Варіант fc-ділянок

1. AHTИ-CD20 антитіло, що містить: (a) амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, представлену послідовністю № 13; (b) амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, представлену послідовністю № 14; та (с) варіант вихідної Fc-ділянки, причому згаданий варіант Fc-ділянки містить амінокислотну заміну, вибрану з групи, що включає 247I/339Q та 247I/339D. 2. AHTИ-CD20 антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що згаданим варіантом Fc є 247I/339Q. 3. AHTИ-CD20 антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що згаданим варіантом Fc є 247I/339D. 4. A HTИ -CD20 антитіло за п. 2, що містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, представлену послідовністю № 29, та амінокислотну послідовність важкого ланцюга, представлену послідовністю № 31. 5. A HTИ -CD20 антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що легкий ланцюг кодується нуклеїновокислотною послідовністю, представленою послідовністю № 30, а важкий ланцюг кодується нуклеїновокислотною послідовністю, представленою послідовністю № 32. 6. A HTИ -CD20 антитіло за п. 3, що містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, представлену послідовністю № 29, та амінокислотну послідовність важкого ланцюга, представлену послідовністю № 33. 7. A HTИ -CD20 антитіло за п. 6, яке відрізняється тим, що легкий ланцюг кодується нуклеїновокислотною послідовністю, представленою UA (21) a200700820 (22) 18.07.2005 (24) 25.05.2010 (86) PCT/US2005/025276, 18.07.2005 (31) 60/598,855 (32) 04.08.2004 (33) US (31) 60/602,953 (32) 19.08.2004 (33) US (31) 60/604,339 (32) 25.08.2004 (33) US (31) 60/609,101 (32) 10.09.2004 (33) US (31) 60/638,442 (32) 23.12.2004 (33) US (31) 60/643,718 (32) 13.01.2005 (33) US (46) 25.05.2010, Бюл.№ 10, 2010 р. (72) АЛЛАН БАРРЕТТ, US, ЦЗЯН ВЕЙДУН, US, ТАНЬ ЇНЬ, US, УОТКІНС ДЖЕФФРІ ДІН, US (73) АПЛАЙД МОЛЕК'ЮЛЕР ІВОЛЮШН, ІНК., US (56) WO2004063351 A, 29.07.09. US2004002587 A, 01.01.04. WO0040272 A, 13.07.2000. WO8807089 A, 22.09.88. SHIELDS R. L. ET AL: "High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for FcgammaRI, FcgammaRII, FcgammaRIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the FcgammaR" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM,, US, vol. 276, no. 9, 2 March 2001 (2001-03-02), pages 6591-6604. TAN L. K. ET AL: "INFLUENCE OF THE HINGE REGION ON COMPLEMENT ACTIVATION, C1Q BINDING, AND SEGMENTAL FLEXIBILITY IN CHIMERIC HUMAN IMMUNOGLOBULINS" PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE, WASHINGTON, DC, US, vol. 87, no. 1, January 1990 (1990-01), pages 162-166. 2 (19) 1 3 90682 4 послідовністю № 30, а важкий ланцюг кодується 9. Фармацевтична композиція за п. 8, що додатнуклеїновокислотною послідовністю, представково містить фармацевтично прийнятний носій. леною послідовністю № 34. 10. Застосування анти-CD20 антитіла за будь8. Фармацевтична композиція, що містить яким з пп. 1-7 для виготовлення лікарського заанти-CD20 антитіло за будь-яким з пп. 1-7. собу для лікування лімфоми. Цей винахід має відношення до поліпептидів, що містять новий варіант Fc-ділянки. Конкретно, новий варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу містить щонайменше одну заміну амінокислоти, опис якої наведено, яка надає імуноглобуліну, що містить згаданий варіант Fc-ділянки, змінену ефекторну функцію або змінений період півжиття у плазмі, порівняно з вихідним імуноглобуліном, який не має такої заміни амінокислоти. На додаток до цього, цей винахід пропонує спосіб зміни ефекторної функції моноклонального антитіла або подовження періоду півжиття у плазмі поліпептиду, до якого функціонально приєднаний варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. Розкриваються варіанти терапевтичного застосування поліпептидів, білків, зокрема, моноклональних антитіл, що містять варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. Існує щонайменше сімнадцять моноклональних антитіл, які зараз схвалені у Сполучених Штатах для застосування як терапевтичні засоби для лікування людей. На додаток до цього, існує декілька сотень моноклональних антитіл, які піддають клінічним випробуванням, і тисячі на стадії передклінічного випробування для лікування різних захворювань або розладів, у тому числі, наприклад, відторгнення трансплантатів, раку, запальних захворювань, сепсису, нефриту, хвороби Альцгеймера, алергій, діабету, автоімунних захворювань, артриту, розсіяного склерозу та інфекційних захворювань. У галузі терапевтичних моноклональних антитіл існує схильність до швидкого зростання їх кількості у наступні роки. Після вакцин, антитіла (або імуноглобуліни, "Ig") становлять другий найпоширеніший тип біофармацевтичного засобу, який піддають клінічному випробуванню (Стоквін Л.Г. (Stockwin L.H.) та інші, Biochemical Society Transactions, 31:433-436, 2003). Генна інженерія зробила значний внесок до розвитку галузі терапевтичних моноклональних антитіл. Ефективність потенційного терапевтичного моноклонального антитіла часто буде змінюватись при найменших змінах білкової послідовності згаданого антитіла. Заміна однієї амінокислоти на варіабельній ділянці моноклонального антитіла має потенціал до зміни спорідненості, з якою згаданий антиген зв'язує антигенну детермінанту, а також таких властивостей антитіла як швидкість Kon або швидкість Κoff·. Такі заміни амінокислот можуть визначити вдалу або невдалу спробу застосування моноклонального антитіла як терапевтичного засобу. Подібним чином, найменші зміни амінокислотної послідовності Fc-ділянки моноклонального антитіла можуть спричинити глибокі зміни властивостей ефекторної функції згаданого антитіла або періоду півжиття білка, з яким функціонально зв'язана згадана Fc-ділянка. Fc-ділянка антитіла (тобто карбоксикінцеві кінці важких ланцюгів антитіла, які сполучають домени СН2, CH3 і частину шарнірних ділянок (дивись Фіг.1)) має обмежену різноманітність і залучена до здійснення фізіологічних ролей, які відіграються згаданим антитілом. Ефекторні функції, які припадають на Fc-ділянку антитіла, змінюються у залежності від класу та підкласу антитіла і включають (і) зв'язування згаданого антитіла через Fc-ділянку зі специфічним Fc-рецептором ("FcR") на клітині, яка ініціює різноманітні біологічні реакції, у тому числі, наприклад, фагоцитоз і знищення частинок, сенсибілізованих антитілом, кліренс імунних комплексів, вивільнення медіаторів запалення, трансплацентарний перехід згаданого антитіла і контроль продукування імуноглобулінів, (іі) комплементзалежну цитотоксичність ("CDC"), де Fc-ділянка зв'язує C1q складову комплементу і, тим самим, ініціює класичний шлях активації комплементу, наслідком чого є лізис мішені, (ііі) антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність ("ADCC"), де певні клітини людської імунної системи, наприклад, фагоцити та NK-клітини (природні клітини-кілери), через Fc рецептор, зв'язуються з Fc-ділянкою антитіла через специфічні антитілозв'язувальні рецептори на імунокомпетентних клітинах і, у подальшому, передають сигнал на знищення структурної одиниці, з якою зв'язане згадане антитіло, та (iv) зв'язування із гладкими клітинами, базофілами та еозинофілами. Спорідненість, з якою Fc-ділянка може зв'язувати конкретний FcR (наприклад, FcRn), або рівень опосередковування Fc-ділянкою CDC або ADCC активності, є важливими факторами визначення ефективності та періоду півжиття терапевтичних білків, зокрема, моноклональних антитіл. Детально визначена модифікація амінокислот на Fc-ділянці людського IgG є активною сферою дослідження, що надає інформацію відносно взаємозв'язку між структурою та функцією, яка має відношення до розробки терапевтичних білків, зокрема моноклональних антитіл (дивись, наприклад, патент США №6,165,745 та публікацію WO 2004/035752 щодо зміни періоду півжиття у плазмі поліпептиду, функціонально зв'язаного з Fcділянкою, та патент США №6,737,056 і публікацію WO 2004/029207 щодо зміни ефекторної функції моноклонального антитіла, що містить модифіковану Fc-ділянку). Для розробки нових терапевтичних білків, зокрема, моноклональних антитіл, корисною була б можливість раціонального конструювання Fcділянки з конкретними амінокислотними модифікаціями, які надавали б бажану корисну властивість антитілу, що становить інтерес. Не слід очікувати, що усі моноклональні антитіла будуть поліпшені як терапевтичний засіб унаслідок одна 5 90682 6 кової конкретної амінокислотної модифікації на Fcу цих положеннях для людського IgG є валін (279), ділянці. Корисним для терапевтичного моноклонагліцин (341), пролін (343) та тирозин (373). льного антитіла, що зв'язує один антиген-мішень, Відповідно до варіанта здійснення цього винаможе виявитись посилення конкретної ефекторної ходу, якому віддається перевага, залишком амінофункції, у той час як для іншого терапевтичного кислоти, яким замінюється залишок, присутній на моноклонального антитіла, що зв'язує інший антивихідній Fc-ділянці, є залишок природної амінокиген-мішень, корисним може виявитись посилення слоти. У разі, якщо не вказується інше, вихідною іншої ефекторної функції або навіть її ослаблення. Fc-ділянкою може бути нативна або ненативна FcКорисним для одного терапевтичного моноклонаділянка, відповідно до варіанта, якому віддається льного антитіла може виявитись здатність до зв'яперевага, людського походження або по суті людзування конкретного Fc-рецептора з більшою споського походження. Амінокислотна послідовність рідненістю, у той час як інше антитіло може бути вихідної Fc-ділянки, відповідно до варіанта, якому поліпшеним як терапевтичний засіб шляхом зв'явіддається перевага, відповідає послідовності, зування того самого Fc-рецептора з нижчою споріпредставленій послідовностями №1, №2, №3 або дненістю і, тим самим, видалення з організму з №4. Відповідно до варіанта, якому віддається пебільшою швидкістю. На додаток до цього, конкретревага, вихідна Fc-ділянка має залишок нативної на амінокислотна модифікація або заміна амінокиамінокислоти у положенні, яке повинно замінюваслоти на Fc-ділянці і кінцевий результат, які могли тись для одержання варіанта Fc-ділянки відповідб принести користь терапевтичному антитілу, моно до цього винаходу. Однак на додаток до цього жуть залежати від антигенної мішені, з якою зв'ярозуміється, що варіантом Fc-ділянки є вихідна Fcзується згадане антитіло та/або захворювання чи ділянка, модифікована таким чином, що вона місрозладу, які підлягають поліпшенню за допомогою тить щонайменше одну амінокислотну заміну, як згаданого антитіла. розкривається у описі. На додаток до цього розуСпособи і композиції, що змінюють конкретні міється, що вихідна Fc-ділянка може бути повноефекторні функції, пов'язані з Fc-ділянкою антитімірною Fc-ділянкою або її частиною, що містить ла, є необхідними для поліпшення властивостей залишок амінокислоти, який підлягає заміні для існуючих терапевтичних антитіл, а також для розодержання варіанта Fc-ділянки. робки нових терапевтичних антитіл із бажаними Цей винахід додатково пропонує поліпептиди, властивостями. Моноклональні антитіла з варіанвідповідно до варіанта, якому віддається перевага, тами Fc-ділянки можуть застосовуватись для лікумоноклональні антитіла, що містять варіант Fcвання різних захворювань або розладів, у тому ділянки (або її функціональний фрагмент), що місчислі, наприклад, запальних розладів, раку, автоітить щонайменше одну амінокислотну заміну у мунних розладів, розладів, пов'язаних із передаположенні 279, 341, 343 або 373, порівняно з вихічею сигналу клітинами та інфекційних захворюдною Fc-ділянкою. Варіант Fc-ділянки, що містить вань. На додаток до цього, способи та композиції, щонайменше одну амінокислотну заміну у Fcщо змінюють період півжиття у сироватці терапевположенні 279, 341, 343 або 373, може додатково тичного білка, чи то шляхом збільшення періоду містити щонайменше одну додаткову амінокислотпівжиття, із забезпеченням, тим самим, застосуну заміну на Fc-ділянці, порівняно із залишком вання меншої кількості доз, чи то шляхом зменамінокислоти, присутнім на нативній Fc-ділянці шення періоду півжиття, із забезпеченням, тим такого самого типу, що і варіант Fc-ділянки. самим, більш швидкого виведення з організму, Відповідно до одного з варіантів здійснення, були б корисними для розробки терапевтичних варіант Fc-ділянки (тобто варіант вихідної Fcантитіл, а також інших терапевтичних білків. ділянки) містить щонайменше 1, 2, 3 або більше Для поліпшення ефективності терапевтичного амінокислотних замін, які вибрані з числа наведебілка, зокрема, моноклонального антитіла, необних нижче: 235G, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, хідними є варіанти Fc-ділянки з поліпшеними вла237N, 237R, 238Е, 238G, 238Н, 238I, 238L, 238V, стивостями. 238W, 238Y, 244L, 245R, 247А, 247D, 247Е, 247F, Цей винахід пропонує варіанти Fc-ділянки, 247М, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247Т, 247W, 247Y, тобто Fc-ділянки, що містять заміну амінокислоти, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249L, 249М, 249N, 249Р, опис якої наведено (дивись, наприклад, Таблицю 249Y, 251Н, 251I, 251W, 254D, 254Е, 254F, 254G, 1), яка надає корисні властивості поліпептидам, 254Н, 254I, 254K, 254L, 254М, 254N, 254Р, 254Q, що містять згадані варіанти Fc-ділянки. 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256Н, 256I, Fc-положення вихідної Fc-ділянки, на яких мо256K, 256L, 256V, 256W, 256Y, 257А, 257I, 257М, же бути здійснена будь-яка заміна амінокислоти 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, для одержання варіанта Fc-ділянки відповідно до 267Н, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271Т, 272Н, цього винаходу, включають положення 279, 341, 272K, 272L, 272R, 279А, 279D, 279F, 279G, 279Н, 343 та 373 Fc-ділянки, де нумерація залишків, тоб279I, 279K, 279L, 279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, то номер їх положення на Fc-ділянці, відповідає 279Т, 279W, 279Y, 280Т, 283F, 283G, 283Н, 283I, індексу Європейського співтовариства за Кеботом 283K, 283L, 283М, 283Р, 283R, 283Т, 283W, 283Y, (дивись Фіг.2 у описі). Цей винахід пропонує варіа285N, 286F, 288N, 288Р, 292Е, 292F, 292G, 292I, нти Fc-ділянки, що містять амінокислотну заміну у 292L, 293S, 293V, 301W, 304Е, 307Е, 307М, 312Р, положеннях 279, 341, 343 або 373 вихідної Fc315F, 315K, 315L, 315Р, 315R, 316F, 316K, 317Р, ділянки або у будь-якій їх комбінації. Вихідна Fc317Т, 318N, 318Р, 318Т, 332F, 332G, 332L, 332М, ділянка факультативно може мати залишки нена332S, 332V, 332W, 339D, 339Е, 339F, 339G, 339Н, тивних амінокислот у інших положеннях, окрім 279, 339I, 339K, 339L, 339М, 339N, 339Q, 339R, 339S, 341, 343 та 373. Залишками нативних амінокислот 339W, 339Y, 341D, 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 7 90682 8 341L, 341М, 341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, Відповідно до варіанта, якому віддається пе341V, 341W, 341Y, 343А, 343D, 343Е, 343F, 343G, ревага, вихідна Fc-ділянка варіанта Fc-ділянки 343Н, 343I, 343K, 343L, 343М, 343N, 343Q, 343R, відповідно до цього винаходу є нативною або ем343S, 343Т, 343V, 343W, 343Y, 373D, 373Е, 373F, бріонально закодованою Fc-ділянкою людського 373G, 373Н, 373I, 373K, 373L, 373М, 373N, 373Q, походження, яка вибрана з групи, яка включає IgG, 373R, 373S, 373Т, 373V, 373W, 375R, 376Е, 376F, IgA, IgE, IgM та IgD або їхній поліморфний варіант 376G, 376Н, 376I, 376L, 376М, 376N, 376Р, 376Q, чи їхній функціональний фрагмент. Відповідно до 376R, 376S, 376Т, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, варіанта, якому віддається перевага, вихідною Fc377Р, 378N, 379N, 379Q, 379S, 379Т, 380D, 380N, ділянкою є Fc-ділянка IgG, а відповідно до варіан380S, 380Т, 382D, 382F, 382Н, 382I, 382K, 382L, та, якому віддається більша перевага, Fc-ділянка 382М, 382N, 382Р, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382V, IgG1, IgG3 або IgG4. Вихідна Fc-ділянка може фа382W, 382Y, 385Е, 385Р, 386K, 423N, 424Н, 424М, культативно містити одну або декілька додаткових 424V, 426D, 426L, 427N, 429А, 429F, 429М, 430А, амінокислотних замін, порівняно з нативною Fc430D, 430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, ділянкою, окрім тих, опис яких наведено у цьому 430N, 430Р, 430Q, 430R, 430S, 430Т, 430V, 430W, описі (тобто тих замін, які наведені у Таблиці 1), 430Y, 431Н, 431K, 431Р, 432R, 432S, 438G, 438K, зокрема, одну або декілька амінокислотних замін, 438L, 438Т, 438W, 439Е, 439Н, 439Q, 440D, 440Е, відомих у цій галузі або тих, які описані у патентах 440F, 440G, 440Н, 440I, 440K, 440L, 440М, 440Q, США №6,165,745 або №6,737,056 чи публікаціях 440Т, 440V або 442K. WO 2004/035752 або WO 2004/029207 (з яких усі у Відповідно до варіанта здійснення, якому відповному обсязі включені до цього опису шляхом дається перевага, варіант Fc-ділянки містить щопосилання); така(-і) амінокислотна(-і) заміна(-и), у найменше 1, 2, 3 або більше амінокислотних заразі присутності на вихідній Fc-ділянці, повинна(-і) мін, які вибрані з числа наведених нижче: 235G, також бути присутньою(-іми) у варіанті Fc-ділянки 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238Е, 238G, відповідно до цього винаходу та у поліпептиді, що 238Н, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247А, містить варіант Fc-ділянки відповідно до цього 247D, 247Е, 247F, 247М, 247N, 247Q, 247R, 247Т, винаходу, якщо тільки вона не знаходилась у по247W, 247Y, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249L, 249M, ложенні, яке у подальшому замінювалось для 249N, 249P, 249Y, 251Н, 251I, 251W, 254D, 254Е, одержання варіанта Fc-ділянки. 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254L, 254М, 254N, Цей винахід пропонує поліпептид, відповідно 254Р, 254Q, 254R, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, до варіанта, якому віддається перевага, монокло256Н, 256I, 256K, 256L, 256W, 257А, 257I, 257М, нальне антитіло, що містить варіант Fc-ділянки 257N, 257S, 258D, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, відповідно до цього винаходу або його функціона267Н, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 271Т, 272Н, льний фрагмент. Відповідно до варіанта здійснен272K, 272R, 279А, 279D, 279G, 279Н, 279N, 279Q, ня, якому віддається перевага, моноклональним 279S, 279Т, 279W, 279Y, 280Т, 283F, 283Н, 283K, антитілом, що містить варіант Fc-ділянки відповід283М, 283R, 283W, 285N, 286F, 288N, 288Р, 292Е, но до цього винаходу, є химерне антитіло. Відпо292G, 292I, 301W, 304Е, 307Е, 307М, 312Р, 315F, відно до варіанта здійснення, якому віддається 315L, 315Р, 316F, 317Р, 317Т, 318N, 318Р, 318Т, більша перевага, моноклональним антитілом, що 332L, 332М, 332R, 332S, 332W, 339D, 339F, 339I, містить варіант Fc-ділянки відповідно до цього 339K, 339М, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, винаходу, є гуманізоване антитіло або людське 341D, 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 341L, 341М, антитіло, послідовність каркасної ділянки і послі341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, довність константної ділянки якого мають по суті 341Y, 343D, 343Е, 343G, 343Н, 343K, 343N, 343Q, людське походження. Згадане химерне, гуманізо343R, 343S, 343Т, 343W, 343Y, 373D, 373Е, 373G, ване або людське антитіло є, відповідно до варіа373Н, 373I, 373K, 373L, 373М, 373Q, 373R, 373S, нта, якому віддається перевага, непроцесованим 373Т, 373W, 375R, 376G, 376N, 376Р, 376Q, 376R, антитілом або одноланцюговим антитілом. У разі, 376S, 376Т, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377Р, якщо моноклональне антитіло, що містить варіант 378D, 378N, 379N, 379Q, 379Т, 380N, 380S, 380Т, Fc-ділянки відповідно до цього винаходу, повинно 382D, 382F, 382I, 382K, 382L, 382Q, 382R, 382S, застосовуватись як терапевтичний засіб для ліку382Т, 382V, 382W, 382Y, 385Е, 386K, 423N, 424Н, вання людей, згадана Fc-ділянка має, відповідно 424М, 424V, 426D, 426L, 427N, 429А, 429F, 429М, до варіанта, якому віддається перевага, по суті 430А, 430D, 430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, людське походження. 430М, 430N, 430Р, 430Q, 430R, 430S, 430Т, 430V, Відповідно до варіанта, якому віддається пе430W, 430Y, 431Н, 431K, 431Р, 432R, 432S, 438K, ревага, поліпептид, що містить варіант Fc-ділянки 438L, 438Т, 438W, 439Е, 440D, 4401 або 440L. або факультативно сполучений із варіантом FcХарактеристики варіантів Fc-ділянки відповідділянки (тобто "варіант поліпептиду"), має щонайно до цього винаходу, відповідно до варіанта, якоменше одну амінокислотну заміну на варіанті Fcму віддається перевага, визначають за допомогою ділянки порівняно з вихідною Fc-ділянкою, і деодного з декількох експериментальних способів, монструє змінену ефекторну функцію або змінений опис яких наводиться. Такі варіанти Fc-ділянки період півжиття у сироватці, порівняно з відповіднадають змінену ефекторну функцію або змінений ною характеристикою поліпептиду, що містить період півжиття у сироватці моноклональному анвихідну Fc-ділянку згаданого варіанта Fc-ділянки, титілу, що містить згаданий варіант Fc-ділянки, де "щонайменше однією амінокислотною заміною або змінений період півжиття у сироватці поліпепна варіанті Fc-ділянки" є (і) будь-яка амінокислотна тиду, до якого згаданий варіант Fc-ділянки є функзаміна у положенні 279, 341, 343 або 373 Fcціонально приєднаним. ділянки чи (іі) щонайменше одна з наведених ниж 9 90682 10 че амінокислотних замін на Fc-ділянці: 235G, 292А, 311А, 311D, 311N, 311T, 311V, 311 Υ, 315L, 235R, 236F, 236R, 236Y, 237K, 237N, 237R, 238Е, 318Ν, 318Р, 318Т, 318V, 332T, 332V, 339D, 339F, 238G, 238Н, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 244L, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 339R, 339S, 245R, 247А, 247D, 247Е, 247F, 247М, 247N, 247Q, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 380N, 380S, 247R, 247S, 247Т, 247W, 247Y, 248F, 248Р, 248Q, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 436I, 440G, 248W, 249L, 249М, 249N, 249Р, 249Y, 251Н, 251I, 440H, 4401 або 440L, [відповідно до варіанта, яко251W, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, му віддається перевага, 247А, 247F, 247М, 247Т, 254L, 254М, 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254V, 254W, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279А, 283М, 288N, 254Y, 255K, 255N, 256Н, 256I, 256K, 256L, 256V, 292А, 311D, 311N, 311Т, 315L, 318N, 318Р, 318Т, 256W, 256Y, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 258D, 318V, 339D, 339I, 339K, 339М, 339N, 339Q, 339R, 260S, 262L, 264S, 265K, 265S, 267Н, 267I, 267K, 339S, 376А, 376V, 377K, 379N, 380N, 382А, 4401 268K, 269N, 269Q, 271Т, 272Н, 272K, 272L, 272R, або 440L], де згадане моноклональне антитіло, що 279А, 279D, 279F, 279G, 279Н, 279I, 279K, 279L, містить варіант Fc-ділянки, демонструє підвищену 279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279Т, 279W, 279Y, ADCC, порівняно з моноклональним антитілом, що 280Т, 283F, 283G, 283Н, 283I, 283K, 283L, 283М, містить вихідну Fc-ділянку. 283Р, 283R, 283Т, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, Цей винахід пропонує моноклональне антиті288Р, 292Е, 292F, 292G, 292I, 292L, 293S, 293V, ло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить що301W, 304Е, 307Е, 307М, 312Р, 315F, 315K, 315L, найменше одну з наведених нижче амінокислот315Р, 315R, 316F, 316K, 317Р, 317Т, 318N, 318Р, них замін на Fc-ділянці: 235Q, 235R, 235S, 236F, 318Т, 332F, 332G, 332L, 332М, 332S, 332V, 332W, 236R, 236Y, 237Е, 237K, 237N, 237R, 238Е, 238G, 339D, 339Е, 339F, 339G, 339Н, 339I, 339K, 339L, 238Н, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 339М, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339W, 339Y, 341D, 249L, 249Р, 250K, 250М, 250R, 251Н, 251I, 251W, 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, 252Y, 254L, 254Р, 254Q, 254Т, 254V, 256V, 257А, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 343А, 343D, 343Е, 343F, 343G, 343Н, 343I, 343K, 265Н, 265K, 265S, 267G, 267Н, 267I, 267K, 269N, 343L, 343М, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343Т, 343V, 269Q, 270А, 270G, 270K, 270М, 270N, 271Т, 272Н, 343W, 343Y, 373D, 373Е, 373F, 373G, 373Н, 373I, 272K, 272L, 272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 373K, 373L, 373М, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373Т, 279W, 283D, 283F, 283G, 283Н, 283L, 283W, 283Y, 373V, 373W, 375R, 376Е, 376F, 376G, 376Н, 376I, 285N, 288Р, 292Е, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 376L, 376М, 376N, 376Р, 376Q, 376R, 376S, 376Т, 301W, 304Е, 307А, 307Е, 307М, 311F, 311I, 311K, 376V, 376W, 376Y, 377G, 377K, 377Р, 378N, 379N, 311S, 312Р, 314F, 314I, 314V, 314W, 315F, 315Р, 379Q, 379S, 379Т, 380D, 380N, 380S, 380Т, 382D, 316F, 317Р, 327Т, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 382F, 382Н, 382I, 382K, 382L, 382М, 382N, 382Р, 332R, 332W, 341D, 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382V, 382W, 382Y, 385Е, 341L, 341М, 341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 385Р, 386K, 423N, 424Н, 424М, 424V, 426D, 426L, 341W, 341Y, 343А, 343D, 343Е, 343F, 343G, 343Н, 427N, 429А, 429F, 429М, 430А, 430D, 430F, 430G, 343L, 343M, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343T, 343V, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, 430Р, 430Q, 343W, 343Y, 373A, 373D, 373E, 373F, 373G, 373I, 430R, 430S, 430Т, 430V, 430W, 430Y, 431Н, 431K, 373K, 373L, 373M, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373T, 431P, 432R, 432S, 438G, 438K, 438L, 438Т, 438W, 373V, 373W, 375R, 376A, 376E, 376F, 376G, 376H, 439Е, 439Н, 439Q, 440D, 440Е, 440F, 440G, 440Н, 376W, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 430H, 430K, 430N, 440I, 440K, 440L, 440М, 440Q, 440Т, 440V чи 442K, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434I, 440D, 440T, або (ііі) щонайменше дві амінокислотні заміни, 440V або 442K, [відповідно до варіанта, якому віднаведені у представлених вище (і) або (іі), чи (iv) дається перевага, 235R, 236F, 236Y, 237Е, 237K, щонайменше 1, 2 або 3 амінокислотні заміни, на237N, 237R, 238Е, 238G, 238Н, 238I, 238L, 238V, ведені у представлених вище (і) або (іі) на додаток 238W, 238Y, 247R, 250K, 251Н, 254Т, 257I, 257М, до щонайменше однієї амінокислотної заміни на 257N, 257S, 257V, 265Н, 265K, 265S, 267G, 267Н, Fc-ділянці, не наведеної у представлених вище (і) 267I, 267K, 269N, 269Q, 270А, 270G, 270K, 270М, або (іі). Відповідно до варіанта, якому віддається 270N, 271T, 272N, 272R, 288Р, 292Е, 301W, 304Е, перевага, зміненою ефекторною функцією є поси316F, 317Р, 327Т, 328V, 329Y, 332K, 332R, 341F, лення ADCC, послаблення ADCC, посилення CDC, 341I, 341М, 341Р, 341Q, 341R, 341Т, 341W, 341Y, послаблення CDC, підвищення спорідненості до 343W, 373А, 373Е, 373G, 373S, 376А, 376W, 432R зв'язування C1q, зменшення спорідненості до зв'яабо 432S], де згадане моноклональне антитіло, що зування C1q, підвищення спорідненості до зв'язумістить варіант Fc-ділянки, демонструє знижену вання FcR (відповідно до варіанта, якому віддаADCC активність, порівняно з моноклональним ється перевага, FcRn) або зменшення антитілом, що містить вихідну Fc-ділянку. спорідненості до зв'язування FcR (відповідно до Цей винахід пропонує моноклональне антитіваріанта, якому віддається перевага, FcRn), порівло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить щоняно зі згаданим поліпептидом, який не має амінонайменше одну з наведених нижче амінокислоткислотної заміни на Fc-ділянці (тобто на вихідній них замін на Fc-ділянці: 238L, 244L, 245R, 249Р, Fc-ділянці). 252Y, 256Р, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, Цей винахід пропонує моноклональне антиті258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279А, 279D, ло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить що279G, 279Н, 279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279Т, найменше одну з наведених нижче амінокислот279W, 279Y, 283А, 283D, 283F, 283G, 283Н, 283I, них замін на Fc-ділянці: 247А, 247F, 247М, 247Т, 283K, 283L, 283N, 283Р, 283Q, 283R, 283S, 283Т, 247V, 247Y, 249Е, 249Y, 254F, 254М, 254Y, 256А, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288Р, 293V, 307E, 258D, 279А, 283А, 283I, 283K, 283М, 283R, 288N, 307М, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 11 90682 12 312Р, 316K, 317Р, 318N, 318Т, 332F, 332Н, 332K, Цей винахід пропонує моноклональне антиті332L, 332М, 332R, 332S, 332W, 339N, 339Т, 339W, ло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить що341Р, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, 343R, 343Т, 343Y, найменше одну з наведених нижче амінокислот375R, 376G, 376I, 376М, 376Р, 376Т, 376V, 377K, них замін на Fc-ділянці: 236Y, 244L, 247А, 247D, 378D, 378N, 380N, 380S, 380Т, 382F, 382Н, 382I, 247Е, 247G, 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 248F, 382K, 382L, 382М, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 248Р, 248Q, 248W, 249Е, 249L, 249М, 249N, 249Р, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430А, 430F, 430G, 249Y, 251F, 251Н, 251I, 251W, 254А, 254F, 254K, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, 430Q, 430R, 254L, 254М, 254R, 254Y, 255K, 256A, 256G, 256I, 430S, 430Т, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 434F, 434G, 256L, 256M, 256P, 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 434Н, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436Т, 438K, 438L, 279Q, 279S, 279W, 279Y, 280K, 280T, 283F, 283G, 438Т, 438W, 440K або 442K, [відповідно до варіан283Н, 283I, 283K, 283L, 283М, 283N, 283Р, 283R, та, якому віддається перевага, 245R, 252Y, 256Р, 283S, 283W, 292L, 307А, 307М, 311F, 311I, 311K, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 311L, 311M, 311T, 311V, 311W, 311Y, 312Р, 314F, 262L, 279А, 279D, 279G, 279Н, 279N, 279Q, 279S, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315F, 315K, 315L, 315Р, 279Т, 279W, 279Y, 283F, 283Н, 283K, 283R, 285N, 315R, 316K, 317Р, 317Т, 318N, 318Т, 332А, 332D, 286F, 307Е, 307М, 311I, 311K, 311L, 311M, 312Р, 332Е, 332F, 332G, 332L, 332М, 332Q, 332S, 332Т, 318N, 318Т, 332S, 339W, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, 332V, 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339Н, 339I, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380Т, 382F, 339K, 339N, 339Q, 339R, 339S, 339Т, 339W, 339Y, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382V, 382W, 382Y, 341D, 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 341L, 341М, 423N, 427N, 430А, 430F, 430Н, 430I, 430L, 430М, 341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 341Y, 343А, 343D, 343Е, 343G, 343Н, 343K, 343L, 434F, 434G, 434H, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 343М, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343Т, 343W, 343Y, 438L або 438W], де згадане моноклональне анти373D, 373Е, 373F, 373Н, 373I, 373K, 373L, 373М, тіло, що містить варіант Fc-ділянки, демонструє 373N, 373Q, 373R, 373Т, 373V, 373W, 375R, 376А, підвищену спорідненість до зв'язування FcRn, по376F, 376G, 376Н, 376L, 376N, 376Р, 376Q, 376R, рівняно з моноклональним антитілом, що містить 376S, 376Т, 376V, 377Р, 379N, 379Q, 379S, 379Т, вихідну Fc-ділянку. 380А, 380N, 380S, 380Т, 382I, 382L, 382Q, 382V, Цей винахід пропонує моноклональне антиті386K, 426D, 426L, 429А, 429F, 429М, 430А, 430D, ло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить що430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, найменше одну з наведених нижче амінокислот430Р, 430R, 430S, 430Т, 430V, 430W, 430Y, 431Н, них замін на Fc-ділянці: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 431P, 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q 238Е, 238G, 238Н, 238W, 247А, 247D, 247Е, 247F, або 440Y, [відповідно до варіанта, якому віддаєть247G, 247Н, 247I, 247L, 247М, 247N, 247Q, 247R, ся перевага, 236Y, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249Е, 247S, 247W, 247Y, 248А, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249L, 249М, 249N, 249Y, 251Н, 251I, 251W, 254F, 249Е, 249L, 249М, 249Y, 251F, 251Н, 251I, 251W, 254K, 254L, 254М, 254R, 254Y, 255K, 256А, 256G, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254L, 256I, 256L, 256М, 256Р, 256Q, 256W, 260S, 280K, 254М, 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254Т, 254V, 254W, 283W, 307М, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311Т, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, 256I, 256K, 256М, 311V, 311W, 311Y, 314I, 314V, 314W, 314Y, 315Р, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 317Р, 332D, 332L, 332М, 332S, 332W, 339D, 339F, 268D, 268K, 270А, 270М, 279I, 279K, 279L, 280Т, 339I, 339K, 339N, 339S, 339W, 339Y, 341D, 341Е, 292Е, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 341F, 341Н, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, 341Р, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315Р, 316F, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, 343D, 317Т, 326W, 327Т, 339Е, 339G, 339L, 339R, 341D, 343Е, 343G, 343Н, 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 341Е, 341F, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, 341Q, 343Т, 343W, 343Y, 373Е, 373F, 373Н, 373I, 373K, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, 343М, 343V, 373L, 373Q, 373R, 373Т, 373W, 376А, 376G, 376N, 343W, 373A, 373D, 373G, 373K, 373L, 373M, 373N, 376Р, 376Q, 376R, 376S, 376Т, 376V, 377Р, 379N, 373Q, 373S, 373T, 373V, 373W, 376H, 376L, 376W, 379Q, 379Т, 382I, 382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 376Y, 424M, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 429М, 430А, 430D, 430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430W, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440A, 440D, 440E, 430L, 430М, 430N, 430Р, 430R, 430S, 430Т, 430V, 440F або 440М, [відповідно до варіанта, якому 430W, 430Y, 431Н, 431Р, 434Y, 438L або 440Y], де віддається перевага, 237R, 247D, 247Е, 247F, згадане моноклональне антитіло, що містить варі247Н, 247I, 247L, 247М, 247N, 247Q, 247W, 247Y, ант Fc-ділянки, демонструє підвищену CDC актив248А, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249L, 249М, 249Y, ність, порівняно з моноклональним антитілом, що 251Н, 251I, 251W, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, містить вихідну Fc-ділянку. 254I, 254K, 254М, 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254Т, Цей винахід пропонує моноклональне антиті254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, 256K, ло, що містить варіант Fc-ділянки, що містить що256М, 256R, 256W, 265Y, 280Т, 292G, 292I, 311D, найменше одну з наведених нижче амінокислот311Е, 311G, 311N, 315F, 315Р, 316Т, 317Т, 327Т, них замін на Fc-ділянці: 235G, 235S, 236R, 237Е, 341D, 341Е, 341F, 341I, 341L, 341Y, 343W, 373А, 237K, 237N, 237R, 238А, 238Е, 238G, 238Н, 238I, 373G, 373М, 373Q, 376W, 376Y, 424М, 424V, 430D, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247Н, 247I, 247L, 430W, 431Р або 432S], де згадане моноклональне 247Т, 247Y, 250M, 252Y, 254D, 254E, 254I, 254P, антитіло, що містить варіант Fc-ділянки, демон254Q, 254T, 254V, 255N, 257A, 257I, 257M, 257N, струє зменшену спорідненість до зв'язування 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, 265Y, 267G, 267H, FcRn, порівняно з моноклональним антитілом, що 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270M, 270N, містить вихідну Fc-ділянку. 271T, 272H, 272L, 272N, 292A, 293S, 301W, 307E, 311E, 311S, 316F, 318P, 327T, 328V, 329Y, 330K, 13 90682 14 330R, 332E, 332M, 343I, 373S, 378D, 380D, 382D, на Fc-ділянці: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 238Е, 382F, 382N, 382P, 382R, 382S, 382W, 382Y, 385E, 238G, 238Н, 238W, 247А, 247D, 247Е, 247F, 247G, 385P, 423N, 424H, 424M або 427N [відповідно до 247Н, 247I, 247L, 247М, 247N, 247Q, 247R, 247S, варіанта, якому віддається перевага, 235G, 235S, 247W, 247Y, 248А, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249Е, 236R, 237Е, 237K, 237N, 237R, 238А, 238Е, 238G, 249L, 249М, 249Y, 251F, 251Н, 251I, 251W, 254D, 238Н, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, 247I, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254L, 254М, 247L, 247Т, 250М, 257А, 257I, 257М, 262L, 264S, 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254Т, 254V, 254W, 254Y, 267G, 267Н, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, 270G, 255K, 255N, 256F, 256Н, 256I, 256K, 256М, 256R, 270М, 270N, 271Т, 272Н, 301W, 311S, 327Т, 329Y, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, 267G, 267I, 268D, 330K, 378D, 385Е, 423N або 424Н], де згадане мо268K, 270А, 270М, 279I, 279K, 279L, 280Т, 292Е, ноклональне антитіло, що містить варіант Fc292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311E, 311F, 311G, ділянки, демонструє знижену CDC активність, по311N 311R, 311Y, 315F, 315K, 315Р, 316F, 317Т, рівняно з моноклональним антитілом, що містить 326W, 327Т, 339Е, 339G, 339L, 339R, 341D, 341Е, вихідну Fc-ділянку. 341F, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, 341Q, 341R, Цей винахід додатково пропонує моноклона341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, 343М, 343V, 343W, льне антитіло, що містить варіант Fc-ділянки від373А, 373D, 373G, 373K, 373L, 373М, 373N, 373Q, повідно до цього винаходу, де згадане антитіло 373S, 373Т, 373V, 373W, 376Н, 376L, 376W, 376Y, специфічно зв'язує людський антиген-мішень. Від424М, 424V, 426D, 429А, 429F, 429М, 430D, 430W, повідно до варіанта, якому віддається перевага, 431P, 432R, 432S, 439Q, 440D, 440Е, 440F або антиген-мішень вибраний з групи, яка включає 440М [відповідно до варіанта, якому віддається перевага, 237R, 247D, 247Е, 247F, 247Н, 247L, CD3, CD20, CD25, TNF , Her2/neu, CD33, CD52, 247М, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248А, 248F, 248Р, EGFR, EpCAM, MUC1, GD3, СЕА, СА125, HLA-DR, 248Q, 248W, 249L, 249М, 249Y, 251Н, 251I, 251W, TGFp, VEGF, GDF8, GDF11, грелін або будь-який 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254М, їхній попередник або функціональний фрагмент. 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254Т, 254V, 254W, 254Y, Цей винахід пропонує варіант поліпептиду, що 255K, 255N, 256F, 256Н, 256K, 256М, 256R, 256W, містить варіант Fc-ділянки, що містить щонаймен265Y, 280Т, 292G, 292I, 311D, 311Е, 311G, 311N, ше одну з наведених нижче амінокислотних замін 315F, 315Р, 316Т, 317Т, 327Т, 341D, 341Е, 341F, на Fc-ділянці: 238L, 244L, 245R, 249Р, 252Y, 256Р, 341I, 341L, 341Y, 343W, 373А, 373G, 373М, 373Q, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 376W, 376Y, 424М, 424V, 430D, 430W, 431Р або 262L, 270K, 272L, 272R, 279А, 279D, 279G, 279Н, 432S], де згаданий варіант поліпептиду демон279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279Т, 279W, 279Y, струє зменшений період півжиття у сироватці, по283А, 283D, 283F, 283G, 283Н, 283I, 283K, 283L, рівняно з вихідним поліпептидом (тобто поліпеп283N, 283Р, 283Q, 283R, 283S, 283Т, 283W, 283Y, тидом, ідентичним зі згаданим варіантом 285N, 286F, 288N, 288Р, 293V, 307E, 307М, 311A, поліпептиду, який, однак, не має згаданої вище 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 312Р, 316K, амінокислотної заміни). 317Р, 318N, 318Т, 332F, 332Н, 332K, 332L, 332М, Відповідно до одного з варіантів здійснення, 332R, 332S, 332W, 339N, 339Т, 339W, 341Р, 343Е, цей винахід пропонує спосіб підвищення ADCC 343Н, 343K, 343Q, 343R, 343Т, 343Y, 375R, 376G, активності моноклонального антитіла, відповідно 376I, 376М, 376Р, 376Т, 376V, 377K, 378D, 378N, до варіанта, якому віддається перевага, терапев380N, 380S, 380Т, 382F, 382Н, 382I, 382K, 382L, тичного моноклонального антитіла (або його фун382М, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382V, 382W, кціонального фрагмента), що включає конструю382Y, 423N, 427N, 430А, 430F, 430G, 430Н, 430I, вання нуклеїнової кислоти, яка являє собою 430K, 430L, 430М, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430Т, нуклеїнову кислоту, що кодує варіант Fc-ділянки, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 434F, 434G, 434Н, 434W, який містить щонайменше одну з наведених нижче 434Y, 436I, 436L, 436Т, 438K, 438L, 438Т, 438W, амінокислотних замін: 247А, 247F, 247Н, 247I, 440K або 442K, [відповідно до варіанта, якому від247L, 247М, 247Т, 247V, 247Y, 249Е, 249Y, 251F, дається перевага, 245R, 252Y, 256Р, 257А, 257I, 254F, 254М, 254Y, 256А, 256М, 258D, 268D, 268Е, 257М, 257N, 257S, 257V, 258D, 260S, 262L, 279А, 279А, 280А, 280K, 283А, 283I, 283K, 283М, 283R, 279D, 279G, 279Н, 279N, 279Q, 279S, 279Т, 279W, 288N, 292А, 311Α, 311D, 311Ν, 311Т, 311V, 311Y, 279Y, 283F, 283Н, 283K, 283R, 285N, 286F, 307Е, 315L, 318N, 318Р, 318Т, 318V, 330K, 332T, 332V, 307М, 311I, 311K, 311L, 311M, 312Р, 318N, 318Т, 339D, 339F, 339G, 339I, 339K, 339M, 339N, 339Q, 332S, 339W, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, 343R, 375R, 339R, 339S, 339T, 376A, 376V, 377G, 377K, 379N, 377K, 378D, 378N, 380S, 380Т, 382F, 382K, 382Q, 380N, 380S, 382A, 382I, 385E, 427N, 429M, 434W, 382R, 382S, 382Т, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 436I, 440G, 440H, 4401 або 440L [відповідно до 430А, 430F, 430Н, 430I, 430L, 430М, 430N, 430Q, варіанта, якому віддається перевага, 247А, 247F, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 434F, 434G, 247М, 247Т, 247V, 247Y, 254F, 254Y, 258D, 279А, 434Н, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, 438L або 283М, 288N, 292А, 311D, 311N, 311Т, 315L, 318N, 438W], де згаданий варіант поліпептиду демон318Р, 318Т, 318V, 339D, 339I, 339K, 339М, 339N, струє збільшений період півжиття у сироватці, по339Q, 339R, 339S, 376А, 376V, 377K, 379N, 380N, рівняно з вихідним поліпептидом (тобто поліпеп382А, 4401 або 440L]. Молекула нуклеїнової кистидом, ідентичним зі згаданим варіантом лоти, що кодує варіант Fc-ділянки, може конструполіпептиду, який, однак, не має згаданої вище юватись (наприклад, із молекули нуклеїнової кисамінокислотної заміни). лоти, що кодує вихідну Fc-ділянку або нативну FcЦей винахід пропонує варіант поліпептиду, що ділянку) таким чином, щоб включати щонайменше містить варіант Fc-ділянки, що містить щонайменодну амінокислотну заміну, як наведено вище, тоді ше одну з наведених нижче амінокислотних замін 15 90682 16 як згадана молекула нуклеїнової кислоти функціому віддається перевага, 235R, 236F, 236R, 236Y, нально зв'язана з додатковою нуклеїновою кисло237Е, 237K, 237N, 237R, 238Е, 238G, 238Н, 238I, тою, що кодує антитіло (наприклад, нуклеїновоки238L, 238V, 238W, 238Y, 247R, 249P, 250K, 251Н, слотною послідовністю, що кодує залишкову 254Т, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 265Н, 265K, частину важкого ланцюга імуноглобуліну), або зга265S, 267G, 267Н, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270А, даний спосіб може додатково включати подальше 270G, 270K, 270М, 270N, 271Т, 272R, 288Р, 292Е, функціональне зв'язування нуклеїнової кислоти, 301W, 304Е, 316F, 317Р, 327Т, 329Y, 332K, 332R, що кодує варіант Fc-ділянки (тобто після введення 341F, 341I, 341М, 341Р, 341Q, 341R, 341Т, 341W, щонайменше однієї амінокислотної заміни, вказа341Y, 343W, 373А, 373Е, 373G, 373S, 376W, 429А, ної вище), з додатковою нуклеїновою кислотою, 432R або 432S]. Молекула нуклеїнової кислоти, що що кодує антитіло. Згаданий спосіб може додаткокодує варіант Fc-ділянки, може конструюватись во включати експресію і очищення моноклональ(наприклад, із молекули нуклеїнової кислоти, що ного антитіла, що містить варіант Fc-ділянки. Згакодує вихідну Fc-ділянку або нативну Fc-ділянку) даний спосіб може додатково включати експресію і таким чином, щоб включати щонайменше одну очищення моноклонального антитіла, що містить амінокислотну заміну, як наведено вище, тоді як вихідну Fc-ділянку. Згаданий спосіб може додатзгадана молекула нуклеїнової кислоти функціонаково включати визначення ADCC активності згально зв'язана з додатковою нуклеїновою кислоданого моноклонального антитіла, що містить ватою, що кодує антитіло (наприклад, нуклеїновокиріант Fc-ділянки, і згаданого моноклонального слотною послідовністю, що кодує залишкову антитіла, що містить вихідну Fc-ділянку, за допочастину важкого ланцюга імуноглобуліну), або згамогою будь-якого способу, доступного у цій галузі даний спосіб може додатково включати подальше або опис якого наводиться у цьому описі. Згаданий функціональне зв'язування нуклеїнової кислоти, спосіб може додатково включати вибирання монощо кодує варіант Fc-ділянки (тобто після введення клонального антитіла, що містить варіант Fcщонайменше однієї амінокислотної заміни, вказаділянки, з ADCC активністю, яка перевищує відпоної вище), з додатковою нуклеїновою кислотою, відну активність згаданого моноклонального антищо кодує антитіло. Згаданий спосіб може додаткотіла, що містить вихідну Fc-ділянку (тобто підвиво включати експресію і очищення моноклональщену, відповідно до варіанта, якому віддається ного антитіла, що містить варіант Fc-ділянки. Згаперевага, щонайменше на 5%, 10%, 12%, 14%, даний спосіб може додатково включати експресію і 16%, 18%, 20% або більше). Цей винахід додаткоочищення моноклонального антитіла, що містить во пропонує моноклональне антитіло або його вихідну Fc-ділянку. Згаданий спосіб може додатфункціональний фрагмент, що містить варіант Fcково включати визначення ADCC активності згаділянки, який одержують за цим способом. даного моноклонального антитіла, що містить ваВідповідно до одного з варіантів здійснення, ріант Fc-ділянки, і згаданого моноклонального цей винахід пропонує спосіб зниження ADCC актиантитіла, що містить вихідну Fc-ділянку, за доповності моноклонального антитіла, відповідно до могою будь-якого способу, доступного у цій галузі варіанта, якому віддається перевага, терапевтичабо опис якого наводиться у цьому описі докуменного моноклонального антитіла (або його функціоті. Згаданий спосіб може додатково включати винального фрагмента), що включає конструювання бирання моноклонального антитіла, що містить нуклеїнової кислоти, яка являє собою нуклеїнову варіант Fc-ділянки, з ADCC активністю, меншою за кислоту, що кодує варіант Fc-ділянки, який містить відповідну активність згаданого моноклонального щонайменше одну з наведених нижче амінокислоантитіла, що містить вихідну Fc-ділянку (тобто тних замін: 235Q, 235R, 235S, 236F, 236R, 236Y, зменшену, відповідно до варіанта, якому віддаєть237Е, 237K, 237N, 237R, 238Е, 238G, 238Н, 238I, ся перевага, щонайменше на 5%, 10%, 12%, 14%, 238L, 238V, 238W, 238Y, 247G, 247R, 249L, 249Р, 16%, 18%, 20% або більше). Цей винахід додатко250K, 250М, 250R, 251Н, 251I, 251W, 252Y, 254L, во пропонує моноклональне антитіло або його 254Р, S254Q, 254Т, 254V, 256V, 257А, 257I, 257М, функціональний фрагмент, що містить варіант Fc257N, 257S, 257V, 260S, 262L, 264S, 265Н, 265K, ділянки, який одержують за цим способом. 265S, 267G, S267H, 267I, 267K, 269N, 269Q, 270А, Відповідно до одного з варіантів здійснення, 270G, 270K, 270М, 270N, 271T, 272Н, 272K, 272L, цей винахід пропонує спосіб підвищення спорідне272N, 272R, 279D, 279F, 279K, 279L, 279W, 283D, ності до зв'язування FcRn моноклонального анти283F, 283G, 283Н, 283L, 283Т, 283W, 283Y, 285N, тіла, відповідно до варіанта, якому віддається пе288Р, 292Е, 292F, 292G, 292I, 293S, 293V, 301W, ревага, терапевтичного моноклонального антитіла 304Е, 307А, 307Е, 307М, 311F, 311I, 311K, 311S, (або його функціонального фрагмента), що вклю312Р, 314F, 314I, 314V, 314W, 315F, 315Р, 316F, чає конструювання нуклеїнової кислоти, яка являє 317Р, 327Т, 328V, 329Y, 332G, 332K, 332L, 332R, собою нуклеїнову кислоту, що кодує варіант Fc332W, 341D, 341Е, 341F, 341H, 341I, 341K, 341L, ділянки, який містить щонайменше одну з наведе341М, 341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341W, них нижче амінокислотних замін: 238L, 244L, 245R, 341Y, 343А, 343D, 343Е, 343F, 343G, 343Н, 343L, 249Р, 252Y, 256Р, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 343М, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343Т, 343V, 343W, 257V, 258D, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279А, 343Y, 373А, 373D, 373Е, 373F, 373G, 373I, 373K, 279D, 279G, 279Н, 279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, 373L, 373М, 373N, 373Q, 373R, 373S, 373Т, 373V, 279Т, 279W, 279Y, 283А, 283D, 283F, 283G, 283Н, 373W, 375R, 376А, 376Е, 376F, 376G, 376Н, 376W, 283I, 283K, 283L, 283N, 283Р, 283Q, 283R, 283S, 376Y, 379Q, 382D, 382S, 429А, 429F, 430Н, 430K, 283Т, 283W, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288Р, 293V, 430N, 430Q, 430R, 430W, 432R, 432S, 434I, 440D, 307А, 307Е, 307М, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 440Т, 440V або 442K [відповідно до варіанта, яко311V, 311W, 312Р, 316K, 317Р, 318N, 318Т, 332F, 17 90682 18 332Н, 332K, 332L, 332М, 332R, 332S, 332W, 339N, певтичного поліпептиду, що включає конструю339Т, 339W, 341Р, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, 343R, вання нуклеїнової кислоти, яка являє собою нукле343Т, 343Y, 375R, 376G, 376I, 376М, 376Р, 376Т, їнову кислоту, що кодує варіант Fc-ділянки, який 376V, 377K, 378D, 378N, 380N, 380S, 380Т, 382F, містить щонайменше одну з наведених нижче амі382Н, 382I, 382K, 382L, 382М, 382N, 382Q, 382R, нокислотних замін: 238L, 244L, 245R, 249Р, 252Y, 382S, 382Т, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430А, 256Р, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 258D, 430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, 260S, 262L, 270K, 272L, 272R, 279А, 279D, 279G, 430Q, 430R, 430S, 430Т, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 279Н, 279М, 279N, 279Q, 279R, 279S, 279Т, 279W, 434F, 434G, 434Н, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436Т, 279Y, 283А, 283D, 283F, 283G, 283Н, 283I, 283K, 438K, 438L, 438Т, 438W, 440K або 442K [відповід283L, 283N, 283Р, 283Q, 283R, 283S, 283Т, 283W, но до варіанта, якому віддається перевага, 245R, 283Y, 285N, 286F, 288N, 288Р, 293V, 307А, 307Е, 252Y, 256Р, 257А, 257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 307М, 311A, 311I, 311K, 311L, 311M, 311V, 311W, 258D, 262L, 279А, 279D, 279G, 279Н, 279N, 279Q, 312Р, 316K, 317Р, 318N, 318Т, 332F, 332Н, 332K, 279S, 279Т, 279W, 279Y, 283F, 283Н, 283K, 283R, 332L, 332М, 332R, 332S, 332W, 339N, 339Т, 339W, 285N, 286F, 307А, 307Е, 307М, 311I, 311K, 311L, 341Р, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, 343R, 343Т, 343Y, 311M, 312Р, 318N, 318Т, 332S, 339W, 343Е, 343Н, 375R, 376G, 376I, 376М, 376Р, 376Т, 376V, 377K, 343K, 343Q, 343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 378D, 378N, 380N, 380S, 380Т, 382F, 382Н, 382I, 380Т, 382F, 382K, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382V, 382K, 382L, 382М, 382N, 382Q, 382R, 382S, 382Т, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430А, 430F, 430Н, 430I, 382V, 382W, 382Y, 423N, 427N, 430А, 430F, 430G, 430L, 430М, 430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, 430Q, 430R, 431Н, 431K, 434F, 434G, 434Н, 434W, 434Y, 436I, 430S, 430Т, 430V, 430Y, 431Н, 431K, 434F, 434G, 436L, 438K, 438L або 438W]. Молекула нуклеїнової 434Н, 434W, 434Y, 436I, 436L, 436Т, 438K, 438L, кислоти, що кодує варіант Fc-ділянки, може конс438Т, 438W, 440K або 442K, [відповідно до варіантруюватись (наприклад, з молекули нуклеїнової та, якому віддається перевага, 245R, 252Y, 256Р, кислоти, що кодує вихідну Fc-ділянку або нативну 257A, 257I, 257M, 257N, 257S, 257V, 258D, 262L, Fc-ділянку) таким чином, щоб включати щонайме279A, 279D, 279G, 279Н, 279N, 279Q, 279S, 279T, нше одну амінокислотну заміну, як наведено вище, 279W, 279Y, 283F, 283Н, 283K, 283R, 285N, 286F, тоді як згадана молекула нуклеїнової кислоти фун307А, 307Е, 307М, 311I, 311K, 311L, 311M, 312Р, кціонально зв'язана з додатковою нуклеїновою 318N, 318Т, 332S, 339W, 343Е, 343Н, 343K, 343Q, кислотою, що кодує антитіло (наприклад, нуклеї343R, 375R, 377K, 378D, 378N, 380S, 380Т, 382F, новокислотною послідовністю, що кодує залишко382K, 382Q, З 82R, 382S, 382Т, 382V, 382W, 382Y, ву частину важкого ланцюга імуноглобуліну), або 423N, 427N, 430А, 430F, 430Н, 430I, 430L, 430М, згаданий спосіб може додатково включати пода430N, 430Q, 430R, 430S, 430V, 430Y, 431Н, 431K, льше функціональне зв'язування нуклеїнової кис434F, 434G, 434Н, 434W, 434Y, 436I, 436L, 438K, лоти, що кодує варіант Fc-ділянки (тобто після 438L або 438W]. Молекула нуклеїнової кислоти, введення щонайменше однієї амінокислотної защо кодує варіант Fc-ділянки, може функціонально міни, вказаної вище), з додатковою нуклеїновою зв'язуватись із молекулою нуклеїнової кислоти, що кислотою, що кодує антитіло. Згаданий спосіб мокодує терапевтичний білок. Молекула нуклеїнової же додатково включати експресію і очищення мокислоти, що кодує варіант Fc-ділянки, може консноклонального антитіла, що містить варіант Fcтруюватись (наприклад, з молекули нуклеїнової ділянки. Згаданий спосіб може додатково включакислоти, що кодує вихідну Fc-ділянку або нативну ти експресію і очищення моноклонального антитіFc-ділянку) таким чином, щоб включати щонаймела, що містить вихідну Fc-ділянку. Згаданий спосіб нше одну амінокислотну заміну, як наведено вище, може додатково включати визначення спорідненотоді як згадана молекула нуклеїнової кислоти фунсті до зв'язування FcRn згаданого моноклональнокціонально зв'язана з додатковою нуклеїновою го антитіла, що містить варіант Fc-ділянки, і згадакислотою, що кодує поліпептид (наприклад, нукленого моноклонального антитіла, що містить їновокислотною послідовністю, що кодує Fc-Fcвихідну Fc-ділянку, за допомогою будь-якого споділянку гібридного білка), або згаданий спосіб мособу, доступного у цій галузі або опис якого навоже додатково включати подальше функціональне диться у цьому документі. Згаданий спосіб може зв'язування нуклеїнової кислоти, що кодує варіант додатково включати вибирання моноклонального Fc-ділянки, після введення щонайменше однієї антитіла, що містить варіант Fc-ділянки, зі спорідамінокислотної заміни, вказаної вище, з нуклеїноненістю до зв'язування FcRn, яка перевищує відвою кислотою, що кодує не-Fc гібридного партнеповідну спорідненість до зв'язування FcRn згадара. Згаданий спосіб може додатково включати ного моноклонального антитіла, що містить експресію і очищення поліпептиду, що містить вавихідну Fc-ділянку (тобто підвищену, відповідно до ріант Fc-ділянки. Згаданий спосіб може додатково варіанта, якому віддається перевага, щонайменше включати експресію і очищення поліпептиду, що на 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% або більмістить вихідну Fc-ділянку. Згаданий спосіб може ше). Цей винахід додатково пропонує моноклонадодатково включати визначення in vivo періоду льне антитіло або його функціональний фрагмент, півжиття у сироватці згаданого поліпептиду, що що містить варіант Fc-ділянки, який одержують за містить варіант Fc-ділянки, і згаданого поліпептицим способом. ду, що містить вихідну Fc-ділянку, за допомогою Відповідно до одного з варіантів здійснення, будь-якого способу, доступного у цій галузі або цей винахід пропонує спосіб збільшення in vivo опис якого наводиться у цьому описі. Згаданий періоду півжиття у сироватці поліпептиду, відповіспосіб може додатково включати вибирання полідно до варіанта, якому віддається перевага, терапептиду, що містить варіант Fc-ділянки, де згада 19 90682 20 ний поліпептид має збільшений in vivo період півчати експресію і очищення моноклонального антижиття у сироватці, порівняно з in vivo періодом тіла, що містить варіант Fc-ділянки. Згаданий спопівжиття у сироватці згаданого поліпептиду, що сіб може додатково включати експресію і очищенмістить вихідну Fc-ділянку (тобто підвищений, відня моноклонального антитіла, що містить вихідну повідно до варіанта, якому віддається перевага, Fc-ділянку. Згаданий спосіб може додатково вклющонайменше на 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, чати визначення спорідненості до зв'язування 20% або більше). Цей винахід додатково пропонує FcRn згаданого моноклонального антитіла, що поліпептид (тобто гібридний поліпептид), що місмістить варіант Fc-ділянки, і згаданого моноклонатить варіант Fc-ділянки, який одержують за цим льного антитіла, що містить вихідну Fc-ділянку, за способом. допомогою будь-якого способу, доступного у цій Відповідно до одного з варіантів здійснення, галузі або опис якого наводиться у цьому докумецей винахід пропонує спосіб зниження спорідненонті. Згаданий спосіб може додатково включати сті до зв'язування FcRn моноклонального антитіла, вибирання моноклонального антитіла, що містить відповідно до варіанта, якому віддається перевага, варіант Fc-ділянки, зі спорідненістю до зв'язування терапевтичного моноклонального антитіла (або FcRn, меншою за відповідну спорідненість до зв'яйого функціонального фрагмента), що включає зування FcRn згаданого моноклонального антитіконструювання нуклеїнової кислоти, що кодує вала, що містить вихідну Fc-ділянку (тобто зменшеріант Fc-ділянки, який містить щонайменше одну з ну, відповідно до варіанта, якому віддається наведених нижче амінокислотних замін: 235Q, перевага, щонайменше на 5%, 10%, 12%, 14%, 236Y, 237K, 237R, 238Е, 238G, 238Н, 238W, 247А, 16%, 18%, 20% або більше). Цей винахід додатко247D, 247Е, 247F, 247G, 247Н, 247I, 247L, 247М, во пропонує моноклональне антитіло (що містить 247N, 247Q, 247R, 247S, 247W, 247Y, 248А, 248F, варіант Fc-ділянки), який одержують за цим спо248Р, 248Q, 248W, 249Е, 249L, 249М, 249Y, 251F, собом. 251Н, 251I, 251W, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, Відповідно до іншого варіанта здійснення, цей 254I, 254K, 254L, 254М, 254N, 254Р, 254Q, 254R, винахід пропонує спосіб зменшення in vivo періоду 254Т, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, півжиття у сироватці поліпептиду, відповідно до 256I, 256K, 256М, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, варіанта, якому віддається перевага, терапевтич265Y, S267G, 267I, 268D, 268K, 270А, 270М, 279I, ного поліпептиду, що включає конструювання нук279K, 279L, 280Т, 292Е, 292F, 292G, 292I, 292L, леїнової кислоти, що кодує варіант Fc-ділянки, 311D, 311Е, 311F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, який містить щонайменше одну з наведених нижче 315K, 315Р, 316F, 317Т, 326W, 327Т, 339Е, 339G, амінокислотних замін: 235Q, 236Y, 237K, 237R, 339L, 339R, 341D, 341Е, 341F, 341I, 341K, 341L, 238Е, 238G, 238Н, 238W, 247А, 247D, 247Е, 247F, 341М, 341N, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 247G, 247Н, 247I, 247L, 247М, 247N, 247Q, 247R, 341Y, 343М, 343V, 343W, 373А, 373D, 373G, 373K, 247S, 247W, 247Y, 248А, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 373L, 373М, 373N, 373Q, 373S, 373Т, 373V, 373W, 249Е, 249L, 249М, 249Y, 251F, 251Н, 251I, 251W, 376Н, 376L, 376W, 376Y, 424М, 424V, 426D, 429А, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254L, 429F, 429М, 430D, 430W, 431Р, 432R, 432S, 434I, 254М, 254N, 254Р, 254Q, 254R, 254Т, 254V, 254W, 439Q, 440А, 440D, 440Е, 440F або 440М [відповід254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, 256I, 256K, 256М, но до варіанта, якому віддається перевага, 237R, 256R, 256W, 256Y, 264S, 265S, 265Y, S267G, 267I, 247D, 247Е, 247F, 247Н, 247L, 247М, 247N, 247Q, 268D, 268K, 270А, 270М, 279I, 279K, 279L, 280Т, 247W, 247Y, 248А, 248F, 248Р, 248Q, 248Q, 249L, 292Е, 292F, 292G, 292I, 292L, 311D, 311Е, 311F, 249М, 249Y, 251Н, 251I, 251W, 254D, 254Е, 254F, 311G, 311N, 311R, 311Y, 315F, 315K, 315Р, 316F, 254G, 254Н, 254I, 254K, 254М, 254N, 254Р, 254R, 317Т, 326W, 327Т, 339Е, 339G, 339L, 339R, 341D, 254Т, 254V, 254W, 254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, 341Е, 341F, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, 341Q, 256K, 256М, 256R, 256W, 265Y, 280Т, 292G, 292I, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, 343М, 343V, 311D, 311Е, 311G, 311N, 315F, 315Р, 316Т, 317Т, 343W, 373А, 373D, 373G, 373K, 373L, 373М, 373N, 327Т, 341D, 341Е, 341F, 341L, 341Y, 343W, 373А, 373Q, 373S, 373Т, 373V, 373W, 376Н, 376L, 376W, 373G, 373М, 373Q, 376W, 376Y, 424М, 424V, 430D, 376Y, 424М, 424V, 426D, 429A, 429F, 429M, 430D, 430W, 431P або 432S]. Молекула нуклеїнової кис430W, 431P, 432R, 432S, 434I, 439Q, 440A, 440D, лоти, що кодує варіант Fc-ділянки, може констру440E, 440F або 440М [відповідно до варіанта, якоюватись (наприклад, із молекули нуклеїнової кисму віддається перевага, 237R, 247D, 247Е, 247F, лоти, що кодує вихідну Fc-ділянку або нативну Fc247Н, 247L, 247М, 247N, 247Q, 247W, 247Y, 248А, ділянку) таким чином, щоб включати щонайменше 248F, 248Р, 248Q, 248Q, 249L, 249М, 249Y, 251Н, одну амінокислотну заміну, як наведено вище, тоді 251I, 251W, 254D, 254Е, 254F, 254G, 254Н, 254I, як згадана молекула нуклеїнової кислоти, що ко254K, 254М, 254N, 254Р, 254R, 254Т, 254V, 254W, дує варіант Fc-ділянки, функціонально зв'язана з 254Y, 255K, 255N, 256F, 256Н, 256K, 256М, 256R, нуклеїновою кислотою, що кодує додаткову послі256W, 265Y, 280Т, 292G, 292I, 311D, 311Е, 311G, довність антитіла (наприклад, нуклеїновокислот311N, 315F, 315Р, 316Т, 317Т, 327Т, 341D, 341Е, ною послідовністю, що кодує залишкову частину 341F, 341L, 341Y, 343W, 373А, 373G, 373М, 373Q, важкого ланцюга імуноглобуліну), або згаданий 376W, 376Y, 424М, 424V, 430D, 430W, 431Р або спосіб може додатково включати подальше функ432S]. Нуклеїнова кислота, що кодує варіант Fcціональне зв'язування нуклеїнової кислоти, що ділянки, може функціонально зв'язуватись із нуккодує варіант Fc-ділянки, після введення щонайлеїновою кислотою, що кодує терапевтичний біменше однієї амінокислотної заміни, вказаної вилок. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує варіще, з додатковою нуклеїновою кислотою, що кодує ант Fc-ділянки, може конструюватись (наприклад, антитіло. Згаданий спосіб може додатково вклюіз молекули нуклеїнової кислоти, що кодує вихідну 21 90682 22 Fc-ділянку або нативну Fc-ділянку) таким чином, 426D, 426L, 429А, 429F, 429М, 430А, 430D, 430F, щоб включати щонайменше одну амінокислотну 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430М, 430N, 430Р, заміну, як наведено вище, тоді як згадана молеку430R, 430S, 430Т, 430V, 430W, 430Y, 431Н, 431Р, ла нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з 432R, 432S, 434W, 434Y, 438L, 438W, 440Q або додатковою нуклеїновою кислотою, що кодує полі440Y [відповідно до варіанта, якому віддається пептид (наприклад, нуклеїновокислотною послідоперевага, 236Y, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249Е, вністю, що кодує He-Fc-ділянку гібридного білка), 249L, 249М, 249N, 249Y, 250K, 250R, 251Н, 251I, або згаданий спосіб може додатково включати 251W, 254А, 254F, 254K, 254L, 254М, 254R, 254Y, подальше функціональне зв'язування нуклеїнової 255K, 256А, 256G, 256I, 256L, 256М, 256Р, 256Q, кислоти, що кодує варіант Fc-ділянки, після вве256W, 260S, 280K, 283W, 307М, 311F, 311I, 311K, дення щонайменше однієї амінокислотної заміни, 311L, 311M, 311Т, 311V, 311W, 311Y, 314I, 314V, вказаної вище, з нуклеїновою кислотою, що кодує 314W, 314Y, 315Р, 317Р, 332D, 332L, 332М, 332S, не-Fc гібридного партнера. Згаданий спосіб може 332W, 332Y, 339D, 339F, 339I, 339K, 339N, 339S, додатково включати експресію і очищення поліпе339Т, 339W, 339Y, 341D, 341Е, 341F, 341Н, 341I, птиду, що містить варіант Fc-ділянки. Згаданий 341K, 341L, 341М, 341N, 341Р, 341Q, 341R, 341S, спосіб може додатково включати експресію і очи341Т, 341V, 341W, 341Y, 343D, 343Е, 343G, 343Н, щення поліпептиду, що містить вихідну Fc-ділянку. 343K, 343N, 343Q, 343R, 343S, 343Т, 343W, 343Y, Згаданий спосіб може додатково включати визна373D, 373Е, 373Н, 373I, 373K, 373L, 373Q, 373R, чення in vivo періоду півжиття у сироватці згадано373T, 373W, 376A, 376G, 376N, 376P, 376Q, 376R, го поліпептиду, що містить варіант Fc-ділянки, і 376S, 376T, 376V, 377P, 379N, 379Q, 379T, 382I, згаданого поліпептиду, що містить вихідну Fc382L, 386K, 426D, 426L, 429F, 429M, 430A, 430D, ділянку, за допомогою будь-якого способу, доступ430F, 430G, 430Н, 430I, 430K, 430L, 430M, 430N, ного у цій галузі або опис якого наводиться у цьо430P, 430R, 430S, 430T, 430V, 430W, 430Y, 431Н, му документі. Згаданий спосіб може додатково 431P, 432R, 434Y, 438L або 440Y]. Молекула нуквключати вибирання поліпептиду, що містить варілеїнової кислоти, що кодує варіант Fc-ділянки, ант Fc-ділянки, де згаданий поліпептид має зменможе конструюватись (наприклад, з молекули нукшений in vivo період півжиття у сироватці, порівнялеїнової кислоти, що кодує вихідну Fc-ділянку або но з in vivo періодом півжиття у сироватці нативну Fc-ділянку) таким чином, щоб включати згаданого поліпептиду, що містить вихідну Fcщонайменше одну амінокислотну заміну, як наведілянку (тобто зменшений, відповідно до варіанта, дено вище, тоді як згадана молекула нуклеїнової якому віддається перевага, щонайменше на 5%, кислоти функціонально зв'язана з додатковою ну10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% або більше). Цей клеїновою кислотою, що кодує антитіло (напривинахід додатково пропонує поліпептид (тобто клад, нуклеїновокислотною послідовністю, що когібридний поліпептид), що містить варіант Fcдує залишкову частину важкого ланцюга ділянки, який одержують за цим способом. Відпоімуноглобуліну), або згаданий спосіб може додатвідно до іншого варіанта здійснення, цей винахід ково включати подальше функціональне зв'язупропонує спосіб підвищення CDC активності моновання нуклеїнової кислоти, що кодує варіант Fcклонального антитіла, відповідно до варіанта, ділянки, після введення щонайменше однієї аміноякому віддається перевага, терапевтичного монокислотної заміни, вказаної вище, до додаткової клонального антитіла, що включає конструювання нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло. Згаданий Fc-ділянки антитіла, що містить щонайменше одну спосіб може додатково включати експресію і очиз наведених нижче амінокислотних замін: 236Y, щення моноклонального антитіла, що містить ва244L, 247А, 247D, 247Е, 247G, 247N, 247Q, 247R, ріант Fc-ділянки. Згаданий спосіб може додатково 247S, 247W, 248F, 248Р, 248Q, 248W, 249Е, 249L, включати експресію і очищення моноклонального 249М, 249N, 249Р, 249Y, 250K, 250R, 251F, 251Н, антитіла, що містить вихідну Fc-ділянку. Згаданий 251I, 251W, 254А, 254F, 254K, 254L, 254М, 254R, спосіб може додатково включати визначення CDC 254Y, 255K, 256А, 256G, 256I, 256L, 256М, 256Р, активності моноклонального антитіла, що містить 256Q, 256W, 256Y, 260S, 268D, 279Q, 279S, 279W, варіант Fc-ділянки, і згаданого моноклонального 279Y, 280K, 280Т, 283F, 283G, 283Н, 283I, 283K, антитіла, що містить вихідну Fc-ділянку, за допо283L, 283М, 283N, 283Р, 283R, 283S, 283W, 292L, могою будь-якого способу, доступного у цій галузі 307А, 307М, 311F, 311I, 311K, 311L, 311M, 311T, або опис якого наводиться у цьому описі. Згаданий 311V, 311W, 311Y, 312Р, 314F, 314I, 314V, 314W, спосіб може додатково включати вибирання моно314Y, 315F, 315K, 315L, 315Р, 315R, 316K, 317Р, клонального антитіла, що містить варіант Fc317Т, 318N, 318Т, 332А, 332D, 332Е, 332F, 332G, ділянки, з CDC активністю, яка перевищує CDC 332Н, 332L, 332М, 332N, 332Q, 332S, 332Т, 332V, активність моноклонального антитіла, що містить 332W, 332Y, 339D, 339F, 339G, 339Н, 339I, 339K, вихідну Fc-ділянку (тобто підвищену, відповідно до 339N, 339Q, 339R, 339S, 339Т, 339W, 339Y, 341D, варіанта, якому віддається перевага, щонайменше 341Е, 341F, 341Н, 341I, 341K, 341L, 341М, 341N, на 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% або біль341Р, 341Q, 341R, 341S, 341Т, 341V, 341W, 341Y, ше). Цей винахід додатково пропонує моноклона343А, 343D, 343Е, 343G, 343Н, 343K, 343L, 343М, льне антитіло, що містить варіант Fc-ділянки, який 343N, 343Q, 343R, 343S, 343Т, 343W, 343Y, 373D, одержують за цим способом. 373Е, 373F, 373Н, 373I, 373K, 373L, 373М, 373N, Відповідно до іншого варіанта здійснення, цей 373Q, 373R, 373Т, 373V, 373W, 375R, 376А, 376F, винахід пропонує спосіб зниження CDC реакції 376G, 376Н, 376L, 376N, 376Р, 376Q, 376R, 376S, моноклонального антитіла, відповідно до варіанта, 376Т, 376V, 377Р, 379N, 379Q, 379S, 379Т, 380А, якому віддається перевага, терапевтичного моно380N, 380S, 380Т, 382I, 382L, 382Q, 382V, 386K, клонального антитіла, що включає конструювання 23 90682 24 Fc-ділянки антитіла, що містить щонайменше одну поліпептид, який містить варіант Fc-ділянки відпоз наведених нижче амінокислотних замін: 235G, відно до цього винаходу. Відповідно до варіанта, 235S, 236R, 237Е, 237K, 237N, 237R, 238A, 238E, якому віддається перевага, поліпептид, що містить 238G, 238Н, 238I, 238L, 238V, 238W, 238Y, 245R, варіант Fc-ділянки, закодований згаданою нуклеї247Н, 247I, 247L, 247Т, 247Y, 250М, 252Y, 254D, новою кислотою, має амінокислотну заміну, як 254Е, 254I, 254Р, 254Q, 254Т, 254V, 255N, 257А, показано у Таблиці 1, порівняно з вихідною Fc257I, 257М, 257N, 257S, 257V, 262L, 264S, 265H, ділянкою згаданого варіанта. Відповідно до варіа265Y, 267G, 267Н, 267I, 267K, 268K, 269N, 269Q, нта, якому віддається перевага, згаданим поліпеп270G, 270М, 270N, 271Т, 272Н, 272L, 272N, 292А, тидом є моноклональне антитіло і за варіантом, 293S, 301W, 307Е, 311Е, 311S, 316F, 318Р, 327Т, якому віддається ще більша перевага, згаданим 328V, 329Y, 330K, 330R, 332K, 339Е, 339М, 343I, моноклональним антитілом є непроцесоване анти373S, 378D, 380D, 382D, 382F, 382N, 382Р, 382R, тіло або одноланцюгове антитіло. Згадане монок382S, 382W, 382Y, 385Е, 385Р, 423N, 424Н, 424М лональне антитіло може бути химерним, гуманізоабо 427N [відповідно до варіанта, якому віддаєтьваним або людським моноклональним антитілом. ся перевага, 235G, 235S, 236R, 237Е, 237K, 237N, Відповідно до іншого варіанта здійснення, цей 237R, 238А, 238Е, 238G, 238Н, 238I, 238L, 238V, винахід пропонує вектор, відповідно до варіанта, 238W, 238Y, 245R, 247I, 247L, 247Т, 250М, 257А, якому віддається перевага (але без обмеження), 257I, 257М, 262L, 264S, 267G, 267Н, 267I, 267K, плазміду, рекомбінантний експресійний вектор, 268K, 269N, 269Q, 270G, 270М, 270N, 271Т, 272Н, експресійний вектор на основі геному дріжджів або 301W, 311S, 327Т, 329Y, 330K, 330R, 378D, 385Е, експресійний вектор на основі ретровірусного ге423N або 424Н]. Молекула нуклеїнової кислоти, ному, що містить полінуклеотид, який кодує поліщо кодує варіант Fc-ділянки, може конструюватись пептид, що являє собою поліпептид із варіантом (наприклад, з молекули нуклеїнової кислоти, що Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. кодує вихідну Fc-ділянку або нативну Fc-ділянку) Відповідно до іншого варіанта здійснення, цей таким чином, щоб включати щонайменше одну винахід пропонує клітину-хазяїна, що містить моамінокислотну заміну, як наведено вище, тоді як лекулу нуклеїнової кислоти відповідно до цього згадана молекула нуклеїнової кислоти функціонавинаходу. Відповідно до варіанта, якому віддаєтьльно зв'язана з додатковою нуклеїновою кислося перевага, клітина-хазяїн відповідно до цього тою, що кодує антитіло (наприклад, нуклеїновокивинаходу містить один або декілька векторів або слотною послідовністю, що кодує залишкову генно-інженерних конструкцій, що містять молекучастину важкого ланцюга імуноглобуліну), або згалу нуклеїнової кислоти відповідно до цього винаданий спосіб може додатково включати подальше ходу. Клітина-хазяїн відповідно до цього винаходу функціональне зв'язування нуклеїнової кислоти, являє собою клітину, до якої було введено вектор що кодує варіант Fc-ділянки, після введення щовідповідно до цього винаходу (наприклад, шляхом найменше однієї амінокислотної заміни, вказаної трансформації, трансдукції, інфекції, трансфекції, вище, до додаткової нуклеїнової кислоти, що кодує електропорації тощо), де згаданий вектор містить антитіло. Згаданий спосіб може додатково вклюполінуклеотид, що кодує поліпептид, який являє чати експресію і очищення моноклонального антисобою поліпептид із варіантом Fc-ділянки відповітіла, що містить варіант Fc-ділянки. Згаданий сподно до цього винаходу. Факультативно згаданий сіб може додатково включати експресію і вектор може бути стабільно включеним до хромоочищення моноклонального антитіла, що містить соми клітини-хазяїна. Типами клітини-хазяїна є вихідну Fc-ділянку. Згаданий спосіб може додатклітини ссавців, бактерій, рослин і дріжджів. Відпоково включати визначення CDC активності моноквідно до варіанта, якому віддається перевага, клілонального антитіла, що містить варіант Fcтиною-хазяїном є клітина СНО (яєчник китайського ділянки, і згаданого моноклонального антитіла, що хом'ячка), клітина COS (яєчник мавпи), клітина містить вихідну Fc-ділянку, за допомогою будьSP2/0, клітина NS0, дріжджова клітина або похідна якого способу, доступного у цій галузі або опис чи потомство клітини будь-якого типу, якому відякого наводиться у цьому документі. Згаданий дається перевага. спосіб може додатково включати вибирання моноВідповідно до іншого варіанта здійснення, цей клонального антитіла, що містить варіант Fcвинахід пропонує фармацевтичну композицію, що ділянки, з CDC активністю, нижчою за CDC активмістить поліпептид, що містить варіант Fc-ділянки ність моноклонального антитіла, що містить вихідвідповідно до цього винаходу або його функціонану Fc-ділянку (тобто зменшену, відповідно до варільний фрагмент. Відповідно до варіанта, якому анта, якому віддається перевага, щонайменше на віддається перевага, згаданим поліпептидом є 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% або більше). моноклональне антитіло, відповідно до варіанта, Цей винахід додатково пропонує моноклональне якому віддається ще більша перевага, терапевтиантитіло, що містить варіант Fc-ділянки, який одечне моноклональне антитіло. Згадане моноклонаржують за цим способом. льне антитіло може бути химерним, гуманізованим Відповідно до іншого варіанта здійснення, цей або людським моноклональним антитілом. Відповинахід пропонує виділену молекулу нуклеїнової відно до альтернативного варіанта, згаданим полікислоти, яка являє собою молекулу нуклеїнової пептидом може бути поліпептид окрім антитіла, кислоти, що кодує варіант Fc-ділянки відповідно для якого є корисним змінений період півжиття у до цього винаходу або його функціональний фрасироватці, який надається згаданому поліпептиду гмент. Відповідно до варіанта, якому віддається завдяки функціональному зв'язку та коекспресії з більша перевага, виділена молекула нуклеїнової варіантом Fc-ділянки відповідно до цього винахокислоти являє собою нуклеїнову кислоту, що кодує ду. Фармацевтична композиція відповідно до цього 25 90682 26 винаходу може додатково містити фармацевтично Цим винаходом передбачаються варіанти теприйнятний носій. У згаданій фармацевтичній комрапевтичного та діагностичного застосування мопозиції поліпептид, що містить варіант Fc-ділянки, ноклональних антитіл, гетерологічних поліпептиє активним інгредієнтом. Відповідно до варіанта, дів, що містять варіант Fc-ділянки відповідно до якому віддається перевага, фармацевтична комцього винаходу, які розкриваються у цьому описі. позиція містить однорідну або по суті однорідну Фіг.1 - схематичне зображення молекули IgG з популяцію моноклонального антитіла, що містить різноманітними поміченими ділянками та зрізами. варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. Фіг.2 - впорядковане розміщення різноманітФармацевтична композиція для терапевтичного них амінокислотних послідовностей вихідної Fcзастосування, відповідно до варіанта, якому віддаділянки, у тому числі людського lgG1 ((послідовється перевага, є стерильною і може бути ліофіліність №1) із показаними не-а та а алотипами), зованою. людського IgG2 (послідовність №2), людського Цей винахід пропонує спосіб пригнічення актиIgG3 (послідовність №3), людського IgG4 (послідовності білка у ссавця, відповідно до варіанта, яковність №4), мишачого lgG1 (послідовність №5), му віддається перевага, у людини, яка потребує мишачого IgG2A (послідовність №6), мишачого цього, що включає введення терапевтично ефекIgG2B (послідовність №7) і мишачого IgG3 (послітивної кількості або профілактично ефективної довність №8). кількості поліпептиду (відповідно до варіанта, якоФіг.3 - різноманітні амінокислотні послідовносму віддається перевага, моноклонального антитіті, у тому числі ділянки СН2 (послідовність №9) та ла), що містить варіант Fc-ділянки відповідно до ділянки CH3 (послідовність №10) людського lgG1, цього винаходу, згаданому ссавцю. Відповідно до а також послідовності f алотипу (послідовність варіанта, якому віддається перевага, згаданий №11) та а, z алотипу (послідовність №12) людсьполіпептид, що містить варіант Fc-ділянки, є парткого lgG1, що включають ділянку CH1, шарнірну нером зв'язування білка, призначеного для пригніділянку, ділянки СН2 та CH3. чення. Цей винахід додатково пропонує спосіб Фіг.4 - різноманітні амінокислотні послідовнослікування або запобігання захворювання або розті, що містяться у: (а) варіабельній ділянці легкого ладу, що покращується шляхом пригнічення транланцюга (LCVR) анти-CD20 антитіла (І) (послідовсдукції сигналу унаслідок зв'язування моноклонаність №13); (b) варіабельній ділянці важкого ланльного антитіла, що містить варіант Fc-ділянки цюга (HCVR) анти-CD20 антитіла (І) (послідовність відповідно до цього винаходу, з його антигенною №14); (с) LCVR анти-CD20 антитіла (II) (послідовдетермінантою, що включає введення хворому ність №15); та HCVR анти-CD20 антитіла (II) (пос(наприклад, людині), що потребує такого лікування лідовність №16). На Фіг.4е представлені амінокисабо запобігання, терапевтично або профілактично лотні послідовності, що містяться у межах ефективної кількості моноклонального антитіла варіабельної ділянки анти-CD20 антитіла. (Дивись відповідно до цього винаходу. тимчасову заявку США №60/471,958, яку було поЦей винахід пропонує готовий виріб, що вклюдано 20 травня 2003 року, та патент США чає пакувальний матеріал і поліпептид, що являє №5,843,439, які включено до цього опису). собою поліпептид, який містить варіант Fc-ділянки Фіг.5 - амінокислотна послідовність повного відповідно до цього винаходу, який розміщують у легкого ланцюга анти-CD20 антитіла ΑΜΕ 133. На згаданому пакувальному матеріалі. Цей винахід Фіг.5b представлена нуклеїновокислотна послідододатково пропонує композиції, що містять моноквність повного легкого ланцюга ΑΜΕ 133. лональні антитіла і гетерологічні поліпептиди, що Фіг.6 - амінокислотна та нуклеїновокислотна містять варіант Fc-ділянки, опис якого наведено, послідовності повного важкого ланцюга трьох вата фізіологічно або фармацевтично прийнятний ріантів анти-CD20 антитіла ΑΜΕ 133, яким відданосій або розріджувач. ється перевага. Конкретно, на Фіг.6а представлена Відповідно до деяких варіантів здійснення, цей амінокислотна послідовність повного важкого ланвинахід пропонує поліпептид, що містить: і) немоцюга варіанта 247I/339Q. На Фіг.6b представлена дифіковану людську каркасну ділянку ("FR") (нануклеїновокислотна послідовність повного важкого приклад, до природного людського каркаса не буланцюга варіанта 247I/339Q. На Фіг.6с представло внесено жодних змін) та іі) варіант Fc-ділянки. лена амінокислотна послідовність повного важкого Відповідно до певного варіанта здійснення, згадаланцюга варіанта 247I/339D. На Фіг.6d представний немодифікований людський каркас є людсьлена нуклеїновокислотна послідовність повного ким ембріональним каркасом. Відповідно до іншоважкого ланцюга варіанта 247I/339D. На Фіг.6е го варіанта здійснення, цей винахід пропонує представлена амінокислотна послідовність повнокомпозиції, що містять поліпептид, де згаданий го важкого ланцюга варіанта 378D. На Фіг.6f предполіпептид містить: і) щонайменше одну рандоміставлена нуклеїновокислотна послідовність повнозовану гіперваріабельну послідовність та іі) варіго важкого ланцюга варіанта 378D. ант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. ВідНумерація залишків амінокислот у важкому повідно до додаткового варіанта здійснення, цей ланцюзі імуноглобуліну (Fc-ділянка) у цьому описі винахід пропонує композиції, що містять поліпепта пунктах формули винаходу відповідає Індексу тид, де згаданий поліпептид містить: і) немодифіЄвропейського співтовариства за Кеботом (Кебот кований людський каркас (наприклад, людський (Kabat) та інші, Sequences of Proteins of ембріональний каркас), іі) щонайменше одну ранImmunological Interest, 5-е видання, Public Health домізовану гіперваріабельну послідовність, та ііі) Service, National Institutes of Health, Bethesda, штат варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу. Меріленд (1991)). "Індекс Європейського співтовариства за Кеботом" стосується нумерації залишків 27 90682 28 людського антитіла IgG, яка представлена у цьому Молекула нуклеїнової кислоти є "функціональописі на Фіг.2. Наприклад, у положенні 438 усі но зв'язаною" або "функціонально приєднаною" у людські lgG1, IgG2, IgG3, IgG4 та мишачі IgG3 маразі знаходження у функціональному зв'язку з інють амінокислоту Q, у той час як мишачий lgG1 шою молекулою нуклеїнової кислоти. Наприклад, має амінокислоту І, мишачий IgG2a має амінокиспромотор або енхансер є функціонально зв'язаним лоту Т, а мишачий IgG2B має амінокислоту K. На із кодувальною послідовністю нуклеїнової кислоти, додаток до цього, заміни у цьому описі називають якщо він впливає на транскрипцію згаданої посліза номером положення амінокислоти, у якому віддовності; або зв'язувальний сайт рибосоми є фунбувається заміна, з подальшим позначенням амікціонально зв'язаним із кодувальною послідовніснокислоти, на яку було замінено присутню на вихітю нуклеїнової кислоти, якщо він розміщений дній Fc-ділянці у тому самому положенні таким чином, щоб полегшувати трансляцію. Моле(наприклад, 249G означає залишок гліцину, яким кула нуклеїнової кислоти, що кодує варіант Fcбуло замінено залишок, присутній у положенні 249 ділянки, функціонально зв'язана з молекулою нуквихідної Fc-ділянки). Згаданий номер означає полеїнової кислоти, що кодує гетерологічний білок ложення в людському lgG1 незалежно від того, є (тобто білок або його функціональний фрагмент, чи ні згадана вихідна Fc-ділянка людським lgG1; у який, у тому вигляді, у якому він існує за природразі, якщо вихідна Fc-ділянка не є людським lgG1, них умов, не містить Fc-ділянки), якщо вона роззгаданий номер означає гомологічне положення міщена таким чином, що експресований гібридний на вихідній Fc-ділянці, у разі, якщо вона буде впобілок являє собою гетерологічний білок або його рядковано розміщена для порівняння з людським функціональний фрагмент, приєднаний у 3'-5' наlgG1 у цьому положенні. прямку або 5'-3' напрямку до поліпептиду, що місТерміни "суб'єкт" та "хворий", що вживається у тить варіант Fc-ділянки; гетерологічний білок може цьому описі, означають будь-яку тварину, по відбути безпосередньо прилеглим до поліпептиду, ношенню до якої поліпептид, що містить варіант що містить варіант Fc-ділянки або може бути відоFc-ділянки відповідно до цього винаходу, може кремленим від нього лінкерною послідовністю бути застосованим із терапевтичною метою, у тобудь-якої довжини та складу. Подібним чином мому числі людину, а також інших ссавців (наприлекула поліпептиду (у цьому описі вживається як клад, свійських тварин (наприклад, собак, кішок), синонім терміну "білок") є "функціонально зв'язаспортивних тварин (наприклад, коней) та сільськоною" або "функціонально приєднаною", якщо вона господарських тварин (наприклад, велику рогату знаходиться у функціональному зв'язку з іншим худобу, свиней та овець)), які можуть одержати поліпептидом. користь від такого лікування. Термін "функціональний фрагмент", що вжиТерміни "лікування" або "запобігання", що вається у цьому описі відносно поліпептиду або вживається у цьому описі, мають відношення до білка (наприклад, варіант Fc-ділянки або моноклозахворювання або розладу, пов'язаного з рівнями нальне антитіло), означає фрагменти цього білка, білка, що відхиляються від норми, або до захвощо зберігають щонайменше одну функцію непрорювання або розладу для яких може бути корисцесованого поліпептиду. Фрагменти можуть різниною зміна активності або рівня білка. тися за розміром від шести амінокислот до повної Термін "виділена", у разі його застосування по амінокислотної послідовності непроцесованого відношенню до нуклеїнової кислоти, означає нукполіпептиду мінус одна амінокислота. Функціоналеїнову кислоту, що ідентифікується і відокремлюльний фрагмент поліпептиду, що містить варіант ється від щонайменше однієї забруднювальної Fc-ділянки відповідно до цього винаходу, зберігає нуклеїнової кислоти, з якою вона, як правило, є щонайменше одну "амінокислотну заміну" за висполученою у своєму природному джерелі. Видізначенням, що наводиться у цьому описі. Функціолена нуклеїнова кислота має форму або оточення, нальний фрагмент поліпептиду, що містить варіщо відрізняється від форми або оточення, у яких ант Fc-ділянки, зберігає щонайменше одну вона знаходиться за природних умов. Молекули функцію, яка, як відомо у цій галузі, пов'язується з виділеної нуклеїнової кислоти, таким чином, відріFc-ділянкою (наприклад, ADCC, CDC, зв'язування зняються від молекули нуклеїнової кислоти у тому Fc-рецептора, зв'язування C1q, регуляція мемвигляді, у якому вона існує у природних клітинах. бранних рецепторів за типом негативного зворотМолекула виділеної нуклеїнової кислоти являє ного зв'язку або може, наприклад, збільшувати in собою молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься vivo або in vitro період півжиття у сироватці поліпеу клітинах, які зазвичай експресують закодований птиду, до якого він є функціонально приєднаним). у них поліпептид, де, наприклад, молекула нуклеїТермін "очищений" або "очищати" означає нової кислоти займає місце у плазміді або хромозначне видалення щонайменше одного забруднюсомі, яке відрізняється від її локалізації у природвача із зразка. Наприклад, антигенспецифічне анних клітинах. Виділена нуклеїнова кислота може титіло може бути очищеним шляхом повного або бути присутньою у одноланцюговій або дволанцюзначного видалення (щонайменше 90%, 91%, 92%, говій формі. У разі, коли молекула виділеної нук93%, 94%, 95% або, відповідно до варіанта, якому леїнової кислоти повинна застосовуватись для віддається більша перевага, щонайменше 96%, експресії білка, олігонуклеотид або полінуклеотид 97%, 98% або 99%) щонайменше одного забрудбуде містити як мінімум смисловий або кодувальнювального білка, що не є імуноглобуліном; воно ний ланцюг, однак може містити як смисловий, так може бути також очищеним шляхом видалення і антисмисловий ланцюги (тобто може бути дволаімуноглобулінового білка, який не зв'язується з тим нцюговим). самим антигеном. Наслідком видалення білків, що не є імуноглобулінами, та/або видалення імуног 29 90682 30 лобулінів, що не зв'язують конкретний антиген, є перевага, варіант Fc-ділянки вихідного поліпептипідвищення відсотка антигенспецифічних імуногду містить щонайменше одну амінокислотну замілобулінів у зразку. У іншому прикладі поліпептид ну, порівняно з вихідним поліпептидом, де згадана (наприклад, імуноглобулін), експресований у бакзаміна знаходиться на Fc-ділянці. Вихідний політеріальних клітинах-хазяях, очищають шляхом пептид може бути або може не бути нативним поповного або значного видалення білків клітиниліпептидом. хазяїна; тим самим підвищується відсоток поліпеТермін "Fc-ділянка", що вживається у цьому птиду у зразку. описі, означає С-кінцеву ділянку важкого ланцюга Термін "нативний", що вживається у цьому імуноглобуліну (наприклад, як показано на Фіг.1). описі у відношенні до поліпептиду (наприклад, Fc"Fc-ділянка" може бути Fc-ділянкою з нативною ділянки), означає, що згаданий поліпептид має послідовністю або варіантом Fc-ділянки. Незваамінокислотну послідовність, яка являє собою аміжаючи на те, що загальноприйняті межі Fc-ділянки нокислотну послідовність поліпептиду, широко важкого ланцюга імуноглобуліну можуть змінюварозповсюджену за природних умов, або її природтись, Fc-ділянка важкого ланцюга людського IgG, ний поліморфізм. Нативний поліпептид (наприяк правило, визначається відтинком від залишку клад, нативна Fc-ділянка) може продукуватись амінокислоти у положенні Cys226 або від Pro230 рекомбінантними методами або виділятись із придо її карбоксильного кінця. Відповідно до деяких родного джерела. варіантів здійснення, варіанти містять лише часТермін "експресійний вектор", що вживається у тини Fc-ділянки і можуть включати або не включацьому описі, означає молекулу рекомбінантної ти карбоксильний кінець. Fc-ділянка імуноглобуліДНК, що містить бажану кодувальну послідовність ну, як правило, містить дві константні ділянки, СН2 і відповідні нуклеїновокислотні послідовності, нета CH3, як показано, наприклад, на Фіг.1. Відповіобхідні для експресії функціонально зв'язаної кодно до деяких варіантів здійснення, передбачадувальної послідовності у конкретному організміються варіанти, що маютьодин або декілька консхазяїні. тантних доменів. Відповідно до інших варіантів Термін "клітина-хазяїн", що вживається у цьоздійснення, передбачаються варіанти без таких му описі, означає будь-яку еукаріотну або прокаріконстантних доменів (або лише із частинами таких отну клітину (наприклад, бактеріальні клітини, наконстантних доменів). приклад, Е. coli, клітини СНО, дріжджові клітини, "Домен СН2" Fc-ділянки людського IgG (який клітини ссавців, клітини птахів, клітини амфібій, називають також доменом "С 2"), як правило, проклітини рослин, клітини риб та клітини комах), лостягається від приблизно амінокислоти 231 до калізовану чи то in vitro або in situ, чи то in vivo. приблизно амінокислоти 340 (дивись Фіг.1). УнікаКлітини-хазяї, наприклад, можуть знаходитись у льність домену СН2 полягає у тому, що він не є трансгенній тварині. щільно спарованим з іншим доменом. Між двома Словосполучення "вихідний поліпептид", що доменами СН2 інтактної нативної молекули IgG вживається у цьому описі, означає поліпептид, що знаходяться два N-зв'язані розгалужені ланцюги містить амінокислотну послідовність, яка може вуглеводу. бути заміненою або зміненою (наприклад, аміно"Доменом CH3" Fc-ділянки людського IgG кислотна заміна) з одержанням варіанта (тобто (який називають також доменом "С 3"), як правиваріанта поліпептиду). Відповідно до варіанта ло, є відтинок залишків від С-кінця до домену СН2 здійснення, якому віддається перевага, вихідний на Fc-ділянці, що простягається від приблизно поліпептид містить щонайменше частину нативної залишку амінокислоти 341 до приблизно залишку або ненативної Fc-ділянки, тобто природної Fcамінокислоти 447 (дивись Фіг.2). ділянки або Fc-ділянки із щонайменше однією мо"Функціональна Fc-ділянка" має "ефекторну дифікацією амінокислотної послідовності. Відповіфункцію" Fc-ділянки нативної послідовності. Щодно до деяких варіантів здійснення, конкретно пенайменше одна ефекторна функція поліпептиду, редбачаються варіанти, що є коротшими або що містить варіант Fc-ділянки відповідно до цього довшими від вихідного поліпептиду. Відповідно до винаходу, може бути підсилена або зменшена відваріанта здійснення, якому віддається особлива носно поліпептиду, що містить нативну Fc-ділянку перевага, вихідний поліпептид відрізняється за або вихідну Fc-ділянку варіанта. Прикладами ефефункцією (наприклад, посилена або ослаблена кторних функцій (але без обмеження) є: зв'язуванефекторна функція, зв'язування рецептора, in vitro ня Clq; комплементзалежна цитотоксичність або in vivo період півжиття у сироватці), порівняно (CDC); зв'язування Fc-рецептора; антитілозалежна з варіантом. клітинноопосередкована цитотоксичність (ADCC); Словосполучення "варіант вихідного поліпепфагоцитоз; регуляція мембранних рецепторів за тиду", що вживається у цьому описі, означає політипом негативного зворотного зв'язку (наприклад, пептид, що містить амінокислотну послідовність, В-клітинного рецептора; BCR) тощо. Такі ефекторяка відрізняється від амінокислотної послідовності ні функції можуть потребувати функціонального вихідного поліпептиду щонайменше однією амінозв'язку Fc-ділянки зі зв'язувальним доменом (накислотою заміною. Відповідно до певних варіантів приклад, варіабельним доменом антитіла) і моздійснення, варіант містить щонайменше 40%, жуть оцінюватись за допомогою різноманітних 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% чи аналізів (наприклад, аналіз Fc-зв'язування, аналіз 90% або, відповідно до варіанта, якому віддається ADCC, аналіз CDC, вичерпання клітин-мішеней зі найбільша перевага, щонайменше 95%, 97% або зразків цільної або фракціонованої крові тощо). 99% Fc-ділянки (тобто "частину" Fc-ділянки). Від"Fc-ділянка нативної послідовності" або "Fcповідно до варіанта здійснення, якому віддається ділянка дикого типу" означає амінокислотну послі 31 90682 32 довність, що є ідентичною амінокислотній послідояка є щонайменше на 80%, щонайменше на 85%, вності Fc-ділянки, яка є розповсюдженою у прировідповідно до варіанта, якому віддається більша ді. Зразкові людські Fc-ділянки нативної послідовперевага, щонайменше на 90%, 91%, 92%, 93%, ності представлені на Фіг.2 і включають Fc-ділянку 94% або, відповідно до варіанта, якому віддається нативної послідовності людського lgG1 (f та а, z ще більша перевага, щонайменше на 95%, 96%, алотипи, тобто не-А та А алотипи); Fc-ділянку на97%, 98% або 99% гомологічною амінокислотній тивної послідовності людського IgG2; Fc-ділянку послідовності нативного людського амінополіпепнативної послідовності людського IgG3; і Fcтиду. ділянку нативної послідовності людського IgG4, а Терміни "Fc-рецептор" або "FcR" застосовутакож їхні природні варіанти. На Фіг.2 також покається для опису рецептора, який зв'язується з Fcзані мишачі Fc-ділянки нативної послідовності. ділянкою (наприклад, Fc-ділянкою антитіла). FcR, "Варіант Fc-ділянки" містить амінокислотну поякому віддається перевага, є FcR нативної посліслідовність, що відрізняється від амінокислотної довності. Більш того, FcR, якому віддається перепослідовності Fc-ділянки нативної послідовності вага, є рецептор, який зв'язує IgG антитіло (гамма(або її фрагмента) щонайменше однією "амінокисрецептор) і який включає рецептори підкласів лотною заміною", як визначається у цьому описі. Fc RI, Fc RII, Fc RIII, у тому числі алельні варіанти Відповідно до варіанта здійснення, якому віддаі альтернативно сплайсовані форми цих рецептоється перевага, варіант Fc-ділянки має щонаймерів. Рецептори Fc RII включають Fc RIIA ("активанше одну амінокислотну заміну, порівняно з Fcційний рецептор") та Fc RIIB ("пригнічувальний ділянкою нативної послідовності або Fc-ділянкою рецептор"), які мають однакові амінокислотні посвихідного поліпептиду, відповідно до варіанта, лідовності, які головним чином різняться на цитоякому віддається перевага, 1, 2, 3, 4 або 5 аміноплазматичних доменах. Огляд рецепторів FcRs кислотних замін, порівняно з Fc-ділянкою нативної наведено у Равеч (Ravetch) та Кінет (Kinet), Annu. послідовності або Fc-ділянкою вихідного поліпепRev. Immunol. 9:457-92 (1991); Капел (Capel) та тиду. Відповідно до альтернативного варіанта інші, Immunomethods 4:25-34 (1994); та де Гаас (de здійснення, варіант Fc-ділянки можна одержати за Haas) та інші, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). способами, які розкривають у цьому описі, і цей Іншим FcR, якому віддається перевага, є рецептор варіант Fc-ділянки може гібридизуватись із відпоновонароджених, FcRn, що відповідає за переневідним гетерологічним поліпептидом, наприклад, сення материнських IgGs до плода (Гайєр (Guyer) варіабельним доменом антитіла або поліпептита інші, J. Immunol. 117:587 (1976); Кім (Кіm) та дом, що не є антитілом, наприклад, зв'язувальним інші, J. Immunol. 24:249 (1994)). Інші FcRs, у тому доменом рецептора або ліганду. числі ті, які будуть ідентифіковані у майбутньому, Термін "похідна", що вживається у цьому опиохоплюються терміном "FcR", який застосовується сі, у контексті поліпептидів означає поліпептид, що у цьому описі. містить амінокислотну послідовність, яка була зміСловосполучення "антитілозалежна клітиннонена шляхом введення заміни залишку амінокисопосередкована цитотоксичність" і скорочення лоти. Термін "похідна", що вживається у цьому "ADCC" означають клітинноопосередковану реакописі, означає також поліпептид, який був модифіцію, під час якої неспецифічні цитотоксичні клітини кований шляхом ковалентного приєднання до зга(наприклад, неспецифічні), що експресують FcRs даного поліпептиду молекули будь-якого типу. (наприклад, природні клітини-кілери ("NK"), нейтНаприклад, але без обмеження, антитіло може рофіли і макрофаги), розпізнають зв'язане антитібути модифікованим, наприклад, шляхом глікозило на клітині-мішені і у подальшому спричинюють лування, ацетилування, поліетиленгліколізування, лізис згаданих клітин-мішеней. Головні клітини, що фосфоритування, амідування, шляхом дериватиопосередковують ADCC, природні клітини-кілери зації за допомогою відомих захисних/блокувальних (NK-клітини), експресують лише Fc RIII, у той час груп, шляхом протеолітичного розщеплення, зв'яяк моноцити експресують Fc RI, Fc RII та Fc RIII. зування із клітинним лігандом або іншим білком Словосполучення "ефекторні клітини", що тощо. Дериватизований поліпептид можна одервживається у цьому описі, означає лейкоцити (віджати шляхом хімічних модифікацій із застосуванповідно до варіанта, якому віддається перевага, ням способів, відомих фахівцям у цій галузі, у тому людські), що експресують один або декілька FcRs і числі (але без обмеження) шляхом специфічного здійснюють ефекторні функції. Відповідно до варіхімічного розщеплення, шляхом ацетилування, анта, якому віддається перевага, згадані клітини формілування, метаболічного синтезу тунікаміцину експресують принаймні Fc RIII і здійснюють ефектощо. На додаток до цього, дериватизований політорну функцію ADCC. Прикладами лейкоцитів, що пептид має подібну або ідентичну функцію, що і опосередковують ADCC, є РВМС (мононуклеари поліпептид, похідною якого він є. Зрозуміло, що периферичної крові), NK-клітини, моноцити, цитополіпептид, що містить варіант Fc-ділянки відповітоксичні Т-клітини та нейтрофіли. Ефекторні клітидно до цього винаходу, може бути похідною, як ни можуть виділятись із нативного джерела (навизначається у цьому описі, причому, відповідно приклад, із крові або мононуклеарів периферичної до варіанта, якому віддається перевага, дериватикрові). зація відбувається у межах Fc-ділянки. Варіант поліпептиду зі "зміненою" спорідненісСловосполучення "по суті людського похотю до зв'язування FcRn належить до числа тих, що дження", що вживається у цьому описі по відномають або підвищену (тобто збільшену, більшу шенню до поліпептиду (наприклад, Fc-ділянки або або вищу) або знижену (тобто зменшену, нижчу моноклонального антитіла), означає те, що згадаабо меншу) спорідненість до зв'язування FcRn, ний поліпептид має амінокислотну послідовність, порівняно з вихідним поліпептидом згаданого ва 33 90682 34 ріанта або з поліпептидом, що містить нативну Fcний сортер зі збудженням флуоресценції) або інші ділянку, у разі визначення при рН 6,0. Варіант поспособи. Зміна "аналітичного сигналу" може відоліпептиду, який демонструє підвищене зв'язування бражати зміну життєздатності клітин та/або зміну або підвищену спорідненість до зв'язування FcRn, кінетичного показника дисоціації, кінетичного показв'язує FcRn із більшою спорідненістю, аніж вихідзника асоціації чи обох разом. "Підвищений аналіний поліпептид. Варіант поліпептиду, який демонтичний сигнал" означає, що визначений показник є струє знижене зв'язування або знижену споріднебільшим за інший показник (наприклад, варіант ність до зв'язування FcRn, зв'язує FcRn із меншою може мати підвищений (більший) показник при спорідненістю, аніж вихідний поліпептид. Такі вапроведенні ELISA, порівняно з вихідним поліпепріанти, що демонструють знижений рівень зв'язутидом). "Менший" аналітичний сигнал означає, що вання з FcRn, можуть мати низький або майже визначений показник є меншим за інший показник незначний рівень зв'язування з FcRn, наприклад, (наприклад, варіант може мати нижчий (менший) 0-20% зв'язування з FcRn порівняно з вихідним показник при проведенні ELISA, порівняно з вихідполіпептидом. Варіант поліпептиду, який зв'язує ним поліпептидом). FcRn з "підвищеною спорідненістю", порівняно з Термін "зв'язувальна спорідненість" означає його вихідним поліпептидом, належить до числа константу дисоціації у стані рівноваги (виражену у тих, шо зв'язують FcRn із підвищеною зв'язувальодиницях концентрації), що пов'язується з кожною ною спорідненістю, аніж вихідний поліпептид, у зв'язувальною взаємодією Fc-рецептора-Рсразі, коли кількість варіанта поліпептиду і вихідноділянки. Зв'язувальна спорідненість безпосередго поліпептиду у аналізі зв'язування є по суті однаньо пов'язується з відношенням кінетичного показковою і усі інші обставини є ідентичними. Наприника дисоціації (який, як правило, виражається у клад, варіант поліпептиду з підвищеною обернених одиницях часу, наприклад, секунди-1), спорідненістю до зв'язування FcRn може демонподіленого на кінетичний показник асоціації (який, струвати збільшення спорідненості до зв'язування як правило, виражається у одиницях концентрації FcRn від приблизно 1,10 до приблизно 100 разів на одиницю часу, наприклад, моль/с). Взагалі не(за більш типовим варіантом, від приблизно 1,2 до можливо однозначно вказати, чи обумовлені зміни приблизно 50 разів), порівняно з вихідним поліпепконстант дисоціації у стані рівноваги різницями у тидом, де спорідненість до зв'язування FcRn вишвидкості асоціації/дисоціації чи обох разом, якщо значають, наприклад, за допомогою твердофазнотільки кожен із цих параметрів не є експериментаго імуноферментного аналізу (ELISA) або іншого льно визначеним (наприклад, визначення за доспособу, доступного пересічному фахівцю у цій помогою програм BIACORE або SAPIDYNE). галузі. Термін "шарнірна ділянка", що вживається у Словосполучення "амінокислотна заміна", що цьому описі, означає відтинок амінокислот у людвживається у цьому описі, означає заміну щонайського lgG1, що простягається від Glu216 до менше одного існуючого залишку амінокислоти у Pro230 людського lgG1. Шарнірні ділянки інших даній амінокислотній послідовності іншим "замінізотипів IgG можуть впорядковано розміщуватись ним" залишком амінокислоти. Згаданий замінний для порівняння з послідовністю lgG1 шляхом роззалишок або залишки можуть бути "природними міщення у однакових положеннях першого і останзалишками амінокислот" (тобто закодованими генього залишків цистеїну, що утворюють міжланцюнетичним кодом) і вибраними з-посеред аланіну гові S-S зв'язки. (Ala); аргініну (Arg); аспарагіну (Asn); аспарагінової "Clq" являє собою поліпептид, що містить сайт кислоти (Asp); цистеїну (Cys); глутаміну (Gln); глузв'язування для Fc-ділянки імуноглобуліну. Clq тамінової кислоти (Glu); гліцину (Gly); гістидину разом із двома сериновими протеазами, Сlr та Cls, (His); ізолейцину (IIе): лейцину (Leu); лізину (Lys); утворює комплекс СІ, першу складову шляху CDC. метіоніну (Met); фенілаланіну (Phe); проліну (Pro); Термін "антитіло", що вживається у цьому описерину (Ser); треоніну (Thr); триптофану (Тrр); тисі взаємозамінно з терміном "імуноглобулін" або розину (Туг) і валіну (Val). Заміна одним або декі"Ig", вживається у найширшому значенні і конкретлькома неприродними залишками амінокислот но означає моноклональні антитіла (у тому числі також передбачається визначенням амінокислотнепроцесовані моноклональні антитіла), поліклоної заміни, наведеним у цьому описі. Словосполунальні антитіла, мультиспецифічні антитіла (начення "неприродний залишок амінокислоти" ознаприклад, біспецифічні антитіла) та фрагменти анчає залишок, окрім наведених вище природних титіл доти, доки вони демонструють бажану залишків амінокислот, що є здатним до ковалентбіологічну активність або функціональну активного зв'язування прилеглого(-их) залишку(-ів) аміність. Одноланцюгові антитіла та химерні, людські, нокислот у поліпептидному ланцюзі. Прикладами гуманізовані або приматизовані (з пересадженою неприродних залишків амінокислот є норлейцин, гіперваріабельною ділянкою) антитіла, а також омітин, норвалін, гомосерин та інші аналоги залихимерні або одноланцюгові антитіла з пересаджешків амінокислот, наприклад, описані у Еллман ною гіперваріабельною ділянкою тощо, що містять (Ellman) та інші, Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). частини, одержані від різних видів, також входять Словосполучення "аналітичний сигнал" ознадо обсягу цього винаходу і терміну "антитіло". Різні чає результат будь-якого способу виявлення бічастини цих антитіл можуть з'єднуватись хімічним лок-білкових взаємодій, з включенням (але без шляхом за допомогою традиційних методів, синтеобмеження) визначень оптичної густини за допотичним шляхом або їх можна одержати як суміжмогою колориметричного аналізу, інтенсивності ний білок за допомогою методів генної інженерії. флуоресценції або розпадів на хвилину. АналітичНаприклад, нуклеїнові кислоти, що кодують химений формат може включати ELISA, FACS (клітинрний або гуманізований ланцюг, можуть експресу 35 90682 36 ватись із продукуванням суміжного білка. Дивись, Термін "фрагмент", що вживається у цьому наприклад, патент США №4,816,567; Європатент описі, означає поліпептид, що містить амінокисло№0,125,023 В1; патент США №4,816,397; Європатну послідовність із щонайменше 5, 15, 20, 25, 40, тент №0,120,694 В1; WO 86/01533; Європатент 50, 70, 90, 100 або більше суміжних залишків амі№0,194,276 В1; патент США №5,225,539; Європанокислот амінокислотної послідовності іншого потент №0,239,400 В1 та патенти США №5,585,089 ліпептиду. Відповідно до варіанта, якому віддаєтьта №5,698,762. Дивись також Ньюмен Р. (Newman ся перевага, фрагмент поліпептиду зберігає R.) та інші, BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, щонайменше одну функцію непроцесованого полівідносно приматизованих антитіл та патент США пептиду. №4,946,778 (на ім'я Ладнер (Ladner) та інших) та Термін "химерне антитіло", що вживається у Берд Р.Е. (Bird R.E.) та інші, Science, 242:423-426, цьому описі, включає моновалентні, двохвалентні 1988, відносно одноланцюгових антитіл. Зрозуміабо полівалентні імуноглобуліни. Моновалентним ло, що усі форми антитіл, що містять Fc-ділянку химерним антитілом є димер, утворений химерним (або її частину) входять за цим описом до обсягу важким ланцюгом, зв'язаним через дисульфідні терміну "антитіло". Окрім того, антитіло може помістки з химерним легким ланцюгом. Двохвалентмічатись міткою, яка піддається виявленню, іммоним химерним антитілом є тетрамер, утворений білізуватись на твердій фазі та/або кон'югуватись двома димерами важкий ланцюг-легкий ланцюг, із гетерологічною сполукою (наприклад, фермензв'язаними через щонайменше один дисульфідний том або токсином) за способами, відомими у цій місток. Химерний важкий ланцюг антитіла, признагалузі. ченого для застосування на людях, містить антиСловосполучення "фрагмент антитіла", що гензв'язувальну ділянку, одержану з важкого ланвживається у цьому описі, означає частину інтактцюга нелюдського антитіла, яка зв'язана ного антитіла. Прикладами фрагментів антитіл принаймні з частиною константної ділянки людсь(але без обмеження) є лінійні антитіла; молекули кого важкого ланцюга, наприклад, CH1 або СН2. одноланцюгових антитіл; Fc або Fc' пептиди, Fab Химерний легкий ланцюг антитіла, призначеного та Fab-фрагменти і мультиспецифічні антитіла, для застосування на людях, містить антигензв'язуутворені із фрагментів антитіл. Фрагменти антитіл, вальну ділянку, одержану з легкого ланцюга невідповідно до варіанта, якому віддається перевага, людського антитіла, яка зв'язана принаймні з часзберігають принаймні частину шарнірної ділянки і, тиною константної ділянки людського легкого факультативно, ділянки CH1 важкого ланцюга IgG. ланцюга (CL). Антитіла, фрагменти або похідні, що Відповідно до інших варіантів здійснення, яким мають химерні важкі ланцюги і легкі ланцюги з віддається перевага, фрагменти антитіл містять однаковою або різною специфічністю зв'язування принаймні частину ділянки СН2 або ділянку СН2 у варіабельної ділянки, можна також одержати шляцілому. хом відповідного об'єднання окремих поліпептидТермін "функціональний фрагмент", що вжиних ланцюгів за стадіями відомого способу. Відповається у цьому описі, у разі застосування по відвідно до цього варіанта підходу, хазяї, що ношенню до моноклонального антитіла, означає експресують химерні важкі ланцюги, культивуютьчастину моноклонального антитіла, яка все ще ся окремо від хазяїв, що експресують химерні легкі зберігає функціональну активність. Функціональланцюги, імуноглобулінові ланцюги окремо видіною активністю може бути, наприклад, антигензляють, після чого об'єднують. Відповідно до альв'язувальна активність або специфічність, рецептернативного варіанта, хазяї можуть співкультивуторзв'язувальна активність або специфічність, ватись із наданням ланцюгам можливості ефекторна функціональна активність тощо. Функспонтанного об'єднання у культуральному середоціональні фрагменти моноклонального антитіла вищі з подальшим виділенням складеного імуногвключають, наприклад, окремі важкі або легкі ланлобуліну чи фрагмента або ж як важкі, так і легкі цюги та їхні фрагменти, наприклад, VL, VH та Fd; ланцюги можуть експресуватись у одній клітинімоновалентні фрагменти, наприклад, Fv, Fab та хазяїні. Способи продукування химерних антитіл є Fab'; двохвалентні фрагменти, наприклад, F(ab')2; відомими у цій галузі (дивись, наприклад, патенти одноланцюгові Fv (scFv); та Fc-фрагменти. Опис США №6,284,471; №5,807,715; №4,816,567; та таких термінів можна знайти, наприклад, у Гарлоу №4,816,397). (Harlowe) та Лейн (Lane), Antibodies: A Laboratory "Гуманізованими" формами нелюдських (наManual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York приклад, мишачих) антитіл (тобто гуманізованими (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A антитілами), як застосовується у цьому описі, є Comprehensive Desk Reference (редактор Майєрс антитіла, що містять мінімальну послідовність (або Р.А. (Myers R.A.), New York: VCH Publisher, Inc.); жодної послідовності), одержану з нелюдського Хастон (Huston) та інші, Cell Biophysics, 22:189-224 імуноглобуліну. Більшою частиною, гуманізовані (1993); Плакган (Pluckthun) та Скерра (Skerra), антитіла є людськими імуноглобулінами (антитілоMeth. Enzymol., 178:497-515 (1989) та у Дей Е.Д. реципієнт), у яких залишки гіперваріабельної діля(Day E.D.), Advanced Immunochemistry, Second Ed., нки реципієнта замінюють на залишки гіперваріаWiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Термін "фунбельної ділянки нелюдського виду (антитілокціональний фрагмент" включає, наприклад, фрадонор), наприклад, миші, кролика, пацюка або гменти, які одержують шляхом протеазного розпримату окрім людини, що мають бажану специфіщеплення або відновлення моноклонального чність, спорідненість і потенціал. У деяких випадантитіла та методами рекомбінантних ДНК, відоках, залишки каркасної ділянки (FR) людського мих фахівцям у цій галузі. імуноглобуліну замінюють на відповідні нелюдські залишки. На додаток до цього, гуманізовані анти 37 90682 38 тіла можуть містити залишки, яких немає у антитіідентифікований і відокремлений та/або виділений ла-реципієнта або у антитіла-донора. Ці модифізі складової його природного середовища. Забрукації, як правило, здійснюють до додаткового поднювальними складовими природного середовиліпшення ефективності антитіла. Взагалі, ща згаданого поліпептиду є матеріали, які могли б гуманізоване антитіло буде містити по суті повний перешкодити діагностичному або терапевтичному щонайменше один, а, відповідно до типового варізастосуванню згаданого поліпептиду, і можуть анта, два варіабельні домени, у яких усі або по включати ферменти, гормони та інші білкові або суті усі гіперваріабельні петлі (гіперваріабельні небілкові розчинені речовини. Відповідно до певділянки) відповідають гіперваріабельним ділянкам них варіантів здійснення, виділений поліпептид є нелюдського імуноглобуліну, і усі або по суті усі очищеним (1) до рівня, що перевищує 95% (мас.) залишки каркасної ділянки є залишками послідовполіпептидів, як визначається за методом Лоурі, а ності людського імуноглобулілу. Гуманізоване анвідповідно до варіанта, якому віддається перевага, титіло може також містити принаймні частину конщо перевищує 99% (мас.), (2) до рівня, достатньостантної ділянки (Fc) імуноглобуліну, як правило, го для одержання щонайменше 15 залишків Nконстантної ділянки людського імуноглобуліну. кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовОпис зразкового способу, що застосовують для ності за допомогою секвенатора з роторним бараодержання гуманізованих антитіл, наведено у пабаном, або (3) до однорідності, що визначається тенті США №5,225,539. за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакТермін "імуноадгезин", що вживається у цьому риламідному гелі у присутності додецилсульфату описі, означає антитілоподібні молекули, що об'єнатрію) за відновних або невідновних умов із заднують зв'язувальний домен гетерологічного білбарвлюванням кумасі синім або сріблом. Виділека-"адгезину" (наприклад, рецептора, ліганду або ний поліпептид включає поліпептид in situ у межах ферменту), з константним доменом імуноглобулірекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна ну. У структурному відношенні, імуноадгезини явскладова природного середовища поліпептиду ляють собою злиття амінокислотної послідовності буде відсутньою. За звичайних умов, однак, видіадгезину з бажаною зв'язувальною специфічністю, лений поліпептид буде одержуватись впродовж яка відрізняється від сайта антитіла, призначеного щонайменше однієї стадії очищення. для розпізнавання і зв'язування антигену (антигенТермін "лікування", що вживається у цьому зв'язувальний центр антитіла) (тобто є "гетеролоописі, означає як терапевтичне лікування так і гічною"), з послідовністю константного домену імупрофілактичні або запобіжні заходи. До суб'єктів ноглобуліну. або хворих, які потребують лікування, належать Термін "домен зв'язування ліганду", що вживасуб'єкти або хворі, які вже мають розлад, а також ється у цьому описі, означає будь-який нативний ті, у яких згаданому розладу треба запобігти. рецептор або будь-яку ділянку або її похідну, що Терміни "розлад" і "захворювання", що вживазберігає принаймні якісну лігандзв'язувальну здатються у цьому описі взаємозамінно, означають ність відповідного нативного рецептора. Відповідбудь-який стан, для якого було б корисним лікуно до певних варіантів здійснення, рецептор поховання варіантом поліпептиду (поліпептид, що місдить із мембранного поліпептиду, що має тить варіант Fc-ділянки відповідно до цього винаекстрацелюлярний домен, який є гомологічним ходу), у тому числі хронічні і гострі розлади або члену надсімейства імуноглобулінових генів. Інзахворювання (наприклад, патологічні стани, які шими рецепторами, які не є членами надсімейства обумовлюють схильність хворого до конкретного імуноглобулінових генів, однак специфічно охопрозладу). Відповідно до певних варіантів здійсненлюються цим визначенням, є рецептори цитокінів ня, згаданим розладом є рак. Відповідно до певних і, зокрема, рецептори з тирозинкіназною активнісваріантів здійснення, термін "автоімунне захворютю (рецептори тирозинкіназ), члени надсімейств вання" вживається взаємозамінно з терміном "аврецепторів гемопоетину і фактора росту нервової тоімунний розлад" для позначення стану суб'єкта, тканини і молекули адгезії клітин (наприклад, Е-, Lщо характеризується пошкодженнями клітин, тката Р-селектини). нин та/або органів, спричиненими імунологічною Термін "рецепторзв'язувальний домен", що реакцією суб'єкта на свої власні клітини, тканини вживається у цьому описі, означає будь-який ната/або органи. Термін "запальне захворювання" тивний ліганд для рецептора, у тому числі, напривживають взаємозамінно з терміном "запальний клад, молекули адгезії клітин або будь-яку ділянку розлад" для позначення стану суб'єкта, що харакабо похідну такого нативного ліганду, що зберігає теризується запаленням. Автоімунні розлади мопринаймні кількісну рецепторзв'язувальну здатжуть асоціюватись або можуть не асоціюватись із ність відповідного нативного ліганду. запаленням. Більш того, запалення може спричиТермін "химера антитіло-імуноадгезин", що нюватись або може не спричинюватись автоімунвживається у цьому описі, означає молекулу, яка ним розладом. Певні розлади можуть одночасно об'єднує щонайменше один зв'язувальний домен характеризуватись як автоімунні і запальні розлаантитіла із щонайменше одним імуноадгезином. ди. Приклади включають (але без обмеження) біспеТерміни "рак" та "раковий", що вживаються у цифічні химери CD4-IgG, опис яких наведено у цьому описі, означають або описують фізіологічБерг (Berg) та інші, PNAS (USA) 88:4723-4727 ний стан ссавців, який, як правило, характеризу(1991) та Чарноу (Charnow) та інші, J. Immunol, ється нерегульованим ростом клітин. Прикладами 153:4268 (1994). раку (але без обмеження) є карцинома, лімфома, Термін "виділений" поліпептид, який вживабластома, саркома і лейкоз. Більш конкретними ється у цьому описі, означає поліпептид, який був прикладами таких раків є плоскоклітинний рак, 39 90682 40 дрібноклітинний рак легень, великоклітинний рак Як вживається у цьому описі, варіантом полілегень, аденокарцинома легень, плоскоклітинна пептиду, який "опосередковує антитілозалежну карцинома легень, рак очеревини, злоякісна гепаклітиноопосередковану цитотоксичність (ADCC) у тома, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлуприсутності людських ефекторних клітин із більнкової залози, гліобастома, рак шийки матки, рак шою ефективністю", аніж вихідне антитіло, є варіяєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатоант поліпептиду, який in vitro або in vivo є значно ма, рак молочної залози, рак товстої кишки, рак більш ефективним щодо опосередковування анастомозу ободової та прямої кишки, рак ендоADCC, коли кількість варіанта поліпептиду і вихідметрію або матки, рак слинних залоз, рак нирок, ного антитіла, що застосовується під час аналізу, є рак передміхурової залози, рак зовнішніх жіночих по суті однаковою. Наприклад, такий варіант спристатевих органів, рак щитовидної залози, печінкочинює більший рівень лізису клітин-мішеней при во-клітинний рак та рак голови та шиї різних типів. проведенні даного аналізу ADCC, аніж вихідний Термін "мітка", що вживається у цьому описі, ознаполіпептид під час ідентичного аналізу ADCC. Такі чає сполуку або композицію, що піддається виявваріанти можуть ідентифікуватись, наприклад, за ленню, яку кон'югують безпосередньо або опоседопомогою аналізу ADCC, однак застосовуватись редковано з поліпептидом. Згадана мітка може можуть також інші аналізи або методи визначення піддаватись виявленню сама по собі (наприклад, ADCC активності (наприклад, модельні тварини). радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або Відповідно до варіанта, якому віддається переваж, у разі ферментативної мітки, може каталізувати га, варіант поліпептиду є від приблизно 1,2 рази, хімічну зміну субстратної сполуки або композиції, 1,3 рази або 1,4 рази, 1,5 рази, 50 разів, 100 разів, яка піддається виявленню. приблизно 500 разів або приблизно у 1000 разів Термін "рецептор", що вживається у цьому більш ефективним щодо опосередковування описі, означає поліпептид, здатний до зв'язування ADCC, аніж вихідний поліпептид. щонайменше з одним лігандом. Рецептором, якоТермін "симптоми антитіло- або імуноадгезинму віддається перевага, є мембранний або розреагуючого захворювання" має відношення до тих чинний рецептор, що має екстрацелюлярний лігасимптомів, які взагалі асоціюються з конкретним ндзв'язувальний домен і, факультативно, інші захворюванням. Наприклад, симптомами, які за домени (наприклад, трансмембранний домен, внунормальних обставин асоціюються із хворобою трішньоклітинний домен та/або "мембранний Крону, є: біль у черевній порожнині, діарея, кровоякір"). Рецептором, який оцінюють за допомогою теча із прямої кишки, втрата маси, втрата апетиту, аналізу, опис якого наводиться, може бути інтактзневоднення, анемія, здуття живота, фіброз, запаний рецептор або його фрагмент чи похідна (налення кишечнику і недостатність харчування. Фраприклад, гібридний білок, що містить зв'язувальза "за таких умов, за яких інтенсивність симптомів ний домен рецептора, злитого з одним або зменшується" означає будь-який ступінь якісного декількома гетерологічними поліпептидами). або кількісного зменшення інтенсивності симптоБільш того, рецептор, який оцінюють щодо його мів, що піддаються виявленню, будь-якого антитізв'язувальних властивостей, може бути присутнім ло- або імуноадгезинреагуючого захворювання, у у клітині або ізольованим і, відповідно до факультому числі (але без обмеження) впливу, що піддатативного варіанта, нанесеним на аналітичний ється визначенню, на швидкість одужання від запланшет або якусь іншу тверду фазу або може хворювання (наприклад, швидкість приросту маси безпосередньо мітитись і застосовуватись як зонд. тіла) або зменшення інтенсивності принаймні одТермін "антитілореагуюче захворювання", що ного із симптомів, які за нормальних умов асоціювживається у цьому описі, означає будь-яке заються з конкретним захворюванням (наприклад, у хворювання або медичний стан, який, як показано, разі, якщо антитіло- або імуноадгезинреагуючим піддається лікуванню, принаймні частково, у разі захворюванням була б хворобаКрону, зниження застосування антитілотерапії. Приклади таких заінтенсивності принаймні одного з наведених нижче хворювань і медичних станів включають (але без симптомів: біль у черевній порожнині, діарея, крообмеження) лімфому (як було показано, піддаєтьвотеча із прямої кишки, втрата маси, втрата апеся лікуванню за допомогою RITUXAN), інфекційне титу, зневоднення, анемія, здуття живота, фіброз, захворювання (як було показано, респіраторнозапалення кишечнику і недостатність харчування). синцитіальний вірус піддається лікуванню за доМоноклональні антитіла та рецептори помогою SYNAGIS), трансплантат нирок (було Непроцесоване антитіло ("імуноглобулін" або показано, що корисним у цьому разі виявляється "Ig") у тому вигляді, у якому воно існує за природZENAPAX), хворобу Крона та ревматоїдний артрит них умов, являє собою молекулу імуноглобуліну, (як було показано, піддається лікуванню за допощо складається із чотирьох пептидних ланцюгів, могою REMICADE), рак молочної залози (як було двох важких (Н) ланцюгів (приблизно 50-70кДа, у показано, піддається лікуванню за допомогою разі повної довжини) і двох легких (L) ланцюгів HERCEPTIN) та рак товстої кишки (як було пока(приблизно 25кДа, у разі повної довжини), взаємозано, піддається лікуванню за допомогою зв'язаних дисульфідними зв'язками. Амінокінцева EDRECOLOMAB). Термін "імуноадгезинреагуюче частина кожного ланцюга включає варіабельну захворювання", що вживається у цьому описі, ділянку довжиною приблизно 100-110 амінокислот означає будь-яке захворювання або медичний або більше, що є відповідальною, головним чином, стан, який, як показано, піддається лікуванню, за розпізнавання антигену. Карбоксикінцева часпринаймні частково, у разі застосування імуноадтина кожного ланцюга утворює константну ділянку, гезинтерапії. що є відповідальною, головним чином, за ефекторну функцію. 41 90682 42 Легкі ланцюги класифікуються як каппа або ідентичними і будуть конкурувати, у разі провеламбда і характеризуються конкретною константдення твердофазного імуноферментного аналізу ною ділянкою. Важкі ланцюги класифікуються як (ELISA) за один і той самий антиген або антигенну гамма, мю, альфа, дельта або іпсилон і визначадетермінанту). ють ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, Термін "специфічно зв'язується" або "перевавідповідно. Важкий ланцюг кожного типу характежно зв'язується", що вживається у цьому описі, ризується конкретною константною ділянкою. має відношення до ситуації, при якій один із членів Кожен важкий ланцюг складається з варіабеспецифічної зв'язувальної пари значною мірою з льної ділянки важкого ланцюга (у цьому описі іншими молекулами, окрім свого(їх) специфічного("HCVR") і константної ділянки важкого ланцюга. их) зв'язувального(-их) партнера(-ів), не зв'язуєтьКонстантна ділянка важкого ланцюга складається ся. Згаданий термін вживається також у тому разі, із трьох доменів (CH1, СН2 та CH3) у разі IgG, IgD наприклад, коли антигензв'язувальний домен анта IgA; і 4 доменів (CH1, СН2, CH3 та СН4) у разі титіла відповідно до цього винаходу є специфічIgM та IgE. Кожен легкий ланцюг складається з ним для конкретної антигенної детермінанти, яку варіабельної ділянки легкого ланцюга (у цьому несе ряд антигенів, і у цьому разі специфічне анописі "LCVR") і константної ділянки легкого ланцютитіло, що несе антигензв'язувальний домен, буде га. Константна ділянка легкого ланцюга складаздатним до зв'язування різних антигенів, що неється з одного домену, CL. Згадані ділянки HCVR суть згадану антигенну детермінанту. та LCVR можуть додатково підрозділятись на гіпеFc-ділянка означає частину інтактного антитірваріабельні ділянки (CDRs), які називають також ла, наприклад, IgG, яку одержують шляхом розhv-ділянками, які чергуються з більш консервативщеплення за допомогою ферменту папаїну (диними ділянками, які називають каркасними ділянвись Фіг.1). Fc-ділянка являє собою гомодимер, де ками (FR). Кожна HCVR і LCVR складається із кожен ланцюг складається з частини шарнірної трьох гіперваріабельних ділянок і чотирьох каркаділянки, а також доменів СН2 і CH3. Згадана Fcсних ділянок, які розміщуються від амінокінця до ділянка є димером унаслідок міжланцюгових дисукарбоксильного кінця у такому порядку: FR1, льфідних зв'язків, які утворюються між шарнірними CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Номенклатура ділянками, і численних нековалентних зв'язків між амінокислот кожного домену відповідає добре відоменами CH3. IgG є найчисленнішим класом імудомим домовленостям [наприклад, Кебот (Kabat), ноглобулінів у організмі, він становить приблизно "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 75% загального об'єму імуноглобулінів і рівномірно National Institutes of Health, Bethesda, штат Мерірозподіляється між інтраваскулярними і екстраваленд (1991)]. Функціональна здатність антитіла до скулярними пулами. Дуже незначна кількість IgG зв'язування конкретного антигену колективно випродукується на ранніх стадіях первинної імунної значається шістьома гіперваріабельними ділянкавідповіді на антиген, однак він являє собою основми. Однак навіть один варіабельний домен, що ну форму антитіла, що продукується під час втомістить лише три гіперваріабельні ділянки, специринної імунної відповіді. фічні щодо антигену, може мати здатність до розЯк було описано вище, антитіла мають ділянпізнавання і зв'язування антигену, хоча і з нижчою ки, головним чином, ділянки СН2 та CH3, що залуспорідненістю, аніж повний Fab. чені до неантигензв'язувальних функцій. Разом ці Моноклональні антитіла відповідно до цього ділянки і частина лінкерної послідовності є загальвинаходу можуть продукуватись за допомогою, новідомими як Fc-ділянка, і мають декілька ефекнаприклад, методів гібридом, добре відомих у цій торних функцій, що опосередковуються шляхом галузі, а також рекомбінантних методів, методів зв'язування ефекторних молекул. проявлення у фагах, синтетичних методів або Ефекторні функції, опосередковані Fcкомбінацій таких методів, добре відомих у цій гаділянкою антитіла, можуть підрозділятись на дві лузі. Термін "моноклональне антитіло", що вживакатегорії: (1) ефекторні функції, які здійснюються ється у цьому описі, не обмежується антитілами, після зв'язування антитіла з антигеном (ці функції які продукують за допомогою методів гібридом. включають, наприклад, участь шляху активації "Моноклональне антитіло" означає антитіло, яке комплементу або клітини, що несуть Fc-рецептор одержують з однієї копії або клону, у тому числі, (FcR)); та (2) ефекторні функції, які здійснюються наприклад, будь-якого еукаріотного, прокаріотного незалежно від зв'язування антигену (ці функції або фагового клону, а не спосіб, за допомогою забезпечують, наприклад, персистенцію у системі якого його продукують. "Моноклональне антитіло" кровообігу і здатність до перенесення через кліможе бути інтактним (повним або непропесоватинні бар'єри шляхом трансцитозу). Наприклад, ним) антитілом, по суті інтактним антитілом, функзв'язування Clq складової комплементу з антитіціональним фрагментом антитіла або воно може лами активує систему комплементу. Після опсонібути химерним антитілом, людським антитілом зації, активація комплементу є важливим елеменабо гуманізованим антитілом. том процесу лізису клітинних патогенів. Активація Популяція "моноклональних антитіл" означає комплементу також стимулює запальну реакцію і однорідну або по суті однорідну (або чисту) попуможе бути залученою до автоімунної гіперчутлиляцію антитіл (тобто щонайменше приблизно 90%, вості. Окрім того, антитіла зв'язуються із клітинами 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, відповідно до вачерез Fc-ділянку, де сайт зв'язування Fcріанта, якому віддається більша перевага, щонайрецептора на Fc-ділянці антитіла зв'язується з FcR менше приблизно 97% або 98%, або відповідно до на клітині. Існує цілий ряд FcRs, специфічних для варіанта, якому віддається найбільша перевага, антитіл різних класів, у тому числі IgG, IgE, IgA та щонайменше 99% антитіл у згаданій популяції є IgM. Незважаючи на те, що цей винахід не обме 43 90682 44 жується жодним конкретним механізмом, зв'язумають значно інтенсивнішу реакцію, аніж 2 інші вання антитіла з FcR на поверхні клітини ініціює групи. ряд важливих і різноманітних біологічних реакції, у Fc RI, Fc RII та Fc RIII є рецепторами супертому числі поглинання і знищення частинок, сенродини імуноглобулінів (IgSF); Fc RI має три досибілізованих антитілом, кліренс імунних комплекмени IgSF на своєму екстрацелюлярному домені, сів, лізис сенсибілізованих антитілом клітину той час як на екстрацелюлярних доменах Fc RII мішеней клітинами-кілерами (ADCC), виділення та Fc RIII знаходиться лише по два домени IgSF. медіаторів запалення, трансплацентарний перехід Fc-рецептором іншого типу є Fc-рецептор новонаі контроль продукування імуноглобулінів. роджених (FcRn). FcRn у структурному відношенні Декілька ефекторних функцій антитіла опосеє подібним до головного комплексу гістосумісності редковуються FcRs, які зв'язують Fc-ділянку анти(МНС) і складається з -ланцюга, нековалентно тіла. FcRs визначаються за їхньою специфічністю зв'язаного з 2-мікроглобуліном. до ізотипів імуноглобулінів; Fc-рецептори IgG анВаріанти Fc-ділянок титіл позначають як Fc R, IgE як Fc R, IgA як Fc R Цей винахід пропонує варіанти поліпептидів, тощо. Були ідентифіковані три підкласи Fc R: нуклеїновокислотні послідовності, що кодують ваFc RI (CD64), Fc RII (CD32) та Fc RIII (CD16). ріанти поліпептидів, і способи одержання варіантів Оскільки кожен підклас Fc R кодується двома поліпептидів. Відповідно до варіанта, якому віддаабо трьома генами, а наслідком альтернативного ється перевага, варіанти поліпептидів відповідно сплайсингу РНК є утворення численних транскридо цього винаходу відрізняються від вихідного поптів, існує широке розмаїття ізоформ Fc R. Три ліпептиду щонайменше однією амінокислотною гени, що кодують підклас Fc RI (Fc RIA, Fc RIB та модифікацією, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, амінокислотною заміною. "ВихіFc RIC) утворюють кластер на ділянці І q21.1 довдний" поліпептид, поліпептид "дикого типу", "старгого плеча хромосоми 1; усі гени, що кодують ізотовий" або "неваріантний" поліпептид, відповідно форми Fc RII (Fc RIIA, Fc RIlB та Fc RIIC) і два до варіанта, якому віддається перевага, містить гени, що кодують Fc RIII (Fc RIIIA та Fc RIllB), принаймні частину Fc-ділянки антитіла, і амінокисутворюють кластер на ділянці 1q22. Ці різні підтилотна заміна у варіанті поліпептиду відбувається у пи FcR експресуються на клітинах різних типів (намежах Fc-ділянки. Вихідний поліпептид, що місприклад, Равеч (Ravetch) та Кінет (Kinet), Annu. тить Fc-ділянку, може бути одержаним за допомоRev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). У людей, напригою методів, доступних у цій галузі для одержання клад, Fc RlIIB знаходиться лише на нейтрофілах, у поліпептидів, що містять Fc-ділянку або її частину. той час як Fc RIIIA знаходиться на макрофагах, Відповідно да варіанта здійснення, якому віддамоноцитах, NK-клітинах та субпопуляції Т-клітин. ється перевага, вихідним поліпептидом є антитіло. Заслуговує на увагу те, що Fc RIIIA є присутнім на Однак вихідним поліпептидом може бути будьNK-клітинах, тобто на клітинах одного з типів, що який інший поліпептид, що містить принаймні часзалучені до ADCC. тину Fc-ділянки (наприклад, імуноадгезин). ЧастиРецептор людського Fc RIIIA (CD16) має просна Fc-ділянки у вихідному поліпептиді може бути тий поліморфізм у положенні 158 на екстрацелюнативною або ненативною послідовністю, відповілярному домені, що кодує фенілаланін або валін у дно до варіанта, якому віддається перевага, це цьому положенні. V алель Fc RIIIA має більшу нативна послідовність людського походження. спорідненість до людського lgG1, аніж F алель. Відповідно до певних варіантів здійснення, варіант V158 алель також опосередковує ADCC із більFc-ділянки може бути одержаним (наприклад, за шою ефективністю. Клінічні дані показали кореляметодами, опис яких розкривається у цьому описі) цію між генотипом рецептора Fc RIIIA у хворих, і злитим із відповідним гетерологічним поліпептияких піддають лікуванню рітуксаном (Rituxan), і дом, наприклад, із варіабельною ділянкою антитітерапевтичною реакцією. Було показано, що як ла або зв'язувальним доменом рецептора чи лігаклінічна, так і молекулярна реакції, а також час для нду або з будь-яким терапевтичним поліпептидом. прогресування, є більшими у хворих, гомозиготних Відповідно до варіанта, якому віддається пеза генотипом Fc RIIIA-158V (приблизно 20% попуревага, вихідний поліпептид містить Fc-ділянку ляції). У протилежність до цього, хворі, гетерозигоабо її функціональну частину. Взагалі, Fc-ділянка тні або гомозиготні за генотипом Fc RIIIA-158F вихідного поліпептиду буде являти собою Fcнижчої спорідненості (приблизно 80% популяції), ділянку нативної послідовності, а відповідно до реагують гірше. Ці дані дозволяють зробити приваріанта, якому віддається перевага, Fc-ділянку пущення, що Fc-мутації, які підсилюють ADCC аклюдської нативної послідовності. Однак Fc-ділянка тивність носіїв 158F, можуть підвищити клінічну вихідного поліпептиду може мати одну або декільефективність антитілотерапії раку. Генетичний ка попередньо існуючих змін або модифікацій аміполіморфізм також присутній у рецепторі людськонокислотної послідовності (наприклад, амінокисго Fc RIIA (CD32) у положенні 131 екстрацелюлялотну заміну), порівняно з Fc-ділянкою нативної рного домену, що кодує гістидин (Н) або аргінін (R) послідовності. Наприклад, попередньо зміненою у цьому положенні. Було встановлено, що полімогла бути Clq зв'язувальна активність Fc-ділянки морфізм у положенні 131 впливає на його здатабо зміненою могла бути Fc R зв'язувальна споріність до зв'язування з людським IgG. Нещодавні дненість Fc-ділянки. Бажаний варіант Fc-ділянки дані також демонструють кореляцію між поліморабо нуклеїнова кислота, що кодує варіант Fcфізмом Fc RIIA у положенні 131 і клінічною реакціділянки, який становить інтерес, може конструюєю на Rituxan. Хворі, гомозиготні за алелем Н131, ватись без функціонального зв'язку з бажаним гібридизаційним партнером варіанта Fc-ділянки 45 90682 46 (наприклад, варіабельною ділянкою антитіла, геСуттєві модифікації біологічних властивостей терологічним білком) із подальшим конструюванFc-ділянки можуть здійснюватись шляхом вибору ням для функціонального з'єднання з ним. Відпоамінокислотних замін, які значно різняться за свовідно до додаткових варіантів здійснення, Fcїм впливом на зміну (а) структури каркаса поліпепділянка вихідного поліпептиду є абстрактною (натиду на ділянці заміни, наприклад, складчастої або приклад, умоглядною або візуальним зображенспіральної конформації, (b) заряду або гідрофобням на комп'ютері або папері) і, без її фізичного ності молекули на сайті-мішені або об'єму бічного існування, генний інженер, який займається консланцюга, (d) взаємодії з вуглеводом або (e) гнучтруюванням антитіл, може прийняти рішення відкості руху домену. Природні залишки підрозділяносно амінокислотної послідовності бажаного ваються на класи на основі простих властивостей ріанта Fc-ділянки і одержати поліпептид, що бічних ланцюгів: містить таку послідовність або ДНК, яка кодує амі(1) гідрофобні: norleucine, met, ala, val, leu, ile; нокислотну послідовність бажаного варіанта Fc(2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; ділянки. Однак, відповідно до варіанта, якому від(3) кислотні: asp, glu; дається перевага, нуклеїнова кислота, що кодує (4) основні: asn, gln, his, lys, arg; Fc-ділянку вихідного поліпептиду, є доступною і цю (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланнуклеїновокислотну послідовність змінюють для цюгів: gly, pro; та одержання варіанта нуклеїновокислотної послідо(6) ароматичні: trp, tyr, phe. вності, що кодує варіант Fc-ділянки. Неконсервативні заміни потягнуть за собою Нуклеїнову кислоту, що кодує варіант вихіднозаміну члена одного з цих класів на член іншого го поліпептиду (або просто варіант Fc-ділянки), класу. Консервативні заміни потягнуть за собою можна одержати за допомогою методів, відомих у заміну члена одного із цих класів на інший член цій галузі, із застосуванням вказівок, наведених у того самого класу. цьому описі для конкретних послідовностей. Ці Як показано у Прикладах, наведених нижче, методи включають (але без обмеження) одержанможна сконструювати варіант Fc-ділянки зі зміненя шляхом сайтспрямованого (або із застосуванною активністю (ефекторна(-і) функція(-ії) та/або ням олігонуклеотидів) мутагенезу, PCR (полімерафармакокінетика). Можна, наприклад, модифікузна ланцюгова реакція) мутагенезу (наприклад, вати один або декілька залишків амінокислот FcВаллетт (Vallette) та інші, Nuc. Acids Res. 17:723ділянки для зміни (наприклад, підвищення або 733 (1989) і касетного мутагенезу (наприклад, зменшення) ADCC активності чи CDC активності Уеллс (Wells) та інші, Gene 34:315-323 (1985) поабо FcRn-зв'язувальної спорідненості. Відповідно передньо одержаної нуклеїнової кислоти, що кодо варіанта, якому віддається перевага, модифідує згаданий поліпептид. Сайтспрямований мутакація являє собою заміну, як вказано у наведеній у генез є методом одержання варіантів, якому цьому описі Таблиці 1. Взагалі, можна здійснити віддається перевага. Цей метод є добре відомим у амінокислотну заміну на одному або декількох цій галузі (дивись, наприклад, Картер (Carter) та залишках Fc-ділянки, які ідентифікуються у цьому інші, Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) і Кунописі, як такі, що впливають на ADCC активність, з кел (Kunkel) та інші, Proс. Natl. Acad. Sci. USA метою одержання такого варіанта Fc-ділянки. Від82:488 (1987)). повідно до варіанта, якому віддається перевага, Відповідно до альтернативного варіанта або замінюватись буде не більше від одного до прибдодатково, бажана амінокислотна послідовність, лизно десяти залишків Fc-ділянки. Fc-ділянки за що кодує варіант поліпептиду, може бути визначецим описом, що містять одну або декілька амінона, а нуклеїновокислотна послідовність, що кодує кислотних замін, будуть, відповідно до варіанта, таку амінокислотну послідовність варіанта поліпеякому віддається перевага, зберігати щонайменше птиду (наприклад, поліпептиду, що містить варіант приблизно 80%, відповідно до варіанта, якому відFc-ділянки, що містить амінокислотну заміну, як дається перевага, щонайменше приблизно 90%, а описано у цьому описі) може бути одержана синвідповідно до варіанта, якому віддається найбільтетичним шляхом. Це все ще вважається варіанша перевага, щонайменше приблизно 95% послітом Fc-ділянки вихідної Fc-ділянки, незважаючи на довності вихідної Fc-ділянки або нативної послідоте, що вихідна Fc-ділянка не була молекулярним вності людської Fc-ділянки. попередником варіанта Fc-ділянки, а була, замість Шляхом введення відповідної(-их) модифікацього, амінокислотною послідовністю Fc-ділянки, ції(-ій) амінокислотної послідовності до вихідної присутньою у вихідному матеріалі за відсутності Fc-ділянки, можна одержати варіант Fc-ділянки, бажаної амінокислотної заміни. який (у разі порівняння з вихідною Fc-ділянкою) (а) Амінокислотна послідовність вихідного поліпеопосередковує ADCC у присутності людських ефептиду може модифікуватись з метою одержання кторних клітин із більшою або меншою ефективніваріанта Fc-ділянки зі зміненою зв'язувальною стю та/або (b) опосередковує CDC у присутності спорідненістю Fc-рецептора або активністю in vitro людського комплементу з більшою або меншою та/або in vivo: та/або зміненою ADCC активністю in ефективністю та/або (с) зв'язує C1q з бажаною vitro та/або in vivo; та/або зміненою CDC активнісспорідненістю та/або (d) зв'язує Fc-гамматю in vitro та/або in vivo. Амінокислотна послідоврецептор (Fc R) або Fc-рецептор новонароджених ність вихідного поліпептиду може також модифіку(FcRn) із бажаною спорідненістю. Такі варіанти Fcватись із метою одержання варіанта Fc-ділянки зі ділянок будуть, як правило, містити щонайменше зміненими комплементзв'язувальними властивосодну амінокислотну модифікацію на Fc-ділянці. тями та/або періодом півжиття у кров'яному руслі. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданою модифікацією є амінокислотна замі 47 90682 48 на, відповідно до варіанта, якому віддається більамінокислотної модифікації(-ій), які розкриваються ша перевага, амінокислотна заміна, вказана у нау цьому описі, наслідком чого є зміна зв'язування ведених у цьому описі Таблицях 1-9. Fc-рецептора та/або ADCC активності та/або CDC Відповідно до варіанта, якому віддається пеактивності. ревага, Fc-ділянкою вихідного поліпептиду є людВідповідно до альтернативного варіанта або ська Fc-ділянка або її функціональний фрагмент, додатково, корисним може бути об'єднання амінонаприклад, нативна людська Fc-ділянка людського кислотних модифікацій з однією або декількома lgG1 (f та а, z алотипи), IgG2, IgG3, IgG4 та усі відодатковими амінокислотними модифікаціями, що домі або відкриті алотипи будь-яких видів. Такі змінюють Clq зв'язувальну та/або CDC функцію ділянки мають нативні послідовності, наприклад, Fc-ділянки. Наприклад, вихідний поліпептид може послідовності, показані на наведених у цьому опибути нездатним до зв'язування Clq та/або опосесі Фіг.2 (послідовності №1-8) та Фіг.3 (послідовносредковування CDC і може бути модифікованим за ті №9-12). методикою, наведеною у цьому описі, таким чиВідповідно до певних варіантів здійснення, для ном, що він набуде ці додаткові ефекторні функції. одержання варіанта Fc-ділянки з посиленою ADCC Більш того, поліпептиди з попередньо існуючою активністю, вихідний поліпептид, відповідно до Clq зв'язувальною активністю, які, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, має поперефакультативного варіанта, додатково мають здатдньо існуючу ADCC активність (наприклад, вихідність до опосередковування CDC, можуть бути ний поліпептид містить Fc-ділянку людського lgG1 модифіковані таким чином, що одна або обидві або людського IgG3). Відповідно до деяких варіанзгадані активності будуть посиленими (або, відпотів здійснення, варіант має посилену ADCC активвідно до альтернативного варіанта, ослабленими). ність (наприклад, більш високі рівні, порівняно з Опис певних амінокислотних модифікацій Fcвихідним матеріалом, за результатами аналізу ділянки, що змінюють Clq зв'язувальну активність ADCC, опис якого наведено), порівняно з вихідним та/або модифікують CDC активність, наведено у поліпептидом, тобто моноклональне антитіло, що цьому описі (дивись Таблицю 2, Таблицю 7, Табмістить варіант Fc-ділянки, має посилену ADCC лицю 8 і Таблицю 10) і, наприклад, у WO 0042072. активність, порівняно, за ідентичних обставин, з Як було розкрито вище, може бути сконструмоноклональним антитілом, що містить вихідну Fcйована Fc-ділянка або її частина зі зміненою ефеділянку або нативну послідовність Fc-ділянки lgG1 кторною функцією, наприклад, шляхом модифікуабо IgG3, але, за всіх інших умов, ідентичну з мовання CDC активності та/або ADCC активності. ноклональним антитілом, що містить варіант FcНаприклад, можна одержати варіант Fc-ділянки з ділянки. поліпшеною CDC активністю або поліпшеною Відповідно до варіанта, якому віддається пеADCC активністю. Відповідно до альтернативного ревага, амінокислотну(-і) заміну(-и) вводять до варіанта, коли виникає необхідність у зниженні або СН2 та/або CH3 доменів Fc-ділянки. Відповідно до ліквідації ефекторної функції, може бути сконструваріанта, якому віддається перевага, вихідна Fcйованим варіант Fc-ділянки зі зниженою CDC акділянка, що застосовується як матриця для одертивністю та/або зниженою ADCC активністю. Віджання таких варіантів, містить Fc-ділянку людськоповідно до інших варіантів здійснення, може бути го IgG. підвищена лише одна із цих активностей і, відповіВідповідно до певних варіантів здійснення, для дно до альтернативного варіанта, також знижена одержання варіанта Fc-ділянки з посиленою CDC інша активність, наприклад, може бути одержаний активністю, вихідний поліпептид, відповідно до варіант Fc-ділянки з поліпшеною ADCC активнісваріанта, якому віддається перевага, має поперетю, але зниженою CDC активністю і навпаки. На дньо існуючу CDC активність. Відповідно до дедодаток до цього, можна сконструювати варіант яких варіантів здійснення, варіант має посилену Fc-ділянки з модифікованою зв'язувальною споріCDC активність (наприклад, більш високі рівні, дненістю до FcRn, білка А та/або інших Fcпорівняно з вихідним матеріалом, за результатами зв'язувальних білків. аналізу CDC, опис якого наведено), порівняно з Відповідно до деяких варіантів здійснення, цей вихідним поліпептидом, тобто моноклональне анвинахід пропонує композиції, що містять варіант титіло, що містить варіант Fc-ділянки, має посилевихідного поліпептиду, де вихідний поліпептид ну CDC активність, порівняно, за ідентичних обмістить Fc-ділянку (або її частину) і де варіант місставин, із моноклональним антитілом, що містить тить щонайменше одну модифікацію мембранного вихідну Fc-ділянку або нативну послідовність Fcзалишку амінокислоти у межах Fc-ділянки (дивись, ділянки lgG1 або IgG3, але, за всіх інших умов, наприклад, Дізенхофер (Deisenhofer), Biochemistry, ідентичну з моноклональним антитілом, що міс20:2361-70, квітень 1981, та WO 0042072). Відповітить варіант Fc-ділянки. дно до інших варіантів здійснення, цей винахід Варіанти поліпептидів, опис яких наведено, пропонує композиції, що містять варіант вихідного можуть бути піддані додатковим модифікаціям, у поліпептиду, що має Fc-ділянку, де згаданий варізалежності від бажання або гаданого застосування ант містить щонайменше одну модифікацію немеполіпептиду. Такі модифікації можуть включати, мбранного залишку амінокислоти у межах Fcнаприклад, додаткову зміну амінокислотної посліділянки. Відповідно до додаткових варіантів здійсдовності (заміна, інсерція та/або делеція залишків нення, цей винахід пропонує варіант вихідного амінокислот), модифікації вуглеводів, злиття з геполіпептиду, що має Fc-ділянку, де згаданий варітерологічним(-и) поліпептидом(-ами) та/або коваант містить щонайменше одну модифікацію мемлентні модифікації. Такі додаткові модифікації мобранної амінокислоти і щонайменше одну модифіжуть здійснюватись перед, одночасно з або після 49 90682 50 кацію немембранної амінокислоти, обидві з яких зміни у варіанті, порівняно з вихідним поліпептизнаходяться у межах Fc-ділянки. дом (відбіркові аналізи пропонуються, наприклад, Комбінаторні варіанти у WO 0042072). Опис додаткових зразкових аналіВідповідно до деяких варіантів здійснення, вазів наведено нижче. ріант Fc-ділянки відповідно до цього винаходу місВідповідно до варіанта здійснення, якому відтить дві або декілька амінокислотних модифікацій дається перевага, варіант поліпептиду (тобто по(наприклад, замін). Такі комбінаторні варіанти моліпептид, що містить варіант Fc-ділянки відповідно жна одержати, наприклад, шляхом вибору двох до цього винаходу або її функціональну частину) або декількох амінокислотних замін, докладний являє собою моноклональне антитіло, яке по суті опис яких наведено вище (дивись, наприклад, зберігає здатність до специфічного зв'язування Таблицю 1), або однієї чи декількох амінокислотантигену (через немодифіковану антигензв'язуваних замін, які наведені у Таблиці 1, на додаток до льну ділянку або модифіковану антигензв'язувазаміни, відомої у цій галузі. льну ділянку), порівняно з вихідним поліпептидом Комбінаторні варіанти, наведені у Таблиці 1, (наприклад, здатність до зв'язування, відповідно та інші комбінаторні варіанти (наприклад, заміни, до варіанта, якому віддається перевага, менше ніж розкриті у WO 0042072, застосовані у поєднанні із у 20 разів, 10 разів, 7 разів або менше ніж у прибзамінами, розкритими у цьому описі), можуть вилизно 5 разів відрізняється від здатності до зв'язупробуватись на певну активність (наприклад, вання вихідного поліпептиду). Здатність до зв'язуFcRn-зв'язувальна активність, ADCC активність і вання варіанта поліпептиду з антигеном може CDC активність) за допомогою різноманітних анавизначатись за допомогою таких методів, як ELISA лізів (приклади дивись нижче). У цьому відношен(твердофазний імуноферментний аналіз), FACS ні, можуть бути ідентифіковані корисні комбінатор(клітинний сортер зі збудженням флуоресценції)ні варіанти. аналіз або радіоімунопреципітація (радіоімунний Відповідно до певних варіантів, яким віддаєтьаналіз); наприклад, аналіз зв'язування FcR може ся перевага, численні амінокислотні заміні, присузастосовуватись для оцінки варіантів відповідно тні у варіанті Fc-ділянки відповідно до цього винадо цього винаходу. Наприклад, зв'язування Fcходу, мають одну амінокислотну заміну, яка рецепторів, наприклад, Fc RI, Fc RIIa, Fc RIIb, підвищує ADCC активність, і одну амінокислотну Fc RIII, FcRn тощо, може визначатись шляхом модифікацію, яка підвищує спорідненість до зв'ятитрування варіанта поліпептиду і визначення зування Fc-рецептора новонароджених (FcRn) зв'язаного варіанта поліпептиду за допомогою (наприклад, при рН 6,0) поліпептиду, що містить антитіла, яке зв'язується з варіантом поліпептиду у варіант Fc-ділянки. Відповідно до інших варіантів форматі ELISA (дивись Приклади, наведені нижздійснення, комбінаторні варіанти відповідно до че). Наприклад, варіант, що містить антитіло, може цього винаходу мають одну мембранну амінокисперевірятись за допомогою стандартного твердолотну модифікацію у варіанті Fc-ділянки відповідфазного імуноферментного аналізу для визначенно до цього винаходу і одну немембранну амінокиня зв'язування з FcRn при рН 6,0 або рН 7,0 чи рН слотну модифікацію. Додаткові комбінаторні 7,4. Тверда поверхня, сенсибілізована стрептавіваріанти у варіантах Fc-ділянок відповідно до цьодином або нейтравідином, може застосовуватись го винаходу можуть бути одержані шляхом об'єддля іммобілізації міченого біотином FcRn від будьнання двох або декількох амінокислотних замін, якого виду, наприклад, миші або людини. Після опис яких наведено, або щонайменше однієї аміблокування, іммобілізований рецептор може інкунокислотної заміни, опис якої наведено у цьому буватись із варіантами поліпептидів (наприклад, описі, із замінами, опис яких наведено, наприклад, антитілами), розбавленими у буферних розчинах у WO 0042072. при рН 6,0 або рН 7,0. На наступній стадії додають Аналізи варіантів поліпептидів молекулу, специфічну для людських антитіл (наЦей винахід пропонує різноманітні аналізи для приклад, козячий (Fab')2 анти-людський-Fab, кон'юперевірки варіантів Fc-ділянок або поліпептидів, гований з ферментом). У подальшому може додащо містять варіант Fc-ділянки відповідно до цього ватись субстрат із метою визначення рівня винаходу. Відбіркові аналізи можуть застосовувазв'язування варіанта поліпептиду з іммобілізоватись для віднаходження або підтвердження корисним FcRn при рН 6,0 або рН 7,0 чи рН 7,4. Резульних варіантів. Наприклад, комбінаторні варіанти тати цього аналізу можуть порівнюватись зі здат(дивись, наприклад, Таблицю 10) можуть перевіністю вихідного (неваріантного) поліпептиду до рятись для віднаходження варіантів зі зміненим зв'язування того самого FcR. Відповідно до інших FcR зв'язуванням та/або зміненою ADCC активнісваріантів здійснення, яким віддається перевага, тю та/або зміненою CDC активністю (наприклад, складові для здійснення ELISA (наприклад, з підвищеною або зниженою ADCC чи CDC активніFcRn) для перевірки варіантів, пакуються до набостю) та/або модифікованою здатністю до вичерру (наприклад, з інструкціями щодо застосування). пання клітин-мішеней (наприклад, В-клітин) із ціАналіз ADCC може також застосовуватись для льної крові. Окрім того, як описано нижче, аналізи перевірки варіантів відповідно до цього винаходу. відповідно до цього винаходу можуть застосовуваАналізи ADCC можуть здійснюватись in vitro або in тись для віднаходження або підтвердження варіаvivo. Для оцінки ADCC активності варіанта поліпентів, що мають благотворну терапевтичну активптиду, in vitro аналіз ADCC може здійснюватись із ність у суб'єкта (наприклад, у людини із застосуванням різних відношень ефектор:мішень. симптомами антитіло- або імуноадгезинреагуючоУ зразковому аналізі ADCC може застосовуватись го захворювання). Аналізи різноманітних типів молінія клітин-мішеней, що експресують будь-який із жуть застосовуватись для визначення будь-якої наведених нижче антигенів-мішеней: CD20, CD22, 51 90682 52 CD33, CD40, CD63, рецептор EGF (епідермальний Варіанти відповідно до цього винаходу можуть фактор росту), рецептор her-2, простатаспецифічтакож перевірятись на активацію комплементу. ний мембранний антиген, вуглевод Lewis Υ, гангДля оцінки активації комплементу може бути здійліозиди GD2 та GD3, lamp-i, СО-029, L6 та ephA2. сненим аналіз CDC (дивись, наприклад, ГаззаноЕфекторні клітини можна одержати від здорового Санторо (Gazzano-Santoro) та інші, J. Immunol. донора (наприклад, у день проведення експериMethods, 202:163 (1996)). Наприклад, різні конценменту) та з РВМС (мононуклеари периферичної трації варіанта поліпептиду і людського комплемекрові), очищених за допомогою Histopaque (фірма нту можуть розбавлятись буферним розчином. Sigma). Після цього клітини-мішені піддають попеКлітини, що експресують антиген, з яким зв'язуредньому інкубуванню з IgG, що містить варіант ється варіант поліпептиду, можуть розбавлятись Fc-ділянки відповідно до цього винаходу, напридо густини 1 106клітин/мл. Суміші варіанта поліклад, 0,1-1000нг/мл впродовж 30хв перед змішупептиду, розбавленого людського комплементу і ванням з ефекторними клітинами при співвідноклітин, що експресують антиген, можуть наносишеннях ефектор:мішень, наприклад, 40:1, 20:1 та тись на 96-лунковий плоскодонний планшет для 10:1. Після цього ADCC активність може визначакультури тканини та інкубуватись впродовж 2год тись колориметричним шляхом за допомогою напри температурі 37°С у атмосфері 5% СО2 для бору для виявлення цитотоксичності (Cytotoxicity полегшення комплементопосередкованого лізису Detection Kit) (фірма Roche Molecular Biochemicals) клітин. Після цього до кожної лунки може бути додля кількісного визначення загибелі і лізису клітин, даним 50мкл барвника аламара синього (фірма виходячи з результатів визначення активності лакAccumed International) з подальшим інкубуванням татдегідрогенази (LDH), яка вивільнюється із цитовпродовж ночі при температурі 37°С. Оптична гусзолю пошкоджених клітин до надосадової рідини. тина може визначатись за допомогою 96Рівень ADCC активності, у разі аналізу клітинлункового флуориметра зі збудженням при 530нм і мішеней, мічених хромом, може визначатись шляемісією при 590нм. Результати можуть виражатись хом визначення кількості виділеного хрому 51. у відносних одиницях флуоресценції (RFU). КонАнтитілонезалежна клітинна цитотоксичність може центрації зразків можуть обчислюватись за станвизначатись шляхом визначення активності LDH із дартною кривою і відсоток активності, порівняно з клітин-мішеней та ефекторних клітин за відсутносневаріантним поліпептидом, може повідомлятись ті антитіла. Загальне вивільнення може визначадля варіанта поліпептиду, що викликає інтерес. тись після додання 1% тритон Х-100 до суміші кліВідповідно до певних варіантів здійснення, ватин-мішеней та ефекторних клітин. Інкубація ріанти поліпептидів відповідно до цього винаходу клітин-мішеней та ефекторних клітин може здійсне активують або слабо активують комплемент. нюватись впродовж оптимізованого періоду часу Наприклад, варіант поліпептиду демонструє приб(0,54-18год) при температурі 37°С у атмосфері 5% лизно 0-10% CDC активність у цьому аналізі, поріСO2 з подальшим центрифугуванням аналітичних вняно з контрольним антитілом, що має немутовапланшетів. Надосадові рідини після цього можуть ну Fc-ділянку lgG1. Відповідно до варіанта, якому переноситись до 96-лункових планшетів і інкубувіддається перевага, цей варіант, як видається, ватись з реактивом для виявлення LDH впродовж зовсім не має CDC активності (наприклад, яка пе30хв при температурі 25°С. Після цього, за допоревищувала б фонову) у вищезгаданому аналізі могою планшет-рідера, може визначатись оптична CDC. Відповідно до інших варіантів здійснення, густина зразка при 490нм. Після цього відсоток встановлено, що варіант поліпептиду відповідно цитотоксичності може обчислюватись за допомодо цього винаходу має підвищену CDC, порівняно гою наведеного нижче рівняння: відсоток цитотокз вихідним поліпептидом (наприклад, із демонсичності=експериментальне значення-контроль з струванням, відповідно до варіанта, якому відданизьким рівнем/контроль з високим рівнемється перевага, підвищення CDC активності in vitro контроль з низьким рівнем 100%. Відсоток цитотоабо in vivo приблизно від 1,1 разу, 1,5 разу, 1,7 ксичності анти-CD20 і варіантів може після цього разу або 2 разів до приблизно 100 разів (або більбезпосередньо порівнюватись із рівною кількістю ше), у разі порівняння значень ІС50)· RITUXAN для одержання критерію відносної ефекВаріанти поліпептидів відповідно до цього витивності. У зразковому аналізі ADCC можуть занаходу можуть також перевірятись на вичерпання стосовуватись клітини SKW6.4, що надекспресуклітин-мішеней у аналізі проб цільної крові. Наприють антиген CD20 (наприклад, закуплений від клад, різні концентрації варіанта поліпептиду зі Американської колекції типових культур) як джеспецифічністю, спрямованою на CD20, можуть рело клітин-мішеней. У цій галузі відомо багато перевірятись на вичерпання В-клітин у аналізі варіантів цього аналізу (наприклад, Цукерман проб цільної крові за допомогою FACS (клітинний (Zuckerman) та інші, CRC Crit Rev Microbiol сортер зі збудженням флуоресценції) (Вагмейстер 1978;7(1):1-26). (Vugmeyster) та інші, 2003 Cytometry 52A, 101-109). Придатними ефекторними клітинами для проПроби свіжовідібраної крові інкубують із різними ведення таких аналізів (але без обмеження) є NKконцентраціями варіанта поліпептиду при темпеклітини, макрофаги та інші РВМС. Відповідно до ратурі 37°С у атмосфері 5% СО2 впродовж 4год альтернативного варіанта або додатково, ADCC (час може змінюватись). Після інкубування еритактивність варіантів поліпептидів відповідно до роцити піддають лізису за інструкціями виробника цього винаходу може оцінюватись in vivo, наприза допомогою хлориду амонію (фірма Becktonклад, на тваринних моделях, як розкрито наприDickinson, номер за каталогом 555899) і В-клітини клад, у Клайнс (Clynes) та інших, PNAS (USA) виявляють за допомогою FACS із застосуванням 95:652-656 (1998)). міченого флуоресцентним реактивом антитіла, 53 90682 54 специфічного до В-клітин (наприклад, анти-CD19). 0,5год, 1год, 24год, 48год, 72год, 96год, 120год, Результати можуть бути вираженими як відсоткове 168год та 336год. Дані можуть підбиратись, напривичерпання В-клітин відносно необробленої проби клад, за допомогою фармакокінетичної програми або проби, інкубованої зі стороннім (невичерпним) (WinNonLin) із застосуванням двохкамерної моделі антитілом. з нульовим запізнюванням для визначення імунноВідповідно до варіанта здійснення, якому відго кліренсу. Імунний кліренс може застосовуватись дається перевага, варіант поліпептиду вичерпує Вдля визначення постійного рівня у плазмі за допоклітини з більшою ефективністю, аніж вихідний могою наведеного нижче рівняння: поліпептид. Варіант поліпептиду може вичерпуваС=Доза/(Імунний кліренс Т), де Τ являє собою ти В-клітини, наприклад, з інтенсивністю, яка приінтервал між дозами, а С - рівень у плазмі у стаціблизно у два рази або більше перевищує відповідонарному стані. Фармакокінетичні експерименти ну характеристику вихідного поліпептиду, а можуть проводитись на мишах, що не мають пухвідповідно до варіанта, якому віддається перевага, лин, наприклад, як мінімум, на 5 мишах/момент приблизно у п'ять разів або більше. Окрім того, часу. варіант може демонструвати більшу активність Типові тваринні моделі можуть застосовуващодо вичерпування В-клітин. Наприклад, варіант тись на наступній стадії таким чином. До правого може вичерпувати той самий відсоток В-клітин, боку мишей лінії СВ17 із тяжким комбінованим порівняно з вихідним поліпептидом, однак застоімунодефіцитом підшкірно імплантували 106 Rajiсовувати для цього приблизно у п'ять разів, а відклітин. Внутрішньовенне введення ударних доз повідно до варіанта, якому віддається перевага, варіанта Fc-антитіла, Fc-антитіла дикого типу та приблизно у десять разів меншу кількість антитіл. RITUXAN може розпочинатись негайно після імВичерпання клітин-мішеней, опосередковане варіплантації і продовжуватись доти, доки діаметр антами, може бути поліпшеним приблизно від 2 пухлини не стане більшим за 2см. Об'єм пухлини разів, 3 разів, 5 разів до приблизно 1000 разів або може визначатись кожного понеділка, середи та більше, а відповідно до варіанта, якому віддається п'ятниці шляхом визначення довжини, ширини та перевага, поліпшеним приблизно від 5 разів до глибини пухлини за допомогою штангенциркуля приблизно 1000 разів порівняно з вихідним полі(об'єм пухлини=ширина довжина глибина). Крива пептидом. часової залежності об'єму пухлини придається для Варіанти відповідно до цього винаходу можуть визначення швидкості росту пухлини для фармаперевірятись також in vivo. Може бути застосовакодинамічних обчислень. Слід застосовувати як ним in vivo аналіз будь-якого типу. Конкретний мінімум приблизно 10 тварин на групу. приклад аналізу одного типу наведено нижче. Цей Порівняння фармакодинаміки варіанта Fcзразковий аналіз надає можливість передклінічної антитіла, Fc-антитіла дикого типу та RITUXAN на оцінки Fc-варіантів in vivo. Варіант, призначений Стадії II може здшснюватись таким чином. Виходля випробування, може бути включеним до Fcдячи з опублікованих даних, RITUXAN у дозі ділянки конкретного антитіла, яке, як відомо, має 10мкг/г на тиждень повністю пригнічував ріст пухтаку саму активність. Наприклад, варіант може лин in vivo (Клайнс (dynes) та інші, Nat. Med. 6:443бути включеним до Fc-ділянки анти-CD20 IgG 446, 2000). Таким чином, перевірці може піддавашляхом мутагенезу. Це надає можливість безпотись щотижневий діапазон доз 10мкг/г, 5мкг/г, середнього порівняння вихідного IgG та Fc1мкг/г, 0,5мкг/г та 0мкг/г. Постійний рівень у плазмі, варіанта IgG з RITUXAN (відомо, що цей препарат при якому швидкість росту пухлин пригнічується на стимулює регрес пухлин). Передклінічна оцінка 50%, може графічно визначатись залежністю між може здійснюватись 2 стадіями (фармакокінетична постійним рівнем у плазмі та ефективністю. Посі фармакодинамічна стадія). Мета фармакокшетитійний рівень у плазмі може обчислюватись, як чних досліджень Стадії І полягає у визначенні ісописувалось вище. У разі необхідності, значення τ нування різниць імунного кліренсу Fc-варіанта IgG може відповідним чином коректуватись для кожнота антитіла з відомою in vivo активністю (наприго варіанта Fc-антитіла та Fc-антитіла дикого типу, клад, RITUXAN). Різниці імунного кліренсу можуть у залежності від їх фармакокінетичних властивосспричинювати різниці постійного рівня IgG у сиротей, для одержання порівнянного з RITUXAN посватці. У разі виявлення різниць у постійних концетійного рівня у плазмі. Статистично поліпшені фантраціях, вони повинні бути нормалізованими для рмакодинамічні значення варіанта Fc-антитіла, забезпечення можливості здійснення точних поріпорівняно з вихідним поліпептидом (наприклад, внянь. Мета фармакодинамічних досліджень СтаFc-антитілом дикого типу) та RITUXAN, будуть, дії II полягає у визначенні впливу мутацій Fc на, у взагалі, вказувати на те, що варіант Fc-антитіла цьому разі, розвиток пухлини. У попередніх дослізабезпечує поліпшену активність in vivo. дженнях RITUXAN застосовували одноразову доДодаткове фармакодинамічне порівняння вазу, яка повністю пригнічувала розвиток пухлини. ріантів Fc-антитіл, Fc-антитіл дикого типу та Оскільки це не надає можливості визначення кільRITUXAN може здійснюватись на макакахкісних різниць, слід застосувати діапазон доз. крабоїдах, як описувалось раніше (Рефф (Refi) та Фармакокінетичне порівняння Fc-варіанта, виінші, Blood 83, 435-445, 1994). Крива залежності хідної Fc дикого типу та RITUXAN на Стадії І може "доза-ефект" для вичерпання периферичних Вздійснюватись, наприклад, наведеним нижче чиклітин та В-клітин лімфовузлів може застосовуваном. По-перше, 40мкг (або інша доза, призначена тись для порівняння відносної активності Fcдля випробування) на тварину може вводитись варіантів із Fc дикого типу та RITUXAN, які були внутрішньовенним шляхом із кількісним визначенвведені внутрішньовенно та/або підшкірно. Статиням рівнів IgG у плазмі через 0 год, 0,25год, стично поліпшені фармакодинамічні значення Fc 55 90682 56 варіанта, порівняно з вихідним поліпептидом (надодатково включає стадію f) ідентифікування варіприклад, Fc дикого типу) та RITUXAN, будуть, взаанта-кандидата, як двовидовий поліпшений варігалі, вказувати на те, що варіант Fc-антитіла заант, що опосередковує цитотоксичність клітинбезпечує поліпшену активність in vivo. мішеней у присутності ефекторних клітин другого Відповідно до варіанта здійснення, якому відвиду з більшою ефективністю, аніж вихідний полідається перевага, варіанти (тобто поліпептид, що пептид. Відповідно до варіанта здійснення, якому містить варіант Fc-ділянки відповідно до цього віддається перевага, ідентифіковані двовидові винаходу або його функціональну частину) відповаріанти після цього перевіряють in vivo за доповідно до цього винаходу перевіряють таким чином, могою одного або декількох аналізів на тваринах. що ідентифікуються варіанти, придатні для тераВідповідно до певних варіантів здійснення, певтичного застосування щонайменше на двох двовидові поліпшені варіанти спочатку ідентифівидах. Такі варіанти у цьому описі називають куються шляхом здійснення аналізу проб цільної "двовидовими поліпшеними варіантами" і вони є крові із застосуванням людської крові для віднахоособливо придатними для ідентифікування варіандження поліпшених варіантів, із подальшим здійстів, що можуть застосовуватись як терапевтичний ненням другого аналізу проб цільної крові із застозасіб на людях, а також для демонстрації (або суванням крові мишей, пацюків або приматів окрім ймовірної демонстрації) ефективності на модельлюдини, для ідентифікування субпопуляції поліпних тваринах. У цьому відношенні, цей винахід шених варіантів, що є двовидовими поліпшеними пропонує способи ідентифікування варіантів, що варіантами. Відповідно до деяких варіантів здійсмають велику можливість бути схваленими для нення, цей винахід пропонує способи ідентифікуклінічної перевірки на людях, оскільки дані, одервання двовидових поліпшених варіантів, що вклюжані на тваринних моделях, будуть, ймовірно, підчають: а) надання: і) клітин-мішеней, іі) композиції, тверджувати будь-які варіанти перевірки на людях, що містить варіант-кандидат вихідного поліпептипредставлені до урядових регулятивних органів ду, що має принаймні частину Fc-ділянки, де зга(наприклад, Управління із санітарного нагляду за даний варіант-кандидат містить щонайменше одну харчовими продуктами і медикаментами (США)). амінокислотну заміну на Fc-ділянці і де варіантВідповідно до певних варіантів здійснення, кандидат опосередковує вичерпання клітиндвовидові поліпшені варіанти спочатку ідентифімішеней у присутності крові першого виду (наприкуються шляхом здійснення аналізу ADCC із заклад, людини) з більшою ефективністю, аніж вихістосуванням людських ефекторних клітин для віддний поліпептид, та ііі) крові другого виду (напринаходження поліпшених варіантів, із подальшим клад, мишачих, пацючих або приматів окрім здійсненням другого аналізу ADCC із застосуванлюдини), та b) інкубування згаданої композиції із ням ефекторних клітин мишей, пацюків або примаклітинами-мішенями за таких умов, за яких варітів окрім людини, для ідентифування субпопуляції ант-кандидат зв'язує клітини-мішені з одержанням, поліпшених варіантів, що є двовидовими поліпшетаким чином, клітин-мішеней, зв'язаних варіантомними варіантами. Відповідно до деяких варіантів кандидатом, с) змішування крові другого виду із здійснення, цей винахід пропонує способи ідентиклітинами-мішенями, зв'язаними варіантомфікування двовидових поліпшених варіантів, що кандидатом, і d) визначення вичерпання клітинвключають: мішеней, опосередкованої варіантом-кандидатом. a) надання: і) клітин-мішеней, іі) композиції, що Відповідно до певних варіантів здійснення, згадамістить варіант-кандидат вихідного поліпептиду, ний спосіб додатково включає стадію e) визначенщо має принаймні частину Fc-ділянки, де згаданий ня того, чи опосередковує варіант-кандидат вичеваріант-кандидат містить щонайменше одну амірпання клітин-мішеней у присутності крові другого нокислотну заміну на Fc-ділянці і де варіантвиду з більшою ефективністю, аніж вихідний полікандидат опосередковує цитотоксичність клітинпептид. Відповідно до деяких варіантів здійснення, мішеней у присутності ефекторних клітин першого згаданий спосіб додатково включає стадію f) іденвиду (наприклад, людини) з більшою ефективністифікування варіанта-кандидата, як двовидовий тю, аніж вихідний поліпептид, та ііі) ефекторних поліпшений варіант, що опосередковує вичерпанклітин другого виду (наприклад, мишачих, пацючих ня клітин-мішеней у присутності ефекторних клітин або приматів окрім людини), та другого виду з більшою ефективністю, аніж вихідb) інкубування згаданої композиції із клітинаний поліпептид. Відповідно до варіанта здійсненми-мішенями за таких умов, за яких варіантня, якому віддається перевага, ідентифіковані кандидат зв'язує клітини-мішені з одержанням, двовидові варіанти після цього перевіряють in vivo таким чином, клітин-мішеней, зв'язаних варіантомза допомогою одного або декількох аналізів на кандидатом, с) змішування ефекторних клітин друтваринах. гого виду із клітинами-мішенями, зв'язаними варіВідповідно до певних варіантів здійснення, антом-кандидатом, і d) визначення опосередковадвовидові поліпшені варіанти ідентифікуються ної варіантом-кандидатом цитотоксичності клітиншляхом здійснення будь-яких вищезгаданих анамішеней. лізів із застосуванням людських компонентів (наВідповідно до певних варіантів здійснення, приклад, людських клітин, людських FcR тощо) згаданий спосіб додатково включає стадію e) видля ідентифікування поліпшених варіантів, із позначення того, чи опосередковує варіант-кандидат дальшим здійсненням того самого аналізу (або цитотоксичність клітин-мішеней у присутності ефеіншого аналізу) з компонентами тварин окрім люкторних клітин другого виду з більшою ефективнісдини (наприклад, мишачими клітинами, мишачими тю, аніж вихідний поліпептид. Відповідно до деFcR тощо). У цьому відношенні може бути ідентияких варіантів здійснення, згаданий спосіб фікованою субпопуляція варіантів, що демонстру 57 90682 58 ють добрі характеристики за наданими критеріями великої рогатої худоби; соматоліберин; паратиреояк у аналізах на основі людського матеріалу, так і їдний гормон; тиреотропін; ліпопротеїни; антитриу аналізах на основі матеріалу другого виду. псин альфа-1; Α-ланцюг інсуліну; В-ланцюг інсуліЗразковий спосіб ідентифікування двовидових ну; проінсулін; фолітропін; кальцитонін; поліпшених варіантів виглядає таким чином. Полютеїнізуючий гормон; глюкагон; фактори згортаперше, нуклеїновокислотну послідовність, що кольної системи крові, наприклад, фактор VIIIC, факдує принаймні частину Fc-ділянки IgG, піддають тор IX, тканинний фактор (TF) і фактор фон Віллемутації таким чином, що експресована амінокисбранда; протизгортальні фактори, наприклад, лотна послідовність має щонайменше одну аміноБілок С; передсердний натрійуретичний фактор; кислотну заміну, з одержанням, таким чином, варілегеневий сурфактант; активатор плазміногену, анта. Після цього визначають характеристики наприклад, урокіназа, людський сечовий або ткацього експресованого варіанта IgG за допомогою нинний активатор плазміногену (t-PA); бомбезин; аналізу ADCC із застосуванням людських мононутромбін; гемопоетичний фактор росту; фактор неклеарів периферичної крові або субпопуляції (накрозу пухлин альфа і бета; енкефаліназа; RANTES приклад, NK-клітин або макрофагів). У разі вста(гормон, відрегульований на активацію, який, за новлення підвищеної ADCC активності, згаданий нормальних умов, експресується і секретується Тваріант перевіряють за допомогою другого аналізу клітинами); людський макрофагальний медіатор ADCC із застосуванням мишачих або пацючих алергічного запалення (МІР-1-альфа); сироваткомононуклеарів периферичної крові. Відповідно до вий альбумін, наприклад, людський сироватковий альтернативного варіанта або на додаток, аналіз альбумін; Мюллерова інгібувальна субстанція; Αможе здійснюватись зі згаданим варіантом на зв'яланцюг релаксину; В-ланцюг релаксину; прорелакзування із клонованими рецепторами гризунів або син; мишачий гонадотропний пептид; мікробний лініями клітин. Зрештою, у разі встановлення за білок, наприклад, бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; допомогою другого аналізу того, що згаданий варіцитотоксичний Т-лімфоцитарний антиген (CTLA), ант виявляється поліпшеним, тобто того, що він наприклад, CTLA-4; інгібін; активін; фактор росту став двовидовим поліпшеним варіантом, його песудинного ендотелію (VEGF); рецептори гормонів ревіряють in vivo на мишах або пацюках. або факторів росту; білок А або білок D; ревматоїЗразкові молекули, що містять варіант Fcдні фактори; нейротропний фактор, наприклад, ділянки нейротропний фактор головного мозку (BDNF), Варіанти Fc-ділянок відповідно до цього винанейротропін-3, -4, -5 або -6 (NT-3, NT-4, NT-5 або ходу можуть бути частиною більших молекул. ЗгаNT-6) чи фактор росту нервової тканини; тромбоданими більшими молекулами можуть бути, нацитарний фактор росту (PDGF); фібробластний приклад, моноклональні антитіла, поліклональні фактор росту, наприклад, FGF та FGF; епідерантитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, мальний фактор росту (EGF); трансформувальний біспецифічні антитіла, імуноадгезини тощо. На фактор росту (TGF), наприклад, TGF-альфа та додаток до цього, варіант Fc-ділянки відповідно до TGF-бета, у тому числі TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGFцього винаходу може бути функціонально зв'яза4 або TGF-5; інсуліноподібний фактор росту-І та -II ним із поліпептидом, що не є антитілом, якому він (IGF-I та IGF-II); дез-(1-3)-IGF-І (IGF-I головного може надавати змінений (збільшений або зменшемозку), білки зв'язування інсуліноподібного фактоний) період півжиття. У цьому разі, очевидним є ра росту; CD білки, наприклад, CD3, CD4, CD8, існування широкого діапазону можливостей застоCD19 та CD20; еритропоетин; остеогенні фактори; сування варіантів Fc-ділянок відповідно до цього імунотоксини; кістковий морфогенний білок (BMP); винаходу. фактор росту і диференціювання клітин (наприАнтитіла, що містять варіанти Fc-ділянок клад, GDF8); інтерферон, наприклад, альфа-, беВідповідно до варіанта здійснення, якому відта- і гамма-інтерферон; колонієстимулювальні дається перевага, молекулою, що містить варіант фактори (CSF), наприклад, M-CSF (макрофагальFc-ділянки (наприклад, поліпептидом), є антитіло. ний колонієстимулювальний фактор), GM-CSF Опис способів одержання антитіл наведено нижче. (гранулоцитарно-макрофагальний колонієстиму(і) Вибір і одержання антигенів лювальний фактор) та G-CSF гранулоцитарний Взагалі, коли молекулою, що містить варіант колонієстимулювальний фактор); інтерлейкіни (IL), Fc-ділянки, є антитіло, згадане антитіло спрямонаприклад, від IL-I до IL-25; супероксиддисмутаза; вують проти антигену, що становить інтерес. Відрецептори клітин Т-25; поверхневі мембранні білповідно до варіанта, якому віддається перевага, ки; фактор розпаду; вірусний антиген, наприклад, згаданим антигеном є поліпептид, і наслідком ввечастина оболонки вірусу СНІД; транспортні білки; дення антитіла ссавцю, що страждає на захворю"хомінг"-рецептори; білки стінок судин, що прийвання або розлад, корисним для якого було б змемають участь у міграції та хомінгу лімфоцитів; реншення кількості або зниження активності гуляторні білки; інтегрини, наприклад, CD11a, антигенної молекули, може бути терапевтична CD11b, CD11c, CD18, ICAM (фактор міжклітинної користь для цього ссавця. Однак, застосовуватись адгезії), VLA4 та VCAM (фактор адгезії клітин суможуть також антитіла, спрямовані проти неполідин); пухлинноспецифічний антиген, наприклад, пептидних антигенів (наприклад, такі як пухлинні рецептор HER2, HER3 або HER4; грелін; член гліколіпідні антигени; дивись патент США апоптозного шляху; та фрагменти або попередни№5,091,178). ки будь-якого з вищезгаданих поліпептидів. Зразкові антигени включають (але без обмеАнтигени, яким віддається перевага, включаження) такі молекули, як ренін; соматотропін, у ють (але без обмеження) CD білки, наприклад, тому числі людський соматотропін і соматотропін CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 та CD34; членів сі 59 90682 60 мейства рецепторів ErbB, наприклад, рецептори бустер-ін'єкцію 1/5 або 1/10 вихідної кількості пепEGF (епідермальний фактор росту), рецептори тиду або кон'югата у повному ад'юванті Фрейнда HER2, HER3 або HER4; молекули адгезії клітин, шляхом підшкірного введення на численних діляннаприклад, LFA-1, Масl, p 150.95, VLA-4, ІСАМ-1, ках. Через сім-чотирнадцять днів тварин знекровVCAM, інтегрин а4/р7 та інтегрин Хv/р3, У тому люють, і сироватку аналізують на титр антитіл. числі 5 або його субодиниці (наприклад, анти-CDI Тварини одержують бустер-ін'єкції до плато титру. Іа, анти-CD18 або анти-CDI 1b антитіла); фактори Відповідно до варіанта, якому віддається переваросту, наприклад, VEGF (фактор росту судинного га, тварина реімунізується з кон'югатом того самоендотелію); тканинний фактор (TF); альфаго антигену, однак, кон'югованого з іншим білком та/або іншим перехреснозв'язувальним агентом. інтерферон ( -IFN); фактор росту і диференціюКон'югати можуть також одержуватись у культурі вання клітин, наприклад, GDF-8; інтерлейкін, нарекомбінантних клітин як злиття білків. На додаток приклад, IL-8; IgE; антигени групи крові; рецептор до цього, агенти агрегування, наприклад, галун, flk2/flt3; рецептор ожиріння (ОВ); рецептор mpl; відповідним чином застосовуються для підсилення CTLA-4; білок С і грелін. імунної реакції. Розчинні антигени або їхні фрагменти, кон'ю(iiі) Моноклональні антитіла говані, відповідно до факультативного варіанта, з Цей винахід пропонує моноклональні антитіла іншими молекулами, можуть застосовуватись як з варіантами Fc-ділянок. Моноклональні антитіла імуногени для одержання антитіл. Для трансмембможна одержати різноманітними шляхами, у тому ранних молекул, наприклад, рецепторів, їхні фрачислі за допомогою методу гібридом (наприклад, гменти (наприклад, екстрацелюлярний домен реяк описано Колер (Kohler) та іншими, Nature, цептора) можуть застосовуватись як імуноген. 256:495, 1975) або методів рекомбінантних ДНК Відповідно до альтернативного варіанта, клітини, (наприклад, патент США №4,816,567). що експресують трансмембранну молекулу, моЗа методом гібридом, мишу або іншу відповіджуть застосовуватись як імуноген. Такі клітини ну тварину-хазяїна, наприклад, хом'ячка або макаможуть бути одержані із природного джерела (наку, імунізують для ініціювання утворення лімфоциприклад, лінії ракових клітин) або це можуть бути тів, що продукують або здатні до продукування клітини, що були трансформовані рекомбінантниантитіл, які будуть специфічно зв'язуватись із білми методами для експресії трансмембранної моком, що застосовується для імунізації. Відповідно лекули. Інші антигени і їхні форми, придатні для до альтернативного варіанта, лімфоцити можуть одержання антитіл, будуть очевидними для фахівімунізуватись in vitro. Після цього лімфоцити злиців у цій галузі. вають із клітинами мієломи за допомогою відпові(іі) Поліклональні антитіла дного гібридизаційного агента, наприклад, поліеЦей винахід пропонує поліклональні антитіла з тиленгліколю, з одержанням клітини гібридоми. варіантами Fc-ділянок. Наприклад, набір людських Одержані таким чином клітини гібридоми висіваімуноглобулінів, що містить модифіковані констанють і культивують у відповідному культуральному тні ділянки lgG1, може бути трансплантований середовищі, яке, відповідно до варіанта, якому імуноглобулінінактивованим мишам, унаслідок віддається перевага, містить одну або декілька чого будуть одержані миші, що експресують набір речовин, що пригнічують ріст або виживання неIgG, що містить модифіковані Fc-ділянки (дивись, злитих вихідних клітин мієломи. Наприклад, у разі, наприклад, Мендес М.Дж. (Mendez MJ.) та інші, якщо вихідним клітинам мієломи бракує ферменту Nature Genetics 15:146 (1997)). Поліклональні ангіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази титіла, відповідно до варіанта, якому віддається (HGPRT або HPRT), культуральне середовище перевага, одержують шляхом численних підшкірдля гібридом, як правило, буде включати гіпоксанних (sc) або внутрішньоочеревинних (ір) ін'єкцій тин, аміноптерин і тимідин (середовище HAT). Ці тваринам відповідного антигену та ад'юванту. Коречовини запобігають росту HGPRT-недостатніх рисним може бути кон'югування відповідного антиклітин. гену з білком, що є імуногенним у видів, які підляКлітинами мієломи, яким віддається перевага, гають імунізації (наприклад, гемоціаніном лімфи є клітини, які ефективно зливаються, підтримують равлика, сироватковим альбуміном, тиреоглобулістабільне високорівневе продукування антитіла за ном великої рогатої худоби або соєвим інгібітором допомогою відібраних антитілопродукуючих клітин трипсину), із застосуванням біфункціонального і є чутливими до живильного середовища, наприабо дериватизаційного агента (наприклад, малеіклад, середовища HAT. З числа ліній клітин міємідобензоїлсульфосукцинімідного ефіру) для лом перевага віддається лінії мишачих мієлом, кон'югування через залишки цистеїну, Nнаприклад, лінії, одержаній з мишачих пухлин гідросукциніміду для кон'югування через залишки МОРС-21 та МРС-1 І, які доступні від Salk Institute лізину, глутаральдегіду, бурштинового ангідриду, Cell Distribution Center, San Diego, штат КаліфорSOC12 або R1N=C=NR, де R та R1 є різними алкінія, США, та клітинам SP-2 або X63-Ag8-653, досльними групами. тупним з Американської колекції типових культур, Нижче наведені приклади загальних методів Rockville, штат Меріленд, США. Описували також імунізації кролів та мишей. Тварин імунізують пролінії клітин людських мієлом та мишачих-людських ти антигену, імуногенних кон'югатів або дериватів гетеромієлом для продукування людських монокшляхом об'єднання, наприклад, 100мкг або 5мкг лональних антитіл (наприклад, Козбор (Kozbor), J. білка або кон'югата (наприклад, для кролика або Immunol, 133:3001 (1984)). миші, відповідно), з 3 об'ємами повного ад'юванту Культуральне середовище, у якому вирощуФрейнда і підшкірного введення розчину на чисють клітини гібридом, аналізують на продукування ленних ділянках. Через місяць тварини одержують