Застосування неомилюваного екстракту рослинної пульпи для лікування старіння шкіри

1. Застосування неомилюваного екстракту рослинної пульпи, що містить тритерпенову фракцію, яке відрізняється тим, що вказана тритерпенова фракція містить еритродіол,  -амірин,  амірин і лупеол, для отримання косметичного, фармацевтичного або харчового продукту, призначеного для профілактики і/або лікування порушень шкіри, пов'язаних зі старінням шкіри, при цьому вміст еритродіолу складає від 7 до 40 % ваг. неомилюваного екстракту. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що масова фракція  -амірину складає від 5 % до 30 % неомилюваного екстракту. 3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що сума масових фракцій  -амірину і лупеолу складає від 10 % до 50 % неомилюваного екстракту. C2 2 UA 1 3 гістологічні зміни, які є причиною функціональних аномалій органів. Перші видимі ознаки проявляються на рівні шкірних тканин у вигляді зміни текстури, кольору, прозорості і появи зморшок. Цим виявам можуть сприяти зовнішні чинники, такі як сонце, тютюн. Однією з основних теорій є значення вільних радикалів кисню (BPK) в процесі старіння. На рівні шкіри BPK описані як ранні медіатори запальних патологій і старіння (Kress М. et al., Pain 1995; 62:87-94). У процесі старіння всі структури шкіри змінюються. Але фундаментальні зміни переважають в дермі, і основними мішенями і основними активними учасниками є фібробласти і позаклітинний матрикс. Фібробласти здатні старіти. Отже, їх кількість зменшується, їх функція сповільнюється і їх фенотип змінюється. І тоді вони активно беруть участь в деградації позаклітинного матриксу дерми. До того ж під час старіння фібробласти втрачають свою реактивність і їх регуляція модулюється. Дійсно, вважається, що старіння пов'язано із зменшенням, навіть відсутністю відповіді на зовнішні стреси і, отже, з появою інфекційних, аутоімунних захворювань і раку (Gardner I. D. Rev. Infect. Dis. 1980; 2:801-10). Поява зморшок є однією з найбільш ранніх ознак старіння. Для деяких людей вона є справжньою проблемою в їх відносинах із зовнішнім світом. Тому в цей час багато які косметичні продукти, призначені для лікування старіння шкіри, є загальнодоступні. Ці спеціальні продукти створені головним чином на основі рослинних екстрактів. Арганія, відома в міжнародній ботанічній номенклатурі під назвою Argania spinosa (L.) Shells, особливо ціниться в косметичній промисловості, більш конкретно ядро зерна. Арганія - це невисоке дерево, висотою від 6 до 10 метрів, за зовнішнім виглядом нагадує оливкове дерево. Зовнішній вигляд крони може варіювати, вона може бути вертикальною або плакучою. На дуже колючих гілках знаходиться зовсім дрібне листя, списоподібне, черговорозташоване, вузьке, коротке (приблизно 2 см), часто згруповане в пучок. Листя Арганії звичайно не опадає, але іноді в період сильної засухи воно опадає. Квіти жовто-зеленого кольору, двостатеві (тичинки і маточки на одній квітці) і пентамірні (5 пелюсток і 5 чашолистків) утворюють суцвіття типу клубочка. Період цвітіння з травня по червень. Арганія починає плодоносити у віці 5 років. Плід являє собою жовту безчерешкову овальну ягоду довжиною 4-5 см. Вона має м'ясистий оплодень (який також називають пульпою), в якому знаходиться щось на зразок «помилкової кісточки», дуже твердої, коричневого кольору. Цей елемент насправді складається з 2-3 плоских зрощених між собою зерен, всередині кожного з яких знаходиться маслянисте ядро. Найбільшу цінність в застосуванні представляє ядро зерна. З нього отримують олію, потім макуху. Олія, отримана із зерен, була об'єктом декількох патентів на винахід: отримання олії за допомо 95790 4 гою розчинника (FR 2553788), олія арганії, збагачена неомилюваною речовиною (FR 2724663). Крім олії були також запатентовані інші речовини. Наприклад, пептиди, що походять із жмиху зерен, отриманого в результаті екстракції олії: поєднання олії і пептидів жмиху для лікування порушень, пов'язаних зі старінням шкіри (FR 2756183). Лист арганії, білки і сапоніни, що походять із жмиху, також є об'єктами патентів на винахід: EP 1213025 належить до екстрактів листя, EP 1213024 стосується білків, отриманих з жмиху і EP 1430900 - сапонінів, отриманих із жмиху. Пульпа плодів арганії є об'єктом більш пізньої заявки на патент WO2005/039610. Плід арганії являє собою плід з псевдо кісточкою. Він складається з м'ясистого оплодня, який називається пульпою (55-75% плоду), і кісточки, що має дуже тверду оболонку, в якій знаходяться від одного до трьох ядер. З останніх отримують олію. Пульпу плоду піддали хімічному аналізу. Вона складається з вуглеводів, в тому числі целюлози, глюкози, фруктози і цукрози (Charrouf Z. Guillaume D., Ethnoeconomical, enthnomedical and phytochemical study of Argania spinosa (L.), Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 Sandret F. G., Etudes preliminaires des glucides et du latex de la pulpe du fruit d'Argan (Argania spinosa): variation au cours de la maturation, Bulletin de la Societe de Chimie Biologique, 1957, 39, 5-6, 619-631). Заявка на патент WO2005/039610 належить головним чином до застосування композиції на основі пульпи плодів арганії для отримання косметичних продуктів. Екстракт пульпи плодів був більше або менше очищений. Дійсно автори винаходу тестували екстракт на різних стадіях способу. Переважно описане застосування екстракту пульпи плодів, отриманого в результаті екстракції гексаном (стор. 15). Потім після традиційної стадії омилення, відомої фахівцеві, автори тестували неомилювану фракцію, отриману таким чином. Нарешті, автори також передбачили стадію фракціонування неомилюваної речовини шляхом хроматографії, видаливши тритерпенову сполуку еритродіолу. Такий підхід ймовірно ґрунтувався на отриманих результатах, зокрема, на тому факті, що еритродіол як такий володіє токсичністю (приклад 1) в меншій дозі, ніж тритерпенова сполука, така як визначена в документі: фракція А без еритродіолу (стор. 38). До того ж сам по собі еритродіол має слабку перевагу у відношенні UVA і UVB (приклади 3 і 4) в порівнянні з вказаною тритерпеновою фракцією. Таким чином, цей документ загалом стосується застосування тритерпенової фракції екстракту пульпи плодів арганії для отримання косметичних продуктів і переважно для лікування шкіри після впливу UVA і UVB шляхом стимуляції метаболізму фібробластів. Більш конкретно в цьому документі указано, що ця тритерпенова фракція, така як розкрита в WO2005/039610, володіє тим більшою активністю, чим менший вміст еритродіолу. Несподівано автори даного винаходу виявили 5 ефект інгібування фізіологічного старіння фібробластів зрілої шкіри неомилюваним екстрактом пульпи плодів арганії, багатим на еритродіол; причому вказаний екстракт можна отримати шляхом екстракції ацетоном з подальшим проведенням традиційної стадії омилення. Однак можна обґрунтовано вважати, що переваги даного винаходу можна поширити на будь-який неомилюваний екстракт рослинної пульпи, що містить тритерпенову фракцію, склад якої за своїми основними компонентами близький до складу, отриманого з пульпи плодів арганії. Даний винахід належить до застосування неомилюваного екстракту рослинної пульпи, що містить тритерпенову фракцію, який відрізняється тим, що вказана тритерпенова фракція містить еритродіол, -амірин, -амірин і лупеол, для отримання косметичного, фармацевтичного або харчового продукту, призначеного для профілактики і/або лікування порушень шкіри, пов'язаної зі старінням шкіри. Переважно вказаний екстракт отримують шляхом екстракції ацетоном із здійсненням подальшої традиційної стадії омилення. Цей неомилюваний екстракт, який також називають первинною омилюваною речовиною, можна розчинити в ексципієнті для того, щоб полегшити приготування лікарської форми. Переважно вказаний екстракт отримують з рослини, вибраної із сімейства Sapotaceae; і більш переважно указаний екстракт отримують з пульпи плодів арганії. Перевага екстракції ацетоном полягає в тому, що можна не використовувати латекс, який утворює велику частину ліпідної фракції, і таким чином отримувати високу концентрацію неомилюваних речовин в ліпідній фракції. Композиція неомилюваної речовини за даним винаходом відрізняється як в якісному, так і в кількісному відношенні від переважної композиції, описаної в заявці на патент WO2005/039610. Екстракти за даним винаходом відрізняються своїм вмістом тритерпенових речовин. Аналіз останніх можна проводити хроматографією в газоподібній фазі відповідним традиційним методом, який дозволяє ідентифікувати -амірин, еритродіол. Напроти, -амірин і лупеол цим методом не виділяються, кількісний аналіз цих молекул можна проводити традиційним методом. Переважно тритерпенова фракція вказаного екстракту складається з еритродіолу, масова фракція якого складає приблизно від 7% до 40% первинної неомилюваної речовини, -амірину, масова фракція якого складає приблизно від 5% до 30% первинної неомилюваної речовини, -амірину і лупеолу, сума масових фракцій яких складає приблизно від 10% до 50% первинної неомилюваної речовини. Переважно вказана масова фракція еритродіолу складає приблизно від 10% до 20% первинної неомилюваної речовини; і більш переважно дорівнює приблизно 15% первинної неомилюваної речовини. Переважно вказана масова фракція -амірину складає приблизно від 7% до 20% первинної неомилюваної речовини; і більш переважно дорівнює 95790 6 приблизно 10% первинної неомилюваної речовини. Переважно сума масових фракцій -амірину і лупеолу складає приблизно від 15% до 30% первинної неомилюваної речовини; і більш переважно дорівнює приблизно 20% первинної неомилюваної речовини. Вміст цих різних молекул залежить від умов проведення екстракції. Ці значення будуть меншими в косметичному, фармацевтичному або харчовому продукті в залежності від одного або декількох ексципієнтів, які будуть введені в первинну неомилювану речовину. Перевагою даного винаходу є істотний внесок еритродіолу у властивості неомилюваного екстракту за даним винаходом проти старіння. Оскільки BCK відіграють важливу роль в процесі старіння шкіри, антирадикальний ефект (анти-BCK) еритродіолу оцінювали шляхом порівняння з неомилюваною речовиною пульпи плодів арганії за даним винаходом. Шкода, яка наноситься BCK клітинам, виявляється в зміні ліпідних компонентів плазматичної мембрани (ліпоперокиснення), білків (денатурація і розкладання) і генетичного матеріалу ДНК (мутації). Мета експериментів, проведених in vitro, полягала у визначенні: ефективності захисту за допомогою еритродіолу і неомилюваного екстракту від окиснення мембранних ліпідів (приклад 3); і захисної здатності еритродіолу і інших тритерпенових молекул (лупеол,  і -амірин) відносно зміни ДНК геному (приклад 4). Ці експерименти дозволили показати, що еритродіол - це молекула, яка володіє значним антиоксидантним потенціалом. В окремому способі здійснення даного винаходу екстракцію можна здійснити таким чином: висушену пульпу плодів арганії подрібнюють, потім екстрагують ацетоном. Можна також застосовувати суміш ацетон-вода. Екстракцію проводять при перемішуванні або статично при співвідношенні рослина/розчинник, яке може змінюватися від 1/2 до 1/20 при температурі від кімнатної до температури кипіння розчинника і протягом часу від 30 хвилин до 24 годин. Після екстракції твердий залишок рослини відділяють від екстрагуючого розчину фільтруванням або центрифугуванням. Розчин може бути більше або менше концентрований до отримання сухого екстракту. У останньому випадку суху речовину можна розчиняти в спирті для проведення омилення. У розчин вводять гідроксид металу, зокрема гідроксид натрію або калію в концентраціях, що змінюються від 0,1 до 10 N. Омилення проводять при температурі від кімнатної температури до температури кипіння при перемішуванні і протягом часу від 15 хвилин до 48 годин в залежності від температури. Очищення проводять шляхом екстракції рідина/рідина. У середовище гідролізу додають незмішуваний розчинник, яким може бути вода, насичена або ненасичена солями [NaCl, (NH4)2SO4], зі значеннями рН від 3 до 9. Цю фазу промивання 7 можна повторити декілька разів. Після очищення органічні фази оброблюють так, щоб усунути розчинник. Цю обробку можна проводити шляхом випарювання під контролем тиску. На стадії випарювання можна отримати продукт, що має більш або менш воскоподібну ліпідну консистенцію, первинну неомилювану речовину. Можна додати ексципієнт, як такий можна використовувати віск тваринного походження (наприклад, бджолиний) або рослинного походження (карнаубський віск, канделільський віск або віск жожоба), рослинну олію (кукурудзяну, сафлорову, кунжутну, арганову), гліцерин, продукти синтетичного походження, такі як вазелінове масло, багатоатомні спирти (такі як пропіленгліколь, бутиленгліколь, гліцерин), етерифіковані тригліцериди (такі як miglyol 812, myritol 318, neobee MJ), оксипронільовані полімери формули Н(ОСН2СНСН3)nОН або оксіетильовані полімери формули Н(ОСН2-СН2)nОН, складні діефіри жирного спирту різної довжини від C1 до С40. Пропорції первинної неомилюваної речовини пульпи плодів арганії і ексципієнту можуть варіювати від 1/99 до 99/1. Перевага даного винаходу полягає в помірній собівартості використання пульпи плодів для лікування, направленого проти старіння. Неомилюваний екстракт використовують без додаткової стадії очищення, яка дорого коштує. Таким чином, композицію за даним винаходом можна отримати способом, в якому використовують традиційні стадії екстракції і омилення, відомі фахівцеві. Застосування неомилюваного екстракту рослинної пульпи за даним винаходом дозволяє попереджувати і/або лікувати шкірні порушення, які проявляються у вигляді зміни текстури, кольору, прозорості шкіри і появи зморшок. В окремому способі здійснення винаходу шкірні порушення є наслідком зниження або відсутності відповіді на зовнішні стреси, зокрема, викликані сонцем або тютюном. В іншому способі здійснення винаходу шкірні порушення є наслідком зниження або втрати індукування білків HSP72. Білки HSP від «Heat Shock Protein» конститутивно експресуються в численних клітинах і володіють функціями, необхідними для підтримки білків, звідки їх назва «шаперонні» білки. Дійсно, вони інгібують агререгацію денатурованих білків, перешкоджаючи утворенню небажаних асоціацій білків, і вони беруть участь у внутрішньоклітинному транспорті і підтримці деяких білків в неактивній формі (Morris S. D. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27: 220-224). Білки HSP також відіграють головну роль у відповіді на стрес і, зокрема, в процесах клітинного захисту, запускаючи адаптативну відповідь (Maytin Е. V. J. Invest. Dermatol. 1995; 104: 448-55). Несподіваним чином застосування екстракту за даним винаходом дозволяє відновити індукування білків HSP72 в зістарених фібробластах. У рамках даного винаходу косметичний, фармацевтичний або харчовий продукт, що містить екстракт за винаходом, вводять пероральним або топічним шляхом, переважно топічним. Галенову форму для топічного нанесення ви 95790 8 бирають з групи, що містить креми, гелі, мазі і спреї. Переважно форму для перорального введення вибирають з групи, що включає таблетки, желатинові капсули і порошки для питних суспензій. Переважно кількість вказаного екстракту в кінцевому косметичному продукті складає приблизно від 0,001% до 50%, переважно приблизно від 0,01% до 10% і більш переважно приблизно від 0,1% до 2% ваг. від загальної ваги препарату. Препарат може додатково містити інші діючі речовини, добре відомі фахівцеві, для лікування і/або попередження шкірних порушень, пов'язаних зі старінням шкіри. Переважно вказаний препарат містить інші речовини, отримані з арганії, відомі своєю «антивіковою» активністю, такі як, наприклад, олія, отримана із ядра зерна, і пептиди жмиху. Нижченаведений приклад композиції за винаходом приведений для відомості і не обмежує винахід. Процентний вміст виражений ваговими процентами по відношенню до загальної ваги композиції. ПРИКЛАД 1: Догляд проти в'ялості обличчя Неомилюваний екстракт пульпи плодів арганії 0,1-2% Збагачена олія арганії 1-5% Пептиди арганії 0,1-1% Похідне вітаміну E 0,1-0,5% Складний гліцериновий ефір вітаміну F 0,1-0,5% Пальмітат вітаміну А 0,1-1% Метилстеарат глюкози 1-5% Тригліцериди капринової і каприлової кислоти 2-8% Рідкий парафін 5-12% Віддушка достатня кількість Очищена вода кількість, достатня до 100 гр Наступні приклади ілюструють винахід, не обмежуючи його об'єм. ПРИКЛАД 2: спосіб отримання неомилюваного екстракту пульпи плодів арганії. 1 тонну сухої пульпи плодів арганії подрібнюють, потім екстрагують в реакторі за допомогою 5 тонн ацетону. Екстракцію проводять при перемішуванні протягом однієї години при кип'ятінні із зворотним холодильником. Після охолоджування розчин фільтрують, потім концентрують у вакуумі до отримання маслянистого десольватованого екстракту. Цей залишок оброблюють 500 літрами етанолу 95 об.%. Додають в нього 100 л 10 н. розчину їдкого натру і доводять до кипіння із зворотним холодильником при перемішуванні протягом години. Після охолоджування гідролізований розчин вміщують в декантатор, вводять в нього 500 л гептану і 300 л води. Екстрагування рідина/рідина проводять обережно. Після декантації витягують органічну фазу. Проводять дві повторні екстракції за допомогою 500 л гептану. З гептанові фази групують і тричі промивають, використовуючи кожний раз 500 л води. Промиті органічні фази десольватують. Отримують в результаті воскоподібну масу. У цьому екстракті, який відповідає первинній нео 9 95790 милюваній речовині, проводять кількісне визначення вмісту тритерпенових речовин. Він містить 10% -амірину, 15% еритродіолу і 20% суміші лупеол--амірин. ПРИКЛАД 3: аналіз антирадикальної дії еритродіолу - аналіз ліпідного пероксидування 1) Вступ Плазматична мембрана є першою і основною мішенню BCK і, будучи багатою на ліпіди, вона є місцем посиленого пероксидування (Girotti A. W., J. Free Radic. Biol. Med. 1995; 1: 87-95). Пероксиди, що утворилися в процесі цього ліпідного окиснення, також є дуже реактивні і можуть руйнувати протеїновий і геномний матеріал. Для оцінки зміни мембрани автори винаходу виміряли пероксидування ліпідів шляхом кількісного визначення in vitro комплексів, утворених продуктами ліпідного окиснення і тіобарбітуровою кислотою. Ці комплекси називають TBARS 10 (Thiobarbituric Acid Reactive Substances) і тест називається: Тест TBARS. З тим, щоб звести до мінімуму хімічний оксидативний стрес, лінію фібробластів L929 обробили комплексом, що складається із сполуки пероксиду 2+ 3+ водню (H2O2) і заліза (Fe /Fe ), відтворюючи таким чином реакцію Фентона, що є джерелом BCK ібільш конкретно гідроксильного радикалу (ОН°) (Vessey D. A. et al. J. Invest. Dermatol. 1992; 99: 2+ 3+ 859-63): H2O2+Fe OH°+OH +Fe . 2) Методологія Тестовані продукти: Продукти випробовували на лінії зістарених фібробластів L929. Клітини попередньо обробили продуктами в різній концентрації (таблиця 1) протягом 16 годин і потім стимулювали комплексом 2+ 3+ H2O2-Fe /Fe протягом 1 години. LK0304 неомилюваного екстракту пульпи плодів арганії отримували відповідно до прикладу 2. Таблиця 1 Тестовані розчини Продукт Неомилювана речовина пульпи плодів арганії Комплект:LK0304 Еритродіол/EXTRASYNTHES E Комплект:05040605 Вітамін E* SIGMA T-1539 Маточний розчин 10 мг/мл (DMEM/TWEEN20) -20°C 10 мг/мл DMSO -20°C Тестовані розчини 0,3 мкг/мл 1 мкг/мл 3 мкг/мл 0,3 мкг/мл-0,68 мкМ 1 мкг/мл-2,26 мкМ 3 мкг/мл-6,78 мкМ 400 мкг/мл-928,7 мкМ 400 мг/мл -20°C * Молекула, яка називається антирадикальною. Пероксидування мембранних ліпідів аналізували шляхом вимірювання показників TBARS (за Morliere P. et al Biochem. Biophys. Acta. 1991; 1084: 261-268). Принцип проведення тесту: У кислому середовищі при 95°С утворюються комплекси, позначені TBARS, абревіатура від Thio Barbituric Acid Reactive Substances, між продуктами ліпідного окиснення (малондіальдегідом або МДА) і тіобарбітуровою кислотою (ТБА), кількісний аналіз яких можна проводити за флуоресценцією в порівнянні з еталоном гамма за допомогою МДА. Кількісний аналіз TBARS виражають в пмоль/мкг білків. Кількісний аналіз білків і TBARS проводять у внутрішньоклітинному середовищі. Обчислення процента захисту клітинних мембран: На основі результатів обчислення TBARS в пмоль/мкг білків захисну ефективність різних продуктів проти окиснення мембранних ліпідів обчис лювали таким чином. % захисту  TBARS контроль  TBARS продукт  100 TBARS контроль 3) Результати-обговорення Після обробки протягом 16 годин з використанням різних тестованих продуктів модель радикального стресу, використовувана в цьому експерименті (реакція Фентона), індукує істотне пероксидування ліпідів в фібробластах L929. Цей потужний розряд гідроксильного радикала ОН° генерує оксидативний стрес на клітинному рівні і, зокрема, на рівні мембран. Проте в цьому типі окиснювальної реакції продукти, отримані пероксидуванням ліпідів, вміщуються в клітини, і кількісний аналіз TBARS відбувається у внутрішньоклітинному середовищі. Отримані результати приведені нижче в таблиці II. 11 95790 12 Таблиця II Аналіз пероксидування ліпідів Тестовані активні речовини Vit E 400 мкг/мл-928,7 мкМ Еритродіол 0,3 мкг/мл-0,68 мкМ 1 мкг/мл-2,26 мкМ 3 мкг/мл-6,78 мкМ Неомилювана речовина пульпи плодів арганії 0,3 мкг/мл 1 мкг/мл 3 мкг/мл Вітамін Е, утворюючий молекулу, яка називається антирадикальною, зменшує пероксидування 2+ 3+ ліпідів, індуковане комплексом H2O2-Fe ZFe , і дуже ефективно захищає клітинні мембрани (приблизно 56%). Неомилюваний екстракт пульпи плодів арганії, отриманий за прикладом 2, володіє антирадикальною активністю в концентраціях 1 і 3 мкг/мл (30 і 37% захисту ліпідних мембран відповідно). Еритродіол, молекула, що міститься в тритерпеновій фракції неомилюваного екстракту, володіє хорошою антиоксидантною активністю, при цьому ефективність залежить від дози. Еритродіол володіє активністю починаючи з 0,3 мкг/мл (33% захисту). Антирадикальна дія еритродіолу в концентрації 3 мкг/мл дуже значна і порівняна з вітаміном Е. 4) Висновки Модель in vitro, представлена в цьому дослідженні, відображає наслідки істотного оксидативного стресу, направленого на основну клітинну мішень, якою є плазмова мембрана. Таким чином кількісний аналіз пероксидування ліпідів є хорошим показником оксидативного стресу і дозволяє оцінити антиоксидантну дію діючих речовин відносно гідроксильного радикала на рівні клітинної мебрани. Вітамін Е, антиоксидантна молекула, дозволяє оцінити цю модель. У цих експериментальних умовах було зазначено, що екстракт за даним винаходом, що містить еритродіол, а також еритродіол як такий, володіють значним антиоксидантним потенціалом. ПРИКЛАД 4: аналіз антиоксидантної дії еритродіолу аналіз геномного удару 1) Вступ ДНК є мішенню ВСК, які викликають модифікацію основ (окиснення, нітрування, деамінування: Guetens G. et al Clin. Lab. Sci. 2002; 39: 331-475), утворення розривів в ланцюгу (безосновні сайти або Р-елімінування) і місточкового зв'язку ДНКбілки і ДНК-гідроксипероксиди. Зміна геномного матеріалу викликає каскад клітинних реакцій (вилочне блокування реплікації, активація ключових білків, зупинка клітинного циклу), які приводять до індукування механізмів репарації. Таким чином система репарації основ або BER (Base Excision Захист мембранних ліпідів в % Типове відхилен- N:число експериСередній ня ментів 56,62 8,74 3 33,75 38,43 53,22 15,39 7,68 17,30 3 3 3 21,38 30,53 37,39 37,53 17,80 9,45 3 3 2 Repair) (Freidberg Е. С. et al DNA repair and mutagenesis, ASMpress; Washington DC 1995) бере на себе відновлення основ, модифікованих оксидативним стресом. Ця система діє швидко і ефективно за трьома ключовими стадіями: 1 - виявлення пошкодженої основи; 2 - розтин і вирізання ураження; 3 - повторний синтез в місці розриву. BCK можуть продукуватися в такій кількості, що системи клітинного захисту і репарації можуть не справлятися. Якщо активуються виконавці апоптозу, пошкоджена клітина вмирає. Але у випадку, якщо пошкодження ДНК погано репаруються, може виникнути генерація делетуючих мутацій, які будуть брати участь в ініціації онкогенезу. Тому біологічні наслідки оксидативного стресу (загибель або мутагенез) зумовлюють більш довгострокові події, такі як старіння або рак. Численні дослідження показали сильну кореляцію між старінням і прогресуючою і необоротною акумуляцією оксидативних пошкоджень на рівні клітинних макромолекул. Декілька дослідницьких груп показали на гризунах, що вміст 8-оксигуаніну, виміряний в різних тканинах, таких як шкіра, з віком збільшується (Tahara S. et al Merch. Ageing Dev. 2001; 122: 415-426). Роботи Месоссі P. et al (Free Radic. Biol. Med. 1999; 26: 303-8), що стосуються скелетного м'яза людини, показують, що оксидантні пошкодження ДНК або ліпідів акумулюються з віком. Та ж команда також показала, що у осіб, страждаючих хворобою Альцгеймера, вміст окиснених основ в ДНК лімфоцитів і вміст антиоксидантів в плазмі істотно вищий і нижчий, відповідно, ніж у здорових (Месоссі P. et al Arch. Neurol. 2002; 59: 794-8). 2) Мета Після здійснення прикладу 3 і з тим, щоб проконтролювати антирадикальну активність еритродіолу на інший моделі, автори винаходу аналізували його захисну здатність відносно зміни геномної ДНК, викликаної оксидативним стресом, в порівнянні з неомилюваним екстрактом пульпи плодів арганії і інших тритерпенових молекул, що також містяться в цьому екстракті. Вони генерували ураження ДНК стресом H2O2 і опосередковано аналізували пошкодження, що 13 95790 утворилися в результаті, аналізуючи реакцію відновлення. Для цього використали набір, який називається тест 3D (DNA Damage Detection). Цей біохімічний дослід імітує in vitro реакцію відновлення шляхом вирізання (Salles В. et al Anal. Biochem. 1995; 232: 37-42 і Salles В. et al Biochimie 1999; 81: 53-58). Тест 3D оснований на репарації пошкоджень ДНК за допомогою очищених людських клітинних екстрактів. На стадії репарації маркер вбудовували в ДНК і це включення, що є кіль 14 кісним відбиванням репарованих пошкоджень, потім виявляли за допомогою хемілюмінесценції. 3) Методологія Тестовані продукти: Продукти оцінювали за лінією зістарених фібробластів L929. Клітини попередньо оброблювали продуктами (таблиця III) протягом 16 годин і потім стимулювали за допомогою H2O2 (пероксид водню 3%-GIFRER-Лабораторія Gifrer Barbezat) в концентрації 100 мкМ протягом 30 хвилин. Таблиця III Тестовані розчини Продукт Неомилювана речовина пульпи плодів арганії Комплект:LK0304 Еритродіол/EXTRASYNTHES E Комплект:05040605 Лупеол (тритерпен) -амірин (тритерпен) -амірин (тритерпен) Тест 3D Принцип проведення був наступним: після пошкодження геномної ДНК (оксидативна обробка) клітини лізували. Лізат накладали на мікропланшет, покритий полілізином: 1. Адсорбція ДНК 2. Інкубування ДНК з білковим екстрактом (збагаченим репаруючими ферментами) і нуклеотидним пулом, один з нуклеотидів якого мічений біотином (dUTP-Biotin)-Репарація пошкоджень і інкорпорування в ДНК нуклеотидів, мічених «dUTP-Biotin». 3. Інкубування з ферментативним комплексом «Avidine-Peroxydase»-виявлення за допомогою авідину інкорпорованих dUTP-Biotin. 4. Введення люмінесцентного субстрату пероксидази і кількісний аналіз сигналу, що подається пропорційно кількості відновлених пошкоджень. Протокол проведення тесту вели відповідно до інструкцій постачальника комплекту (Test 3D Solyscel-Ref: SFRIDN013-AES Laboratoire). Після закінчення реакції планшет зчитували в люмінометрі (MITHRAS LB940-BERTFIOLD). Обчислення процента захисту ДНК: Маточний розчин 10 мг/мл (DMEM/TWEEN20) -20°C 10 мг/мл DSMO -20°C Тестовані розчини 3 мкг/мл 50 мМ DSMO -20°С 50 мМ DSMO -20°C 50 мМ DSMO -20°C 3 мкг/мл-7 мкМ 3 мкг/мл-6,78 мкМ 3 мкг/мл-7 мкМ 3 мкг/мл-7 мкМ Приведене нижче відношення дозволяє обчислити для кожної концентрації тестованого продукту % захисту від пошкоджень ДНК, індукованих оксидативним стресом % захисту ДНК  IL Н2О 2   IL продукт  100 Н2О 2   IL контрольни зразок  й 4) Результати і висновки Результати, отримані в прикладі 3, показали, що еритродіол володіє найбільшою антирадикальною активністю при 3 мг/мл (6,78 мкМ). Тому автори тестували всі тритерпени (лупеол, -амірин, амірин і еритродіол) і неомилюваний екстракт пульпи плодів арганії в концентрації 3 мг/мл в тесті 3D «DNA Damage Detection». Вказаний неомилюваний екстракт отримували способом за прикладом 2. Отримані результати представлені нижче в таблиці IV. Значення, вказані в цій таблиці, це проценти інгібування (або % захисту) пошкоджень ДНК в результаті екзогенного оксидативного стресу по відношенню до клітин «базального контрольного зразка» (100%) і до клітин, «що піддались стресу H2O2» (0%). 15 95790 16 Таблиця IV Захист ДНК еритродіолом Контрольний зразок H2O2 100 мкМ-30хв Еритродіол 3 мкг/мл-6,78 мкм Неомилювана речовина пульпи плодів арганії 3 мкг/мл Лупеол 3 мкг/мл-7 мкМ -амірин 3 мкг/мл-7 мкМ -амірин 3 мкг/мл-7 мкМ Інтенсивність люмінесценції 5460 % пошкоджень ДНК 0 % захисту ДНК 11576,7 100 0 5520 1 99 6193,3 12 88 9020 58,2 41,8 8663,3 52,4 47,6 13133,3 125,4 -25,4 Обробка за допомогою H2O2 індукує високий процент окиснення на рівні гуаніну з утворенням, зокрема, 8-оксо-7,8-дигідро-2'-дезоксигуанозину (8-оксогуанін) (Dizdaroglu М. et al Arch. Biochem. Biophys. 1991; 285: 388-390). Тест 3D показує сильне збільшення люмінесцентності після обробки за допомогою H2O2, яке відображає високу відновну активність і, отже, значний вміст пошкоджених основ в ДНК. Неомилюваний екстракт пульпи плодів арганії ефективно захищає ДНК від оксидативного стресу. Еритродіол, молекула, що міститься в неомилюваному екстракті в концентрації 3 мкг/мл, володіє дуже високою антиоксидантною активністю, забезпечуючи 99% захисту ДНК від утворення оксидативних пошкоджень. Порівняння тритерпенових молекул з однаковою молярною концентрацією (приблизно 7 мкМ) показує, що найбільш активним є еритродіол. ПРИКЛАД 5: Модель дослідження in vitro дії неомилюваного екстракту за винаходом на індукування білків HSP72 1) Бібліографія У різних роботах показана втрата індуктивності білків HSP72 в процесі старіння. У пацієнтів немолодого віку індукування білка HSP72 при тепловому впливі істотно знижена на рівні шкіри (Muramatsu Т. et al. Br. J. Dermatol. 1996; 134: 1035-1038). З іншого боку Gustmann-Conrad A. et al. (Exp. Cell. Res. 1998; 241: 404-413) показали, що індукування білка HSP72 під дією теплового стресу істотно знижується в фібробластах шкіри у немолодих людей в порівнянні з молодими людьми. У тому ж дослідженні було показано, що рівень індукування HSP72 також знижується в фібробластах (молодої шкіри) або в лініях фібробластів (IMR-90), зістарених в процесі клітинних ділень. Перший помірний стрес є достатнім для того, щоб індукувати in vitro білки HSP, з тим, щоб вони захищали клітину від нових стресів (Morris S. D. et al. J. Clin. Invest. 1996; 97: 706-12). HSP72 є основним білком сімейства HSP70, експресованим в кератиноцитах і фібробластах шкіри і індукованим численними агентами стресу (тепло, УФ і т. д.) (Trautinger F. et al. J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 334-38; Charveron М. et al. Cell. Biol. Toxicol. 1995; 11: 161-65). 2) Порядок проведення експерименту Автори даного винаходу вибрали аналіз рівня індукування під впливом теплового стресу білків HSP72 в фібробластах IMR-90 (лінії фібробластів) в процесі старіння для оцінки «антивікових» властивостей екстракту пульпи плодів арганії, отриманого за прикладом 2, тобто який містить 10% амірину, 15% еритродіолу і 20% суміші лупеол-амірин. На першому етапі автори створили і затвердили модель клітинного старіння шляхом індукування старіння фібробластів під дією оксидативного стресу. Модель індукованого старіння: Фібробласти діляться до критичної стадії, яку називають реплікативним старінням і яка асимілюється з клітинним старінням. Але старіння може також бути викликане, зокрема, оксидативним стресом, йдеться про «Stress-Induced Premature Senescence або SIPS» (Dumont et al Free Radic. Biol. Med. 2000; 28: 361-373). Використовувана модель: індукування старіння в лінії молодих фібробластів IMR-90 було виявлене в результаті обробки клітин з використанням H2O2 протягом 2 годин. Через 72 години після цього стресу клітини IMR-90 постаріли. На другому етапі вони показали зниження рівня індукції HSP72 в результаті теплового стресу в зістарених фібробластах в порівнянні з молодими фібробластами. Нарешті, вони провели оцінку властивостей екстракту пульпи плодів арганії, отриманого в прикладі 2, тобто який містить 10% амірину, 15% еритродіолу і 20% суміші лупеол-амірин на цій моделі старіння. 3) Результати Для кращого розуміння винаходу і його цілей, переваг і властивостей нижче приведений опис прикладених малюнків, на яких: На фігурі 1 представлений аналіз ступеню ін 17 дукування HSP72 в фібробластах IMR-90 на рівні транскрипції і трансляції. На фігурі 2 представлений аналіз, проведений методом Western Blot, вмісту білків HSP72 в клітинах IMR-90, оброблених різними концентраціями екстракту пульпи плодів арганії за винаходом. На фігурі 3 представлений напівкількіснийаналіз ступеню індукування білків HSP72 (нормалізованого рівнем експресії Р-актиніну) в зістарених фібробластах IMR-90, попередньо оброблених різними концентраціями екстракту пульпи плодів арганії за винаходом. Аналіз індукування HSP72 під дією теплового стресу в процесі старіння фібробластів IMR-90: Клітини, культивовані при 37°С, інкубували протягом 1 години при 45°C і потім інкубували при 37°C протягом 2 годин (аналіз РНКм) або протягом 4 годин (аналіз білків): Експресія білка (Western Blot) Внутрішньоклітинні білки, екстраговані з фібробластів, аналізували за допомогою технології Western Blot, використовуючи анти-HSP72 антитіло (моноклональне антитіло, CHEMICON) і систему непрямого виявлення люмінесценції. Мембрану аналізували і кількісний аналіз інтенсивності смуг проводили за допомогою денситометрії (програма ImageMaster TotalLab AMERSHAM). Рівень експресії HSP72 нормалізували рівнем білка, експресованого конститутивним чином, -актиніну. На фігурі 1A представлений напівкількісний аналіз методом Western Blot ступеню індукування білків HSP72 в молодих фібробластах IMR-90 (□) і в зістарених фібробластах IMR-90 ( ) (старіння викликане H2O2). Таким чином, на фігурі 1 виразно показано, що рівень білків HSP72 в молодих фібробластах IMR-90 індукований тепловим стресом. Це індукування HSP72 знижується в зістарених фібробластах IMR-90. Експресія РНКм (PCR в реальному часі) Автори аналізували експресію HSP72 на рівні транскрипції шляхом кількісного аналізу РНКм методом PCR в реальному часі. Рівень експресії гену HSP72, що розглядається, обчислювали в зразках, які зазнали теплового стресу, і в контрольних зразках. Рівень експресії гену HSP72 потім нормалізували, використовуючи три контрольних гени [-актинін, GAPDH (людська гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназа) і YWHAZ (зета-поліпептид білка активації тирозин-3монооксигенази, триптофан-5-монооксигенази)], експресія якого є конститутивною. Нарешті, фіксуючи експресію в контрольних зразках на рівні 1, можливо визначити чинник індукування гену HSP72. На фігурі 1B представлений кількісний аналіз методом PCR в реальному часі ступеню індукування РНКм HSP72 в молодих фібробластах IMR90 (□) і в зістарених фібробластах IMR-90 ( ) (ста 95790 18 ріння викликане H2O2). Фігура 1B виразно показує, що індукування РНКм HSP72 також дуже низьке при старінні, індукованому в фібробластах IMR-90. Аналіз ефективності екстракту пульпи плодів арганії Автори винаходу використали модель індукованого старіння або SIPS (Stress Induced Premature Senescence) лінії фібробластів IMR-90 для оцінки екстракту пульпи плодів арганії, отриманого за прикладом 2. Клітини інкубували з екстрактом пульпи плодів арганії в концентраціях 1 і 3 мкг/мл протягом 24 годин. Потім їх піддавали оксидативному стресу, що спричиняє старіння. Результати обробки порівнювали з комплектом «молодих» клітин IMR-90 і комплектом «зістарених» клітин (індуковане старіння), що не пройшли попередньої обробки екстрактом пульпи плодів арганії. Через три доби (72 години) після оксидативного стресу HSP72 були індуковані за допомогою нагрівання. Нарешті, PHK і білки HSP72 піддали аналізу методами PCR в реальному часі і Western Blot, відповідно. На фігурі 2 представлений аналіз методом Western Blot вмісту білків HSP72 в клітинах IMR90, оброблених різними концентраціями неомилюваного екстракту, отриманого в прикладі 2. «Т» і «ST» означають відповідно «контрольний зразок» і «тепловий шок». Аналізи А, В, C і D належать відповідно до молодих фібробластів IMR-90, зістарених фібробластів IMR-90 (старіння, індуковане H2O2), зістарених фібробластів IMR-90, інкубованих з неомилюваним екстрактом в концентрації 1 мкг/мл, і, нарешті, зістарених фібробластів IMR-90, інкубованих з неомилюваним екстрактом в концентрації 3 мкг/мл. На фігурі 3 представлений напівкількісний аналіз ступеню індукування білків HSP72 (нормалізованого рівнем експресії □-актину) в зістарених фібробластах IMR-90, попередньо оброблених екстрактом неомилюваної речовини в концентрації 1 мкг/мл (C) і 3 мкг/мл (D). Представлені також показники індукування білків HSP72 в молодих фібробластах IMR-90 (А) і зістарених фібробластах IMR-90 (В) (старіння, індуковане H2O2). На цих фігурах 2 і 3 показано, що в зістарених фібробластах IMR-90 індукування білків HSP72 більше не відбувається, але що екстракт пульпи плодів арганії в концентраціях 1 і 3 мкг/мл відновлює індукування HSP72 під дією теплового стресу. Нарешті, нижче на таблиці V приведений чинник індукування (після нормалізації) РНКм HSP72 в зістарених фібробластах, попередньо оброблених різними концентраціями екстракту пульпи плодів арганії. 19 95790 20 Таблиця V Чинник індукування Молоді IMR-90 IMR-90, старіння індуковане H2O2 Постарені IMR-90+ екстракт пульпи плодів арганії 1 мкг/мл Зістарені IMR-90+ екстракт пульпи плодів арганії 3 мкг/мл Ця таблиця підтверджує результати, отримані на рівні транскрипції, і показує майже повну репарацію індукування РНКм HSP72 за допомогою екстракту пульпи плодів арганії. Найбільш активний цей екстракт в концентрації 3 мкг/мл. 4) Висновки Білки HSP72 - це білки, індуковані численними стресами (тепло) і які відіграють важливу роль в процесах адаптативної відповіді. Відомо, що індукування білків HSP72 на рівні шкіри і в інших тканинах знижується з віком і, зокрема, при клітинному старінні. До того ж визнано, що старіння пов'язане зі зниженням відповіді на зовнішній стрес, що викликає вікові патології. Чинник індукування 109,1 79,0 84,3 98,1 На моделі старіння, індукованого в фібробластах культури, автори оцінили здатність екстракту пульпи плодів арганії модулювати зниження індукування HSP72 при тепловому впливі. Сукупність результатів підтверджує, з одного боку, сильне зниження індукування HSP72 (при тепловому стресі) в зістарених фібробластах в порівнянні з молодими фібробластами. З іншого боку, ці роботи показують, що екстракт пульпи плодів арганії відновлює індукування білків HSP72 в зістарених фібробластах. У цій моделі дослідження in vitro екстракт пульпи плодів арганії обмежує біологічні наслідки клітинного старіння і, отже, володіє властивостями проти старіння. 21 95790 22 23 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 95790 Підписне 24 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601