Застосування мутанта сс-хемокіну при лікуванні розсіяного склерозу

1. Застосування мутанта СС-хемокіну, який містить щонайменше дві мутації в катіонному сайті петлі 40-х положень амінокислот, як представлено на фігурі 1, і який в порівнянні з молекулою дикого типу має знижену GAG-зв'язуючу активність, для отримання фармацевтичної композиції для лікування розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих захворювань, в якому хемокін вибраний з RANTES, МIР-1-альфа, МIР-1-бета, МIР-3, МIР-4, НСС1, I309, I35612 і МСР-2. 2. Застосування за п.1, в якому мутант хемокіну представляє мутант RANTES. 3. Застосування за п.2, в якому мутант хемокіну представляє потрійний мутант RANTES, в якому три основні амінокислоти в катіонному сайті петлі 40-х положень амінокислот заміщені іншими амінокислотами. C2 2 (11) 1 3 77950 4 (IL-8), є хемотаксичними для нейрофілів, в той час ємодії GAG-RANTES вивчали на різних моделях. як СС-хемокіни активні відносно різних лейкоцитів, RANTES зв'язується з GAG на людських ендотелівключаючи моноцити, лімфоцити, еозинофіли, альних клітинах пупкової вени (HUVECs) в мікробазофіли, NK-клітини (природні кілери) і дендритні молярних концентраціях з афінністю і специфічнісклітини. тю вище, ніж інші хемокіни, такі, як МСР-1, IL-8 або NН2-кінцевий домен хемокінів бере участь в МІР-1 альфа. Мабуть, така взаємодія є не просто зв'язуванні з рецептором, і NH2-кінцевий процесінг електростатичною, але також залежить від інших може або активувати хемокіни, або перетворювати параметрів, таких, як довжина і N- і Охемокіни в повністю неактивні. сульфатування GAG [Kuschert G.S. et al., BiochemN-кінцеві варіанти синтетичних С-С-хемокінів istry, 1999 38(39): 12959-68]. Клітинні лінії з дефітестували на їх активність в якості інгібіторів або цитом GAG також можуть зв'язуватися з хемокінаантагоністів природних, форм. МСР-1, МСР-3 і ми, але присутність поверхневих GAG на клітині RANTES, що втратили 8-9 HN2-кінцевих амінокисзначно посилює їх активність по відношенню до лот, є неактивними на моноцитах і придатні як рецепторів, коли вони знаходяться в низьких конантагоністи рецепторів [Gong J.H. et al., J. Exp. центраціях [AH S. et al., J. Biol. Chem., 2000, 275 Med. 1995, 181 (2): 631-40 і Gong J.H. et al., J. Biol. (16): 11721-7]. В інших дослідах було показано, що Chem., 1996, 271 (18): 10521-7]. GAG, зокрема, гепаринсульфат, сприяють взаємоЗбільшення RANTES на один метіонін приводії RANTES з клітинною поверхнею макрофагів і дить до майже повної інактивації молекули, і Metподальшому придушенню ВІЛ-інфекції, результат, RANTES поводиться, як антагоніст у відношенні що кореспондується з добре відомою резистентніаутентичного RANTES [Proudfoot A.E. et al., J. Biol. стю цих клітин зі слабою експресією гепаринсульChem, 1996, Feb. 2; 271 (5): 2599-603]. фату, до противірусної дії RANTES [Ora vecz Т. et WO 99/16877 відноситься до усіченого з аміноal., J. Immunol., 1997, 159(9):4587-92]. кінця RANTES, у якого відсутні NH2-кінцеві аміноРозчинні GAG конкурують з клітинними мемкислоти, відповідні амінокислотним залишкам 1, 1бранними GAG і можуть діяти як специфічні інгібі2, 1-3 або 1-4 природного RANTES, і що володіє тори індукованої RANTES активації поверхні [Архемокін-антагоністичною активністю, а також до рау V. et al., Int. Immunol., 2000, 12(8): 1173-82[ або послідовностей ДНК, що кодують їх, їх застосуванв якості супресору ВІЛ-інфекції [Burns J.M. et al., ню для терапії і/або діагностики захворювань, при Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96 (25): 14499яких необхідна антагоністична активність для дії 504]. хемокінів. RANTES (3-68) являє собою переважУ деяких дослідах по вивченню залежності ний усічений антагоніст хемокінів. структури-функції була зроблена спроба ідентифіНезважаючи на те, що в цілому хемоатрактанкувати домен RANTES, відповідальний за взаємотна активність RANTES і СС-хемокінів вивчалася в дію з GAG, оскільки традиційна консенсусна посліосновному в зв'язку зі специфічними мембранними довність (ВВХВ, де В представляє основний рецепторами клітин, RANTES може також взаємозалишок, і X може бути будь-яким залишком) є діяти з глікозаміногліканами (GAG), що широко дуже загальною. Провели картирування епітопу з розрізнюються, розгалуженими групами цукрів, що використанням моноклонального антитіла, отридодаються до деяких білків після трансляції, які маного проти рекомбінантного людського звичайно називаються протеогліканами (PG). Такі RANTES, здатного блокувати як противірусну дію, білки знаходяться на клітинних мембранах, у позатак мобілізацію позаклітинного кальцію, що опосеклітинному матриксі і кровотоці, де можуть також редковуються RANTES [Burns J.M. et al., J. Exp. бути присутніми вільні GAG. Med., 1998, 188 (10): 1917-27]. Даний підхід дозвоВзаємодія з GAG є властивістю, притаманною лив визначити залишки 55-66, як необхідні як для багатьом розчинним молекулам, що передають вияву подібної активності, так і для взаємодії з сигнал клітині (інтерлейкінам, факторам росту). PG GAG, доводячи, що взаємодія з GAG може мати або вільні GAG можуть утворити комплекс з роздодаткову або відмінну функцію від такої, що опочинними молекулами, можливо з метою захистити середковується відповідними рецепторами, як дану молекулу від протеолізу у позаклітинному було також передбачено при дослідженні варіантів середовищі. Було висловлене також припущення, RANTES, що володіють зміненими агрегаційними що GAG можуть допомоги в правильній презентавластивостями [Аррау V. et al., J. Biol. Chem., 1999, ції молекул, що передають сигнал клітині, їх спе274 (39): 27505-12]. цифічному рецептору і, в певних випадках, також Область 55-66, яка представляє 3-кінцевий модулювати активацію клітин-мішеней. альфа-спіральний сегмент, є гомологічною до У випадку хемокінів, концентрування в постійGAG-зв'язуючого домену інши х хемокінів таких, як них градієнтах в місці запалення і, отже, взаємодія IL-8 [Witt D.P. and Lander A.D., Curr. Biol., 1994, 4 з рецепторами клітин і їх активація, ймовірно, мо(5): 394-400], і містить катіонний сайт, що містить дулюється різними формами GAG [Hoogewerf AJ. лізин і аргінін (KKWVR). Така зв'язуюча область et al., Biochemistry 1997, 36 (44):13570-8]. Отже, відрізняється від зв'язуючого сайту для клітинних було висловлене припущення, що модуляція таких рецепторів, що знаходиться в N-кінці [Pakianathan взаємодій може представляти терапевтичний підD.R. et al., Biochemistry, 1997, 36 (32): 9642-8] і хід при запальних захворюваннях [Schwarz М.К. включає деякі залишки, що беруть and Wells T.N., Curr. Opin. Chem. Biol., 1999 участь в агрегації мономерів RANTES, навіть 3(4):407-17] і ВІЛ-інфекції [Burns J.M. et al., Proc. незважаючи на те, що дезагрегуючі мутації, маNatl. Acad. Sci. USA, 1999, 96 (25): 14499-504]. буть, не впливають на взаємодію з GAG Структурні вимоги і функціональні ефекти вза[Czaplewski L.G. et al., J. Biol. Chem., 1999, 274 5 77950 6 (23): 16077-84; WO 98/13495]. ложеннях 44, 45 і 47 молекули дикого типу заміRANTES включає інший катіонний сайт щені іншими амінокислотами. Такі залишки можуть (RKNR) в положеннях залишків 44-47, який зберібути заміщені невеликими аліфатичними неполяргається в GAG-зв'язуючому сайті інших хемокінів, ними або злегка полярними залишками, такими, як таких, як МІР-Ια [Koopmann W. and Krangel M.S., J. Ala, Ser, Thr, Pro i Gl y. Аланін є переважним. Biol. Chem., 1997, 272(15): 10103-9] і MIP-lp [KoopБуло встановлено, що мутантами RANTES, mann W. et al., J. Immunol, 1999, 163 (4): 2120-7]. особливо ефективними при лікуванні MS, є такі, Варіанти людського RANTES, що містять одищо мають амінокислотні послідовності, представничні мутації в даних катіонних сайтах, розкриті як лені відповідно SEQ ID No: 2 і SEQ ID No: 3. антагоністи RANTES, що володіють потенційними Іншим об'єктом даного винаходу є застосувантерапевтичними застосуваннями при лікуванні ня мутантів хемокінів, визначених вище, для отриВІЛ-інфекції і запальних або алергічних захворюмання фармацевтичної композиції для лікування вань [WO 99/33989]. розсіяного склерозу і/або інших демієлінізуючих Було також розкрито, що тільки потрійний музахворювань. тант RANTES, в якому три залишки в положеннях Розсіяний склероз (MS) представляє повільно 44, 45 і 47 заміщені аланіном, втратив здатність прогресуюче захворювання ЦНС, що характеризузв'язуватися з GAG [A. Proudfoot et al., Chemokine ється розсіяними бляшками демієлінізації в голоCordon Conference, Session I, July 24th, 2000, первному мозку і спинному мозку, що приводить до сональне повідомлення]. множинних і різних неврологічних симптомів і У цей час встановлено, що СС-хемокіни, що ознак, звичайно з ремісіями і загостренням (димістять, щонайменше дві мутації в катіонному сайвись Merck Manual, 16-е видання). ті так званої петлі 40-их положень амінокислот, є Причина захворювання невідома, але в якості ефективними при лікуванні розсіяного склерозу такої передбачається імунологічне порушення, при і/або інших демієлінізуючих захворювань. Даний наявності в цей час деякої інформації, що вказує сайт представляє консервативний GAG-зв'язуючий на специфічний механізм. Причини, що висловмотив в СС-хемокінах (таких, як RANTES, МІР-1 люються включають зараження вірусом, що повіальфа і МІР-1 бета, МІР-3, МІР-4, НСС1, 1309, льно розвивається або латентним вірусом і мієліМСР-2). Всі ці мутанти хемокінів володіють зниженоліз під дією ферментів. Рівень IgG звичайно ною здатністю зв'язуватися з GAG в порівнянні з підвищений в СМЖ, і збільшені титри зв'язували з відповідними молекулами дикого типу. різними вірусами, включаючи кір. Значення даних Область, в якій повинні бути присутніми, щофактів і повідомлень про взаємозв'язок з HLAнайменше, дві мутації згідно з даним винаходом, алотипами і зміненою кількістю Т-клітин неясно, так звана петля 40-их положень амінокислот, вкаоскільки докази є до деякої міри суперечливими. зана для ряду СС-хемокінів на фігурі 1. Зокрема, Підвищена частота захворювання в сім'ях передбуло встановлено, що потрійний мутант RANTES, бачає наявність генетичної схильності: жінки часв якому три основних залишки в положеннях 44, тіше захворюють, ніж чоловіки. Мабуть, є чинники 45 і 47 заміщені аланіном, активні на моделях тванавколишнього середовища. Незважаючи на те, рин для лікування розсіяного склерозу. Було покащо початок захворювання звичайно доводиться на зано, що даний потрійний мутант RANTES має вік між 20-40 роками, MS пов'язаний з географічдозозалежний ефект на мишачій моделі ЕАЕ і поною областю, де пацієнт проводить перші 15 років рівнянну ефективність зі стандартним лікуванням життя. Переміщення після 15-літнього віку не змірекомбінантним IFN-бета. Аналогічні результати нює ризик виникнення захворювання. були отримані з усіченим потрійним мутантом Бляшки або острівці демієлінізації з руйнуванRANTES, в якому три залишки в положеннях 44, ням олігодендроглії і навколосудинним запален45 і 47 заміщені аланіном і в яких відсутні 2Nням розсіяні по ЦНС, в основному в білій речовині кінцеві амінокислоти. Даний усічений мутант з нахилом до латеральних і задніх стовпів (особRANTES (що володіє амінокислотною послідовнісливо в шийній і дорсальній областях), зорових тю SEQ ID No: 3) є новим і представляє інший об'нервах і перивентрикулярних областях. Уражаєкт даного винаходу. ються також шляхи в середньому мозку, мості і Аналогічні експериментальні докази були тамозочку, може бути також уражена сіра речовина, кож отримані відносно потрійних мутантів МІР-1 як в мозочку, так і спинному мозку. альфа і МІР-1 бета, які вже відомі і які тут названі, Звичайно зберігаються тіла клітин і аксони, як потрійний мутант МІР-la, R18A-R46A-R48A особливо на ранніх стадіях поразки. Пізніше, аксо[Koopmann W. and Krangel M.S., J. Biol. Chem., ни можуть руйнуватися, особливо на довгих шля1997, 272 (15): 10103-9] і потрійний мутант по 40ха х, і фіброзний гліоз надає шляхам їх «склеротиму положенні амінокислот МІР-1β K45A-R46Aчний» вигляд. Одночасно можна виявити дільниці K48A [Laurence J.S., Biochemistry, 2001, 40:4990поразки на ранніх і пізніх стадіях. Були показані 4999]. хімічні зміни в ліпідних і білкових складових мієліну Вираз «знижена GAG-зв'язуюча активність» в бляшках і навколо них. означає, що мутанти згідно з даним винаходом Захворювання характеризується різними скарволодіють низькою здатністю зв'язуватися з GAG, гами і ознаками дисфункції ЦНС з ремісіями і потобто низький процент кожного з даних мутантів стійно виникаючими загостреннями. зв'язується з GAG (такими, як гепаринсульфат) в Ядерно-магнітний резонанс (MRJ) є найбільш порівнянні з відповідною молекулою дикого типу. чутливим методом діагностики; він може показати Більш переважними є мутанти людського багато бляшок. Дільниці поразки також можуть RANTES, в якому три основні амінокислоти в побути видимими при контрастній комп'ютерній то 7 77950 8 мографії. провести в дозі, яка є такою ж, менше або вище, Досягнення в лікуванні розсіяного склерозу ніж первинна або попередня доза, що вводиться (MS) з'являються повільно, частково внаслідок індивідууму. неповного розуміння патогенезу захворювання. Даний винахід описаний при зверненні до конДля емпіричного лікування основні перешкоди для кретних втілень, але зміст опису включає всі морозвитку включають в сильній мірі різну течію MS, дифікації і заміни, які може провести фахівець в тривалу природу найбільш важливих результативданій області, не відступаючи від значення і мети них заходів і відсутність об'єктивних маркерів ефеформули винаходу. кту лікування, особливо в короткий термін. Зараз винахід буде описаний за допомогою Незважаючи на те, що патогенез MS залишанаступних прикладів, які жодним чином не треба ється невизначеним, природна історія продовжує розглядати як ті, що обмежують даний винахід. У вивчатися. Були розроблені об'єктивні результаприкладах будуть посилання на фігури, представтивні заходи, засновані на даних ядернолені тут нижче. магнітного резонансу, і в цей час відомі багато які Фігура 1: представлено вирівнювання деяких помилки при клінічних випробуваннях, які привели зразкових СС-хемокінів, вирівняних на рівні петлі до поліпшених методів випробувань і кращої ін40-х положень амінокислот. Даний сегмент білка і терпретації результатів. катіонний сайт, який відповідає GAG-зв'язуючому Іншим об'єктом даного винаходу є, о тже, спомотиву, вміщені в рамки. сіб лікування MS введенням ефективної кількості Фігура 2: представлена карта плазміди, викомутантів хемокінів згідно з даним винаходом разом ристаної для клонування RANTES дикого типу і з фармацевтично прийнятним наповнювачем. його мутантів згідно з прикладами. «Ефективна кількість» відноситься до кількості Фігура 3: представлені результати аналізу конактивних інгредієнтів, яка достатня для впливу на курентного зв'язування [125І]-R ANTES і мутантів течію і тяжкість захворювання, що приводить до гепарином в аналізі з гранулами, навантаженими зменшення або ремісії такої патології. Ефективна гепарином. кількість буде залежати від шляху введення і стану Фігура 4: приведені дані аналізів конкурентнопацієнта. го рівноважного зв'язування RANTES і потрійного Додатковим об'єктом даного винаходу є фармутанта по 40-их положеннях амінокислот мацевтичні композиції, що включають мутанти RANTES. хемокінів згідно з даним винаходом, в присутності Фігура 5: показана індукція хемотаксису моноодного або більше фармацевтично прийнятних цитів і Т-клітин під впливом RANTES і потрійних наповнювачів, для лікування MS і/або інших демімутантів по 40-их і 50-их положеннях амінокислот єлінізуючих захворювань. RANTES. «Фармацевтично прийнятний» означає вклюФігура 6: показане інгібування рекрутменту печення будь-якого носія, який не знижує ефективритонеальних клітин під впливом мутанта по 40-их ність біологічної активності активного інгредієнта і положеннях амінокислот RANTES. який не є токсичним для хазяїна, якому його ввоФігура 7: показане інгібування індукованого дять. Наприклад, для парентерального введення RANTES рекрутменту перитонеальних клітин під вищезгадані активні інгредієнти можна включити в впливом усіченого потрійного мутанта по 40-их разову лікарську форму для ін'єкцій в розчинниках положеннях амінокислот RANTES (3-68), отриматаких, як фізіологічний розчин, розчин декстрози, ного в Pichia pastoris. сироватковий альбумін і розчин Рінгера. Фігура 8: показане інгібування індукованого Крім фармацевтично прийнятного носія, комMIP-Ιβ рекрутменту перитонеальних клітин під позиції згідно з даним винаходом можуть також впливом потрійного мутанта по 40-их положеннях включати невеликі кількості добавок, таких, як стаамінокислот MIP-Ιβ (K45 AR46AK48A). білізатори, наповнювачі, буфери і консерванти. Фігура 9: показане інгібування індукованого Введення такого активного інгредієнта може МІР-Ια рекрутменту перитонеальних клітин під бути вн утрішньовенним, внутрішньом'язовим або впливом потрійного мутанта по 40-их положеннях підшкірним шляхом. У даний винахід входять інші амінокислот МІР-Ια (R18A-R46A-R48A). шляхи введення, при яких можуть бути отримані Фігура 10: показане інгібування індукованого бажані концентрації відповідних інгредієнтів в кротіогліколятом рекрутменту клітин під впливом пові. трійного мутанта по 40-их положеннях амінокислот Оптимальна доза активного інгредієнта може RANTES. бути відповідно вибрана, виходячи з шляху ввеФігура 11: показано придушення початку роздення, стану і характеристик пацієнта (статі, віку, витку експериментального аутоімунного енцефамаси тіла, стану здоров'я, маси), ступеня виражеломієліту під впливом всіх потрійних мутантів по ності симптомів, іншого одночасного лікування, 40-их положеннях амінокислот RANTES згідно з частоти лікування і бажаного ефекту. Коректуванданим винаходом. ня і маніпуляції з встановленими дозами знахоПРИКЛАДИ дяться в компетенції фахівців в даній області. 1. Ма теріали і методи Звичайно добова доза активного інгредієнта а) Отримання незв'язуючих гепарин мутантів може складати приблизно від 0,01 до 100мг на кг RANTES маси тіла. Звичайно 1-40мг на кг на день, введені Мутагенез RANTES досягали зворотною полів роздільних дозах або в формі пролонгованого меразною ланцюговою реакцією. Крапкові мутації вивільнення, ефективні для досягнення бажаних вводили в один з двох праймерів, використаних результатів. Друге або подальше введення можна для гібридизації з людською кодуючою послідовні 9 77950 10 стю RANTES (GenBank номер доступу NM-002985) ням системи pT7/LacI. Експресію білка індукували в зворотній орієнтації. Для того щоб підвищи ти доданням до культури 1мМ ізопропіл-b-Dефективність відпалу праймерів (особливо, коли в тіогалактопіранозиду (IPTG). Клітини збирали і праймери вводили численні мутації), ДНК денатуресуспендували в буфері для лізісу (50мМ Трисрували лугом. Денатуровану ДНК розбавляли до НСІ, рН8, 10мМ MgCl2, 5мМ бензамідину/НСІ, 1мМ концентрації приблизно 10 пг/реакція для уникненDTT, 0,1мМ фенілметилсульфонілфториду ня включення немутантної ДНК в реакцію транс(PMSF), DNaзи 20мг/л). Клітини руйнували трьома формації. пропусканнями через французький апарат для Нумерація амінокислот, представлена в припродавлювання клітин під тиском. Потім суспензію кладах і описі, стосується зрілого білка, тобто поцентрифугували при 10000xg протягом 30хв. при чинаючи з Ser, який є амінокислотою в положенні 4°С. Осадок тіл включення, утримуючий RANTES 24 у відповідності до списку послідовностей. Отже, дикого типу або один з мутантів RANTES, солюбідля того, щоб мати правильну відповідність між лізували в 0,1Μ Тріс/НСІ, рН8,0, що містить 6Μ числом амінокислот в списку послідовностей і тагуанідину/НСІ і 1мМ DTT, і перемішували протягом ким в прикладах, 23 потрібно додати до чисел в 30хв. при 60°С. Розчин діалізували проти 3 змін прикладах або описі. 1% оцтової кислоти. Нерозчинні речовини видаляПослідовності використаних мутагенних прайли центрифугуванням при 10000xg протягом 30хв. мерів є наступними, і мутантні основи підкреслені: Супернатант, що містить RANTES дикого типу або один з мутантів R ANTES, ліофілізували. Ліофілізований порошок розчиняли в 0,1Μ Тріс/НСІ, рН8,0, що містить 6Μ гуанідину/НСІ і 1мМ DTT. для отримання концентрації, рівної приблизно 1 мг/мл. Білки ренатурували доданням по краплях в 10 х об'ємі розчину гуанідину розчину 20мМ Тріс/НСІ, рН8,0, що містить 0,01мМ окисленого глутатіону і 0,1мМ відновленого глутатіону. Розчин перемішували протягом ночі при 4°С. Нерозчинні речовини видаляли центрифугуванням при 10000xg протягом 30хв. Значення рН доводили до 4,5 оцтовою кислотою, і електропровідність доводили до 20mS розбавленням водою. Розчин наносили на колонку HiLoad S 26/10, заздалегідь урівноважену 20мМ ацетатом натрію, рН4,5 і білок елюювали лінійним градієнтом 0-2Μ NaCl в тому ж буфері. Фракції, що містять RANTES дикого типу або один з мутантних білків RANTES, збирали, діалізували проти 3 змін оцтової кислоти і ліофілізували. Ліофілізовані білки розчиняли в 50мМ Тріс/НСІ буфері, рН8,0. Лідерну послідовність MKKKWPR, отриману в результаті клонування, відщепляли від RANTES дикого типу або одного з мутантних білків RANTES інкубуванням з ендопротеїназою Arg-C (фермент:субстрат 1:600, мас/мас.) протягом ночі при 37°С. Відщеплені білки відділяли від невідщепленого білка катіонобмінною хроматографією на колонці HiLoad S 26/10, заздалегідь урівноваженій Ампліфікацію проводили в термоблоці для 20мМ ацетатом натрію, рН4,5, що містить 6Μ сеДНК (Perkin-Elmer-Cetus 480) протягом 35 циклів з човини, і білки елюювали лінійним градієнтом 0використанням ДНК-полімерази pfuturbo®. ДНК 2Μ NaCl в тому ж буфері. Збирали відщеплені лігу вали і трансформували в Тор 10 F' компетентфракції і діалізували проти двох змін 1% оцтової ні клітини E.coli (Invitrogen). Послідовність мутантів кислоти і, нарешті, проти 0,1% трифтороцтової перевіряли секвенуванням ДНК. кислоти і потім ліофілізували (Edgerton M.D. et al., b) Експресія і очищення RANTES дикого типу і pg. 33-40 and Proudfoot A.E. et al., pg. 75-87, in мутантів R ANTES в E.coli "Chemokine Protocols", Methods in Molecular Отримані з допомогою ПЛР фрагменти ДНК, як Biology, 2000, vol. 138, Humana Press). пояснено вище, клонували в плазміду pET24d (фіАвтентичність білків дикого типу і мутантного гура 2) з отриманням ряду векторів. Кодуючу поRANTES перевіряли мас-спектрометрією. З викослідовність RANTES дикого типу або мутантного ристанням аналогічної методики отримували інRANTES клонували в 3'-положенні від промотору ший мутант, який містив Met як подовження NH2рТ7 між ХbаІ- і Nhel/XhoI-сайтами. Плазміда міскінця, а також одиничний або потрійний мутанти по тить два маркерних гени (Km і Іасі) і активний по40-их положеннях амінокислот RANTES і одиниччаток реплікації (Ori fl). ний або потрійний мутанти по 50-их положеннях Отримані вектори використали для повторної амінокислот. трансформації штаму Е.соіі BL21(DE3), в якому с) Експресія і очищення RANTES дикого типу і досягається висока експресія білка з використанмутантів R ANTES в Pichia pastoris 11 77950 12 Отримували зрілий потрійний мутант по 40-их буфером для зв'язування (50мМ HEPES, рН7,2, положеннях амінокислот RANTES (R44A-K45Aщо містить 1мМ СаС12, 5мМ MgCl2, 0,15Μ NaCl і R47A) з використанням мегапраймера на основі 0,5% BSA). Проводили серійне розведення гепаПЛР-мутагенезу (Datta A.K., Nucleic Acid. Research, рину в буфері для зв'язування в межах концентра1995, 23 (21): 4530-31). Його клонували в експрецій 20мг/мл-1мкг/мл. Аналіз проводили в загальсуючий вектор Pichia pastoris, pPIC9K, в рамці ному об'ємі 100мкл з доданням в кожну ямку прочитування з препросигнальним пептидом Mat 25мкл розведень гепарину, 25мкл 0,4 нМ [125І]альфа S. cerevisiae. хемокіну, 25мкл гранул, навантажених гепарином Після підтвердження послідовності плазміду (0,2мкг/мл у воді) і 25мкл буферу для зв'язування. переносили в штам-хазяїн Pichia pastoris Аналізи проводили в трьох паралелях. Планшети GS115(his4) електропорацією. His +-клони піддаваінкубували при кімнатній температурі при струшули скринінгу на експресію мутанта RANTES. Прованні протягом 4год. Планшети з фільтром промиводили досліди по експресії в невеликому об'ємі з вали 3 рази 200мкл буфера для промивання з вивикористанням стандартних методів, як описано в користанням вакуумного насоса для видалення наборі для експресії в Pichia від Invitrogen (Life незв'язаного-міченого хемокіну. Потім в кожну ямTechnologies). Стисло, культуру розмножати в збаку додавали 50 мкл сцинтиляційної рідини і визнагаченому середовищі, що містить гліцерин як джечали радіоактивність (1хв./ямка). Дані аналізували рело вуглецю, після чого її осаджували і ресуспез використанням програми GraFit Software. ндували в середовищі, що містить метанол для є) Аналізи рівноважного конкурентного зв'язуіндукції експресії мутантного білка RANTES. Секвання з рецептором рецію мутантного RANTES в середовищі детектуАналізи проводили на мембранах від трансвали при фарбуванні Кумасі синім після проведенфектантів СНО, що експресують CCR1 або CCR5, ня електрофорезу в SDS-П ААГ. з використанням сцинтиляційного аналізу простоКлон, що секретує мутантний RANTES у висорової близькості (SPA), застосовуючи як індикатор кій концентрації (приблизно 500-750мг/л), викорис[І25 І]-МІР-1a. Конкуренти готували серійним розветали для розмноження у великих колбах, що денням немічених хемокінів в буфері для зв'язуструшуються. Бульйон після ферментації центривання в межах концентрацій 10-6-10-12М. Викорисфугували при 5000об./хв. і супернатант використаним буфером для зв'язування був 50мМ HEPES, тали для виділення. рН7,2, що містить 1мМ СаС12, 5мМ MgCl2, 0,15Μ Білок виділяли з супернатанту хроматографіNaCl і 0,5% BSA. Гранули Wheatgerm SPA єю в одну стадію на колонці з гепарин-сефарозою, (Amersham) солюбілізували в PBS до концентрації урівноваженою 0,1Μ Тріс/НСІ, і елюювали лінійним 50мг/мл і розбавляли в буфері для зв'язування до градієнтом 0-2Μ NaCl в тому ж буфері з викорисконцентрації 10мг/мл, і кінцева концентрація при танням 20 об'ємів колонки. Автентичність білка аналізі становила 0,25мг/ямка. Мембрани, отриперевіряли мас-спектрометрією, і було встановлемані з клітин СНО, що експресують CCR1 або но, що продукований в такій системі мутант CCR5, зберігали при -80°С і розбавляли в буфері RANTES (R44A-K45A-R47A), також є усіченим в Nдля зв'язування до концентрації 80мкг/мл. Перед кінці в порівнянні з молекулою дикого типу, тобто постановкою аналізу для зменшення фону змішувін втрачає 2 перших амінокислоти. Отже, отримавали рівні об'єми початкових розчинів мембран і ним таким чином мутант ідентифікували як потрійгранул. Кінцева концентрація мембран становила ний мутант по 40-их положеннях амінокислот 2мкг/мл, і концентрація для [125І]-МІР-1a дорівнюRANTES (3-68)(R44A, K45A, R47A), і його амінокивала 0,1нМ. Планшети інкубували при кімнатній слотною послідовністю є SEQ ID No: 3. температурі при струшуванні протягом 4год. Виd) Аналіз зв'язування гепарину значали радіоактивність і дані аналізували, як опиПроводили хроматографію на гепаринсано для аналізу зв'язування гепарину. сефарозі з використанням 50мкг білків дикого типу f) Аналізи хемотаксису або мутантного RANTES, які навантажували на Хемотаксис моноцитів проводили за допомоколонку з гепарином-сефарозою, урівноважену гою аналізу з використанням камери мікро-Boyden. 25мМ Тріс/НСІ, рН8,0 і 50мМ NaCl, і елюювали Моноцити виділяли з світлого шару кров'яного лінійним градієнтом 0-2Μ NaCl в 25мМ Тріс/НСІ, згустк у з використанням наступної методики видірН8,0. лення: 100мл розчину світлого шару кров'яного Хроматографію на гепарин-сефарозі проводизгустк у розбавляли 100 мл PBS, вміщували на ли з використанням 50мкг білків дикого типу або Фіколл і центрифугували при 600xg протягом 20 мутантного RANTES, які наносили на катіонообхв. при кімнатній температурі. Клітини, утворюючі мінну колонку MonoS, урівноважену 50мМ ацетаповерхню розділу, збирали, двічі промивали PBS і том натрію, рН4,5. Білок елюювали градієнтом 0ресуспендували при концентрації 40-100´10-6/мл в 2Μ NaCl. середовищі RPMI 1640, що містить 5% інактивоваАналіз конкурентного зв'язування проводили з ної фетальної телячої сироватки (FCS), 2мМ глувикористанням RANTES дикого типу, потрійного таміну і 25мМ HEPES, рН7,2. Потім їх виділяли з мутанта по 50-их положеннях амінокислот фракції лімфоцитів доданням 106 овечих еритроRANTES і потрійного мутанта по 40-их положеннях цитів/мл, проводили реакцію розеткоутворення амінокислот RANTES (послідовність SEQ ID No: 2 протягом ночі при 4°С і відділяли другим центритакож позначений тут, як «R44A-K45Aфугуванням в градієнті Фікола при 900xg протягом R47ARANTES»), які були помічені 125I(Amersham) з 20хв. при кімнатній температурі. Моноцити виявпитомою активністю 2200мкюрі/моль. ляли на поверхні розділу між Фіколом і буфером, а 96-ямкові планшети з фільтром просочували Т-клітини знаходилися в осаді. Моноцити проми 13 77950 14 вали PBS і ресуспендували при концентрації денням вони отримували 200мкл внутрішньовенно 300нг коклюшного токсину (List Biological Lab., 2,5´106/мл в середовищі RPMI 1640. Чистоту визначали прямим і бічним розсіюванням збудженої Campbell, СА, США), розчиненого в PBS в хвостову вену. На день 2 твариною робили другу в/ч ін'єфлуоресценції сортованих клітин, і вона була кцію 300нг коклюшного токсину. встановлена на рівні 40-80% в залежності від доВнаслідок даної процедури, починаючи принора. Хемокіни розбавляли до кінцевого об'єму близно з дня 8-10, з'являвся прогресуючий пара30мкл, в межах концентрацій 10-6-10-12Μ в середовищі RPMI вносили в нижню ямку. Над нижньою ліч, починаючи від хвоста і прогресивно висхідний до передніх кінцівок. ямкою вміщували фільтр з розміром пір 5мкм Схема досліду (Neuroprobe) для моноцитів і 8мкм для Т-клітин У дослід входили групи по 10 тварин в кожній. для гарантії відсутності пухирців повітря і систему Всі групи імунізували пептидом MOG35-55 B CFA і скріпляли. 50мкл клітинної суспензії (2,5´10-6 клікоклюшним токсином по протоколу імунізації: тин/мл) в середовищі RPMI вміщували у вер хню Група 1: позитивна контрольна група з ввеямку. Камеру інкубували протягом 30хв. для моноденням одного розчинника (PBS) в/ч. цитів і 1,5год. - для Т-клітин при 37°С в атмосфері Група 2: позитивна контрольна група з ввеО2. Потім клітини видаляли, верхню поверхню денням одного розчинника (PBS) п/ш. мембрани очищали від клітин і потім мембрану Група 3: з введенням потрійного мутанта по промивали PBS. Мембрану фіксували зануренням 40-их положеннях амінокислот RANTES в дозі в МеОН на 1хв., висушували повітрям і забарвлю10мкг/миша в/ч. вали розчинами Fields А і В. Підраховували число Група 4: з введенням потрійного мутанта по клітин, що мігрували при довільному виборі полів 40-их положеннях амінокислот RANTES в дозі зору для кожної ямки з об'єктивом 20х на звичай1мкг/миша в/ч. ному мікроскопі, забезпеченому програмою IBAS. Група 5: з введенням потрійного мутанта по Дані обробляли програмою GraFit. 40-их положеннях амінокислот Met-R ANTES в дозі g) Аналізи по рекрутменту перитонеальних 10мкг/миша в/ч. клітин Група 6: з введенням потрійного мутанта по В першому аналізі рекрутмент клітин індукува40-их положеннях амінокислот Met-R ANTES в дозі ли внутрішньочеревним введенням 10мкг хемокі1мкг/миша в/ч. ну, розведеного в 0,2мл стерильного фізіологічноГрупа 7: з введенням мишачого рекомбінантго розчину (NaCl, що не містить LPS), мишам ного інтерферона бета (m-IFN-β) в дозі самицям BALB/c у віці 8-12 тижнів. Мутанти хемо10000Е/миша п/ш. кінів (10мкг хемокіну, розбавленого в 0,2мл стериГрупа 8: з введенням m-IFN-β в дозі льного фізіологічного розчину) вводили за 30хв. до 20000Е/миша п/ш. введення агоністу. Через 16год. мишей вбивали Розчинник СО2 в аерозолі. Лаваж черевної порожнини провоPBS використали для розведення потрійного дили 3 промиваннями по 5мл PBS і промивні фрамутанта по 40-их положеннях амінокислот кції збирали. Клітини центрифугували при 600xg RANTES, потрійного мутанта по 40-их положеннях протягом 10хв., ресуспендували в кінцевому об'ємі амінокислот Met-RANTES і m-IFN-β до відповідної 1мл і з допомогою гемоцитометру підраховували концентрації. загальне число витягнутих лейкоцитів. Шлях введення У другому аналізі рекрутмент клітин індукуваПотрійний мутант по 40-их положеннях аміноли внутрішньочеревним введенням 200мкл 3% кислот RANTES, потрійний мутант по 40-их полорозчину тіогліколяту в дистильованій воді мишам женнях амінокислот Met-R ANTES і m-IFN-β вводисамицям BALB/c у віці 8-12 тижнів (день 1). Мутант ли щодня в/ч в об'ємі 200мкл/миша. Групам 1, 2 хемокіну (10мкг хемокіну, розведеного в 0,2мл в/ч вводили PBS з розрахунку 200мкл/миша. стерильного фізіологічного розчину) вводили за Тривалість лікування 30хв. до введення тіогліколяту. Мутант хемокіну Лікування кожної тварини починали від дня 4 потім вводили щодня протягом 3 днів (день 2, 3 і досліду (приблизно за 3-5 днів до звичайного ви4). На день 5 мишей вбивали СО2 в аерозолі. Лаяву захворювання) і потім продовжували протягом важ черевної порожнини проводили 3 промиван14 подальших днів (тварин вбивали на день 18 нями по 5мл PBS і промивні фракції збирали. Клідосліду). тини центрифугували при 600xg протягом 10хв., Клінічні спостереження ресуспендували в кінцевому об'ємі 1мл і з допомоПочинаючи з дня 5, тварин індивідуально обгою гемоцитометру підраховували загальне число стежували на наявність паралічу в балах по клініці витягнутих лейкоцитів. таким чином: h) Експериментальний аутоімунний енцефа0 = відсутність ознак захворювання 0,5 = частломієліт (ЕАЕ) ковий параліч хвоста Процедура імунізації 1 = параліч хвоста Мишей самиць С57 BL/6NCrlBR у віці 8 тижнів 1,5 = параліч хвоста + частковий односторонз масою тіла 18-22 імунізували (день=0) підшкірній параліч задніх кінцівок ним введенням в задню область шиї 0,1 мл ему2 = параліч хвоста + слабість задніх кінцівок льсії, що містить 200мкг пептиду MOG35-55 або частковий параліч задніх кінцівок (Neosystem, Strasbourg, Франція) в повному ад'ю2,5 = параліч хвоста + частковий параліч задванті Фройнда (CFA з Mycobacterium butyricum, ніх кінцівок (опущений таз) Difco, Detroit, США), що містить 0,25мг 3 = параліч хвоста + повний параліч задніх кіMycobacterium tuberculosis. Перед підшкірним вве 15 77950 16 нцівок нях амінокислот були здатні індукувати хемотаксис 3,5 = параліч хвоста + повний параліч задніх моноцитів з активністю, порівнянною з RANTES кінцівок + нетримання сечі дикого типу, за винятком потрійного мутанта по 404 = параліч хвоста + параліч задніх кінцівок + их положеннях амінокислот, який був здатний інслабість або частковий параліч передніх кінцівок дукувати істотний хемотаксис тільки в концентрації 5 = агонія або смерть 1мкМ. Однак потрійні мутанти по 40-их і 50-их по2. РЕЗУЛЬТАТИ ложенням амінокислот були рівні по їх здатності a) Аналізи зв'язування з гепарином індукувати хемотаксис Т-клітин (фігура 5). Очищені білки RANTES, мутантні по одному Результати, отримані в аналізах хемотаксису або трьом положенням, аналізували хроматограмоноцитів, добре співпадають з отриманими в фією з гепарином і концентрацію NaCl, необхідну аналізах зв'язування з рецептором. Втрата активдля їх елюювання, порівнювали з профілем елююності потрійного мутанта по 40-их положеннях амівання RANTES дикого типу. Оскільки взаємодія з нокислот RANTES у відношенні хемотаксису могепарином є електростатичною, мутанти також ноцитів відповідають втраті афінності для CCR1. піддавали катіонобмінній хроматографії на колонці d) Аналізи рекрутменту перитонеальних клітин MonoS. Це приводило до зниження концентрації Потрійний мутант по 40-их положеннях аміноNaCl, необхідної для їх елюювання, оскільки в рекислот RANTES не був здатний індукувати рекрутзультаті мутагенезу видаляються основні залишки. мент клітин в черевну порожнину в дозі Різницю в концентрації NaCl, отриману при прове(10мкг/миша), в той час як RANTES викликає істоденні катіонобмінної хроматографії, віднімали з тний рекрутмент (фігура 6). такої, отриманої при проведенні хроматографії з Більш того якщо мутант в дозі 10мкг вводили гепарином. Якщо це значення є позитивним, то це за 30хв. до введення RANTES, рекрутмент клітин, вказує на специфічну взаємодію з гепарином (табщо індукується RANTES, придушувався. Отже, лиця 1). втрата GAG-зв'язування давала інгібітор індуковаПряме визначення зв'язування з гепарином ного хемокінами рекрутменту клітин in vivo. проводили з потрійними мутантами по 40-их і 50Аналогічні результати представлені на фігурі 7 их положеннях амінокислот RANTES в аналізі конз усіченим (3-68) потрійним мутантом по 40-их покурентного зв'язування. RANTES дикого типу і муложеннях амінокислот RANTES (отриманим в танти йодували (Amersham), і всі вони мали однаPichia pastoris), на фігурі 8 з потрійним мутантом кову питому радіоактивність, рівну по 40-их положеннях амінокислот ΜΙΡ-1-β (K45A2200мкюрі/моль. Однак тільки приблизно 20% поR46A-K48A) і на фігурі 9 з потрійним мутантом по трійних мутантів по 40-их положеннях амінокислот 40-их положеннях амінокислот МІР-la (R18A-R46Aзв'язувалося з гранулами, навантаженими гепариR48A). Рекрутмент клітин, стимульований тіогліконом, з максимальним числом імпульсів на хвилилятом, також інгібувався потрійним мутантом по ну, рівним 4000, в порівнянні з 22000 імпульсами 40-их положеннях амінокислот RANTES, як предна хвилину для RANTES дикого типу і мутантом по ставлено на фігурі 10. 50-их положеннях амінокислот (фігура 3). Це покає) Експериментальний аутоімунний еицефазує, що дані залишки в петлі 40-их положень аміломієліт (ЕАЕ) Потрійний мутант по 40-их полонокислот, які піддавали мутагенезу, значною міженнях амінокислот RANTES показував дозозалерою визначають здатність RANTES зв'язуватися з жний ефект на моделі мишачого ЕАЕ. Було гепарином. З іншого боку, це також показує, що показано, що білок в дозах 1мкг/миша і передбачуваний GAG-зв'язуючий мотив в петлі 5010мкг/миша, що вводиться щодня в/ч, починаючи з х положень амінокислот не є «дійсним» сайтом 10-го дня після первинної імунізації MOG, виявляв GAG-зв'язування. порівнянну ефективність зі стандартним лікуванb) Аналізи рівновагового конкурентного зв'язуням рекомбінантним m-IFN-β (фігура 11). Початок вання з рецептором Оцінювали здатність потрійзахворювання істотно сповільнювався, і тяжкість них мутантів по 40-их і 50-их положеннях захворювання (що оцінювали по площі під кривою) амінокислот RANTES конкурувати з [ 125І]-МІРтакож значно знижувався. Крім того, середнє значення максимальної кількості балів по клініці, 1a за зв'язування з отримане під час досліду, також знижувалося. Інрекомбінантними CCR1 і CCR5 в мембранах, ший мутант (потрійний мутант по 40-их положенотриманих з стабільних трансфектантів СНО. Донях амінокислот Met-RANTES) був не здатний вистовірна відмінність була відсутня при будь-якій з одиничних мутацій на обох рецепторах (результаявити позитивний вплив в тому ж досліді. Результати заявників показують чіткий позитити не представлені). Жоден з потрійних мутантів вний вплив при лікуванні всіма потрійними мутанне показував відмінності в зв'язуванні з CCR5 в тами по 40-их положеннях амінокислот RANTES, порівнянні з білком RANTES дикого типу. Однак на які зменшують вираженість клінічних ознак хронічCCR1 потрійний мутант по 40-их положеннях амінокислот мав 100-кратне зниження афінності, в ного ЕАЕ у мишей після імунізації MOG. Отже, потрійний мутант по 40-их положеннях амінокистой час, як потрійний мутант по 50-их положеннях лот RANTES має позитивний терапевтичний амінокислот показував тільки невелику (3-кратну) ефект, і може застосовуватися як лікування при втрату а фінності (фігура 4). хронічних демієлінізуючих захворюваннях таких, c) Аналізи хемотаксису Всі потрійні мутанти по 40-их і 50-их положеняк MS. 17 77950 18 Таблиця 1 Молярність NaCl для елююв ання з колонок з гепарином і моно-S (катіонобмінної) Мутація RANTES Мутація в ідсутня (дикий тип) R44A К45А R47F R44A-K45A-R47A К55А К56А R59A K55A-K56A-R59A Гепарин 0,80 0,61 0,65 0,65 0,47 0,70 0,90 0,79 0,70 MohoS 0,91 0,82 0,97 0,84 0,70 0,86 0,94 0,85 0,75 DNaClHep-S DNaCl Mono-S DDNaCl 0,19 0,15 0,15 0,33 0,10 -0,10 0,01 0,10 0,09 0,04 0,07 0,21 0,05 0,07 0,06 0,16 0,10 0,11 0,08 0,11 -0,05 -0,17 -0,05 -0,06 У подальшій таблиці 2 показана ідентичність послідовностей, представлених в переліку послідовностей і в тексті. Таблиця 2 SEQ ID ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ NO: 1 RANTES дикого типу (WT) Іотрійний мутант по 40-их положеннях аміно2 кислот RANTES Іотрійний мутант по 40-их положеннях аміно3 кислот RANTES (3-68) Потрійний мутант МІР-1-альфа (R18A-R46A4 R48A) Потрійний мутант МІР-1-бета (K45A-R46A5 K48A) Іотрійний мутант по 50-их положеннях аміно6 кислот RANTES Іотрійний мутант по 40-их положеннях аміно7 кислот Met-RANTES 8 Мутант R44-RANTES 9 Мутант K45A-RANTES 10 Мутант R47A-RANTES 11 Мутант K55A-RANTES 12 Мутант K56A-RANTES 13 Мутант R59A-RANTES 14 Іраймер Ρ1 15 Траймер Р2 16 Праймер РЗ 17 Праймер Р4 18 Праймер Р5 19 Праймер Р6 20 Праймер Р7 21 Праймер Р8 22 Праймер Р9 23 Праймер Р10 24 Праймер Р11 25 Праймер Ρ12 26 Праймер РІЗ 27 Праймер Ρ14 28 Праймер Ρ15 29 Праймер Р16 30 WT-1309 31 WT-MIP-1-альфа 32 WT-MIP-1-бета 33 WT-MIP-4 34 WT-MIP-5 35 WT-HCC1 36 WT-136512 37 WT-MCP-2 19 77950 20 21 77950 22 23 Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко 77950 Підписне 24 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601