікованих 24-коміркових планшет, використовували для інфікування свіжих клітин 911, які вирощували у вигляді моношару на покривних скельцях. Наступного дня інфіковані клітини 911 фіксували ацетоном і аналізували за допомогою імунофлуоресценції з використанням апоптинспецифічних моноклональних антитіл 85.1. П'ять із 5 аналізованих клітинних культур, інфікованих гаданим rAd-VP3, містили клітини, що експресують апоптин. Жодна з культур клітин 911, інфікованих Ad-con, і неінфікованих клітин 911 не є апоптин-позитивною. Ці результати показують, що після співтрансфекції ліній аденовірусних пакувальних клітин, таких як клітини 911, необхідним адаптером і аденовірусною ДНК можна отримати життєздатний rAd-VP3, що експресує апоптин. Два штами, отриманих із бляшок rAd-VP3 або rAd-con, використовували для очищення rAd за допомогою здійснення трьох послідовних пасажів бляшок на клітинах 911 або, паралельно, у системі лімітуючих розведень на клітинах PER.C6, як описано в Fallaux (1996). На основі описаних вище способів, результатом яких є продукування rAd-VP3, що експресує апоптин під контролем аденовірусного головного пізнього промотору, автори також одержали аденовірусний вектор, що експресує апоптин під контролем цитомегаловірусного (CMV) промотору. Ці результати показують, що можна одержати різноманітні типи рекомбінантних аденовірусів, що контролюються одним із своїх власних або гетерологічних промоторних елементів. Одержання rAd-УР3 та rAd-con з використанням клітин PER.C6 Одержання в невеликому масштабі партій rAd-VP3 та rAd-con з використанням клітин PER.C6 здійснювали так, як описано раніше (Fallaux, 1996). Коротко процедура описана в експериментальному розділі. За допомогою аналізу бляшкоутворення визначаються титри, які складають приблизно 1011-12 на мл освітленого лізату як для rAd-VP3, так і для rAd-con. Отримані титри не нижче тих, котрі автори спостерігали для інших rAd. За допомогою PCR-аналізу та інфікування HepG2 rAd-VP3 та rAd-con досліджували, чи містили отримані препарати вірусів аденовірус, що комплементує реплікацію (див. також експериментальний розділ). Як партії rAd-VP3, так і партії rAd-con не містили RCA, що було підтверджено двома методами. Автори приходять до висновку, що експресія апоптину не впливає негативно на всі необхідні стадії циклу життя аденовірусу в умовах культивування клітин. Отже, генна терапія на основі аденовірусних векторів, що експресують апоптин, можлива. Внаслідок експресії антіапоптозних білків Ad5 E1 (White, 1996) апоптин оптимально індукує апоптоз після продукування рекомбінантного аденовірусу, що містить апоптин, у великих кількостях. Той факт, що аденовірусний вектор, що експресує апоптин, можна отримати в людських клітинах, трансформованих білками Е1 аденовірусу типу 5 (Ad5), таких як клітини 293, 911 та PERC6, показує, що білок Е1 дає можливість цьому ДНК-вірусу реплікуватися до високих титрів в присутності білку, що індукує апоптоз, апоптину. Ці результати виявляють, що можливо також сконструювати інші рекомбінантні ДНК-вірусні вектори, що експресують апоптин у клітинних лініях, трансформованих білком Е1 аденовірусу 5. Наприклад, можна виростити рекомбінантні парвовірусні вектори на основі парвовірусів Н-1 або MVM у клітинах 293Т, трансформованих білком Е1 Ad5 (Dinsart et al., 1996). Парвовіруси Н-1 або MVM специфічно індукують загибель клітин у трансформованих клітинах, але не в усіх (Lopez-Guerrero, 1997). Парвовірусні вектори, що експресують апоптин, будуть сильнішими при індукції пухлиноспецифічного апоптозу, ніж парвовірус як такий, через додаткову пухлиноспецифічну індукцію апоптозу апоптином (Dinsart et al.,1996, Danen-Van Oorschot, 1997). Схема отримання рекомбінантних вірусних векторів, що містять апоптин, на основі трансформованих білком Е1 Ad5 клітин також справедлива для таких видів РНК-вірусів, як ретровіруси. Індукція апоптозу в лініях людських трансформованих і/або злоякісних клітин Автори досліджували, чи призведе інфікування людських пухлинних клітин rAd-VP3 до апоптозу, індукованому апоптином. Для цього клітини гепатоми людини HepG2, остеосаркоми U20S, клітини SCC-15, отримані з плоскоклітинної карциноми, і клітини зі спонтанно трансформованої лінії кератиноцитів На-СаТ інфікували rAd-VP3. Через день після трансфекції клітини фіксували, і, за допомогою імунофлуоресценції та фарбування DAPI, клітини досліджували на синтез апоптину і виникнення апоптозу. Вже на другий день після інфікування майже всі проаналізовані апоптин-позитивні клітини пухлин людини були апоптозними. У неінфікованих культурах тільки невеликий відсоток клітин пухлин людини виявився апоптозним. Результати для клітин HepG2 і U20S наведені на фігурі 4. Ці результати демонструють, що апоптин, експресований rAd-VP3, може індукувати апоптоз у різноманітних онкогенних і/або трансформованих клітинних лініях ссавців. Експресія апоптину в нормальних клітинах, інфікованих rAd-УР3 Для того, щоб проаналізувати дію апоптину, експресованого rAd-VP3, у неінфікованих нормальних нетрансформованих клітинах, rAd-VP3 інфікували клітини FSK-1. Через чотири дні після трансфекції клітини аналізують за допомогою непрямої імунофлуоресценції з використанням моноклональних антитіл 85.1 і фарбування DAPI. Якнайбільше 8% апоптин-позитивних клітин виявляють забарвлення DAPI з відхиленням від норми, що вказує, що вони могли зазнати індукованого (апоптином) апоптозу. Проте, 7% клітин, що не були інфіковані, також мають картину аберантного фарбування ДНК DAPI. Результати наведені на фігурі 4. Дані про гепатотропний характер людського Ad5 після системної доставки також є важливими для дослідження дії апоптину в нормальних диплоїдних гепатоцитах. Для їх отримання виділені гепатоцити щура вирощували в середовищі Ε Вільямса (Gibco/Life Technologies, Гранд-Айсленд, Нью-Йорк, США) із додаванням інсуліну (2мЕ/мл) та дексаметазону (1нМ). Клітини вирощували на сенсибілізованих колагеном предметних скельцях (Micronic). Первинні гепатоцити щура інфікували вектором на основі аденовірусу Ad-VPS, що експресує апоптин, контрольним аденовірусом, що експресує LacZ, або псевдоінфікують. Через два дні клітини фіксували, і, за допомогою імунофлуоресценції та фарбування DAPI, перевіряли відсоток апоптозних клітин. Не спостерігали різницю у відсотку загиблих клітин між клітинами, інфікованими для експресії апоптину, lacZ, або псевдоінфікованими. Ці спостереження вказують, що гепатоцити (щура) не зазнають індукованого апоптином апоптозу, також і в тому випадку, коли апоптин синтезується аденовірусним вектором. Ці результати показують, що спрямована rAd-VP3 експресія апоптину не спричиняє апоптозу, індукованого апоптином в нормальних нетрансформованих людських клітинах, на відміну від трансформованих або онкогенних людських клітин. Збільшення синтезу апоптину Для того, щоб досліджувати дію прямих послідовностей перед ініціюючим ATG-кодоном апоптину, автори створили дві конструкції pCR-3.1-апоптин. pCR-VP3ori містить вихідні прямі послідовності в зворотному напрямку (5_-ТТТСАА-3_) від ATG-кодона, у той час як інша конструкція pCR-VP3mu містить пряму послідовність в зворотному напрямку 5_-GCCAAC-3_. За допомогою безклітинної системи (in vitro) транскрипції/трансляції з зародків пшениці було показано, що експресія апоптину pCR-VP3mu щонайменше в п'ять разів перевищує експресію, що спостерігається у випадку pCR-VP3ori. Ці дані показують, що характер послідовностей безпосередньо перед ATG-кодоном апоптину впливає на синтез апопти-ну. Створення (вірусних) векторів із прямою, в зворотному напрямку, послідовністю 5_-GCCAAC-3_ перед ATG-кодоном апоптину призведе до більш високого продукування апоптину і, побічно, до підвищеного апоптозу, який індукується апоптином. Важливо також згадати, що амінокислотна послідовність апоптину не змінюється так, як це необхідно для підвищеної ефективності трансляції відповідно до «правила Козак» (Caventer and Stuart, 1991). Відповідно до цього правила, автори повинні були б замінити нуклеотид у позиції +4 з А на G, в наслідок чого повинна була змінитися друга амінокислота апоптину, що можливо могла змінити його активність. Ідентифікація суттєвого фрагменту апоптину. що має апоптозну активність Для того, щоб досліджувати, чи є частина білку апоптину суттєвою для його апоптозної активності, була сконструйована плазміда, яка кодує химерні білки, що складаються з білку зеленої флуоресценції (GFP; Rizzuto, 1995) та N-кінцевих 71 амінокислот апоптину (N-апоптин) або його С-кінцевих 50 амінокислот (Сапоптин). Людські трансформовані клітини, такі як клітини Saos-2 (Zhuang, 1995), трансфекували плазмідами, що експресує химерний GFP/N-апоптин або GFP/C-апоптин. Апоптоз зазнають тільки клітини Saos-2, що експресують GFP/C-апоптин. Це збігається з тим фактом, що С-апоптин (пов'язаний із GFP), може входити в ядро. Ці результати показують, що для індукції апоптозу в (людських) онкогенних або трансформованих клітинах також може бути достатньо частини апоптину. Отже, можна також розробити ефективну (генну) терапію, засновану на (вірусних) векторах, що експресує лише частину апоптину. Крім того, ці дані демонструють, що частина апоптину містить його апоптозну активність, коли вона ковалентно пов'язана з чужорідним білком. Співекспресія VP2 та апоптину в клітинах пухлин людини синергетично збільшує індукцію апоптозу Для того, щоб досліджувати вплив співекспресії VP2 та апоптину на індукцію апоптозу, клітини Saos-2 (спів)трансфекують pCMV-fs, що експресує апоптин, і/або pCMV-VP2mu, що експресує VP2. Клітини фіксували ацетоном через різні проміжки часу після трансфекції. Методом непрямої імунофлуоресценції з моноклональними антитілами CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch, 1996) визначали \/Р2-позитивні клітини, а з моноклональними антитілами CVI-CAV-85.1 - апоптин-позитивні клітини. На 3 день після трансфекції зазнавали апоптоз тільки приблизно 3% VP2 клітин, що експресують і тільки приблизно 10% клітин, що експресу-ють апоптин. На противагу цьому, приблизно 40% клітин Saos-2, що експресують як VP2, так і апоптин, вже були апоптозними. Також через 4 дня після трансфекції відсоток \/Р2/апоптин-позитивних клітин, що зазнали апоптоз, істотно вище, чим для клітин, що експресують один апоптин або один VP2. Ці результати, що наведені на фігурі 5, показують, що VP2 посилює апоптоз, що індукується апоптином. Конструювання та отримання rAD-VP2 Для того, щоб сконструювати рекомбінантний аденовірус, що експресує вірусний білок 2 (VP2) вірусу анемії курок, була отримана адапторна плазміда pMAb-VP2. Фрагмент ВаmНІ у 1,1 кілооснов виділяли з плазміди pCMV-VP2mu, що містить усі кодуючі послідовності VP2, але з 2 точковими мутаціями в межах області, що кодує апоптин (див. експериментальний розділ), і лігували з адапторним вектором рМАb, розщепленим ВаmНІ та обробленим лужною фосфатазою кишечнику теляти. Отриману конструкцію pMAbVP2, показану на фігурі 6, характеризували за допомогою рестрикційного аналізу та аналізу послідовностей. rAD-VP2 створюють за допомогою співтрансфекції клітин 911 ДНК рМАb-VP2 та ДНК pJM17. Співтрансфекцію і всі інші потрібні стадії, необхідні для характеризації, очищення та отримання rAD-1 VP2, здійснювали так само, як було описано у випадку rAd-VP3 та rAd-con. За допомогою непрямої імунофлуоресценції з використанням моноклональних антитіл CVI-CAV-111.1 показали, що клітини 911 та PER.C6, інфіковані rAd-VP2, дійсно можуть експресувати білок VP2. Створення ретровірусного вектору, що експресує апоптин Для того, щоб одержати плазміду pL-VP3-SN (див. фігуру 7), фрагмент ВаmНІ, що несе кодуючі апоптин послідовності, вбудовували в унікальний сайт BamHI pLXSN. Правильну орієнтацію вставки підтверджували рестрикційним аналізом. Щоб перевірити цілісність вставки, клітини COS-7 і HepG2 трансфекували плазмідою pL-VP3-SN методом співосадження з фосфатом кальцію. Через чотири дня після трансфекції клітини фіксували та аналізували за допомогою моноклональних антитіл 85.1 на експресію білку апоптину. Експресія апоптину була виявлена приблизно в 12% клітин. Більшість клітин зазнали апоптоз, що визначали за допомогою фарбування DAPI. Ці дані продемонстрували, що провірусний LTR-промотор здатний контролювати експресію білку апоптину, що його ген залишається непошкодженим у ДНК-конструкції, і що в трансфекованих клітинах HepG2 і COS-7 експресія апоптину індукує апоптоз. Для того, щоб одержати віруси, плазміду pL-VP3-SN трансфекували в клітини Psi-2 і в клітини РА 317 методом співосадження з фосфатом кальцію. Супернатанти клітин збирали через сорок вісім годин після трансфекції, та їх розведення використовували для інфікування клітин HepG2 (супернатант РА 317) і клітин NIH3T3 (супернатант Psi-2) при 4мкг/мл полібрену. Через чотири дня після інфікування клітини фіксували та аналізували на експресію апоптину за допомогою моноклональних антитіл 85.1. Виявлено, що приблизно 1% клітин експресу-вали апоптин. Більшість апоптин-позитивних клітин HepG2 були апоптозними. Ці дані підтверджують, що клітини були трансдуковані ретровірусами, що містять L-апоптин-SN. Крім цього, отримані результати демонструють, що однієї копії про-вірусу достатньо для експресії достатньої кількості білку апоптину, що можна виявити імунофлуоресценцією, і цієї кількості достатньо для індукції апоптозу в клітинній лінії пухлини людини, як-от, клітинної лінії гепатоми HepG2. У сукупності ці дані показують, що ретровірусні вектори, що несуть ген апоптину, можна отримати та можна використовувати для індукції апоптозу в клітинах пухлин людини. Це формально доводить, що ні ген апоптину, ні його експресія не впливають на суттєві стадії циклу життя ретровірусу. Вони також показують, що ретровіруси, що містять апоптин, можна отримувати в кількостях, достатніх для трансдукції клітин пухлин людини в культурі тканини. Ці результати також означають, що експресія апоптину і, отже, апоптоз, що індукує апоптин (людських) пухлинних клітин також буде можливий за допомогою векторних систем, отриманих на основі таких (ретро)вірусів, як плазмовіруси (Noguiez-Hellin, 1996). Критичний момент для такої системи на основі рекомбінантного плазмовірусу, що містить апоптин, полягає в тому, що чи не блокується реплікація ретровірусу експресією апоптину. Автори отримали докази, що цього насправді не відбувається у випадку описаного вище рекомбінантного ретровірусу, що містить апоптин, що припускає успішне одержання рекомбінантного плазмовірусу, що містить апоптин. Діагностичний аналіз на ракові клітини на основі rАD-VР3 Клітинна локалізація апоптину в онкогенних або трансформованих клітинах інша в порівнянні з локалізацією в нормальних нетрансформованих клітинах. Крім того, іншим показником є специфічна здатність апоптину індукувати апоптоз в онкогенних або трансформованих клітинах і не індукувати апоптоз у нормальних клітинах. За допомогою інфікування клітин rAd-VP3 та аналізу локації апоптину і/або індукції апоптозу в цих клітинах можна перевірити чи є клітина злоякісною чи ні. Первинні клітини виділяють із (підозрілої) тканини і культивують у необхідному середовищі. Клітини інфікують rAd-VP3 і, паралельно, rAd-con, та потім аналізують. Наприклад, застосовують імунофлуоресцентний аналіз, заснований на моноклональних антитілах 85.1, специфічних для апоптину. Клітини контролюють на наявність апоптину в цитоплазмі (нормальні клітини) або в ядрі (трансформовані клітини). Крім того, або замість цього, можна оцінити відсоток апоптозних клітин. Якщо відсоток апоптозних клітин у випадку інфікованих rAd-VP3 клітин значно вище, ніж у випадку клітин, інфікованих rAd-con, це означає, що перші клітини стали злоякісними. Експерименти з токсичності рекомбінантного аденовірусу, що містить апоптин, на здорових щурах У умовах культивування тканини апоптин, експресований рекомбінантним аденовірусом rAd-VP3 у нормальних клітинах, наприклад, отриманих від людини або гризуна, не індукує апоптоз. У описаному нижче експерименті автори досліджували, чи не спричиняє експресія апоптину за допомогою рекомбінантного вірусного вектору rAd-VP3 у здорових щурів гострої токсичності. Обидва вектори - використовуваний вектор rAd-VP3 і контрольний вектор rAd - вирощували на клітинах PER.C6, і за допомогою PCR-аналізу підтверджували, що препарат вірусу не містить аденовірусу, що комплементує реплікацію (RCA). Вектори rAd очищали методом центрифугування в градієнті CsCI. Самцям щурів Wag/Rij (Harlan, Нідерланди) з масою тіла приблизно 200 грамів ін'єкціювали рекомбінантний аденовірус, що експресує апоптин (rAd-VP3; 2,5x109 бляшкоутворюючих одиниць, буо) і контрольний рекомбінантний аденовірус, що експресує генний продукт люциферазу (rAd-luc; 2,5x109). Обидва аденовірусних вектори ресуспендували в PBS, що містить 0,1% бичачого сироваткового альбуміну та 10% гліцерину (PBS+). Цей розчин без аденовірусного вектору також ін'єкціювали щурам, і він слугував у якості додаткового негативного контролю. rAd-VP3, rAd-luc або суспензії PBS+ вводили внутрішньовенно, інтраперитонально або підшкірно - двом щурам кожним способом. Макроскопічний патологічний аналіз щурів, оброблених rAd-УР3 Першим способом дослідження можливої токсичної дії експресованого rAd-VP3 апоптину є визначення загального стану здоров'я і, зокрема, маси тіла оброблених щурів, що проводять після ін'єкцій щодня. У продовження експерименту у всіх щурів спостерігався гарний стан здоров'я. Маса тіла в різноманітних групах істотно не відрізнялася. Через 1 тиждень усі щури, що перевіряються, включаючи ін'єкційованих rAd-VP3, додали у вазі, що вказує, що жодна тварина не страждала від гострої токсичності внаслідок однієї з обробок rAd-VP3. Для додаткового доказу відсутності гострої токсичності здійснювали такі визначення. За дві години до умертвіння всім щурам ін'єкціюють BrdU. Після умертвіння деякі тканини (печінка, нирки, кишки, серце, легеня, селезінка, гонади та пеніс) досліджували на патологію безпосередньо і/або збирали також для гістологічного аналізу (див. нижче). Макроскопічний аналіз показує, що ні в одного з оброблених rAd-VP3 щурів немає органів з значними патологічними змінами. Визначення ДНК Ad-VР3 у печінці Основною мішенню ін'єкційованого внутрішньовенно (рекомбінантного) аденовірусу (вектори) є печінка і, до деякої міри, селезінка. Отже, будь-яка токсична дія апоптину буде спостерігатися в печінці. Проводять ряд експериментів для дослідження присутності ДНК Ad-VP3, експресії апоптину Ad-VP3 і можливої цитопатологічної дії в печінці. Спочатку методом Саузерн-блоттингу автори досліджували, чи містить ДНК, виділена в день умертвіння, тобто, через 8 днів після ін'єкції, із печінки щурів, оброблених Ad-VP3, ДНК апоптину. У якості негативного контролю паралельно досліджували ДНК із печінки щурів, оброблених Ad-luc. Перед нанесенням виділеної ДНК на агарозний гель ДНК розщеплювали ВаmНІ, у результаті чого спостерігали фрагмент ДНК апоптину приблизно в 0,5 т.п.о.. Саузерн-блот гібридизували з міченим 32Р зондом ДНК апоптину. BamHI-фрагмент ДНК апоптину чітко видний на Саузерн-блоті у випадку ДНК, отриманої від тварин, оброблених Ad-VP3, і відсутній, як і очікувалося, на смугах, що містять ДНК, виділену з печінки щурів, оброблених контрольним rAd-luc. Для дослідження кількості копій Ad-VP3 у печінці різноманітні кількості ДНК апоптину наносили паралельно на Саузерн-блот і гібридизували з міченим зондом ДНК апоптину. Навіть через вісім днів після внутрішньовенного інфікування можна визначити 0,25 копій Ad-VP3 на клітину, що вказує на дуже істотну трансдукцію Ad-VP3 у печінці. Експресія апоптину і його токсична дія на клітини печінки За допомогою імунного забарвлення парафінових зрізів печінки, обробленої Ad-VP3, або контрольної печінки, із використанням моноклональних антитіл CVI-CAV-85.1 або CVI-CAV-111.3, автори показали, що приблизно 20-30% клітин печінки тварин, оброблених Ad-VP3, експресували апоптин. Зрізи печінки контрольних щурів були негативними по відношенню до апоптину. Для того, щоб досліджувати можливу цитотоксичну дію апоптину, експресо-ваного Ad-VP3, на клітини печінки, застосовували два різноманітних методи. У першому методі зрізи печінки всіх щурів, оброблених AdVP3, і зрізи від контрольних тварин обох типів забарвлювали гематоксиліном і еозином (НЕ). В усіх перевірених зрізах печінки не спостерігали морфологічних патологічних змін, що вказує, що експресія апоптину не є токсичною для клітин печінки щура. Можливу шкідливу дію можна було б виявити при міченні BrdU, що виявляє клітини, що знову розділилися. У випадку печінки, що містить Ad-VP3, кількість мічених Brd клітин приблизно таке ж (приблизно 2%), як у печінці контрольних, оброблених Ad-luc щурів. Отже, експресія апоптину, як така, не виявляє суттєвої токсичної дії in vivo. Апоптин не має токсичної дії на моделі in vivo Як макроскопічний, так і гістологічний аналіз в сукупності з біохімічними і імунологічними даними показують, що експресія апоптину не має (гострої) токсичної дії на моделі in vivo. Ці результати демонструють, що лікування, засноване на експресії апоптину за допомогою застосування вектору доставки генів або за допомогою інших способів, буде мати обмежену негативну побічну дію. Дослідження протипухлинної дії на моделі гепатоми людини Регульована Ad-VP3 експресія апоптину призводить до індукції апоптозу трансформованих людських клітин в умовах культивування тканин. Наприклад, регульована Ad-VP3 експресія апоптину має як результат індукцію апоптозу клітин HepG2, отриманих із гепатоми людини. Дотепер протипухлинна активність апоптину (наприклад, експресованого Ad-VP3) in vivo не досліджувалася. Тому автори визначали на моделі in vivo, чи буде результатом регульованої Ad-VP3 експресії апоптину протипухлинна активність. Для цього самцям голих мишей Balb/C/nu/nu ін'єкціювали підшкірно 1х106 людських клітин HepG2 на ін'єкцію. Клітини гепатоми людини ін'єкціювали кожній миші щонайменше в два або три місця. Через три тижня після ін'єкції розвиваються чіткі гепатомні пухлини, видимі під шкірою, що мають середній розмір щонайменше 5x5мм. У пухлини ін'єкціювали вектори rAd-VP3 і контрольний rAd-conl, суспендовані в PBS, що містить 5% сахарози і 0,1% бичачого сироваткового альбуміну. Вектор rAd-VP3, що експресує апоптин, і контрольний вектор rAd-conl, що містить ген апоптину в протилежній орієнтації 3-5' (зворотній або антисенсовій) стосовно промотору Ad MLP, вирощували на клітинах PER.C6. Методом PCR-аналізу підтверджували, що обидва препарати рекомбінантного аденовірусу вільні від RCA. rAd очищали з застосуванням центрифугування в градієнті CsCI. Ін'єкціювали 7x109 буо часток rAd у 40мкл суспензії на пухлину. Кожним типом rAd-вектору обробляли по 6 мишей із 2-3 пухлинами HepG2. У якості додаткового контролю, групі з 4 голих мишей, що мали пухлини HepG2, в пухлини ін'єкціювали PBS, що містить 5% сахарози і 0,1% бичачого сироваткового альбуміну (група PBS+-). Апоптин має протипухлинну дію на моделі in vivo Для того, щоб перевірити можливу протипухлинну дію експресованого Ad-VPS апоптину на пухлини від людських HepG2, вимірювали розмір підшкірних пухлин під час експерименту, що продовжується ще протягом 7 днів після ін'єкції rAd-VP3 і контрольних суспензій. Як група PBS+, так і група, оброблена контрольним rAdconl, показують поступове збільшення розміру пухлин. На противагу цьому, група, якій в пухлини ін'єкціювали rAd-VP3, показує зменшення розміру пухлин. На сьому добу після ін'єкції голих мишей умертвляли. Пухлини витягали і досліджували макроскопічно. Чітко видно, що гепатомні пухлини, оброблені контрольним вектором rAd-conl або PBS+, є сильно васкуляризованою тканиною пухлини HepG2 і стали більшими після обробки. Цілком інша картина спостерігалася в HepG2-nyxnnH, оброблених rAd-VP3. Маса пухлини, що залишилася, бліда на вид через зменшеної васкуляризації пухлини. Пухлини після обробки rAd-VP3 зменшувалися у розмірі. Пухлини також містили білі міхуровидні структури, що є показником загиблих клітин. Крім індукованої апоптином регресії пухлин, ніякої іншої негативної дії експресії апоптину на органи (перевірялися, зокрема, печінка і селезінка) зареєструвати не вдалося. Апоптин має протипухлинну активність у системі in vivo Отже, пухлини, оброблені rAd-VP3, показали зменшення розміру, у той час як при контрольних обробках цього не відбувається. Це означає, що експресія апоптину має протипухлинну дію на моделі in vivo. Той факт, що експресований Ad-VP3 апоптин може індукувати регресію пухлини у такий швидко зростаючій пухлині, як HepG2, доводить сильну протипухлинну дію апоптину. Той факт, що апоптин уповільнює ріст пухлин у голих мишей, показує, що сама експресія апоптину «вбиває» пухлинні клітини без додаткової імунної реакції. Описані дослідження токсичності та протипухлинної дії показують, що протипухлинна терапія, заснована на апоптині, безпечна і здійснена. Фіг.1 дає схематичне уявлення про суттєві області аденовірусних адапторних векторів pMAd5 та pMab. Фіг.2 дає схематичне уявлення про суттєві області рекомбінантних аденовірусних адапторних векторів pMab-VP3 та pMab-con. Фіг.3 показує активність апоптину, що індукує апоптоз, в клітинах 911, трансфекованих pMab-VP3 або pCMV-VP3. Для трансфекції клітин 911 використовували два незалежно клонованих та очищених препарати ДНК pMab-VP3 (pMab-VP3/ml і pMab-VP3/m2). Клітини фіксували через 3 дня після трансфекції та аналізували методом непрямої імунофлуоресценції з використанням апоптин-специфічних моноклональних антитіл CVICAV-85.1 (85.1; Noteborn efc al., 1991). Відсоток клітин, аномально забарвлених DAPI, наводиться як відносна міра апоп-тозу. Фіг.4 показує активність апоптину (названого VP3) при індукції апоптозу в людських онкогенних клітинах гепатоми HepG2, клітинах остеосаркоми U20S і нормальних нетрансформованих диплоїдних кератиноцитах FSK-1, інфікованих рекомбінантним дефектним за реплікацією аденовірусом Ad-VP3, що містить апоптин. Клітини аналізували методом непрямої імунофлуоресценції з використанням моноклональних антитіл 85.1 та забарвлювали DAPI. Клітини HepG2 та U20S фіксували наступного дня після трансфекції, а клітини FSK-1 збирали і фіксували через 4 дня після трансфекції. Відсоток апоптин-позитивних клітин, що аномально забарвлюються DAPI, наведена як міра апоптозу, який індукується апоптином (чорні прямокутники). За контроль береться відсоток неінфікованих клітин, аномально забарвлених DAPI (незаштриховані прямокутники). Фіг.5 показує активність апоптозу при індукції апоптином і/або VP2 у клітинах Saos-2, трансфекованих 2,5мкг ДНК pCMV-fs, що експресує апоптин (раніше названої pCMV-VP3; апоптин називається VP3) і 2,5мкг ДНК pCMV-neoBam (Danen-Van Oorschot, 1997); або 2,5мкг ДНК pCMV-Vp2, що експресує білок CAV 2 (VP2), і 2,5мкг ДНК pCMV-neoBam; або 2,5мкг pCMV-fs і 2,5мкг pCMV-Vp2, результатом чого є експресія як апоптину (VP3), так і VP2. Клітини фіксували через 3, 4 та 5 днів після трансфекції та аналізували методом непрямої імунофлуоресценції з використанням апоптин-специфічних моноклональних антитіл CVI-CAV-85.1 (85.1; Noteborn et al., 1991) або моноклональних антитіл CVI-CAV-111.1 (Noteborn and Koch., 1996). Відсоток клітин, що аномально забарвлюються DAPI, дається в якості відносної міри апоптозу. Фіг.6 дає схематичне уявлення про суттєві області рекомбінантних аденовірусних адапторних векторів pMab-VP2. Фіг.7 дає схематичне уявлення про суттєві області рекомбінантного рет-ровірусного вектору переноснику PLS-VP3-N. Посилання 1. Aden, D.P., Fogel, Α., Plotkin, S., Damjanov, I., and Knowles, B.B. (1979). Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line. Nature 282, 615-616. 2. Arends, M. J., and Wyllie, A. H. 1991. .Apoptosis; mechanisms and roles in pathology. International review of experimental pathology 32, 223-254. 3. Bellamy, C.O.C., Malcomson, R. D. G., Harrison, D. J.. and Wyllie, A. H. 1995. Cell death and disease: The biology and regulation of apoptosis. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12. 4. Boukamp, P., Petrussevska, R.T., Breitkreutz, Hornung, J., Markham, Α., and Fusenig, R. 1988. Normal keratinazation in a spontaneously immortalized aneuplold human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology 106, 761-771. 5. Cavener, D.R. and Stuart, C.R. (1991). Eukaryotic start and stop translation sites. Nucleic Acids Research 19, 3185-3192. 6. Danen-Van Oorschot A.A.A.M., Fischer D., Grimbergen J.M., Klein В., Zhuang S. -M., Falkenburg J. H.., Backendorf С, Quax P. H. A., Van der Eb A. J., and Noteborn Μ. Η. Μ. (1997). Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells. Proceedings National Academy Sciences, USA: In press. 7. Oilier, L. et al., (1990). p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas. Molecular Cellular Biology 10, 5772-5781. 8. Dinsart, С, Cornelis, J., Rommelaere, J. (1996). Recombinant autonomous parvoviruses: New tools for the genetherapy of cancer? Chimica Oggi/chemistry today. September 1996, 32-38. 9. Earnshaw, W. С., 1995. Nuclear cha. iges in apoptosis. Current opinion in Cell Biology 1, 33"7-343. 10. Fallaux, F. (1996). Gene therapy for hemophilia A:Towards the use of adenoviral vectors? Ph Thesis, Leiden University, The Netherlands. 11. Fallaux F., Kranenburg, Cramer S. J., Houweling, A., Van Ormondt, Η., Hoeben, R. С., and Van der Eb, A. J. (1996) Human Gene Therapy 1, 215-222. 12. Fischer, D.F., Gibbs, S., Van De Putte, P., and Backendorf, C- (1996). Molecular Cellular Biology 16, 53655374. 13. Graham, F. L and Prevec, L. (1991). Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology, volume Г. Gene Transfer and Expression Protols. E. J. Murray, ed. (The Humana Press, Clifton, N.J.) pp 109-128. 14. Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467. 15. Hockenberry, D.M. (1994). Bcl-2 in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 51-55. 16. Hooper, M.L (1994). The role of the p53 and Rb-1 gene in cancer, development and apoptosis. Journal of Cell Science, Supplement 18, 13-17. 17. Horwitz, M.S. (1990). Adenoviridae and their replication, pp 1679-1740. In B.N. Fields and D.M. Knipe (Eds); Virology, Raven Press, Ltd, New York. 18. Kerr, J. F.R. , Winterford, C.M., and Harmon, B.V. (1994). Apoptosis; Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer 73, 2013-2026. 19. Levrero, M., Barban, V., Manteca, S., Baiiay, Α., Balsano. C, Avantaggiati, M.L, Natoli, G., Skeilekens, H-, Tiollais, P., and Perricaudet, M. (1991). Defective and non-defective adenovirus vectors for expressing foreign genes in vitro and in vivo. Gene 101, 195-202. 20. Lopez-Guerro, J-A., Rayet, В., Tuynder, M., Rommelaere, J., and Dinsart, С. (1997). Constitutive activation of U937 promonocytic cell cloncis selected for their resistance to parvovirus H-l infection. Blood 89, 16.12-1653. 21. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. CSHL Press, New York, USA. 22. Mann, R., Mulligan, R.C., and Baltimore, D. (1983). Cell 33, 153-159. 23. McGrory, W.J., Bautista, D.S., and Graham, F.L (1988). A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163, 614-617. 24. Miller, A.D. (1990a). Progress towards human gene therapy. Blood '76, 271-278. 25. Miller, A.D. (19900). Retrovirus packaging cells. Human Gene Therapy, 1, 5-14. 26. Noguiez-Hellin, P., Robert-LeMeur, M., Saizmann, J.L, and Klatzmann, D. (1996). Plasmoviruses: nonviral/viral vectors for gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4175-4180. 27. Noteborn, M.H.M. (1996), PCT application WO 96/41191 Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells as essential characteristic for the development of a anti-tumor therapy. 28. Noteborn, M.H.M. and De Boer, G.F. (1995). Patent USA/no. 030, 335. Noteborn, M.H.M. and Koch, G. (1996). PCT application WO 96/40931" Chicken anemia virus vaccines containing neutralizing conformational epitope. 29. Noteborn, M.H.M., De Boer, G.F., Kant, Α., Koch, G., Bos, J.L, Zantema, Α.. and Van der Eb, A.J. (1990). Expression of avian leukemia virus env~gp85 in Spodoptera frugiperda cells by use of a baculovirus expression vector. Journal'of general Virology 71, 2641-2648. 30. Not-eborn, M.H.M. , De Boer, G. F., Van Roozelaar, D., Karreroan, С., Kranenburg, 0., Vos, J., Jeurissen, 5., Zantema, A., iioeben, R., Koch/ G., Van Ormondt, H., and Van der Eb, A.J. (1991). Characterization of cloned chicken anemia virus DNA that cuntains all elemennts for the infectious replication cycle. Journal of Virology 65, 3131-3139. 31. Noteborn Μ.Η.Μ. and Koch G. (1995). Chicken anaemia virus infection: molecular basis of pathogenicity. Avian Pathology 24; 11-31. 32. Noteborn M.H.M., Koch G., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M., Veldkamp S., Van der Eb A.J. (1994). A single anaemia virus protein, apoptin, causes cytopathogenic effect by inducing apoptosis. In: Proceedings of the international symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia (Kaleta EF, ed) pp 376-381, Rauischholzhausen, Germany., 33. Noteborn M.H.M., Todd D., Verschueren C.A.J., De Gauw H.W.F.M., Curran W.L., Veldkamp S., Douglas A.J., McNulty M.S., Van der Eb A.J., Koch G. (1994). A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J. Virology 68:346-351. 34. Rheinwald, J. and Beckett, M.A. (1980). Defective terminal differentiation in cultures as a consistent and selectable character of malignant human keratinocytes-Cell 22, 629-632. 35. Rheinwald, J.G., and Green, H. (1975). Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6,331-343. 36. Rizzuto, R. (1995). Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organels in living ceils. Curr. Biol. 5, 635-642. 37. Sachs, L. 'and Lotem, J. (1993). Control of programmed cell death in normal and leukemia cells: New implications for therapy. Blood 82, 15-21. 38. Steller, H. (1995). Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267, 1445-1449. 39. Stratford-Perricaudet, L. and Perricaudet, M. (1991). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus, pp 51-61. In; 0. Cohen-Adenauer and M. Boiron (eds); Human Gene rransfer, John Libbey Eurotext. 40. Thompson, C.B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis. and treatment of disease. Science 267, 1456-1462. 41. White, E. (1996). Life, death, and the pursuit of apoptosis. Genes and development 10, 1-15. 42. Wyllie, A.H. (1995). The genetic regulation of apoptosis. Current opinion in Genetics and Development 5, 97104.