Полінуклеотидні маркери

Реферат: Винахід належить до полінуклеотидних маркерів і наборів, що містять зазначені маркери, які можна застосовувати для картування, ідентифікації і виділення гена В, який зумовлює стрілкування, у геномі цукрового буряка. UA 100855 C2 (12) UA 100855 C2 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується селекції за допомогою маркерів і контролю якості насіння цукрового буряка. Зокрема, винахід стосується полінуклеотидів, які близько зчеплені або знаходяться у гені bolting (ген, що зумовлює стрілкування, ген, що визначає одно-дворічний тип розвитку) або гені В у геномі цукрового буряка і які можна застосовувати для створення молекулярних маркерів. Винахід стосується також молекулярних маркерів і наборів, що містять зазначені маркери, які можна застосовувати для картирування, ідентифікації і виділення зумовлюючого стрілкування гена або гена В у геномі цукрового буряка і для того, що розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип і різні гаплоідні генотипи (гаплотипи) у групах рослин цукрового буряка, які мають характерний для дворічного типу розвитку генотип. Винахід стосується також трансгенних підходів, за допомогою яких одержують трансгенні рослини, в яких ген B або надекспресується, або регулюється за типом негативного зв'язку. Окультурений цукровий буряк (Beta vulgaris ssp. vulgaris L) являє собою дворічну рослину, яка у перший рік утворює корінь, що запасає, і листову розетку. Подовження пагону (стрілкування) і утворення квітки починається після періоду низької температури. На противагу цьому, для багатьох диких бурякових роду В. vulgaris ssp. maritima характерний однорічний тип розвитку у результаті присутності зумовлюючого стрілкування гена B у В-локусі, що картований у центральній області хромосоми II. Домінантний алель В-локусу часто зустрічається у різних диких видів бурякових, і він викликає стрілкування протягом періодів з довгим світловим днем і у таких рослин відсутня необхідність у низьких температурах, які, як правило, потрібні для дворічних культиварів (Abe і ін., 1997), що несуть рецесивний алель. Стрілкування (подовження пагону) є першою добре помітною стадією переходу від вегетативного до репродуктивного росту. В окультуреного цукрового буряка стрілкування є небажаним явищем, оскільки воно приводить до зниження врожаю і до проблем у процесі збору врожаю і при екстракції цукру. Через неповну пенетрантність B-алелю і його залежності від навколишнього середовища при селекції ліній рослин існує потреба у близько зчеплених з ним молекулярних маркерах для здійснення скринінга за ознакою його присутності. Виробництво насіння цукрового буряка для продажу часто здійснюють у регіонах, в яких виростають однорічні бур'янисті види бурякових, що може викликати забруднення насіння, що утворюється, пилком цих рослин, приводячи до присутності генотипу, характерного для однорічного типу розвитку, у призначеному для продажу насінні. Це є неприйнятним для покупців. Для виявлення забруднення характерним для однорічного типу розвитку генотипом партії призначеного для продажу насіння вирощують у регіонах, в яких однорічні види бурякових не виростають безпосередньо після збору насіння. Рослини є неяровизованими і забруднюючі рослини виявляють за наявністю стрілок. Є дуже бажаною заміна такого методу оцінки заснованим на застосуванні маркерів скринінговим аналізом, за допомогою якого можна одержувати результати за більш короткий період часу, що повинно приводити до зниження вартості переробки насіння. Підхід, заснований на застосуванні маркерів, може виявитися також доцільним для селекції цукрового буряка, наприклад, для прискорення процесу селекції, або для інтродукції нової ознаки мінливості, вибраної з безлічі диких видів бурякових. У цих випадках важливо мати маркер, близько зчеплений із геном В, для того, щоб точно розрізняти однорічний і дворічний типи розвитку. У даному винаході пропоновані шляхи створення зазначених маркерів. Зокрема, даному винахід стосується полінуклеотиду, насамперед виділеного полінуклеотиду, ідентифікованому у геномі цукрового буряка, включаючи його варіанти і похідні, де полінуклеотид генетично близько зчеплений або бажано локалізований у зумовлюючому стрілкування гені або гені B. Винахід стосується також застосування зазначеного полінуклеотиду для створення маркерів, які можна застосовувати для картирування, ідентифікації і виділення зумовлюючого стрілкування гена або гена B у геномі цукрового буряка. Один зоб'єктів винаходу стосується полінуклеотиду, пропонованому у винаході, для якого характерна істинна косегрегація з фенотипом, асоційованим із геном, що зумовлює стрілкування (геном B), у цукрового буряка. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативні фрагменти, пропонований у винаході і описаний вище, де полінуклеотид можна одержувати з області геномної ДНК, що картована на відстані 1 cМ проти ходу транскрипції щодо маркерів МР0176 і GJ01 і для якої характерна косеграгація з маркером GJ131, що характеризується істинною косегрегацією з фенотипом, що асоційований із геном, що зумовлює стрілкування (геном B), у цукрового буряка. Іншим варіантом здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативні 1 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагменти, насамперед виділений полінуклеотид, пропонований у винаході і описаний вище, який можна одержувати із геномної ДНК, локалізованої в області, що обмежена маркерами GJ131 і GJ01. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, який можна одержувати із геномної ДНК цукрового буряка, пов'язаний із зумовлюючим стрілкування геном або геном В у геномі цукрового буряка, і який містить один або декілька з наступних елементів: а) інтронну область, що дозволяє одержувати продукт ампліфікації розміром приблизно 0,5 т.п.н. за допомогою ПЛР-реакції з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, або пари праймерів, послідовності яких принаймні на 90 %, бажано принаймні на 95 %, більш бажано принаймні на 98 % і аж до 99 % ідентичні послідовностям, представленим у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, при застосуванні геномної ДНК цукрового буряка в якості матриці, насамперед одержувати полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2, 3 або 4, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %-99 % ідентична зазначеній послідовності; б) полінуклеотидний фрагмент, що містить нуклеотидну послідовність, що на 70 %, бажано на 75 %, більш бажано на 80 %, ще більш бажано на 85 %, але найбільш бажано на 90 % і аж до 95 %-99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO: 52; в) полінуклеотидний фрагмент, що містить нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, або послідовність, що на 70 %, бажано на 75 %, більш бажано на 80 %, ще більш бажано на 85 %, але найбільш бажано на 90 % і аж до 95 %-99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 5 або SEQ ID NO: 51; г) полінуклеотидний фрагмент, що після сплайсинга кодує поліпептид, послідовність якого принаймні на 80 %, бажано принаймні на 85 %, більш бажано принаймні на 90 %, ще більш бажано принаймні на 95 %, але найбільш бажано принаймні на 98 % і аж до 100 % ідентична амінокислотній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 6, і необов'язково також д) висококонсервативну ділянку, що кодує мотив домену-приймача регулятора псевдовідповіді (Pseudo Response Regulator Receiver Domain) (PRR), що розташований поблизу NH2-кінця, і мотив CCT на COOH-кінці. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить інтронну область, що дозволяє одержувати продукт ампліфікації розміром приблизно 0,5 т.п.н. за допомогою ПЛР-реакції з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, або пари праймерів, послідовності яких принаймні на 90 %, бажано принаймні на 95 %, більш бажано принаймні на 98 % і аж до 99 % ідентичні послідовностям, представленим у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, при застосуванні геномної ДНК цукрового буряка в якості матриці. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 1, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %-99 % ідентична зазначеній послідовності. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2, 3 або 4, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %99 % ідентична зазначеним послідовностям. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що після сплайсинга кодує поліпептид, послідовність якого принаймні на 80 %, бажано принаймні на 85 %, більш бажано принаймні на 90 %, ще більш бажано принаймні на 95 %, але найбільш бажано принаймні на 98 % і аж до 100 % ідентична амінокислотній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 6. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний 2 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %-99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 5. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 51, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 51. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, що має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 52, або послідовність, що принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і принаймні аж до 95 %99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 52. Всі індивідуальні чисельні значення, які підпадають під діапазон від 70 % - 99 %, зазначений вище у даному описі, тобто, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, повинні також розглядатися як підпадають під об'єм сьогодення винаходу. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 1, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 2, 3 або 4, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 5, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 51, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, що кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 6, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, що містить полінуклеотидний фрагмент, причому, комплементарний ланцюг зазначеного полінуклеотидного фрагмента має здатність гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 52, насамперед у помірних умовах гібридизації, більш бажано у строгих умовах гібридизації. Одному з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, насамперед виділений полінуклеотид, де полінуклеотид можна одержувати із геномної ДНК цукрового буряка, зчепленої із зумовлюючим стрілкування геном або геном В у геномі цукрового буряка, для чого: a) здійснюють скринінг BAC-бібліотеки (бактеріальна штучна хромосома), створеної із дворічного комерційного культивара H20, за допомогою "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, або пари праймерів, послідовності яких принаймні на 90 %, бажано принаймні на 3 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 95 %, більш бажано принаймні на 98 % і аж до 99 % ідентичні послідовностям, представленим у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, за допомогою ПЛР-реакції у наступних умовах: - початкова денатурація при 95 °C протягом 5 хв; потім - 35 циклів ампліфікації по 30 с при 95 °C, - 30 с при 60 °C; - 30 с при 72 °C; і потім - 5 хв при 72 °C; б) відбирають клон BAC SBA079-L24, що містить два набора, послідовних фрагментів, що не перекриваються, які обидва мають послідовність, гомологічну EST (ярлик, що експресується) CV301305, представлену у SEQ ID NO: 1, і поєднують їх в одну послідовність; в) одержують генну структуру гена BvPRR7 буряка, що містить інтрони і екзони, на основі порівняльного аналізу набору послідовних фрагментів послідовності BAС і EST CV301305, представленої у SEQ ID NO:1, і гомології послідовності із геном РRR7 з Arabidopsis. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 1. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 3. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 4. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 51. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 52. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, T у положенні 11043, C у положенні 11143, C у положенні 11150, A у положенні 11220, C у положенні 11238, A у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, G у положенні 12086, T у положенні 12127, A у положенні 12193, G у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 1, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе T у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, T у положенні 11043, C у положенні 11143, C у положенні 11150, A в положенні 11220, A у положенні 11238, T у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, G у положенні 12086, T у положенні 12127, G у положенні 12193, G у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 2, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, G у положенні 11043, T у положенні 11143, C у положенні 11150, A в положенні 11220, C у положенні 11238, T у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, G у положенні 12086, T у положенні 12127, G у положенні 12193, G у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 3, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ 4 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, T у положенні 11043, C у положенні 11143, T у положенні 11150, A в положенні 11220, C у положенні 11238, T у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, G у положенні 12086, T у положенні 12127, A у положенні 12193, G у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 4, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, T у положенні 11043, C у положенні 11143, C у положенні 11150, A в положенні 11220, C у положенні 11238, T у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, A у положенні 12086, T у положенні 12127, A у положенні 12193, A у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 5, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, C у положенні 3827, T у положенні 3954, T у положенні 5284, G у положенні 5714, G у положенні 10954, T у положенні 11043, C у положенні 11143, C у положенні 11150, A в положенні 11220, C у положенні 11238, T у положенні 11299, A у положенні 11391, G у положенні 12053, G у положенні 12086, T у положенні 12127, A у положенні 12193, A у положенні 12337 і G у положенні 12837 і являє собою алель 6, асоційований з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, причому, ця послідовність несе G у положенні 3695, A у положенні 3827, A у положенні 3954, C у положенні 5284, T у положенні 5714, A у положенні 10954, G у положенні 11043, C у положенні 11143, C у положенні 11150, C в положенні 11220, C у положенні 11238, T у положенні 11299, G у положенні 11391, A у положенні 12053, G у положенні 12086, C у положенні 12127, G у положенні 12193, G у положенні 12337 і A у положенні 12837 і являє собою алель 7, асоційований із дворічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу полінуклеотид, пропонований у винаході, містить нуклеотидну послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, амінокислотна послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 6. Одним з варіантів здійснення винаходу є продукт ампліфікації розміром приблизно 0,5 т.п.н., включаючи його інформативний фрагмент, який можна одержувати з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, при застосуванні геномної ДНК цукрового буряка в якості матриці. Конкретним варіантом здійснення винаходу є набір полінуклеотидних маркерів, що містить безліч індивідуальних маркерів, де ці маркери створюють на основі полінуклеотиду, представленого у SEQ ID NO: 5, включаючи будь-який з його алельних варіантів 1-7, які описані вище, і з його допомогою можна виявляти різні SNP (однонуклеотидний поліморфізм, поліморфізм одиничних нуклеотидів) у нуклеотидних положеннях, представлених у таблиці 5, де за допомогою зазначеного набору маркерів можна ідентифікувати різні алелі і таким чином здійснювати диференціацію однорічних і дворічних ліній цукрового буряка. Одним з варіантів здійснення винаходу є одна або кілька молекул-зондів і/або один або декілька праймерів, насамперед одна або декілька пар праймерів, але насамперед одна або декілька пар праймерів, яка(і) складається з "прямого" праймера і "зворотного" праймера, де праймери мають здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області геному цукрового буряка, що генетично близько зчеплений із геном B, але насамперед з областю у гені B, і яка містить полінуклеотид, пропонований у винаході і описаний вище, включаючи його інформативний фрагмент, де зазначений фрагмент містить поліморфізм, насамперед поліморфізм, заснований на SNP, SSR (прості повторювані послідовності), делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізм, заснований на SNP, цей поліморфізм є діагностичним для B-алелю в B-локусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидний маркер, якому можна створювати з полінуклеотидній молекули або її інформативного фрагмента, вибраного із групи 5 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полінуклеотидів, які мають послідовність, представлену у SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, і полінуклеотиду, що кодує поліпептид, амінокислотна послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 6, де зазначений полінуклеотид містить один або декілька поліморфізмів, насамперед поліморфізм, заснований на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізм, заснований на SNP, цей поліморфізм є діагностичним для B-алелю в B-локусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Одним з конкретних варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидний маркер, що створений на основі полінуклеотиду, представленого у SEQ ID NO: 2, зазначений маркер можна застосовувати для виявлення принаймні одного з наступних SNP в 3-му інтроні гена BvPRR7: а) цитозин або тимін у положенні 87, б) цитозин або тимін у положенні 160, в) аденин або гуанін у положенні 406, і у такий спосіб здійснювати диференціацію характерних для однорічного і дворічного типу розвитку гаплотипів. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидний маркер, представлений однієї або декількома молекулами-зондами і/або одним або декількома праймерами, насамперед однієї або декількома парами праймерів, але насамперед парою праймерів, що складається з "прямого" праймера і "зворотного" праймера, де праймери мають здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області геному цукрового буряка, що генетично близько зчеплений із геном B і має нуклеотидні послідовності, представлені у SEQ ID NO:2, і здатністю до ампліфікації інформативного фрагмента, де зазначений фрагмент містить один або декілька поліморфізмів, насамперед поліморфізм, заснований на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізм, заснований на SNP, представлений, наприклад, у таблиці 1, де поліморфізм є діагностичним для B-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти рослини, які мають характерний для однорічного або характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Конкретним варіантом здійснення винаходу є пара праймерів, пропонована у винаході і описана вище, що має здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в 3-му інтроні, представленої у SEQ ID NO: 2, і до ампліфікації інформативного фрагмента із зазначеної області, що містить поліморфізм, насамперед поліморфізм, що представляє собою SNP C/T у положенні № 87 і/або SNP C/T у положенні №160, і/або SNP A/G у положенні №406. Зокрема, пара праймерів включає "прямий" праймер PRR 7-F, представлений у SEQ ID NO: 7, і "зворотний" праймер PRR 7-R, представлений у SEQ ID NO: 8, призначені для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №160, SNP №87 і SNP №406. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидний маркер, представлений однієї або декількома молекулами-зондами і/або одним або декількома праймерами, насамперед однієї або декількома парами праймерів, але насамперед парою праймерів, що складається з "прямого" праймера і "зворотного" праймера, де праймери мають здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області геному цукрового буряка, що генетично близько зчеплений із геном B, насамперед з нуклеотидною послідовністю у гені B, зокрема з нуклеотидною послідовністю, що представлена у SEQ ID NO: 5, і здатністю до ампліфікації інформативного фрагмента, де зазначений фрагмент містить один або декілька поліморфізмів, насамперед поліморфізм, заснований на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізм, заснований на SNP, представлений, наприклад, у таблиці 5, де поліморфізм є діагностичним для B-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти рослини, що мають характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Конкретним варіантом здійснення винаходу є пара праймерів, пропонована у винаході і описана вище, що має здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області, що кодує, гена BvPRR7, що представлена у SEQ ID NO: 5, до ампліфікації інформативного фрагмента із зазначеною послідовністю, яка кодує, що містить поліморфізм, насамперед поліморфізм, що представляє собою SNP A/C у положенні № 3827 і/або SNP A/T у положенні 3954, і/або SNP T/G у положенні 5714, і/або SNP C/A у положенні 11220, і/або SNP G/A у положенні 11391, і/або SNP A/G у положенні 12053, і/або SNP C/T у положенні 12127. Зокрема, перша пар праймерів містить "прямий" праймер F3806, представлений у SEQ ID 6 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 27, і "зворотний" праймер R3807, представлений у SEQ ID NO: 28, для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №3827 і SNP №3954. Друга пар праймерів містить "прямий" праймер F3768, представлений у SEQ ID NO: 21, і "зворотний" праймер R3769, представлений у SEQ ID NO: 22, для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №5714. Третя пар праймерів містить "прямий" праймер F3857, представлений у SEQ ID NO: 37, і "зворотний" праймер R3858, представлений у SEQ ID NO: 38, для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №11220. Четверта пар праймерів містить "прямий" праймер F3859, представлений у SEQ ID NO: 39, і "зворотний" праймер R3860, представлений у SEQ ID NO: 40, для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №11391. П'ята пар праймерів містить "прямий" праймер F3861, представлений у SEQ ID NO: 41, і "зворотний" праймер R3862, представлений у SEQ ID NO: 42, для ампліфікації фрагмента, що містить SNP №12053 і SNP №12127. Одним з варіантів здійснення винаходу є пропонований у винаході полінуклеотидний маркер, представлений однієї або декількома молекулами-зондами і/або одним або декількома праймерами, насамперед однієї або декількома парами праймерів, але насамперед парою праймерів, що складається з "прямого" праймера і "зворотного" праймера, де праймери мають здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області геному цукрового буряка, що генетично близько зчеплений із геном B, насамперед з нуклеотидною послідовністю у промоторній області гена PRR7, насамперед з нуклеотидною послідовністю у промоторній області гена PRR7, що представлена у SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 51 відповідно, і до ампліфікації інформативного фрагмента, який є діагностичним для В-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти рослини, які мають характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Конкретним варіантом здійснення винаходу є полінуклеотидний маркер, що представлений парою праймерів, вибраною з групи, що включає пару праймерів F3808 (SEQ ID NO: 29) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,6 т.п.н.; пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 1,0 т.п.н.; і пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3856 (SEQ ID NO: 36) (таблиця 4), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,8 т.п.н.; коли в якості матриці застосовують геномну ДНК із дворічних ліній, але не забезпечує ампліфікацію у випадку однорічних ліній. Зазначений інформативний фрагмент може містити також один або декілька поліморфізмів, насамперед поліморфізм, заснований на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізм, заснований на SNP, представлений, наприклад, у таблиці 5, що є діагностичним для B-алелю в B-локусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Винахід стосується також однієї або декількох молекул-зондів і/або одному або декількох праймерів, насамперед однієї або декількох пар праймерів, але насамперед пари праймерів, що складається з "прямого" праймера і "зворотного" праймера, де праймери мають здатність до ренатурації з нуклеотидною послідовністю в області геному цукрового буряка, що генетично близько зчеплений ізгеном B, насамперед з нуклеотидною послідовністю у промоторній області гена PRR7, зокрема з нуклеотидною послідовністю у промоторній області гена PRR7, що представлена у SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 51 відповідно, і до ампліфікації інформативного фрагмента, що є діагностичним для B-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти рослини, які мають характерний однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного або однорічного типу розвитку генотип. Іншим конкретним варіантом здійснення винаходу є пара праймерів, вибрана із групи, що включає пару праймерів F3808 (SEQ ID NO: 29) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,6 т.п.н.; пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 1,0 т.п.н.; і пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3856 (SEQ ID NO: 36) (таблиця 4), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,8 т.п.н., коли в якості матриці застосовують геномну ДНК із дворічних ліній, але не забезпечує ампліфікацію у випадку однорічних ліній. Описані вище молекули-зонди і/або праймери можна застосовувати у способі ідентифікації 7 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забруднень характерним для однорічного типу розвитку геномом насіння цукрового буряка, що надходить у продаж. Одним з варіантів здійснення винаходу є набір полінуклеотидних зондів, що містить принаймні дві різні молекули-зонди, які комплементарні підобласті в інформативному полінуклеотидному фрагменті, пропонованому у винаході і описаному вище, що містить поліморфний сайт, за допомогою якого ампліфікують частково, фрагменти, які перекриваються, що розрізняються тільки одним або двома помилковими спарюваннями основ в області перекриття, при цьому перший зонд, насамперед зонд, мічений першим флуоресцентним барвником, більш бажано першим флуоресцентним барвником і гасителем, являє собою один алель, а другий зонд, насамперед зонд, мічений другим флуоресцентним барвником, що не ідентичний першому барвнику, більш бажано другим флуоресцентним барвником і гасителем, являє собою інший алель. У конкретному варіанті здійснення винаходу зазначений інформативний полінуклеотидний фрагмент містить поліморфізм, де зазначений поліморфізм заснований на SNP №3827 у домені-приймачі псевдовідповіді гена PRR7, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 5, a перша молекула-зонд, мічена першим флуоресцентним барвником, має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 47, а друга молекула-зонд, мічена другим флуоресцентним барвником, має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 48. Одним з варіантів здійснення винаходу є застосування полінуклеотиду, пропонованого у винаході і представленого вище, або будь-якого його інформативного фрагмента для створення маркера, який можна застосовувати для аналізу алельної дискримінації з метою виявлення поліморфізму у геномі цукрового буряка, де поліморфізм є діагностичним для В-алелю у Bлокусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного типу розвитку генотип, або застосовувати для картирування гена B у геномі цукрового буряка. Конкретним варіантом здійснення винаходу є застосування одного або декількох праймерів, насамперед однієї або декількох пар праймерів, пропонованих у винаході і описаних вище, в аналізі алельної дискримінації з метою виявлення поліморфізму у геномі цукрового буряка, насамперед поліморфізму, заснованого на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізму, заснованого на SNP, де поліморфізм є діагностичним для В-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для дворічного типу розвитку генотип. В іншому конкретному варіанті здійснення винаходу набір молекул-зондів, пропонованих у винаході і описаних вище, можна застосовувати також у зазначеному аналізі алельної дискримінації. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності у рослини цукрового буряка, який полягає в тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, б) аналізують нуклеотидну послідовність геномної області цукрового буряка, генетично близько зчеплену із геном B і комплементарну або таку, що містить, послідовність полінуклеотиду, пропонованого у винаході і описаного вище, і в) порівнюють зазначену послідовність із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована із дворічним фенотипом і однорічним фенотипом відповідно. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності у рослини цукрового буряка, що полягає у тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, б) ампліфікують фрагмент із зазначеного зразка ДНК за допомогою праймера, насамперед пари праймерів, комплементарної і такої, що зв'язується, з послідовністю, яка присутня у промоторній області гена BvPRR7, зокрема BvPRR7, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 51, і в) порівнюють зазначену послідовність із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована із дворічним фенотипом, але не асоційована з однорічним фенотипом. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності у рослини цукрового буряка, який полягає в тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, 8 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 б) зондують зазначений зразок ДНК молекулою-зондом, що містить специфічну для алелю послідовність, насамперед специфічну для алелю послідовність із промоторної області гена BvPRR7, зокрема BvPRR7, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 51, для якої відомо, що вона присутня в алелі, асоційованому із дворічним типом розвитку, але не є присутньою в алелі, асоційованому з однорічним типом розвитку. У конкретному варіанті здійснення винаходу у зазначеному способі застосовують пару праймерів, вибрану із групи, що включає пару праймерів F3808 (SEQ ID NO: 29) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,6 т.п.н.; пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3809 (SEQ ID NO: 30), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 1,0 т.п.н.; і пару праймерів F3855 (SEQ ID NO: 35) і R3856 (SEQ ID NO: 36) (таблиця 4), що забезпечує одержання продукту ампліфікації розміром 0,8 т.п.н., коли в якості матриці застосовують геномну ДНК із дворічних ліній, але не забезпечує ампліфікацію у випадку однорічних ліній. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб виявлення специфічного гаплотипу в групі рослин цукрового буряка, які мають характерний для дворічного типу розвитку генотип, який полягає в тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, б) аналізують нуклеотидну послідовність геномної області цукрового буряка, генетично близько зчеплену із геном B і комплементарну або таку, що містить, послідовність полінуклеотиду, пропонованого у винаході і описаного вище, і в) порівнюють зазначену послідовність із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована з конкретним гаплотипом. У конкретному варіанті здійснення винаходу здійснюють аналіз послідовності з використанням молекулярного маркера, основою якого є полінуклеотид або його інформаційний фрагмент або один або декілька праймерів, насамперед одна або декілька пар праймерів, але бажано одна або декілька пар праймерів, що включає(ють) "прямий" праймер і "зворотний" праймер, пропоновані у винаході і описані вище. Іншим конкретним варіантом здійснення винаходу є спосіб виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності у рослини цукрового буряка, що полягає у тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, б) аналізують нуклеотидну послідовність інтронної області, яку можна одержувати із геному цукрового буряка за допомогою ПЛР-ампліфікації, з використанням "прямого" праймера PRR 7F, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 7, і "зворотного" праймера, PRR 7-R, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 8, і в) порівнюють зазначену послідовність із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована із дворічним фенотипом або однорічним фенотипом відповідно. В одному з варіантів здійснення винаходу послідовність інтронної області принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %-99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2. Ще в одному конкретному варіанті здійснення винаходу інтронна область має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2. Іншим конкретним варіантом здійснення винаходу є спосіб виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності рослини цукрового буряка, який полягає в тому, що а) відбирають зразок геному рослини цукрового буряка, що підлягає аналізу, б) аналізують нуклеотидну послідовність геномної області, що містить нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 5, і в) порівнюють зазначену послідовність із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована із дворічним фенотипом або однорічним фенотипом відповідно, і г) визначають, чи одежраний зазначений геномний зразок із геному, що визначає однорічний або дворічний фенотип. Ще одним варіантом здійснення винаходу є спосіб, який полягає в тому, що у геномном зразку з рослини цукрового буряка аналізують інтронну область полінуклеотиду, пропонованого у винаході і описаного вище, за допомогою "прямого" і "зворотного" праймерів, фланкуючи підобласть в інтронній області, для якої відомо, що вона містить поліморфний сайт, ампліфікуючи зазначену підобласть і порівнюючи ампліфікований фрагмент із алельною послідовністю, для якої відомо, що вона асоційована із дворічним фенотипом або однорічним фенотипом відповідно. 9 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ще одним конкретним варіантом здійснення винаходу є описаний вище спосіб, який полягає в тому, що створюють набір полінуклеотидних зондів на основі SNP, що містить дві окремих молекули-зонда, які відрізняються принаймні одним помилковим спарюванням, бажано двома або більшою кількістю помилкових спарювань, які локалізовані у сусідніх сайтах, але насамперед одним помилковим спарюванням, у якому перша молекула-зонд, насамперед мічена молекула-зонд, більш бажано молекула-зонд, мічена першим флуоресцентним барвником і гасителем, являє собою один алель, а друга молекула-зонд, насамперед мічена молекула-зонд, більш бажано молекула-зонд, мічена другим флуоресцентним барвником, що не ідентичний першому барвнику, і гасителем, являє собою інший алель, і в якому зазначений набір полінуклеотидних зондів застосовують для дискримінації двох алельних варіантів. Зокрема, маркери, пропоновані у даному винаході, можна застосовувати в аналізі алельної дискримінації, насамперед в аналізі дискримінації різних гаплотипів у групах рослин, які мають характерний для дворічного типу розвитку генотип. Для зазначеного аналізу використовують набір полінуклеотидних зондів, що містить дві окремі молекули-зонди, які комплементарні, наприклад, підобласті гена BvPRR7, яку можна одержувати ПЛР-ампліфікацією з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, при цьому молекули-зонди розрізняються тільки одним помилковим спарювань основ, насамперед у положенні №631. Перша молекула-зонд, насамперед молекула-зонд, що має послідовність, представлену у SEQ ID NO: 9, і позначена першим флуоресцентним барвником, таким, наприклад, як FAM, більш бажано першим флуоресцентним барвником і гасителем, являє собою один алель, а друга молекула-зонд, насамперед молекула-зонд, що має послідовність, представлену у SEQ ID NO: 10, і позначена другим флуоресцентним барвником, що не ідентичний першому барвнику, таким як VIC, більш бажано другим флуоресцентним барвником і гасителем, являє собою другий алель. Наступним варіантом здійснення винаходу є аналіз алельної дискримінації, призначений для виявлення поліморфізму в геномній області геному цукрового буряка, що має здатність до косегрегації з фенотипом однорічності, насамперед поліморфізму, заснованого на SNP, SSR, делеції або інсерції принаймні одного нуклеотиду, але насамперед поліморфізму, заснованого на SNP, де цей поліморфізм є діагностичним для B-алелю у B-локусі і дозволяє розрізняти характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип або різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають характерний для однорічного і характерний для дворічного типу розвитку генотип, для якого застосовують молекулярний маркер, створений на основі полінуклеотиду, пропонованого у винаході і описаного вище, або будь-який його інформативний фрагмент. У конкретному варіанті здійснення винаходу молекулярний маркер містить пари праймерів, пропонованих у винаході і описаних вище. Іншим конкретним варіантом здійснення винаходу є аналіз алельної дискримінації, призначений для виявлення однонуклеотидного поліморфізму в інтронної області, яку можна одержувати із геному цукрового буряка за допомогою ПЛР-ампліфікації з використанням "прямого" праймера PRR 7-F, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 7, і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовність якого представлена у SEQ ID NO: 8, для якого застосовують набір праймерів і/або полінуклеотидних зондів, пропонованих у винаході і описаних вище. В одному з варіантів здійснення винаходу послідовність інтронної області принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %-99 % ідентична нуклеотидній послідовності, представленій у SEQ ID NO: 2. Ще в одному конкретному варіанті здійснення винаходу інтронна область має нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 2. Одним з варіантів здійснення винаходу є застосування полінуклеотиду, пропонованого у винаході і описаного вище, для створення молекулярного маркера, який можна використовувати для виявлення відсутності або присутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності у геномі цукрового буряка, що передбачає а) ідентифікацію зазначених поліморфних сайтів, б) оцінку зв'язку зазначених поліморфізмів з відсутністю або присутністю алелю, асоційованого з ознакою однорічності у цукрового буряка, шляхом в) створення молекули-зонда або декількох молекул-зондів, насамперед праймера або декількох праймерів, бажано пари праймерів або декількох пар праймерів, але найбільш бажано "прямого" і "зворотного" праймера, які розпізнають нуклеотидну послідовність, що фланкує зазначений поліморфний сайт, для ампліфікації полінуклеотиду, що містить 10 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазначений поліморфний сайт, який можна застосовувати для аналізу алельної дискримінації. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб ідентифікації забруднень характерним для однорічного типу розвитку генотипом призначеного для продажу насіння, який полягає в тому, що застосовують полінуклеотид, пропонований у винаході і описаний вище, або його інформативний фрагмент як маркер для виявлення присутності або відсутності алелю, що визначає однорічність, в одежраному з рослини зразку. Зокрема, винахід стосується способу ідентифікації забруднень характерним для однорічного типу розвитку генотипом призначеного для продажу насіння, який полягає в тому, що застосовують полінуклеотид, пропонований у винаході і описаний вище, або його інформативний фрагмент в якості маркера для ідентифікації забруднень характерним для однорічного типу розвитку генотипом призначеного для продажу насіння. Одним з варіантів здійснення винаходу є спосіб ідентифікації забруднень характерним для однорічного типу розвитку генотипом призначеного для продажу насіння, який полягає в тому, що застосовують заснований на використанні маркера аналіз алельної дискримінації, пропонований у винаході і описаний вище. Винахід стосується також застосування гена B, насамперед гена BvPRR7, у заснованому на застосуванні трансгенів підході до одержання рослин, що мають однорічний або фенотип, що характеризується відсутністю стрілкування. Зокрема, винахід стосується химерних конструкцій, що містять касету експресії, яка несе послідовність, що кодує, гена B, бажано послідовність, що кодує, BvPRR7, представлену у SEQ ID NO:1, але найбільш бажано у SEQ ID NO: 52, або послідовність, яка ідентична їй принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %-99 %, під контролем регуляторних елементів, зокрема, під контролем регуляторних елементів, що мають функціональну активність у рослинах. Одним з варіантів здійснення винаходу є химерні конструкції, що містять касету експресії, яка несе послідовність, що кодує, гена B, бажано послідовність, що кодує, BvPRR7, представлену у SEQ ID NO:1, але найбільш бажано у SEQ ID NO: 52, або послідовність, яка ідентична їй принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %99 %, під контролем регуляторних елементів, зокрема, під контролем пов'язаних з ознакою однорічності промотором і термінуючих послідовностей, таких як характерні для гена PRR7, насамперед гена PRR7 Beta vulgaris. В одному з варіантів здійснення винаходу химерна конструкція, описана вище, може містити також ген маркера для селекції, що дозволяє розрізняти трансформований і нетрансформований рослинний матеріал при здійсненні процесу відбору. В одному з варіантів здійснення винаходу химерна конструкція, пропонована у винаході, містить маркер негативної селекції, насамперед маркер для селекції, який кодує фактор, що визначає стійкість до токсичних для рослини сполук, таких як антибіотики або гербіциди. В одному з варіантів здійснення винаходу химерна конструкція, пропонована у винаході, містить маркер позитивної селекції, насамперед маркер для селекції, який кодує фермент, що надає трансформованій рослині селективну перевагу у порівнянні з нетрансформованими рослинами, насамперед перевагу з позицій живлення, такий, наприклад, як ген фосфоманозоізомери, ген ксилозоізомерази. Одним з варіантів здійснення винаходу є вектор, що трансформує, і/або експресійний вектор, насамперед рослинний вектор, що трансформує, і/або експресійний вектор, що містить химерну конструкцію, пропоновану у винаході і описану вище. Одним з варіантів здійснення винаходу є рослинна клітина, насамперед рослинна клітина рослини цукрового буряка, що містить химерну полінуклеотидну конструкцію або векторну молекулу, пропоновану у винаході і описану вище. Одним з варіантів здійснення винаходу є рослина, насамперед рослина цукрового буряка, що містить рослинну клітину, пропоновану у винаході, і експресує білок, що кодується геном B, насамперед білок, що кодується геном BvPRR7, наприклад, рослина, що має однорічний фенотип. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидна конструкція, призначена для трансгенної супресії експресії гена BvPRR7, насамперед за допомогою антизмістового або РНКi-підходу (підходу, заснованого на РНК-інтерференції). Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидна конструкція, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує dsРНК, що має здатність направлено впливати на мРНК, що продукуються у результаті транскрипції послідовності ДНК, що кодує білок гена B, 11 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 насамперед білок гена BvPRR7, приводячи до їх розщеплення. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидна конструкція, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує dsРНК, що практично ідентична за меншою областю послідовності, що кодує, гена B, зокрема області, що кодує, гена BvPRR7, представленої у SEQ ID NO:1, але насамперед у SEQ ID NO: 52, або послідовності, що ідентична їй принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %-99 %. Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотидна конструкція, що містить фрагмент області, що кодує, гена B, зокрема фрагмент області, що кодує, гена BvPRR7, представленої у SEQ ID NO:1, але насамперед у SEQ ID NO: 52, або послідовності, яка ідентична їй принаймні на 70 %, бажано принаймні на 75 %, більш бажано принаймні на 80 %, ще більш бажано принаймні на 85 %, але найбільш бажано принаймні на 90 % і аж до 95 %-99 %, яка знаходиться у касеті для РНКi під контролем конститутивного промотору, такого, наприклад, як промотор Ubi3 з Arabidopsis. Одним з варіантів здійснення винаходу є вектор, що трансформує, і/або застосовуваний для Рнкi експресійний вектор, насамперед рослинний вектор, що трансформує, і/або експресійний вектор, що містить полінуклеотидну конструкцію, пропоновану у винаході і описану вище. Одним з варіантів здійснення винаходу є рослинна клітина, що містить полінуклеотидну конструкцію або векторну молекулу, пропоновану у винаході і описану вище. Одним з варіантів здійснення винаходу є рослина, насамперед рослина цукрового буряка, що містить рослинну клітину, пропоновану у винаході, і експресує dsРНК, у результаті чого придушується стрілкування, і рослина здобуває фенотип, що характеризується відсутністю стрілкування. Короткий опис креслень і послідовностей Креслення На кресленнях показано: на фіг.1-1- порівняння амінокислотних послідовностей REC-доменів різних видів і передбачуваного REC-домену EST CV301305 цукрового буряка. Ідентичні амінокислоти позначені чорним кольором; консервативні – сірим кольором; амінокислоти з низьким рівнем подібності – ясно-сірим кольором і неподібні – білим кольором. Bb, Bordetella bronchiseptica; Bs, Bacillus subtilis; Bv, Beta vulgaris; Ec, Escherichia coli; Kp, Klebsiella pneumoniae; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Rc, Rhodobacter capsulatus; Sc, Streptomyces coelicolor; Sf, Shigella flexneri; St, Salmonella typhimurium; на фіг.2-2- порівняння амінокислотних послідовностей білка PRR7 Arabidopsis і передбаченого фрагмента білка EST V301305 цукрового буряка. Ідентичні амінокислоти позначені чорним кольором; подібні - сірим кольором; і неподібні - білим кольором; на фіг. 3 – порівняльний аналіз первинної структури послідовностей геномної і мРНК гена PRR7 Arabidopsis і EST CV301305 цукрового буряка. Консервативні нуклеотиди Arabidopsis і Beta vulgaris L. позначені сірим кольором. Інтрони позначені заштрихованими смугами; на фіг. 4-4- генетична карта хромосоми II цукрового буряка. Назва маркерів наведені праворуч від хромосоми, а ліворуч показані генетичні дистанції у порядку їх зростання; на фіг. 5 – схематичне зображення генної структури гена BvPRR7, включаючи передбачувані екзони і інтрони. Область, консервативна EST CV301305, позначена широкою стрілкою; на фіг. 6 - порівняння амінокислотних послідовностей представників сімейства продуктів гена PRR Arabidopsis і білка BvPRR7. Ідентичні амінокислоти позначені чорним кольором; консервативні - сірим кольором; амінокислоти з низьким рівнем подібності - ясно-сірим кольором і неподібні - білим кольором. Мотиви REC і CCT позначені прямокутниками; на фіг. 7 – філогенетичний взаємозв'язок між BvPRR7 і спорідненими білками з інших видів квіткових рослин. Передвіщену амінокислотну послідовність BvPRR7 вирівнювали із зазначеними нижче білками за допомогою програми Clustal і конструювали неукорінене філогенетичне дерево. Для виведення еволюційної історії використовували метод "об'єднання сусідів" (Neighbor-Joining Method) (Saitou і Nei, 1987). Для виведення еволюційної історії аналізованих таксонів застосовували консенсусне дерево, побудоване методом "бутстрепа" ("bootstrap") на основі 1000 реплік (Felsenstein, 1985). Гілки, що відповідають розподілу, що відтворюється менше ніж на 50 % "bootstrap»-реплік, видаляли (здійснювали їх колапс). Поруч із гілками зазначений відсоток реплік дерев, для яких асоційовані таксони кластеризували, при здійсненні "bootstrap»-аналізу (1000 реплік). Дерево зображене у такому масштабі, коли довжини гілок представлені у тих же одиницях, що представляють собою еволюційні відстані, які застосовували для виведення філогенетичного дерева. Еволюційні відстані розраховували 12 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за допомогою методу корекції Пуассона (Zuckerkandl і Pauling, 1965) і виражали в одиницях, що представляють собою кількість амінокислотних замін на один сайт. Всі позиції, що містять "проломи", і відсутні дані, виключали з бази даних ("опція повної делеції"). У кінцевій базі даних містилося в цілому 352 позиції. Філогенетичний аналіз здійснювали за допомогою програмного забезпечення MEGA4 (Tamura і ін., 2007). Використовували наступні скорочення: At PRR3, Arabidopsis thaliana PRR3 (NP_568919); At PRR5, Arabidopsis thaliana PRR5 (NP_568446); At PRR7, Arabidopsis thaliana PRR7 (NP_568107); At PRR9, Arabidopsis thaliana PRR9 (NP_566085); At TOC1, Arabidopsis thaliana TOC1/PRR1 (NP_200946); Hv PPD-H1, Hordeum vulgare PPD-H1 (AAY17586); Os PRR37, Oryza sativa PRR37 (Q0D3B6); Ta PPD-D1, Triticum aestivum PPD-D1 (ABL09477); на фіг. 8 – профіль генної експресії BvPRR7 у дворічній рослині цукрового буряка, вирощеній в умовах довгого світлового для (16 год. світла, 8 год. темряви) і при постійній температурі 18 °C. Значення виражали у вигляді відносних рівнів експресії, стандартизованих відносно референс-генів BvBTU і BvICDH за допомогою аналізу на основі геометричного усереднення (Vandesompele і ін., 2002); на фіг. 9 -плазмідна карта бінарного вектора, призначеного для трансформації кДНК BvPRR7 під контролем фрагмента промотору BvPRR7, асоційованого з однорічним типом розвитку рослин. Маркер, що селектується, являє собою ген PMI під контролем промотору HSP80 (Brunke і Wilson, 1993); на фіг. 10 – плазмідна карта бінарного вектора, призначеного для трансгенної супресії BvPRR7 за допомогою РНКi. Інвертований повтор для BvPRR7 складається із кДНК-фрагмента розміром 0,6 т.п.н., який клонували між промотором Ubi3 (Norris та ін., 1993) і термінатором Nos як у змістовій, так і в антизмістовій орієнтації, розділений другим інтроном гена StLS1 картоплі (Eckes і ін., 1986; Vancanneyt і ін., 1990). Маркер, що селектується, являє собою ген PMI під контролем промотору HSP80 (Brunke і Wilson, 1993); Послідовності SEQ ID NO: 1 - нуклеотидна послідовність EST CV301305, SEQ ID NO: 2 - нуклеотидна послідовність інтрона 3 BvPRR7 і її алельна мінливість, призначена для картирування, SEQ ID NO: 3 - нуклеотидна послідовність інтрона 3 алельного варіанта 1 BvPRR7 (гаплотип №1), SEQ ID NO: 4 - нуклеотидна послідовність інтрона 3 алельного варіанта 2 BvPRR7 (гаплотип №2), SEQ ID NO: 5 - геномна нуклеотидна послідовність BvPRR7, SEQ ID NO: 6 - передбачувана амінокислотна послідовність BvPRR7, SEQ ID NO: 7 - нуклеотидна послідовність праймера PRR 7-F, SEQ ID NO: 8 - нуклеотидна послідовність праймера PRR 7-R, SEQ ID NO: 9 - нуклеотидна послідовність зонда PRR7(T1)-FAM, SEQ ID NO: 10 - нуклеотидна послідовність зонда PRR7(T1)-VIC, SEQ ID NO: 11 - нуклеотидна послідовність "прямого" праймера BvPRR7, SEQ ID NO: 12 - нуклеотидна послідовність "зворотного" праймера BvPRR7, SEQ ID NO: 13 - нуклеотидна послідовність "прямого" праймера BvBTU, SEQ ID NO: 14 - нуклеотидна послідовність "зворотного" праймера BvBTU, SEQ ID NO: 15 - нуклеотидна послідовність "прямого" праймера BvICDH, SEQ ID NO: 16 - нуклеотидна послідовність "зворотного" праймера BvICDH, SEQ ID NO: 17 - нуклеотидна послідовність праймера F3766, SEQ ID NO: 18 - нуклеотидна послідовність праймера R3767, SEQ ID NO: 19 - нуклеотидна послідовність праймера F3354, SEQ ID NO: 20- нуклеотидна послідовність праймера R3355, SEQ ID NO: 21 - нуклеотидна послідовність праймера F3768, SEQ ID NO: 22 - нуклеотидна послідовність праймера R3769, SEQ ID NO: 23- нуклеотидна послідовність праймера F3782, SEQ ID NO: 24 - нуклеотидна послідовність праймера R3783, SEQ ID NO: 25 - нуклеотидна послідовність праймера F3784, SEQ ID NO: 26 - нуклеотидна послідовність праймера R3785, SEQ ID NO: 27 - нуклеотидна послідовність праймера F3806, SEQ ID NO: 28 - нуклеотидна послідовність праймера R3807, SEQ ID NO: 29 - нуклеотидна послідовність праймера F3808, SEQ ID NO: 30 - нуклеотидна послідовність праймера R3809, SEQ ID NO: 31 - нуклеотидна послідовність праймера F3810, 13 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 32 - нуклеотидна послідовність праймера R3811, SEQ ID NO: 33 - нуклеотидна послідовність праймера F3853, SEQ ID NO: 34 - нуклеотидна послідовність праймера F3854, SEQ ID NO: 35 - нуклеотидна послідовність праймера F3855, SEQ ID NO: 36 - нуклеотидна послідовність праймера R3856, SEQ ID NO: 37 - нуклеотидна послідовність праймера F3857, SEQ ID NO: 38 - нуклеотидна послідовність праймера R3858, SEQ ID NO: 39 - нуклеотидна послідовність праймера F3859, SEQ ID NO: 40 - нуклеотидна послідовність праймера R3860, SEQ ID NO: 41 - нуклеотидна послідовність праймера F3861, SEQ ID NO: 42 - нуклеотидна послідовність праймера R3862, SEQ ID NO: 43 - нуклеотидна послідовність праймера F3863, SEQ ID NO: 44 - нуклеотидна послідовність праймера R3864, SEQ ID NO: 45 - нуклеотидна послідовність праймера F3865, SEQ ID NO: 46 - нуклеотидна послідовність праймера R3866, SEQ ID NO: 47 - нуклеотидна послідовність зонда PRR7(№3827)-FAM, SEQ ID NO: 48 - нуклеотидна послідовність зонда PRR7(№3827)-VIC, SEQ ID NO: 49 - нуклеотидна послідовність "прямого" праймера BvPRR7, застосовуваного для аналізу експресії генів, SEQ ID NO: 50 - нуклеотидна послідовність "зворотного" праймера BvPRR7, застосовуваного для аналізу експресії генів, SEQ ID NO: 51 - нуклеотидна послідовність геномної нуклеотидної послідовності BvPRR7, що включає промоторну область розміром приблизно 13 т.п.н., SEQ ID NO: 52 - нуклеотидна послідовність області, що кодує, BvPRR7. Визначення Технічні поняття і вирази, застосовувані у даному описі, як правило, якщо спеціально не зазначено інше, мають значення, які звичайно використовують в області молекулярної біології рослин. У даному описі і прикладеній формулі винаходу мається на увазі, якщо з контексту ясно не випливає інше, що вживаний в однині іменник включає також множину. Так, наприклад, посилання на "рослину" включають одну або декілька рослин, а посилання на "клітину" включають суміші клітин, тканин і т.п. Поняття "цукровий буряк" стосується всіх видів і підвидів роду Beta, а також всіх сортів культурного буряка Beta vulgaris. Культурні сорти буряка підрозділяють на чотири групи: листовий буряк, городній буряк, кормовий буряк і цукровий буряк. Поняття "цукровий буряк" стосується також всіх культурних сортів буряка, включаючи сорти, вирощувані для цілей, відмінних від одержання цукру, наприклад, для одержання етанолу, пластиків або індустріальних продуктів. Зокрема поняття "цукровий буряк" стосується кормового буряка і цукрового буряка, але найбільш бажано цукрового буряка. Поняття "однорічна лінія цукрового буряка" стосується рослини цукрового буряка, що містить домінантний алель b у локусі B у гетерозиготному або гомозиготному стані. Поняття "дворічна лінія цукрового буряка" стосується рослини цукрового буряка, що містить рецесивний алель b у локусі B у гетерозиготному стані. Поняття "стрілкування" стосується переходу від вегетативної розеткової стадії до стадії цвітіння або репродуктивного росту. Поняття "ген B" у контексті даного опису стосується гена, що відповідальний за раннє стрілкування цукрового буряка. У рослин, що несуть домінантний алель, відбувається подовження пагону і наступне цвітіння без попереднього знаходження при низьких температурах. Поняття "яровизація" стосується процесу, при якому у деяких рослин прискорюється індукція цвітіння при охолодженні рослин протягом певного періоду часу. Поняття "алель" у контексті даного винаходу стосується альтернативних форм різних генетичних одиниць, асоційованих з різними формами гена або будь-яких видів ідентифікованого генетичного елемента, які альтернативно успадковуються, оскільки розташовані у тому самому локусі у гомологічних хромосомах. У диплоїдній клітині або організмі два алелі даного гени (або маркера), як правило, розташовані у відповідних локусах на парі гомологічних хромосом. У контексті даного опису поняття "розмноження (селекція)» і його граматичні варіанти стосується будь-якого процесу, що дозволяє одержувати індивідуальне потомство. Розмноження може бути статевим або нестатевим або являти собою будь-яку їх комбінацію. 14 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Прикладами розмноження є, але не обмежуючись тільки ними, схрещування, самозапилення, одержання похідної з подвоєним гаплоїдним набором і їх комбінації. Поняття "локус" у контексті даного винаходу стосується області на хромосомі, яка містить ген або будь-який інший генетичний елемент або фактор, що визначає ознаку. У контексті даного опису поняття "генетичний маркер" стосується особливості індивідуального геному (наприклад нуклеотидній або полінуклеотидній послідовності, яка присутня в індивідуальному геномі), асоційованої з одним або декількома локусами, що представляють інтерес. У деяких варіантах здійснення винаходу, залежно від контексту, генетичний маркер є поліморфним у популяції, що представляє інтерес, або являє собою локус, у якому є присутнім поліморфізм. Генетичні маркери являють собою, наприклад, такі маркери, але не обмежуючись тільки ними, як однонуклеотидні поліморфізми (SNP), індели (тобто інсерції/делеції), прості повторювані послідовності (SSR), поліморфізми довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), довільно ампліфіковані поліморфні ДНК (RAPD), маркери, що представляють собою розщеплену ампліфіковану поліморфну послідовність (CAPS), маркери, одержані за допомогою технології розманітності масивів (Diversity Arrays Technology (DArТ), поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP). Генетичні маркери можна застосовувати, наприклад, для локалізації на хромосомі генетичних локусів, що містять алелі, з якими пов'язана варіабельність експресії фенотипічних ознак. Під поняттям "генетичний маркер" може матися на увазі також полінуклеотидна послідовність, комплементарна геномна послідовності, така як послідовність нуклеїнової кислоти, застосовувана в якості зондів. Генетичний маркер фізично може бути локалізований у положенні на хромосомі всередині або поза генетичним локусом, з яким він асоційований (тобто він може бути ітрагеним або екстрагеним відповідно). Інакше кажучи, хоча генетичні маркери, як правило, застосовують, коли локалізація на хромосомі гена, що відповідає локусу, що представляє інтерес, не ідентифікована і має місце не нульовий ступінь рекомбінації між генетичним маркером і локусом, що представляє інтерес, відповідно до одного з об'єктів даного винаходу можна застосовувати також генетичні маркери, які фізично є прикордонними генетичному локусу (наприклад, перебувають всередині геномної послідовності, що відповідає гену, такому як, але не обмежуючись тільки ним, поліморфізм в інтроні або екзоні). У деяких варіантах здійснення даного винаходу один або кілька генетичних маркерів включають від 1 до 10 маркерів, а в деяких варіантах здійснення винаходу один або кілька генетичних маркерів включає більше 10 генетичних маркерів. У контексті даного опису поняття "інформативний фрагмент" стосується полінуклеотидного фрагмента з інформаційним змістом, що є відновлюваним і може сприяти визначенню і/або характеризації генетичного локусу, що представляє інтерес. Цей інформаційний зміст може являти собою поліморфізм, асоційований із зазначеним локусом, що представляє інтерес, такий, наприклад, як, але не обмежуючись тільки ними, однонуклеотидні поліморфізми (SNP), індели (тобто інсерції/делеції), прості повторювані послідовності (SSR), поліморфізми довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), маркери, що представляють собою довільно ампліфіковані поліморфні ДНК (RAPD), розщеплену ампліфіковану поліморфну послідовність (CAPS), маркери, одержані за допомогою технології різноманітності масивів (DArТ), поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP), і їх можна застосовувати для створення генетичного маркера. Інформаційний зміст "інформативного фрагмента" може являти собою також специфічну послідовність, яку можна виявляти за допомогою відповідної молекули-зонда. У контексті даного опису поняття "фенотипічна ознака" стосується такої, що з'являється, або іншим чином проявляється характеристики, індивідуума, що є результатом взаємодії геному з його оточенням. Поняття "заснована на застосуванні маркера селекція" у контексті даного винаходу стосується застосування генетичних маркерів для виявлення однієї або декількох нуклеїнових кислот рослини, де нуклеїнова кислота асоційована з необхідною ознакою, для ідентифікації рослин, які несуть гени необхідних (або небажаних) ознак, у результаті чого ці рослини можна використовувати (або уникати їх використання) у програмі селективного розмноження. Поняття "мікросателітний або SSR (прості повторювані послідовності) (маркер)» у контексті даного винаходу стосується типу генетичного маркера, що складається із численних повторів коротких послідовностей основ ДНК, які перебувають у локусах, повсюдних у рослинної ДНК, і можуть бути високополіморфними. Поняття "ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція)» у контексті винаходу стосується методу одержання відносно великих кількостей специфічних областей ДНК, що дозволяє здійснювати різні аналізи, засновані на використанні цих областей. Поняття « ПЛР-праймер" у контексті винаходу стосується відносно коротких фрагментів 15 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одноланцюгової ДНК, які застосовують у ПЛР-ампліфікації специфічних областей ДНК. Поняття "фенотип" у контексті винаходу стосується помітного(их) характеристиці(ам) генетично контрольованої ознаки. Поняття "поліморфізм" у контексті винаходу стосується присутності у популяції двох або більшої кількості різних форм гена, генетичного маркера або наслідуваної ознаки. Поняття "селективне розмноження" у контексті винаходу стосується програми розмноження, в якій використовують рослини, які несуть або проявляють необхідні ознаки, характерні для батьків. Поняття "полінуклеотид" у контексті даного опису стосується полімерної високомолекулярної молекули, що може бути одноланцюговою або дволанцюговою, що складається з мономерів (нуклеотидів), які містять цукор, фосфат і основу, яка відноситься або до пуринів, або до піримідинів. "Фрагмент полінуклеотиду (полінуклеотидний фрагмент)» являє собою частину даної полінуклеотидної молекули. У вищих рослинах дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) являє собою генетичний матеріал, а рибонуклеїнова кислота (РНК) бере участь у переносі інформації, що входить у ДНК, на білки. "Геном" являє собою повну сукупність генетичного матеріалу, що входить у кожну клітину організму. Таким чином, поняття "полінуклеотид" стосується полімеру ДНК або РНК, що може бути одно- або дволанцюговим, що необов'язково містить синтетичні, які не зустрічаються у природних умовах або змінені нуклеотидні основи, які можуть включатися у полімери ДНК або РНК. Якщо не зазначено інше, то мається на увазі, що конкретна нуклеотидна послідовність, пропонована у даному винаході, включає також її одержані у результаті консервативної модифікації варіанти (наприклад, заміни кодонів через виродженістьгенетичного коду) і комплементарні послідовності, а також певні зазначені послідовності. Зокрема, для заміни кодонів через виродженість генетичного коду можна створювати послідовності, в яких у третьому положенні в одному або у декількох вибраних (або в усіх) кодонах зроблена заміна змішаними основами і/або залишками дезоксиінозину (Batzer і ін., 1991; Ohtsuka і ін., 1985; Rossolini і ін., 1994). Поняття полінуклеотид використовують взаємозамінно з поняттями нуклеїнова кислота, нуклеотидна послідовність, кДНК і мРНК, що кодується геном, і т.д. Мається на увазі, що полінуклеотид, пропонований у винаході, повинен перебувати у виділеній формі. Поняття "виділений" означає, що описаний і пропонований у винаході полінуклеотид не є полінуклеотидом, який зустрічається у природних умовах, якщо реально існує його дублікат, що зустрічається у природних умовах. Таким чином, передбачається, що й інші сполуки, описані нижче, повинні бути виділеними. У контексті рослинного геному полінуклеотид, пропонований у винаході, відрізняється від його дублікатів, що зустрічаються у природних умовах, інсерційною ділянкою і послідовностями, що фланкують, зазначену інсерційну ділянку. У контексті даного опису поняття "нуклеїнова кислота" стосується будь-якого фізичного ланцюга мономерних одиниць, що може відповідати ланцюгу нуклеотидів, включаючи полімер нуклеотидів (наприклад, типовий полімер ДНК або РНК), модифікованих олігонуклеотидів (наприклад, олігонуклеотиди, що містять основи, що не є типовими для біологічної РНК або ДНК, наприклад 2'- O-метильовані олігонуклеотиди), і т.п. У деяких варіантах здійснення винаходу нуклеїнова кислота може бути одноланцюговою, двухланцюговою, багатоланцюговою або являти собою їх комбінації. Якщо не зазначено інше, то конкретна нуклеотидна послідовність, пропонована у даному винаході, необов'язково містить або кодує комплементарні послідовності окрім будь-яких конкретно зазначених послідовностей. Поняття "ген" у широкому розумінні стосується будь-якого сегмента нуклеїнової кислоти, пов'язаного з біологічною функцією. Так, гени включають послідовності, що кодують, і/або регуляторні послідовності, необхідні для їх експресії. Наприклад, поняття "ген" стосується фрагмента нуклеїнової кислоти, що експресує мРНК або функціональну РНК або кодує конкретний білок і який включає регуляторні послідовності. Гени включають також сегменти ДНК, що неекспресуються, які, наприклад, утворюють послідовності, що розпізнаються іншими білками. Гени можна одержувати з різних джерел, включаючи клонування з джерела, що представляє інтерес, або синтез із відомого або передбаченого на основі інформації про послідовності джерела, або вони можуть включати послідовності, сконструйовані так, що вони мають необхідні параметри. "Маркерний ген" кодує ознаку, що селектується або виявляється шляхом скринінга. Поняття "химерний ген" стосується будь-якого гена, що містить 1) послідовності ДНК, включаючи регуляторні і послідовності, що кодують, які не зустрічаються разом у природних умовах, або 2) послідовності, що кодують ділянки білків, які не об'єднані у природних умовах, або 3) ділянки промоторів, які не об'єднані у природних умовах. Таким чином, химерний ген 16 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 може містити регуляторні послідовності і послідовності, що кодують, виведені з різних джерел, або містити регуляторні послідовності і послідовності, що кодують, виведені з того самого джерела, але зібрані іншим способом у порівнянні з їх укладкою у природних умовах. Поняття "трансген" стосується інтродукованого шляхом трансформації у геном і стабільно підтримуваному гену. До трансгенів відносяться, наприклад, гени, які гетерологічні або гомологічні генам конкретної рослини, що підлягаює трансформації. Крім того, трансгени можуть являти собою нативні гени, вбудовані в ненативний організм, або химерні гени. Поняття "білок", "пептид" і "поліпептид" у контексті даного опису використовують взаємозамінно. Поняття « послідовність, що кодує, » стосується послідовності ДНК або РНК, що кодує конкретну амінокислотну послідовність, і не включає послідовності, що не кодують. Вона може являти собою "безперервну послідовність, що кодує, », тобто послідовність, в якій відсутні інтрон, таку як кДНК, або може включати один або декілька інтронів, обмежених відповідними сплайсинговими стиками. "Інтрон" являє собою послідовність РНК, що входить у первинний транскрипт, але яка віддаляється у результаті розщеплення і повторного лігування РНК у клітині з утворенням зрілої мРНК, що може транслюватися у білок. Поняття "промотор" стосується нуклеотидної послідовності, як правило, розташованої проти ходу транскрипції (5') відносно послідовності, що кодує, яка контролює експресію послідовності, що кодує, забезпечуючи розпізнавання РНК-полимеразою і іншими факторами, необхідними для правильної транскрипції. "Промотор" включає мінімальний промотор, що являє собою коротку послідовність ДНК, що містить TATA-бокс і інші послідовності, які забезпечують специфічність сайту ініціації транскрипції, до якого додають регуляторні елементи для контролю експресії. Поняття "промотор" стосується також нуклеотидної послідовності, що містить мінімальний промотор плюс регуляторні елементи, які мають здатність контролювати експресію послідовності, що кодує, або функціональної РНК. Цей тип промотору складається із проксимальних і більш дистально розташованих проти ходу транскрипції елементів, останні елементи часто відносять до енхансерів. Таким чином, "енхансер" позначає послідовність ДНК, що може стимулювати активність промотору і може являти собою властивий промотору елемент або гетерологічний елемент, вбудований для підвищення рівня активності або тканиноспецифічності промотора. Він може проявляти активність в обох напрямках (прямому або зворотному) і може функціонувати навіть при його зсуві або в проти хода, або по ходу транскрипції щодо промотору. І енхансери, і інші елементи, що перебувають проти ходу транскрипції промоторні, зв'язують специфічні для послідовності ДНК-з'єднувальні білки, які опосередковують їх дії. Промотори можуть бути повністю виведені з нативного гена або складатися з різних елементів, виведених з різних промоторів, які присутні у природі, або навіть складатися з різних синтетичних сегментів. Промотор може включати також послідовності ДНК, які беруть участь у зв'язуванні білкових факторів, що контролюють ефективність ініціації транскрипції у відповідь на фізіологічні або пов'язані з фазою розвитку умови. "Сайт ініціації" являє собою положення, що оточує перший нуклеотид, що є частиною транскрибованої послідовності, що позначають також як положення +1. Відносно цього сайту нумерують всі інші послідовності гена і його контролюючі області. Розташовані по ходу транскрипції послідовності (тобто додаткові білки, що кодують, послідовності, розташовані у 3'напрямку) нумерують позитивними числами, а розташовані проти ходу транскрипції послідовності (головним чином області, що контролюються, розташовані у 5'-напрямку) нумерують від'ємними числами. Промоторні елементи, зокрема TATA-елемент, які є неактивними або мають значно знижену промоторну активність за відсутності активації проти ходу транскрипції, позначають як "мінімальні або внутрішні промотори". За присутності прийнятного фактора транскрипції мінімальний промотор функціонує, забезпечуючи транскрипцію. Таким чином, "мінімальний або внутрішній промотор" складається тільки із всіх основних елементів, необхідних для ініціації транскрипції, наприклад, TATA-боксу і/або ініціатора. Поняття "конститутивна експресія" стосується експресії з використанням конститутивного або регульованого промотору. Поняття "обумовлена" або "регульована експресія" стосується експресії, контрольованої регульованим промотором. Поняття "конститутивний промотор" стосується промотору, що може забезпечувати експресію відкритої рамки зчитування (ВРЗ), що забезпечує контроль у всіх або практично у всіх рослинних тканинах протягом всіх або практично всіх стадій розвитку рослини. Будь-який з елементів, що активують транскрипцію, не характеризується абсолютно тканиноспецифічністю, але опосередковує активацію транскрипції у більшості частин рослини на рівні ≥1 % від рівня, що досягається у рослини, в якій транскрипція є найбільш активною. 17 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поняття "регульований промотор" стосується промоторів, які контролюють генну експресію не конститутивно, а регульованим часом і/або просторовим положенням чином, до них відносяться як тканиноспецифічні, так і індукабельні промотори. Вони включають ті, що зустрічаються у природних умовах, і синтетичні послідовності, а також послідовності, які можуть являти собою комбінацію синтетичних і послідовностей, що зустрічаються у природних умовах. Різні промотори можуть контролювати експресію гена в різних типах тканин або клітин або на різних стадіях розвитку або у відповідь на різні фактори навколишнього середовища. У цей час відкриті нові промотори різних типів, які можна застосовувати у рослинних клітинах, їх численні приклади описані у Okamuro та ін., 1989. Типові регульовані промотори, які можна застосовувати у рослинах, включають, але не обмежуючись тільки ними, індуковані антидотами промотори, промотори, виведені з індукованої тетрацикліном системи, промотори, виведені з індукованих саліцилатами систем, промотори, виведені з індукованих спиртами систем, промотори, виведені з індукованих глюкокортикоїдами систем, промотори, виведені з індукованих патогенами систем, і промотори, виведені з індукованих екдизонами систем. Поняття "тканиноспецифічний промотор" стосується регульованих промоторів, які експресуються не у всіх рослинних клітинах, а тільки в одному або декількох типах клітин у конкретних органах (таких як листя або насіння), конкретних тканинах (таких як зародок або сім'ядоля), або у конкретних типах клітин (таких як паренхіма листа або клітини насіння, що запасають). До них відносяться також промотори, регуляція яких обумовлена періодом часу, таким як рання або пізня стадія ембріогенезу, стадія дозрівання у розвитку насіння і плодів, стадія повністю диференційованої тканини листа або початок старіння. Поняття "індукабельний промотор" стосується таких регульованих промоторів, які можуть перетворюватися у специфічні для одного або декількох типів клітин під впливом зовнішнього стимулу, такого як хімічні агенти, світло, гормон, стрес або патоген. Поняття "функціонально пов'язані" стосується асоціації нуклеотидних послідовностей на одному фрагменті нуклеїнової кислоти так, що функція однієї впливає на функцію іншої. Наприклад, регуляторна послідовність ДНК "функціонально пов'язана з" або "асоційована з" послідовністю ДНК, що кодує РНК або поліпептид, якщо дві послідовності розташовані так, що регуляторна послідовність ДНК має здатність впливати на експресію послідовності, що кодує, ДНК (тобто транскрипція послідовності, що кодує, або функціональної РНК перебуває під транскипційним контролем промотору). Послідовності, що кодують, можуть бути функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями у змістовій або антизмістовій орієнтації. Поняття "експресія" стосується транскрипції і/або трансляції ендогенного гена, ВРЗ або її частини або трансгена у рослинах. Наприклад, у випадку антизмістових конструкцій поняття експресія може стосуватися транскрипції тільки антизмістової ДНК. Крім того, експресія стосується транскрипції і стабільної акумуляції змістової (мРНК) або функціональної РНК. Експресія може стосуватися також виробництва білка. Поняття "надекспресія" стосується рівня експресії в трансгенних клітинах або організмах, що перевищує рівні експресії у нормальних або нетрансформованих (нетрансгенних) клітинах або організмах. Поняття "антизмістове інгібування" стосується виробництва антизмістових РНКтранскриптів, які мають здатність придушувати експресію білка з ендогенного гена або трансгена. Поняття "мовчання гена" стосується залежного від гомології придушення вірусних генів, трансгенів або ендогенних ядерних генів. Мовчання гена може бути транскрипційним, коли придушення обумовлене зниженою транскрипцією уражених генів, або пост-транскрипційним, коли придушення обумовлене підвищеним круговоротом (розщеплення) видів РНК, гомологічних ураженим генам (English і ін., 1996). Мовчання гена включає індуковане вірусом мовчання гена (Ruiz і ін., 1998). Поняття "гібридизується" у контексті даного опису стосується загальноприйнятих умов гібридизації, бажано до таких умов гібридизації, в яких використовують 5×SSPE, 1 % ДСН, 1× розчин Денхардта в якості розчину і/або температури гібридизації від 35 °C до 70 °C, бажано 65 °C. Після гібридизації відмивку бажано здійснюють спочатку з використанням 2×SSC, 1 % ДСН, а потім 0,2×SSC при температурі від 35 °C до 75 °C, зокрема від 45 °C до 65 °C, але найбільш бажано при 59 °C (опис позначень SSPE, SSC і розчин Денхардта див. у Sambrook і ін. loc. сit (у зазначеному місці). Строгі умови гібридизації, наприклад описані у Sambrook і ін., вище, є найбільш бажаними. Найбільш бажані строгі умови гібридизації являють собою вищеописані умови, при яких гібридизацію і відмивку здійснюють при 65 °C. Нестрогі умови гібридизації, при яких, наприклад, гібридизацію і відмивку здійснюють при 45 °C, є менш бажаними, а при 35 °C ще менш бажаними. 18 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поняття "гомологія послідовностей або ідентичність послідовностей" у контексті даного опису використовують взаємозамінно. Поняття "ідентичний" або відсоток "ідентичності" у відношенні двох або більшої кількості нуклеотидних або білкових послідовностей позначає, що дві або більша кількості послідовності або підпослідовностей є однаковими або мають певний відсоток однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів при зіставленні і порівняльному аналізі максимальної відповідності, що оцінюють за допомогою одного з наведених нижче алгоритмів порівняння послідовностей або шляхом візуальної оцінки. Якщо дві підлягаючі порівнянню один з одним послідовності мають різну довжину, то поняття ідентичність послідовностей бажано стосується відсотка нуклеотидних залишків більш короткої послідовності, які ідентичні нуклеотидним залишкам більш довгої послідовності. Ідентичність послідовностей традиційно можна визначати c допомогою комп'ютерних програм, таких як програма Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, версія 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Програма Bestfit заснована на алгоритмі локальної гомології Смита і Ватермана (Smith і Waterman, Advances in Applied Mathematics 2, 1981, сс. 482-489) для пошуку сегмента, що має найвищий ступінь ідентичності між двома послідовностями. При застосуванні Bestfit або іншої програми порівняльного аналізу первинної структури послідовностей для вирішення питання про те, чи ідентична конкретна послідовність на 95 % референс-послідовності, пропонованій у даному винаході, параметри бажано регулюють так, щоб відсоток ідентичності розраховувати по всій довжині референс-послідовності і щоб допускати гомологію проломів аж до 5 % від загальної кількості нуклеотидів у референс-послідовності. При використанні Bestfit так звані необов'язкові параметри бажано мають свої попередньо встановлені ("прийняті за умовчанням") значення. Відхилення, виявлені при порівнянні даної послідовності і описаних вище послідовностей, пропонованих у винаході, можуть бути обумовлені, наприклад, додаванням, делецією, заміною, інсерцією або рекомбінацією. Таке порівняння послідовностей бажано можна здійснювати також за допомогою програми "fasta20u66" (версія 2.0u66, вересень 1998 р., William R. Pearson і the University of Virginia; див. також у Pearson, 1990 прикладені приклади, а також http://workbench.sdsc.edu/). Для цієї мети можна використовувати установку "прийнятих за умовчанням" параметрів. Іншим доказом того, що дві нуклеотидні послідовності практично ідентичні, є те, що дві молекули гібридизуються одна з одною у строгих умовах. Фраза "специфічно гібридизується з" стосується зв'язування, утворення дуплекса або гібридизації молекули тільки з певної нуклеотидною послідовністю у строгих умовах, коли послідовність присутня у комплексній суміші (наприклад, загальної клітинної) ДНК або РНК. Поняття "практично зв'язаний(і)» стосується комплементарної гібридизації між нуклеїновою кислотою-зондом і нуклеїновою кислотою-мішенню і має на увазі наявність невеликої кількості помилкових спарювань, які можна допускати при зниженні строгості середовищ для гібридизації для досягнення необхідного виявлення послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. Поняття "строгі умови гібридизації" і "умови відмивки, що відповідають строгій гібридизації" у контексті експериментів по гібридизації нуклеїнових кислот, таких як Саузерн- і Нозернгібридизації, залежать від послідовності і є різними при застосуванні різних параметрів навколишнього середовища. Для специфічної гібридизації більш довгих послідовностей використовують більш високі температури. Докладним посібником з гібридизації нуклеїнових кислот є робота Tijssen "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleiс Acid Probes", частина I, розділ 2: "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", вид-о Elsevier, New York, 1993. Як правило, вибирають дуже строгі умови гібридизації і відмивку, при яких температура приблизно на 5ºС нижче, ніж температура плавлення (Tm) для конкретної послідовності при певній іонній силі і значенні рН. Як правило, при використанні "строгих умов" зонд повинен гібридизуватися з підпослідовністюмішенню, але не гібридизуватися з іншими послідовностями. Tm означає температуру (при певній іонній силі і значенні рН), при якій 50 % послідовностеймішеней гібридизується з точно підібраним зондом. При виборі дуже строгих умов гібридизації температура дорівнює Tm конкретного зонда. Прикладом строгих умов гібридизації на фільтрі методом Саузерн- або Нозерн-Блоттинга для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які мають більше 100 комплементарних залишків, є застосування 50 %-ного формаміду з 1 мг гепарину при 42ºC при здійсненні гібридизації протягом ночі. Прикладом дуже строгих умов відмивки є застосування 0,15M NaCl при 72ºC протягом приблизно 15 хв. Прикладом строгих умов відмивки є відмивка 0,2×SSC при 65ºC протягом 15 хв. (опис SSC-буфера см. у Sambrook, нижче). Часто відмивці у дуже строгих умовах передує відмивка в розслаблених умовах для видалення фонового сигналу зонда. Прикладом відмивки в умовах помірної 19 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 строгості для дуплексів, що складаються, наприклад, більш ніж з 100 нуклеотидів, є застосування 1×SSC при 45ºC протягом 15 хв. Прикладом розслаблених умов відмивку для дуплексів, що складаються, наприклад, більш ніж з 100 нуклеотидів, є застосування 4- 6× SSC при 40 °C протягом 15 хв. Для коротких зондів (наприклад, що складаються приблизно з 10-50 нуклеотидів) строгі умови, як правило, включають концентрації солей, що відповідають менш ніж 1,0M концентрації іонів Na, як правило, приблизно від 0,01 до 1,0M концентрації іонів Na (або інших солей) при pН від 7,0 до 8,3, при цьому температура, як правило, становить принаймні приблизно 30 °C. Строгі умови також можна одержувати при додаванні дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Як правило, величина співвідношення сигналу до шуму, дорівнює 2 (або вище) у порівнянні з виявленою при застосуванні неспорідненого зонда у конкретному досліді з гібридизації, свідчить про наявність специфічної гібридизації. Нуклеїнові кислоти, які не гібридизуються одна з одною у строгих умовах, все ще є практично ідентичними, якщо білки, які вони кодують, є практично ідентичними. Це має місце, наприклад, у випадку, коли копію нуклеїнової кислоти створюють із використанням максимальної виродженості кодонів, що допускається генетичним кодом. "Рослина" позначає будь-яку рослину на будь-якій стадії розвитку, зокрема насіннєву рослину. Поняття "рослинна клітина" стосується структурної і фізіологічної одиниці рослини, що включає протопласт і клітинну оболонку. Рослинна клітина може перебувати у формі виділеної окремої клітини або клітини, що культивується, або являти собою частину високоорганізованої одиниці, такої, наприклад, як тканина рослини, орган рослини або ціла рослина. «Культура рослинних клітин" позначає культури структурних одиниць рослини, таких, наприклад, як протопласти, клітини у культурі клітин, клітини у тканинах рослини, пилок, пилкові трубки, насіннєві зачатки, зародкові мішки, зиготи і зародки на різних стадіях розвитку. Поняття "рослинний матеріал" стосується листя, стебел, коріння, квіток або частин квіток, плодів, пилку, яйцеклітин, зигот, насіння, відведень, культур клітин або тканин або будь-яких інших частин або продуктів рослини. «Орган рослини" позначає окрему і чітко структурно оформлену диференційовану частину рослини, таку як корінь, стебло, лист, листова брунька або зародок. У контексті даного опису поняття "рослинна тканина" стосується групи рослинних клітин, організованих у вигляді структурної і функціональної одиниці. Під це поняття підпадає будь-яка тканина рослини, що присутня у самій рослині або перебуває у культурі. Це поняття включає, але не обмежуючись тільки ними, цілі рослини, органи рослини, насіння рослини, культури тканини і будь-які групи рослинних клітин, організованих у вигляді структурних і/або функціональних одиниць. Використання цього поняття у сполученні із вказівкою якого-небудь конкретного типу рослинної тканини (або безвідносно до нього), як це має місце вище або в іншому місці у даному описі, не слід витлумачувати в тому розумінні, що воно не може стосуватися будь-якого іншого типу рослинної тканини. Даний винахід стосується полінуклеотидів, ідентифікованих у геномі цукрового буряка, включаючи їх варіанти і похідні, де для полінуклеотидів продемонстрована істинна косегрегація з фенотипом цукрового буряка, асоційованим із геном, що зумовлює стрілкування (тобто із геном B), і застосування зазначених полінуклеотидів для створення маркерів, які можна використовувати для картирування і ідентифікації гена, що зумовлює стрілкування, або гена B. Полінуклеотидні маркери, пропоновані у винаході, можна застосовувати також для контролю якості партій насіння, що надходять у продаж, шляхом скринінга насіння, що надходить у продаж, дворічного цукрового буряка відносно забруднювачів, що мають характерний для однорічного типу розвитку генотип, і для ідентифікації однорічних/дворічних рослин у програмах розмноження, в яких використовують ознаку однорічного типу розвитку для прискорення процесу селекції, або коли ознака однорічного типу розвитку інтродукують разом з новими джерелами генетичної варіації. Полінуклеотиди, пропоновані у винаході і описані вище, можна застосовувати також у заснованому на використанні трансгенів підході для одержання трансгенних рослин цукрового буряка, які містять зазначені полінуклеотиди, стабільно інтегровані у геном цукрового буряка. Зокрема, після експресії із геному продукт експресії можна використовувати для модуляції характерного для процесу яровизації відповіді (яровізаційної відповіді) рослини цукрового буряка. В одному з об'єктів винаходу яровізаційну відповідь можна сповільнювати шляхом придушення або регуляції за типом негативного зв'язку експресії гена B. В іншому об'єкті винаходу раннє стрілкування без впливу холоду можна індукувати шляхом надекспресії гена B. 20 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується полінуклеотиду, що картований у локусі B або перебуває у безпосередній близькості до нього, зокрема, на відстані 1 cМ проти ходу транскрипції щодо маркерів МР0176 і GJ01 і який має здатність до косегрегації з маркером GJ131 (Möhring S. і ін., 2004; Gaafar R. M. і ін., 2005) (фіг. 5). Одним з варіантів здійснення винаходу є полінуклеотид, включаючи його інформативний фрагмент, пропонований у винаході, який можна одержувати з області геномой ДНК, картованої на відстані менш 1 cМ, бажано менш 0,75 cМ, більш бажано менш 0,5 cМ, ще більш бажано менше 0,3 cМ, але найбільш бажано менше 0,25 cМ щодо гена B. Полінуклеотид, пропонований у винаході, можна застосовувати також для повної характеризації області, що оточує B-локус, що включає ген B, з метою ідентифікації інших передбачуваних контролюючих час цвітіння перспективних генів (генів-кандидатів). BAC-бібліотеку створювали, використовуючи ДНК із дворічного культивара цукрового буряка H20, що надходить у продаж, . Здійснювали дворазовий відбір частково розщеплених (HindIII) високомолекулярних (HMW) ДНК-фрагментів розміром 100-400 т.пп. ДНК-фрагменти вбудовували шляхом лігування у вектор pBeloBAC-Kan. Бібліотека містила 57600 клонів із середнім розміром вставки приблизно 120 т.п.н., що відповідає приблизно 8-кратному перекриттю геному. Надмірність оцінювали шляхом скринінга з використанням однокопійних зондів, було встановлено, що частота клонів з мітохондріальної або плазмідної ДНК становила менше 1 %. Цю бібліотеку BAC застосовували для виділення повнорозмірної геномної послідовності гена PRR7 цукрового буряка. Зокрема, для скринінга BAC-бібліотеки цукрового буряка застосовували праймери PRR 7-F і PRR 7-R за допомогою стандартних методів ПЛР, добре відомих спеціалістам у даній області. Для скринінга пулів ДНК використовували наступні умови ПЛР: денатурацію праймерів здійснювали при температурі від 90 °C до 98 °C, бажано приблизно при 95ºC, протягом 2-10 хв, бажано приблизно протягом 5 хв, після чого здійснювали 30-40 циклів ампліфікації протягом 2535 с, бажано приблизно 35 циклів ампліфікації протягом 30 с при температурі від 90 °C до 98 °C, бажано приблизно при 95ºC протягом 25-35 с, бажано протягом 30 с при температурі від 55ºC до 65ºC, бажано приблизно при 60ºC, і протягом 25-35 с, бажано 30 с при температурі від 68ºC до 75ºC, бажано приблизно 72ºC, а потім протягом 2-8 хв, бажано приблизно 5 хв, при температурі від 68ºC до 75ºC, бажано приблизно 72ºC.ПЛР-експерименти здійснювали за допомогою відповідної реакційної суміші, що включає прийнятну полімеразу, бажано полімеразу Taq. Наступний скринінг пулів ДНК у відношенні BvPRR 7-фрагментів дозволив ідентифікувати позитивний BAC-клон, що несе відповідний фрагмент. Для одержання повнорозмірної послідовності гена BvPRR7 раніше ідентифікований BACклон секвенували з використанням стандартного методу секвенування, такого, наприклад, як метод піросекевенування, розроблений фірмою "454 Life Sciences". Два набора послідовних фрагментів, що не перекриваються, послідовність яких мала гомологію з послідовністю EST CV301305, потім можна поєднувати у одній послідовності (SEQ ID NO: 5). На основі порівняльного аналізу первинної структури послідовностей набору послідовних фрагментів BAC і EST CV301305 і на основі гомології з послідовністю гена PRR7 з Arabidopsis вдалося передбачити припущену структуру гена BvPRR7 цукрового буряка, що включає інтрони і екзони, що представлена на фіг. 5. На основі зазначеної припущеної геномної послідовності вдалося продемонструвати, що ділянка повного гена BvPRR7 розміром 3,6 т.п.н. простирається на послідовності проти ходу транскрипції від стоп-кодону ATG і ділянка розміром 2,2 т.п.н. простирається по ходу транскрипції щодо області, яка кодує. Відповідна амінокислотна послідовність BvPRR7 представлена у SEQ ID NO: 6. Порівняльний аналіз первинної структури амінокислотної послідовності BvPRR7 і всіх представників сімейства PRR-гена з Arabidopsis, включаючи TOC1 (PRR1), PRR3, PRR5, PRR7 і PRR9, дозволив проілюструвати виражену консервативність мотиву домену-приймача регулятора псевдовідповіді (PRR) (pfam00072) поблизу NH2-кінця і CCT-мотиву (pfam06203) на COOH-кінці (фіг. 6). Крім сімейства PRR-гена з Arabidopsis, BvPRR7 характеризується також вираженою гомологією з PRR7 зернових культур, що проілюстровано за допомогою філогенетичного дерева, представленого на фіг. 7. Встановлено, що гомолог PRR7 у зернових культурах, більш відомий як Ppd, являє собою основний визначальний фактор фотоперіодичної реакції (Turner і ін., 2005; Beales і ін., 2007). Його роль у яровізаційній відповіді, як це виявлено для цукрового буряка, поки не встановлена. З урахуванням їх гомології з відомими контролюючими час цвітіння генами або їх можливою регуляторною функцією, яку можна припустити, виходячи із присутності консервативних доменів, характерних для регуляторних білків, вдалося ідентифікувати кілька генів в якості потенційних кандидатів на роль гена B. Ці гени мають потребу у додаткової валідації за 21 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою досвілів, що оцінюють алельну варіабельність і/або генну експресію, генотипів, характерних для однорічного і дворічного типу розвитку, або на основі експериментів з оцінки комплементарності або "вимикання" з використанням трансгенних підходів. Ген B можна застосовувати у трансгенному підході для одержання трансгенних рослин цукрового буряка, які містять зазначені полінуклеотиди, стабільно інтегровані у геном цукрового буряка. Зокрема, після експресії із геному продукт експресії можна застосовувати для модуляція яровизаційної відповіді рослини цукрового буряка. Відповідно до одного з об'єктів винаходу яровізаційну відповідь можна сповільнювати шляхом придушення або регуляції за типом негативного зв'язку експресії гена B. В іншому об'єкті винаходу раннє стрілкування без впливу холоду можна індукувати шляхом надекспресії гена B. Раніше були розроблені методи застосування молекулярних маркерів, які можна використовувати для генетичного картирування, клонування генів, розмноження рослин за участю маркерів і фінгерпринтингу геному і дослідження генетичних взаємозв'язків. Основою генетичних маркерів є поліморфізми ДНК у нуклеотидних послідовностях геномних областей і їх можна виявляти або за допомогою рестриктаз, або за допомогою двох примованих сайтів. Відомо кілька типів молекулярних маркерів, які можна застосовувати для заснованого на використанні маркерів відбору, у тому числі поліморфізми довжини рестрикційних фрагментів (RFLP), довільно ампліфіковані поліморфні ДНК (RAPD), поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP), прості повторювані послідовності (SSR) і однонуклеотидні поліморфізми (SNP). Інформаційний зміст різних типів маркерів може розрізнятися залежно від методу, застосовуваного для одержання даних про маркери і популяцію, у якій оцінювали маркери. Наприклад, не завжди можливо розрізняти геномні фрагменти, які перебувають у гомозиготному стані, і гетерозиготні фрагменти. У гетерологічній популяції типу F2, кодомінантні маркери, такі як поліморфізми довжини рестрикційних фрагментів (RFLP, Botstein і ін., 1980) і що характеризуються кодоминантностью поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів (AFLP, Vos і ін., 1995), є більш інформативними, ніж домінантні маркери, такі як довільно ампліфіковані поліморфні ДНК (RAPD, Welsh і McCleland, 1990) і такі, що характеризуються домінантністю AFLP. RFLP є кодомінантними і їх можна застосовувати для ідентифікації унікального локусу. RFLP передбачає застосування рестриктаз для розщеплення хромосомної ДНК у специфічних коротких сайтах рестрикції, поліморфізми є результатом дуплікацій сайтів або їх делеції, або мутацій у сайтах рестрикції. При використанні AFLP потрібне розщеплення клітинної ДНК за допомогою рестриктази перед здійсненням ПЛР і селективних нуклеотидів у праймерах для ампліфікації специфічних фрагментів. При використанні цього методу можна оцінювати аж до 100 поліморфних локусів, і для кожного аналізу потрібно лише відносно невеликий зразок ДНК. Найбільш бажаним методом для ампліфікації нуклеотидних фрагментів, що покривають поліморфну область рослинного геному, є полімеразна ланцюгова реакція ("ПЛР") (Mullis і ін., 1986), для здійснення якої використовують пару праймерів, що включає "зворотний" праймер і "прямий" праймер, які мають здатність гібридизуватися із проксимальними послідовностями, що визначають поліморфізм, у їх дволанцюговому форматі. На відміну від RFLP, для здійснення методів, заснованих на ПЛР, потрібний лише невеликий відсоток (приблизно 10 %) ДНК, застосовуваної в якості матриці, для одержання більших кількостей послідовності-мішені за допомогою ПЛР-ампліфікації. Одним з таких заснованих на ПЛР методів є RAPD, у якому застосовують здійснювану у розслаблених умовах ампліфікацію за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням тільки праймерів довільної послідовності для створення специфічних для штаму масивів невідомих ДНК-фрагментів. Для цього методу потрібні лише дуже невеликі зразки ДНК, і він дозволяє аналізувати велику кількість поліморфних локусів. Однак непередбачене поводження коротких праймерів, на які впливають різні умовах реакції, їх домінантний шлях спадкування і популяційна специфічність є основними недоліками RAPD. Мікросателіти або прості повторювані послідовності (SSR), поліморфізми довжини простих послідовностей (SSLP), короткі тандемні повтори (STR), мотиви простих послідовностей (SSM) і мікросателіти послідовностей-мішеней (STM) являють собою клас повторюваних послідовностей, які широко поширені у геномі эекаріот. Варіація кількості і довжини повторів є джерелом поліморфізму навіть серед близкоспоріднених особин. SSR-аналіз заснований на цих (що несуть короткий повтор) послідовностях, які селективно ампліфікують для виявлення варіацій у простих повторюваних послідовностях. Такі мікросателітні послідовності легко можна ампліфіціювати за допомогою ПЛР із використанням пари фланкуючих локус-специфічних 22 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 олігонуклеотидів у якості праймерів для виявлення поліморфізмів довжин ДНК (Litt і Luty, 1989; Weber і May, 1989). Мутації, що зачіпають одне положення у нуклеотидній послідовності, що приводять до замін, делеціям або інсерціям, приводять до однонуклеотидних поліорфімів або SNP, які зустрічаються приблизно через кожні 1,3 т.п.н. у геномі людини (Cooper і ін., 1985; Kwok і ін., 1996). Більшість поліморфізмів цих типів має тільки два алелі і їх називають також біалельними локусами. Позиційне клонування на основі SNP може полегшувати ідентифікацію ознак хвороб іряду біологічно інформативних мутацій (Wang і ін., 1998). Аналізи, засновані на ПЛР-подовженні, які дозволяють ефективно виявляти точечні мутації, можна застосовувати для виявлення SNP. Для процедури потрібні невелика кількість ДНК на зразок. Трьома широко розповсюдженими типами аналізів виявлення SNP з використанням методу ПЛР, є методи, засновані на застосуванні розщеплених ампліфікованих поліморфних послідовностей (CAPS), (Konieczny і Ausubel, 1993; Thiel і ін., 2004), похідних CAPS (dCAPS) (Michaels і Amasino, 1998; Neff і ін… 1998), і конформаційного поліморфізму одного ланцюга (SSCP) (Orita і ін., 989). CAPS-поліморфізми являють собою розходження у довжинах рестрикційних фрагментів, викликані SNP або інделами, які створюють або скасовують розпізнавані рестриктазами сайти рестрикції, що мають ендонуклеазну активність, у ПЛР-ампликонах, що продукуються специфічними для локусу олігонуклеотидними праймерами. Аналізи CAPS здійснюють шляхом розщеплення специфічних для локусу ПЛР-ампліконів однієї або декількома рестриктазами і наступного розподілу розщепленої ДНК на агрозних або поліакриламідних гелях. dCAPS є модифікацією методу CAPS, що дозволяє виявляти більшість однонуклеотидних змін шляхом використання помилково спарених ПЛР-праймерів. За допомогою цього методу сайт, який розпізнається рестриктазою, що включає SNP, інтродукує у ПЛР-продукт за допомогою праймера, що містить одне або кілька помилкових спарювань із ДНК-матрицею. Потім ПЛР-продукт, модифікований таким чином, піддають розщепленню рестриктазою і визначають присутність або відсутність SNP на основі одежраної рестрикційної схеми. Метод SSCP дозволяє розділяти денатуровану дволанцюгову ДНК на неденатуруючому гелі і у результаті дозволяє визначати на основі рухливості у гелі вторинну структуру, а також молекулярну масу одноланцюгової ДНК. Процедура ARMS (ампліфікація рефракторної мутаційної системи)-ПЛР (Ye і ін., 2001) передбачає застосування однієї ПЛР для генотипування SNP (Fan і ін., 2003; Chiapparino і ін., 2004). Складається із двох пар праймерів тетрапраймер використовують для ампліфікації двох різних алелей SNP в одній реакції ПЛР. Для ампліфікації таких фрагментів можна застосовувати альтернативні методи, такі як "лігазна ланцюгова реакція" ("ЛЛР") (Barany F., 1991)), для здійснення якої застосовують дві пари олігонуклеотидних зондів для експонціальної ампліфікації специфічної мішені. Послідовності кожної пари олігонуклеотидів вибирають для того, щоб дозволяти парі гібридизуватися з послідовностями, що примикають, цього ж ланцюга мішені. За допомогою зазначеної гібридизації формують субстрат для залежної від матриці лігази. Також як у випадку ПЛР, продукти, що утворилися, служать в якості матриці у наступних циклах і у такий спосіб здійснюють експоненціальну ампліфікацію необхідної послідовності. ЛЛР можна здійснювати з олігонуклеотидами, що мають проксимальні і дистальні послідовності одного і того ж ланцюга поліморфного сайту. В одному з варіантів здійснення винаходу варто створювати олігонуклеотиди, що включають фактичний поліморфний сайт поліморфізму. У такому варіанті здійснення винаходу умови реакції вибирають так, щоб олігонуклеотиди могли лігуатися разом тільки в тому випадку, коли молекула-мішень або містить, або позбавлена специфічного олігонуклеотиду, що є комплементарним поліморфному сайту, який присутній у олігонуклеотиді. В іншому варіанті олігонуклеотиди можна вибирати так, що вони не включають поліморфний сайт (див. Segev, заявка PCT n WO 90/01069). Ще один альтернативний метод, який можна застосовувати, являє собою "метод лігуовання олігонуклеотидів" ("OLA") (Landegren і ін., 1988). В OLA-протоколі використовують два олігонуклеотиди, які створюють так, щоб вони могли гібридизуватися з послідовностями, що примикають, одного ланцюга мішені. OLA, подібно ЛЛР, найбільш придатний для виявлення точкових мутацій. На відміну від ЛЛР у результаті OLA одержують "лінійну", а не експоненціальну ампліфікацію послідовності мішені. Nickerson зі співавторами у 1990 р. описали аналіз виявлення нуклеїнової кислоти, що поєднує особливості і ПЛР, і OLA (Nickerson і ін., 1990). У цьому методі ПЛР використовують для досягнення експоненціальної ампліфікації ДНК-мішені, що потім виявляють за допомогою OLA. Крім необхідності в здійсненні декількох і різноманітних стадій процесинга, одна із проблем, що 23 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виникають при застосуванні таких комбінованих методів, полягає у тому, що вони включають всі проблеми, пов'язані як із ПЛР, так і з OLA. Відомі також схеми, засновані на лігуванні двох (або більшого числа) олігонуклеотидів у присутності нуклеїнової кислоти, яка має послідовність "діолігонуклеотиду", який утворився, що приводить до ампліфікації діолігонуклеотиду (Wu і Wallace, 1989), і їх можна легко адаптувати для цілей даного винаходу. Таким чином, різні аналізи, засновані на застосуванні генної послідовності, пропонованої у винаході і описаної вище, можна створювати і застосовувати для скринінга рослинного матеріалу щодо присутності або відсутності алелю, асоційованого з ознакою однорічності. На основі SNP можна розробляти молекулярні маркери, бажано такі, як End point TaqMan®, які відрізняються від секвенованих ПЛР-продуктів тим, що їх ампліфікують з однорічних і дворічних рослин. При цьому потрібно здійснювати кілька циклів ПЛР-ампліфікації для того, щоб охопити всю послідовність гена. Потім нові молекулярні маркери треба тестувати із використанням різних генетичних фонів однорічних і дворічних рослин для оцінки робастності молекулярного тесту. В одному з варіантів здійснення винаходу молекулярний маркер являє собою ДНКфрагмент, ампліфікований за допомогою ПЛР, наприклад SSR-маркер або RAPD-маркер. В одному з варіантів здійснення винаходу присутність або відсутність ампліфікованого ДНКфрагмента є показником присутності або відсутності самої ознаки або конкретного асоційованого з ознакою алелю. В одному з варіантів здійснення винаходу розходження ув довжині ампліфікованого ДНК-фрагмента є показником присутності або відсутності конкретного асоційованого з ознакою алелю і у результаті дозволяє диференціювати різні асоційовані з ознакою алелі. У конкретному варіанті здійснення винаходу мікросателітні (прості повторювані послідовності) (SSR) маркери використовують для ідентифікації алелей, що підпадають під обсяг винаходу, у батьківських рослинах і/або їх предках, а також у потомстві рослин, одежраному у результаті схрещування зазначених батьківських рослин. В іншому варіанті здійснення винаходу маркер, заснований на однонуклеотидном поліморфізмі, використовують для ідентифікації алелей, що підпадають під обсяг винаходу, у батьківських рослинах і/або їх предках, а також у потомстві рослин, одежраному у результаті схрещування зазначених батьківських рослин. Ще в одному варіанті здійснення винаходу маркер, заснований на делеції або інсерції ("інделі") принаймні одного нуклеотиду, використовують для ідентифікації, алелей, що підпадають під обсяг винаходу, у батьківських рослинах і/або їх предках, а також у потомстві рослин, одежраному у результаті схрещування зазначених батьківських рослин. Ці маркери можна створювати на основі послідовності полінуклеотидів, пропонованих у винаході і описаних вище. Згідно одного з об'єктів винаходу можна розробляти і застосовувати маркери, які не повністю відповідають представленим у даному описі, або ще не ідентифіковані маркери. На основі інформації, представленої у даному описі, спеціаліст у даній області може ідентифікувати або створювати маркери, які не повністю відповідають представленим у даному описі, але генетично близько зчеплені або бажано локалізовані у гені, що зумовлює стрілкування, або гені B, або зчеплені з маркерами, представленими у даному описі. Спеціалісту у даній області повинно бути очевидно, що інші маркери можуть знайти принаймні таке ж застосування в скринінгових аналізах і пов'язаною з маркерами селекції. Спеціалістам у даній області відомі і доступні кілька методів або підходів, які можна застосовувати для ідентифікації і/або створення маркерів нерівноважного зчеплення і/або зчеплених з і/або локалізованих в області гена B, а також маркерів, які являють собою фактично причинні мутації, відповідальні характерний для дворічного типу розвитку генотип. Відомі спеціалістам у даній області підходи включають, але не обмежуючись тільки ними: - Застосування описаних послідовностей/маркерів у заснованих на використанні гібридизації підходах для ідентифікації іншої послідовності в області, що представляє інтерес: праймерні послідовності, представлені у даному описі, і/або послідовності маркерів/генів (або їх фрагмент), які можна визначати за допомогою праймерних послідовностей, представлених у даному описі, можна застосовувати як зонди (що гібридизуються) для виділення нуклеотидних послідовностей/генів, фланкучих маркери, і/або зчеплених з областю гена B і/або локалізованих у ній, і/або специфічних для нею, зі зразка геномної нуклеїнової кислоти і/або зразка РНК або кДНК, або пула зразків (наприклад, здійснюючи скринінг геномних ресурсів типу BAC-бібліотек або скринінг бібліотек гДНК або кДНК). - Застосування описаних послідовностей/маркерів у заснованих на використанні ПЛР 24 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підходах для ідентифікації іншої послідовності в області, що представляє інтерес: праймерні послідовності, представлені у даному описі, і/або послідовності маркерів/генів(-кандидатів) (або їх фрагмент), які можна визначати за допомогою праймерних послідовностей, представлених у даному описі, можна застосовувати в якості праймерів для (ПЛР-)-ампліфікації нуклеотидної послідовності/гена, що фланкує QTL-область і/або зчепленого з нею, і/або асоційованого з нею, і/або специфічного щодо неї зі зразка геномної нуклеїнової кислоти і/або зразка РНК або кДНК, або пула зразків, або виділених з конкретної рослинної тканини, або не виділених з неї, і/або після специфічної обробки рослини, і з рослини цукрового буряка і у принципі з будь-якого іншого організму, що має достатній ступінь гомології із цукровим буряком. - Застосування описаних послідовностей/маркерів у заснованих на використанні ПЛР підходах для ідентифікації іншої послідовності в області, що представляє інтерес: нуклеотидні послідовності/гени одного або декількох маркерів можна визначати після створення внутрішніх вказаних для зазначених маркерних послідовностей і застосовувати для визначення додаткових фланкуючих послідовностей/генів в області гена B і/або генетично зчеплених і/або асоційованих з ознакою. - Застосування описаних послідовностей/маркерів у заснованих на використанні картирування і/або порівняльного картирування для ідентифікації маркерів в одній(них) і тій(тих) же області(ях) (визначення місця розташування (позиціонування) гена B на інших картах): на основі інформації про місце розташування і/або інформації про маркери, представленої вище, маркери будь-якого типу можна ідентифікувати на основі підходів з використанням генетичного картирування, в остаточному підсумку (якщо у цьому є необхідність) шляхом визначення місця розташування описаних маркерів (методом генетичного картирування або екстраполяції на основі загальних маркерів на картах) на генетичній(них) карті(ах) (високої щільності) і/або інтегрованій(их) генетичній(их) або консенсусній(их) карті(карт). Маркери, які вже є відомими і/або нові маркери, генетично зчеплені і/або розташовані поблизу описаних маркерів і/або області гена B, можна ідентифікувати і/або одержувати і в остаточному підсумку застосовувати для картирування (точного) гена B і/або клонування гена B, і/або застосування для MASселекції. - Застосування описаних послідовностей/маркерів в "in-siloco»-підходах (методи молекулярного моделювання на основі набору обчислювальних методів) для ідентифікації додаткових послідовностей/маркерів/ генів-кандидатів в області(ях) гена B: праймерні послідовності, представлені у даному описі, і/або послідовності маркерів/ генів-кандидатів (або їх фрагмент), які можна визначати за допомогою праймерних послідовностей, представлених у даному описі, або на основі зчеплених маркерів, можна використовувати у "in-silico»-методах для пошуку у базах даних послідовностей або білків (наприклад, з використанням програми BLAST) (додаткових) фланкуючих і/або гомологічних послідовностей/генів, і/або алельної різноманітності (як геномних послідовностей, так і/або послідовностей кДНК або навіть білків, одежраних як із представників роду Capsicum (перець), так і/або з будь-якого іншого організму), які генетично зчеплені і/або асоційовані з ознаками, зазначеними у даному описі, і/або локалізовані в області гена B. - Застосування описаних послідовностей/маркерів у засновані на фізичному картируванні підходах (визначення місця розташування гена B на фізичній карті або у геномній послідовності): праймерні послідовності, представлені у даному описі, і/або послідовності маркерів/генів (або їх фрагменти), які можна визначати за допомогою праймерних послідовностей, представлених у даному описі, або за допомогою інших маркерів, генетично зчеплених з маркерами, представленими у даному описі, і/або локалізованих в області гена B, можна позиціонувати на фізичній карті і/або в (повній) геномній послідовності у принципі будьякого організму, що має достатній ступінь гомології для ідентифікації (перспективних) послідовностей /маркерів/генів, які можна застосовувати для картирування (точного) гена B і/або клонування гена B, і/або застосування для MAS-Селекції. - Застосування описаних послідовностей/маркерів для визначення місця розташування гена B на інших (фізичних) картах або геномах (інших видів…., при цьому для перцю, природно, першорядний інтерес мають інші представники пасльонових (Solanaceae), такі як томати і картопля, але можна застосовувати також модельні види типу Arabidopsis): праймерні послідовності, представлені у даному описі, і/або послідовності маркерів/генів (або їх фрагменти), які можна визначати за допомогою праймерних послідовностей, представлених у даному описі, можна застосовувати для підходів, заснованих на порівняльному картируванні геному або синтенії, для ідентифікації гомологічної області і послідовностей гомологів і/або ортологів/генів (кандидатів), генетично зчеплених з областю гена B і/або розташованих у ній, і які можна застосовувати для картирування (точного) гена B і/або клонування гена B, і/або 25 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосування для MAS-селекції. - Застосування описаних послідовностей/маркерів для відбору відповідних особин, за допомогою яких можна ідентифікувати маркери в області, що представляє інтерес, за допомогою генетичних підходів: праймерні послідовності і/або маркери, представлені у даному описі, можна використовувати для відбору особин з різними/ контрастуючими алелями гена B. Генетичні підходи і/або аналіз об'єднаних сегрегантів (BSA, Michelmore і ін., 1991) можна застосовувати для ідентифікації маркерів/генів у конкретній області, що представляє інтерес, (області гена B) і/або області, асоційованій або генетично зчепленій з описаними ознаками. - Застосування представленої інформації для пошуку (позиційних) генів-кандидатів: представлену інформацію можна застосовувати для ідентифікації позиційних і/або функціональних генів-кандидатів, які можуть бути асоційовані і/або генетично зчеплені з описаними ознаками. Зокрема, маркери, пропоновані у даному винаході, можна застосовувати в аналізі алельної дискримінації, насамперед в аналізі, що дозволяє розрізняти (дискримінувати) різні гаплотипи у групах рослин цукрового буряка, що мають генотип, характерний для дворічного типу розвитку. Зазначений аналіз базується на застосуванні набору полінуклеотидних зондів, що містить дві різні молекули-зонди, які комплементарні, наприклад, підобласті гена BvPRR7, яку можна одержувати шляхом ПЛР-ампліфікації з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, де молекули-зонди розрізняються тільки одним помилковим спарюванням основ, насамперед помилковим спарюванням основ у положенні №631. Іншим об'єктом винаходу є аналіз, що включає застосування маркерів, за допомогою яких можна здійснювати специфічну ідентифікацію однорічних рослин і дворічних рослин, і тому їх можна застосовувати, наприклад, для контролю якості партій насіння. Зокрема, у винаході пропонований аналіз, що базується на застосуванні набору олігонуклеотидних зондів, що містять дві різні молекули-зонди, які комплементарні, наприклад, підобласті гена BvPRR7, яку можна одержувати шляхом ПЛР-ампліфікації з використанням "прямого" праймера PRR 7-F і "зворотного" праймера PRR 7-R, послідовності яких представлені у SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8 відповідно, де молекули-зонди розрізняються тільки одним помилковим спарюванням основ, насамперед помилковим спарюванням основ у положенні №631. Більша частина виробництв насіння цукрового буряка, призначеного для продажу, перебуває на півдні Франції і півночі Італії. В обох регіонах присутні однорічні бур'янисті види бурякових, це може приводити до забруднення їх пилком одержуваних продуктів і як наслідок, до появи характерного для однорічного типу розвитку генотипу у призначеного для продажу насіння. Це є неприйнятним для покупців, і тому всі призначені для продажу партії насіння вирощують у регіонах, таких як Аргентина, в яких бур'янисті види бурякових не виростають безпосередньо після збору насіння. Рослини є неяровизованими і наявність стрілок використовують для ідентифікації партій, забруднених характерним для однорічного типу розвитку генотипом. Ознака однорічного типу розвитку рослин проявляється залежно від стану гена B як моногенна домінантна ознака; таким чином, потреба в яровизації у дворічних рослин є рецесивною. Таким чином, можна припустити, що трансформація визначального однорічний тип розвитку алелю BvPRR7 у характерний для дворічного типу розвитку генотип приводить до включення ознаки щорічного цвітіння, у характерний для дворічного типу розвитку акцепторний генотип. Для підтвердження цієї гіпотези послідовністю, що кодує, визначаючого однорічний тип розвитку алелю гена BvPRR7, яка перебуває під контролем характерних для однорічного типу розвитку промотору і фрагмента термінатора, трансформують характерний для дворічного типу розвитку генотип, такий, наприклад, як G018. Трансформацію можна здійснювати методами, відомими у даній області, такими як методи, описані у Chang і ін., 2002, використовуючи меристему цукрового буряка в якості експлантата і ген фосфоманозоізомерази (PMI) у якості маркера, що селектується. Трансгенні пагони відбирають за ознакою експресії маркера селекції, такого, наприклад, як PMI-активність (Joersbo і ін., 1998), і потім вкорінюють, висаджують у ґрунт і переносять у теплицю. В якості негативного контролю використовують нетрансгенні пагони, які піддають такій же процедурі регенерації in vitro, але без зараження Agrobacterium і селекції. Рослини вирощують у вегетаційних камерах при постійній температурі 18 °C і фотоперіоді 17 год. світла і 7 год. темряви. У цих умовах у жодного з нетрасгенних контролів не повинно бути виявлено будь-яких ознак стрілкування протягом періоду спостереження, у той час як однорічні контрольні рослини у нормі повинні викидати стрілку в межах 8 тижневого періоду часу. На відміну від нетрансгенних дворічних контрольних рослин, у більшості трансгенів стрілкування 26 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повинно починатися через 4-10 тижнів, і вони повинні мати основну ознаку, характерну для однорічних рослин, незважаючи на їх генетичний фон, що відповідає дворічним рослинам. Трансгенні рослини, в яких виявлено стрілкування і цвітіння, піддають перехресному запиленню дворічною підтримуючою лінією з одержанням потомства. У рослин-нащадків оцінюють активність маркера селекції і потім оцінюють щодо стрілкування і цвітіння без яровизації. Більша частина нащадків повинна характеризуватися коефіцієнтом сегрегації 1:1 і прямою кореляцію між PMI-активністю і ознакою однорічності. Ці дані повинні недвозначно підтверджувати причинний зв'язок між BvPRR7 і незалежним від яровизації цвітінням у цукрового буряка. BvPRR7 відіграє основну роль у яровизаційній відповіді цукрового буряка і тому його можна застосовувати для створення стійкості до стрілкування у рослин цукрового буряка шляхом придушення яровизаційної відповіді. Для цієї мети кДНК-фрагмент BvPRR7, такий, наприклад, як фрагмент розміром 0,6 т.пп. , представлений у SEQ ID NO: 1, поміщають у касету для РНКi під контроль конститутивного промотору. Прийнятними конститутивними промоторами, є, наприклад, промотор Ubi3 Arabidopsis (Norris і ін., 1993), промотор 35S CaMV або інші промотори, для яких відомо, що вони забезпечують конститутивну експресію цукрового буряка. Касета експресії містить також маркерний ген, що селектується, під контролем прийнятного промотору. Зокрема, маркерний ген кодує маркер позитивної селекції, такий як фосфоманозоізомераза або ксилозоізомераза. Інвертований повтор BvPRR 7-фрагмента може бути відділений другим інтроном від гена StLS1 картоплі (Eckes і ін., 1986; Vancanneyt і ін., 1990) для стабілізації РНКi-касети, але також для підвищення ефективності процесу РНКi (Wang і Waterhouse, 2001; Smith і ін., 2000). Потім РНКi-касетою можна трансформувати визначальну ознаку дворічного розвитку генотип цукрового буряка, таку, наприклад, як G018, відповідно до описаного вище методу. Трансгенні пагони відбирають за ознакою експресії маркера селекції, такого, наприклад, як PMIактивність (Joersbo і ін., 1998). Пагони, що дають позитивну реакцію, і нетрансгенні контрольні пагони вкорінюють і переносять у теплицю для акліматизації протягом мінімум двох тижнів при 18 C до їх обробки для яровизації. Відповідно до прийнятих методів трансгенні рослини піддають обробці для яровизації, що передбачає витримування протягом 14 днів при постійній температурі 6 °C і 12-годинної низкою штучної освітленості. Перед впливом індукуючих стрілкування умов яровизовані рослини повільно акліматизують протягом двох тижнів у кліматичних камерах шляхом ступеневого підвищення температури з 10 до 18 °C. Потім рослини пересаджують у більші горщики (2 л) і здійснюють моніторинг стрілкування, витримуючи їх при постійній температурі 18 °C і фотоперіоді із тривалим світловим днем 17 год. світла/7 год. темряви. У нетрансгенних контрольних рослин, як правило, стрілкування починається у період між 4-6 тижнями після яровизації. У трансгенних рослин з подавленим геном BvPRR7 часто спостерігається уповільнення стрілкування на період часу, що становить від лише двох тижнів і аж до більш ніж 2 місяців. У деяких випадках стрілкування взагалі не відбувалося в умовах, що існують у теплиці. Крім уповільнення стрілкування і цвітіння трансгенні рослини розвиваються нормально і не мають фенотипічних аномалій. У цілому, для рослин з уповільненим стрілкуванням характерно більша кількість листів у момент стрілкування у результаті пролонгованої вегетативної стадії. Одержання достатніх рівнів трансгенної експресії у відповідних рослинних тканинах є важливим аспектом вирощування створених за допомогою генної інженерії культурних рослин. Експресія гетерологічних послідовностей ДНК у рослині-хазяїні залежить від присутності функціонально зв'язаного промотору, що функціонує в рослині-хазяїні. Вибір промоторної послідовності повинен визначати час, коли експресується гетерологічна послідовність ДНК, і місце в організмі, де це відбувається. Наприклад, якщо існує потреба у надекспресії, то можна застосовувати рослинний промоторний фрагмент, що забезпечує експресію гена у всіх тканинах регенерованої рослини. Зазначені промотори у контексті даного опису позначені як "конститутивні" промотори, і вони мають активність при більшості умов навколишнього середовища і стадіях розвитку або клітинної диференціровки. Прикладами конститутивних промоторів є область ініціації транскрипції вірусу мозаїки кольорової капусти (CaMV) 35S, 1'- або 2'-промотор, виведений з TДНК Agrobacterium tumefaciens, і інші області ініціації транскрипції з різних рослинних генів, які відомі спеціалістам у даній області. Такі гени включають, наприклад, ген AP2, ACT11 з Arabidopsis (Huang і ін., Plant Mol. Biol. 33, 1996, сс. 125-139), Cat3 з Arabidopsis (GenBank NO: U43147, Zhong і ін., Mol. Gen. Genet. 251, 1996, сс. 196-203), ген, що кодує стеароіл-апб (ацилпереносячий білок)-десатуразу з Brassica napus (Genbank NO: X74782, Solocombe і ін., Plant Physiol. 104, 1994, сс. 1167-1176), GPc1 з кукурудзи (GenBank NO: X15596, Martinez і ін., J. 27 UA 100855 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Mol. Biol 208, 1989, сс. 551-565) і Gpc2 з кукурудзи (GenBank NO: U45855, Manjunath і ін., Plant Mol. Biol. 33, 1997, сс. 97-112). В іншому варіанті промотор може забезпечувати експресію молекул нуклеїнових кислот у конкретній тканині або може більш точно контролюватися умовами навколишнього середовища або стадією розвитку. Прикладами умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію за допомогою індукабельних промоторів, є анаеробні умови, підвищена температура або присутність світла. Такі промотори в контексті даного опису позначені як "індукабельні" або "тканиноспецифічні" промотори. Спеціалісту в даній області повинно бути очевидно, що тканиноспецифічний промотор може забезпечувати експресію функціонально зв'язаних послідовностей у тканинах, відмінних від тканини-мішені. Таким чином, у контексті даного опису тканиноспецифічний промотор являє собою промотор, що забезпечує експресію насамперед у тканині-мішені, але може контролювати також певний рівень експресія в інших тканинах. Прикладами промоторів, дія яких залежить від стадії розвитку, є промотори, які ініціюють транскрипцію тільки (або практично тільки) у певних тканинах, таких як плід, насіння або квітки. Промотори, які забезпечують експресію нуклеїнових кислот у насіннєвих зачатках, квітках або насінні, є найбільш бажаними згідно даного винаходу. У контексті даного опису під специфічним або бажаним для насіння промотором мається на увазі промотор, що забезпечує експресію специфічно або бажано у тканинах насіння, наприклад, зазначені промотори можуть бути специфічними для насіннєвого зачатку, специфічними для зародка, специфічними для ендосперму, специфічними для інтегументу, специфічними для насінєвої оболонки або специфічними для певних комбінацій цих органів. Їх прикладами є промотор зі специфічного для насіннєвого зачатку гена BEL1, що описаний у Reiser і ін., Cell 83, 1995, сс. 735-742 (GenBank NO: U39944). Інші придатні специфічні для насіння промотори виводять із наступних генів: MAC1 з кукурудзи (Sheridan і ін., Genetics 142, 1996, сс. 1009-1020, Cat3 з кукурудзи (GenBank NO: L05934, Abler і ін., Plant Mol. Biol. 22, 1993, сс. 10131-1038), що кодує олеозин ген розміром 18 т.п.н. з кукурудзи (GenBank No, J05212, Lee і ін., Plant Mol. Biol. 26, 1994, сс. 1981-1987), vivparous-1 з Arabidopsis (Genbank NO: U93215), що кодує олеозин ген з Arabidopsis (Genbank NO: Z17657), Atmycl з Arabidopsis (Urao і ін., Plant Mol. Biol. 32, 1996, сс. 571-576), сімейство генів 2s білка, що запасає, насіння Arabidopsis (Conceicao і ін., Plant 5, 1994, сс. 493-505), що кодує олеозин ген розміром 20 т.п.н. з Brassica napus (GenBank NO: M63985), napА з Brassica napus (GenBank NO: J02798, Josefsson і ін., JBL 26, 1987, сс. 12196-1301, сімейство генів напину з Brassica napus (Sjodahl і ін., Planta 197, 1995, сс. 264-271), ген, який кодує білок, що запасає, 2S, з Brassica napus (Dasgupta і ін., Gene 133, 1993, сс.301-302), гени, що кодують олеозин A (Genbank NO: U09118) і олеозин B (Genbank NO: U09119) із сої, і ген, що кодує низькомолекулярний богатий сіркою білок із сої (Choi і ін., Mol Gen, Genet. 246, 1995, сс. 266268). В іншому варіанті можна ідентифікувати конкретні послідовності, що представляють собою промотор з необхідними характеристиками експресії або промотор з підвищеної експресійною активністю, або ці або подібні послідовності інтродукувати у послідовності за допомогою мутації. Крім того, можна здійснювати мутагенез цих послідовностей для підвищення експресії трансгенів у конкретних видах. Крім того, можна застосовувати промотори, в яких об'єднані елементи більше одного промотору. Наприклад, в US 5491288 описана комбінація промотору вірусу мозаїки кольорової капусти і промотору гистону. Таким чином, елементи промоторів, представлених у даному описі, можна поєднувати з елементами інших промоторів. Для застосування в даному винаході доступні різні регулюючі транскрипцію 5’- і 3’послідовності. Термінатори транскрипції відповідальні за термінацію транскрипції і правильні поліаденілування мРНК. 3’-нетрасльована регуляторна послідовність ДНК бажано включає від приблизно 50 до приблизно 1000, більш бажано від приблизно 100 до приблизно 1000 пар основ (нуклеотидів) і містить рослинні термінуючі транскрипцію і трансляцію послідовності. Прийнятні термінатори транскрипції і термінатори, для яких відомо, що вони функціонують у рослинах, являють собою термінатор 35S CaMV, термінатор tml, термінатор нопалінсинтази, термінатор Е9 rbc гороху, термінатор для транскрипту T7 з гена октопінсинтази Agrobacterium tumefaciens і 3’-кінець генів протеазних інгібіторів I або II з картоплі або томатів, хоча можна застосовувати також інші 3’-кінцеві елементи, відомі спеціалістам у даній області. В іншому варіанті можна застосовувати також термінатор коіксину гама, олеозину 3 або інші термінатори з роду Coix. Бажаними 3’-елементами є елементи з гена нопалінсинтази Agrobacterium tumefaciens (Bevan і ін., 1983), термінатор для транскрипту T7 з гена октопінсинтази Agrobacterium 28