Генетичні маркери високого вмісту олеїнової кислоти у рослин

Реферат: Винахід належить до мутованої послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує фермент дельта12-фосфатидилхоліндесатуразу (FAD2) з рослини Cruciferae, причому згадана мутована послідовність нуклеїнової кислоти містить неконсервативну мутацію щонайменше одного нуклеотиду щонайменше одного кодону, який представляє амінокислоту, вибрану з групи, яку складають: амінокислота у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданого FAD2, коли послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 258, коли послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот. Винахід також належить до нуклеїнової кислоти, яка є гомологічна, комплементарна чи гібридизаційна зазначеній мутованій послідовності нуклеїнової кислоти, та до рослин, що містять зазначені послідовності. Зазначена мутована послідовність нуклеїнової кислоти забезпечує підвищений вміст олеїнової кислоти в рослинах, які її містять. UA 97642 C2 (12) UA 97642 C2 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цей винахід має відношення до нових генетичних та білкових маркерів, придатних для відбору рослин, які мають високий вміст олеїнової кислоти. Високий вміст олеїнової кислоти у рослинних оліях є бажаною особливістю як з точки зору корисності для здоров'я, так і з точки зору стійкості олеїнової кислоти до окиснення та нагрівання. Зокрема, було показано, що олеїнова кислота є ефективною щодо зниження рівнів холестерину у плазмі (Бонаном (Bonanome) та інші, 1988; Лю (Liu) та інші, 2002). До того ж, її єдиний ненасичений зв'язок, робить олеїнову кислоту (С18:1) набагато менш вразливою жирною кислотою, порівняно з її численними ненасиченими аналогами. Наприклад, швидкість окиснення ліноленової кислоти (С18:3) є у 100 разів вищою за швидкість окиснення олеїнової кислоти (Дебрін (Debruyne), 2004). Одним із найбільш перспективних шляхів у напрямку створення таких рослин є відбір рослин, які по суті позбавлені активності FAD2. Дійсно, FAD2 (дельта-12фосфатидилхоліндесатураза) каталізує перетворення олеїнової кислоти (С18:1) на лінолеву кислоту (С18:2); рослини, які мають знижену активність FAD2, відповідно мають підвищений вміст олеїнової кислоти завдяки її обмеженому катаболізму. Як така, WO 2004/072259 пропонує рослину Brassica napus, яка має високий вміст олеїнової кислоти, причому її ген fad2 представляє стоп-кодон, замість кодону глутаміну (Q) у положенні 185 FAD2. На додаток до цього, US 2005/0039233 пропонує рослину Brassica juncea, яка має високий вміст олеїнової кислоти, причому її ген fad2 представляє стоп-кодон, замість кодону триптофану (W) у положенні 101 FAD2. Brassica napus (рапс) являє собою амфідиплоїд, який містить геноми двох диплоїдних попередників, Brassica rapa (геном А) та Brassica oleracea (геном С) (Пірс (Pires) та інші, 2004). Вміст олеїнової кислоти у традиційній рапсовій олії становить 61% (Стан Скріпец (Stan Skrypetz), 2005). Вартим уваги є те, що цей винахід є результатом віднайдення винахідниками п'яти раніше нерозпізнаних мутацій у генах fad2 рослин Brassica napus: - заміна G на А у положенні 269 гена fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), яка відповідає заміні W на стоп-кодон у положенні 90 білка FAD2A, - заміна С на Τ у положенні 346 гена fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), яка відповідає заміні Q на стоп-кодон у положенні 116 білка FAD2A, - заміна С на Τ у положенні 646 гена fad2С (ген fad2 з геному В. oleracea), яка відповідає заміні Ρ на S у положенні 216 білка FAD2C, - заміна С на Τ у положенні 775 гена fad2А (ген fad2 з геному В. rapa), яка відповідає заміні Ρ на S у положенні 259 білка FAD2A, - заміна С на Τ у положенні 827 гена fad2А (ген fad2 з геному В. rapa), яка відповідає заміні Τ на Μ у положенні 276 білка FAD2A, які корелюють із високим вмістом олеїнової кислоти у рослин, які їх містять. Зокрема, вміст олеїнової кислоти у цих мутованих рапсів коливається у межах від 66% до 82% відповідно до навколишніх умов культивування. Таким чином, цей винахід стосується мутованої нуклеїновокислотної послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує фермент дельта-12-фосфатидилхоліндесатуразу (FAD2), з рослини, зокрема, з рослини Cruciferae, де згадана мутована нуклеїновокислотна послідовність містить неконсервативну мутацію щонайменше одного нуклеотиду щонайменше одного кодону, який представляє амінокислоту, вибрану з групи, яку складають: - амінокислота у положенні 90 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, - амінокислота у положенні 116 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, - амінокислота у положенні 216 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 215 у разі, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, - амінокислота у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 258 у разі, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, - амінокислота у положенні 276 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 275 у разі, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, або гомологічної нуклеїновокислотної послідовності, яка була одержана зі згаданої мутованої нуклеїновокислотної послідовності шляхом заміни, інсерції або делеції щонайменше одного нуклеотиду, і має щонайменше 90% гомологію зі згаданою мутованою 1 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 нуклеїновокислотною послідовністю, за умови, що згадана гомологічна нуклеїновокислотна послідовність представляє згадану мутацію і не кодує функціональну FAD2, або гібридизаційної нуклеїновокислотної послідовності, яка гібридизується за жорстких умов зі згаданою мутованою нуклеїновокислотною послідовністю, за умови, що комплементарна послідовність згаданої гібридизаційної нуклеїновокислотної послідовності представляє згадану мутацію і не кодує функціональну FAD2, або комплементарних послідовностей згаданих мутованої, гомологічної або гібридизаційної нуклеїновокислотних послідовностей. Відсоток гомології даної нуклеїновокислотної послідовності відносно мутованої нуклеїновокислотної послідовності розраховують шляхом підрахування кількості ідентичних нуклеотидів між згаданою даною нуклеїновокислотною послідовністю і мутованою нуклеїновокислотною послідовністю в усіх положеннях оптимального впорядкованого розміщення згаданої даної нуклеїновокислотної послідовності і мутованої нуклеїновокислотної послідовності і ділення цієї кількості на загальну кількість нуклеотидів згаданої даної послідовності. Оптимальне впорядковане розміщення послідовностей може здійснюватись вручну, факультативно шляхом введення "проривів" між нуклеотидами або шляхом застосування комп'ютеризованих засобів впорядкованого розміщення, наприклад, BLAST (основний засіб локалізованого впорядкованого розміщення послідовностей) (Альтшуль (Altschul) та інші, (1997) Nucleic Acids Res, 25:3389-3402). "Жорсткі умови" для даної нуклеїновокислотної послідовності можуть легко визначатись фахівцем у цій галузі, наприклад, як описано у Сембрук (Sambrook) та інших (2001). Заслуговує на увагу те, що конкретні жорсткі умови створюють за допомогою 15 мМ розчину NaCl/1,5 мМ розчину цитрату натрію (0,1Х SSC) та 0,1% розчину лаурилсульфату натрію (SDS) при температурі 50-65°С. Як передбачається цим винаходом, FAD2 Cruciferae складається, як правило, з 383 або 384 амінокислот. У межах звичайних можливостей фахівця у цій галузі є адаптація положень, наведених для вищевизначених мутацій FAD2, яка має більше або менше ніж 383 або 384 амінокислоти. Зразкове впорядковане розміщення послідовностей FAD2 різних видів Cruciferae наведено на Фіг. 14. Як передбачається цим винаходом, нуклеїновокислотна послідовність, яка "не кодує функціональну FAD2", стосується нуклеїновокислотної послідовності, яка кодує FAD2, яка має активність, нижчу за активність відповідної природної FAD2, визначену за однакових умов, зокрема, закодована FAD2 не має активності. За варіантом, якому віддається перевага, мутантні рослини, які несуть нуклеїнові кислоти з вищевизначеними мутаціями, мають підвищений вміст олеїнової кислоти, порівняно з рослинами, генетично ідентичними в усіх інших відношеннях (тобто з рослинами, які є генетично ідентичними, за виключенням згаданих мутацій) та з відповідними рослинами дикого типу. За варіантом, якому віддається перевага, мутантні рослини, які несуть нуклеїнові кислоти з вищевизначеними мутаціями, мають вміст олеїнової кислоти, який становить щонайменше 65%, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше 70%. За одним з варіантів здійснення цей винахід, зокрема, стосується мутованої нуклеїновокислотної послідовності, як визначено вище, причому згадана мутована нуклеїновокислотна послідовність містить щонайменше одну мутацію, вибрану з-посеред: - заміни кодону, який представляє амінокислоту у положенні 90 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, на стоп-кодон, - заміни кодону, який представляє амінокислоту у положенні 116 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, на стоп-кодон, - заміни кодону, який представляє амінокислоту у положенні 216 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 215, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, на кодон, який представляє будь-яку амінокислоту, окрім Р, - заміни кодону, який представляє амінокислоту у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 258, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, на кодон, який представляє будь-яку амінокислоту, окрім Р, - заміни кодону, який представляє амінокислоту у положенні 276 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, 2 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або у положенні 275, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, на кодон, який представляє будь-яку амінокислоту, окрім Т. За іншим варіантом здійснення цей винахід, зокрема, стосується мутованої нуклеїновокислотної послідовності, як визначено вище, де: - кодон, який представляє амінокислоту у положенні 216 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 215, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, замінюють на кодон, який представляє S, - кодон, який представляє амінокислоту у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 258, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, замінюють на кодон, який представляє S, - кодон, який представляє амінокислоту у положенні 276 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 275, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, замінюють на кодон, який представляє М. За варіантом здійснення вищевизначеної мутованої нуклеїновокислотної послідовності, якому віддається перевага, згадана рослина належить до роду Brassica. За іншим варіантом здійснення винаходу, якому віддається перевага, мутована нуклеїновокислотна послідовність представлена Послідовністю № 22 і містить щонайменше одну мутацію, вибрану з групи, яку складають: - заміна G на А у положенні 269 Послідовності № 22, - заміна С на Τ у положенні 346 Послідовності № 22, - заміна С на Τ у положенні 646 Послідовності № 22, - заміна С на Τ у положенні 775 Послідовності № 22, - заміна С на Τ у положенні 827 Послідовності № 22. За ще одним варіантом здійснення цього винаходу мутована нуклеїновокислотна послідовність вибрана з групи, яку складають: Послідовність № 24; Послідовність № 26; Послідовність № 28; Послідовність № 30; Послідовність № 32. Послідовність № 24 представляє ген fad2A В. napus (тобто ген fad2 з геному В. rapa), який містить заміну G на А у положенні 269, яка відповідає заміні W на стоп-кодон у положенні 90 білка FAD2A. Цю мутацію, зокрема, знаходять у лінії рапсу, яка надпродукує олеїнову кислоту, позначеній як "HOR4" у наведеному нижче Прикладі. "HOR4" депонували у NCIMB (Національна колекція промислових мікроорганізмів, Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41403. Послідовність № 26 представляє ген fad2A В. napus, який містить заміну С на Τ у положенні 346, яка відповідає заміні Q на стоп-кодон у положенні 116 білка FAD2A. Цю мутацію, зокрема, знаходять у лінії рапсу, яка надпродукує олеїнову кислоту, позначеній як "HOR3" у наведеному нижче Прикладі. "HOR3" депонували у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41402. Послідовність № 28 представляє ген fad2C В. napus (тобто ген fad2 з геному В. oleracea), який містить заміну С на Τ у положенні 646, яка відповідає заміні Ρ на S у положенні 216 білка FAD2C. Цю мутацію, зокрема, знаходять у лінії рапсу, яка надпродукує олеїнову кислоту, позначеній як "HOR1" у наведеному нижче Прикладі. "HOR1" депонували у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41400. Послідовність № 30 представляє ген fad2A В. napus, який містить заміну С на Τ у положенні 775, яка відповідає заміні Ρ на S у положенні 259 білка FAD2A. Цю мутацію, зокрема, знаходять у лінії рапсу, яка надпродукує олеїнову кислоту, позначеній як "HOR1" у наведеному нижче Прикладі. Послідовність № 32 представляє ген fad2A В. napus, який містить заміну С на Τ у положенні 827, яка відповідає заміні Τ на Μ у положенні 276 білка FAD2A. Цю мутацію, зокрема, знаходять у лінії рапсу, яка надпродукує олеїнову кислоту, позначеній як "HOR2" у наведеному нижче Прикладі. "HOR2" депонували у NCIMB (Національна колекція промислових мікроорганізмів, Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41401. Цей винахід також стосується нуклеїновокислотного фрагмента мутованої нуклеїнової кислоти, як визначено вище, причому згаданий фрагмент містить щонайменше 10, за варіантом, 3 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 якому віддається перевага, щонайменше 100, за варіантом, якому віддається більша перевага, щонайменше 1000 нуклеотидів і містить щонайменше один нуклеотид, суміжний із щонайменше одним кодоном, який представляє амінокислоту, вибрану з групи, яку складають: - амінокислота у положенні 90 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, - амінокислота у положенні 116 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, - амінокислота у положенні 216 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 215, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, - амінокислота у положенні 259 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 258, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, - амінокислота у положенні 276 амінокислотної послідовності згаданої FAD2, коли згадана послідовність FAD2 складається з 384 амінокислот, або у положенні 275, коли згадана послідовність FAD2 складається з 383 амінокислот, або комплементарної послідовності згаданого нуклеїновокислотного фрагмента. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, вищевизначений нуклеїновокислотний фрагмент містить мутований нуклеотид. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, вищевизначений нуклеїновокислотний фрагмент вибраний з групи, яку складають Послідовність № 12, Послідовність № 14, Послідовність № 17, Послідовність № 34 та Послідовність № 35, Послідовність № 3, Послідовність № 4, Послідовність № 5, Послідовність № 6 та Послідовність № 7. Цей винахід також стосується рослини за варіантом, якому віддається перевага, рослини Cruciferae, за варіантом, якому віддається більша перевага, рослини роду Brassica, і за варіантом, якому віддається ще більша перевага, рослини виду Brassica napus, яка має підвищений вміст олеїнової кислоти, або частини згаданої рослини, причому згадана рослина містить щонайменше одну мутовану нуклеїновокислотну послідовність, як визначено вище, або нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище, який містить мутований нуклеотид. Як передбачається цим винаходом, частина рослини має відношення до рослинної клітини, насіння, меристеми, калюсу, суцвіття, бруньки або листа. За конкретним варіантом здійснення вищевизначеної рослини або частини рослини щонайменше одна копія гена fad2, який міститься у геномі згаданої рослини, представлена мутованою нуклеїновою кислотою, як визначено вище. За іншим конкретним варіантом здійснення вищевизначеної рослини або частини рослини, кожна копія гена fad2, який міститься у геномі згаданої рослини, представлена мутованою нуклеїновою кислотою, як визначено вище. Інший варіант здійснення цього винаходу стосується вищевизначеної рослини або частини рослини, де: - одна копія гена fad2A представлена Послідовністю № 30 і одна копія гена fad2C представлена Послідовністю № 28, або - одна копія гена fad2A представлена Послідовністю № 32, або - одна копія гена fad2А представлена Послідовністю № 26, або - одна копія гена fad2А представлена Послідовністю № 24. За ще одним варіантом здійснення цього винаходу вищевизначена рослина або частина рослини являє собою рослину виду Brassica napus, де обидві копії гена fad2A незалежно одна від одної представлені Послідовністю № 24, Послідовністю № 26, Послідовністю № 30 або Послідовністю № 32, та/або обидві копії гена fad2C представлені Послідовністю № 28. За ще одним конкретним варіантом здійснення, вищевизначена рослина або частина рослини вибрана з групи, яку складають: - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41403; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41402; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41400; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41401. Цей винахід також стосується застосування нуклеїнової кислоти, як визначено вище, для відбору рослин або частини рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти. 4 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід також стосується способу відбору рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти, шляхом мутагенезу, який включає наведені нижче стадії: - піддання рослини або частини рослини мутагенній обробці, - регенерація рослин або частини рослин зі згаданої обробленої рослини або частини рослини, - відбір з регенерованих рослин тих із них, які містять щонайменше одну мутовану нуклеїновокислотну послідовність, як визначено вище, або нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище, який містить мутований нуклеотид. Мутагенез може здійснюватись за способами, добре відомими фахівцю у цій галузі, наприклад, за способами, опис яких наведено у МакКаллум (McCallum) та інші (2000). Зокрема, мутагенез здійснюють за допомогою етилметансульфонату (EMS). Регенерація рослин із частин рослини, наприклад, клітин, може здійснюватись за способами, добре відомими фахівцю у цій галузі, наприклад, за способами, опис яких наведено у Герман (Herman) (2005). Цей винахід також стосується способу відбору рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти, шляхом схрещування, який включає наведені нижче стадії: - схрещування рослини або частини рослини з батьківською рослиною або частиною батьківської рослини, яка містить щонайменше одну мутовану нуклеїновокислотну послідовність, як визначено вище, або нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище, який містить мутований нуклеотид, - відбір із рослин-нащадків або частин рослин, які були одержані шляхом схрещування, тих із них, які містять щонайменше одну мутовану нуклеїновокислотну послідовність, як визначено вище, або нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище, який містить мутований нуклеотид. Схрещування може здійснюватись за способами, добре відомими фахівцю у цій галузі, наприклад, за способами, опис яких наведено у Галле (Gallais) (1997). У значенні, вживаному у цьому винаході, термін "нащадки", зокрема, означає саджанці схрещених рослин. За варіантом здійснення вищевизначеного способу відбору рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти, шляхом схрещування, якому віддається перевага, батьківську рослину одержують за вищевизначеним способом відбору рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти, шляхом мутагенезу. За варіантом здійснення вищевизначеного способу відбору рослин, які мають підвищений вміст олеїнової кислоти, шляхом схрещування, якому віддають особливу перевагу, батьківська рослина або частина батьківської рослини вибрана з групи, яку складають: - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41403; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41402; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41400; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41401. Зокрема, наведені нижче методики можуть застосовуватись на стадії відбору вищевизначених способів відбору: методика ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), наприклад, TaqMan аналіз (ПЛР у масштабі реального часу) або алель-специфічна ПЛР, нозерн- або саузерн-блотинг, впорядкована мікро- або макросукупність ДНК, молекулярні сигнальні "маяки", DASH (динамічна алель-специфічна гібридизація), подовження праймерів, літування олігонуклеотидів та ендонуклеазне розщеплення. За одним з варіантів здійснення вищевизначених способів відбору рослин, стадія відбору здійснюється за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), за варіантом, якому віддається перевага, із щонайменше однією з наведених нижче пар праймерів: - Послідовність № 12 і Послідовність № 13, - Послідовність № 14 і Послідовність № 15, - Послідовність № 16 і Послідовність № 17, - Послідовність № 34 і Послідовність № 36, - Послідовність № 35 і Послідовність № 36, - Послідовність № 37 і Послідовність № 13, - Послідовність № 38 і Послідовність № 14, - Послідовність № 39 і Послідовність № 36. 5 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід також стосується рослини, яку одержують за вищевизначеними способами відбору рослин. Цей винахід також стосується набору для відбору рослин, які мають високий вміст олеїнової кислоти, який включає в себе: - щонайменше одну рослину або частину рослини, яка містить щонайменше одну мутовану нуклеїновокислотну послідовність, як визначено вище, або нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище, який містить мутований нуклеотид, - щонайменше один нуклеїновокислотний фрагмент, як визначено вище. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, вищевизначений набор включає в себе: щонайменше одну рослину або частину рослини, вибрану з групи, яку складають - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41403; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41402; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41400; - рослина, депонована у NCIMB (Абердин, Шотландія) 17 травня 2006 року під номером депонування 41401. щонайменше одна з наведених нижче пар праймерів: - Послідовність № 12 і Послідовність № 13, - Послідовність № 14 і Послідовність № 15, - Послідовність № 16 і Послідовність № 17, - Послідовність № 34 і Послідовність № 36, - Послідовність № 35 і Послідовність № 36, - Послідовність № 37 і Послідовність № 13, - Послідовність № 38 і Послідовність № 14, - Послідовність № 39 і Послідовність № 36. Цей винахід також стосується мутованої FAD2 з рослини, закодованої мутованою нуклеїновокислотною послідовністю, як визначено вище. Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, яку складають Послідовність № 13, Послідовність № 15, Послідовність № 16, Послідовність № 36, Послідовність № 37, Послідовність № 38, Послідовність №39. Цей винахід також стосується специфічного антитіла проти мутованого ферменту дельта12-фосфатидилхолінденатурази (FAD2) з рослини, як визначено вище. У значенні, вживаному у цьому винаході, термін "антитіло" означає також фрагменти антитіла, наприклад, Fab-, F(ab)'2 або scFv-фрагменти. Таке антитіло легко може одержати фахівець у цій галузі з мутованих ферментів дельта-12-фосфатидилхоліндесатурази за цим винаходом за допомогою наведених нижче стандартних способів. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, згадане антитіло є моноклональним антитілом. Антитіла за цим винаходом є особливо придатними для виявлення мутованих ферментів дельта-12-фосфатидилхоліндесатурази за цим винаходом, зокрема, у клітинних екстрактах рослин. Короткий опис фігур На Фіг. 1 зображені часткові геномні нуклеотидні послідовності гена fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), клоновані з ліній "LLR1" (як з лінії "LLR1#S007", так і з лінії "LLR1#PR-2601") та ліній "HOR1" (як з лінії "HOR1#S005", так і з ліній "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12"). У верхній частині зображена послідовність "LLR1" (Послідовність № 1) і у нижній частині зображена послідовність "HOR1" (Послідовність № 3). Стрілкоподібний значок вказує одну нуклеотидну мутацію С на Т, результатом якої є амінокислотна модифікація. Прямий та зворотний праймери для мутантного алель-специфічного маркера на основі ПЛР виділені жирним шрифтом і підкреслені. На Фіг. 2 зображені часткові геномні нуклеотидні послідовності гена fad2C (ген fad2 з геному В. oleracea), клоновані з ліній "LLR1" (як з лінії "LLR1#S007", так і з лінії "LLR1#PR-2601") та ліній "HOR1" (як з лінії "HOR1#S005", так і з ліній "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12"). У верхній частині зображена послідовність "LLR1" (Послідовність № 2) і у нижній частині зображена послідовність "HOR1" (Послідовність № 4). Стрілкоподібний значок вказує одну нуклеотидну мутацію С на Т, результатом якої є амінокислотна модифікація. Прямий та зворотний праймери для мутантного алель-специфічного маркера на основі ПЛР виділені жирним шрифтом і підкреслені. На Фіг. 3 зображені часткові геномні нуклеотидні послідовності гену fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), клоновані з ліній "LLR1" (як з лінії "LLR1#S007", так і з лінії "LLR1#PR-2601") та ліній 6 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "HOR2". У верхній частині зображена послідовність "LLR1" (Послідовність № 1) і у нижній частині зображена послідовність "HOR2" (Послідовність № 5). Стрілкоподібний значок вказує одну нуклеотидну мутацію С на Т, результатом якої є амінокислотна модифікація. Прямий та зворотний праймери для мутантного алель-специфічного маркера на основі ПЛР виділені жирним шрифтом і підкреслені. На Фіг. 4 зображені часткові геномні нуклеотидні послідовності гену fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), клоновані з ліній "LLR1" (як з лінії "LLR1#S007", так і з лінії "LLR1#PR-2601") та ліній "HOR3". У верхній частині зображена послідовність "LLR1" (Послідовність № 1) і у нижній частині зображена послідовність "HOR3" (Послідовність № 6). Стрілкоподібний значок вказує одну нуклеотидну мутацію С на Т, результатом якої є стоп-кодон (TAG), забарвлений у сірий колір. Прямий та зворотний праймери для мутантного алель-специфічного маркера на основі ПЛР виділені жирним шрифтом і підкреслені. На Фіг. 5 зображені часткові геномні нуклеотидні послідовності гена fad2A (ген fad2 з геному В. rapa), клоновані з ліній "LLR1" (як з лінії "LLR1#S007", так і з лінії "LLR1#PR-2601") та ліній "HOR4". У верхній частині зображена послідовність "LLR1" (Послідовність № 1) і у нижній частині зображена послідовність "HOR4" (Послідовність № 7). Стрілкоподібний значок вказує одну нуклеотидну мутацію G на А, результатом якої є стоп-кодон (TAG), забарвлений у сірий колір. Прямий та зворотний праймери для мутантного алель-специфічного маркера на основі ПЛР виділені жирним шрифтом і підкреслені. На Фіг. 6 зображені амінокислотні послідовності генів fad2A, вироджених із геномної нуклеотидної послідовності, клонованої з ліній "LLR1", "HOR1", опублікованого гена fad2 В. rapa і опублікованого гена fad2 В. napus. Стрілкоподібний значок вказує положення амінокислотної заміни (Р на S), яка є результатом однієї нуклеотидної мутації (С на Т) у лінії "HOR1". На Фіг. 7 зображені амінокислотні послідовності генів fad2C, вироджених із геномної нуклеотидної послідовності, клонованої з ліній "LLR1", ліній "НОR1", опублікованого гена fad2 В. oleracea і опублікованого гена fad2 В. napus. Стрілкоподібний значок вказує положення амінокислотної заміни (Р на S), яка є результатом однієї нуклеотидної мутації (С на Т) у лінії "НОR1". На Фіг. 8 зображені амінокислотні послідовності генів fad2A, вироджених із геномної нуклеотидної послідовності, клонованої з ліній "LLR1", ліній "HOR2", опублікованого гена fad2 В. rapa і опублікованого гена fad2 В. napus. Стрілкоподібний значок вказує положення амінокислотної заміни (Т на М), яка є результатом однієї нуклеотидної мутації (С на Т) у лінії "HOR2". На Фіг. 9 зображені амінокислотні послідовності генів fad2A, вироджених із геномної нуклеотидної послідовності, клонованої з ліній "LLR1", ліній "HOR3", опублікованого гена fad2 В. rapa і опублікованого гена fad2 В. napus. Стрілкоподібний значок вказує положення стоп-кодону, який є результатом однієї нуклеотидної мутації (С на Т) у лінії "HOR3". На Фіг. 10 зображені амінокислотні послідовності генів fad2A, вироджених із геномної нуклеотидної послідовності, клонованої з ліній "LLR1", ліній "HOR4", опублікованого гена fad2 В. rapa і опублікованого гена fad2 В. napus. Стрілкоподібний значок вказує положення стоп-кодону, який є результатом однієї нуклеотидної мутації (G на А) у лінії "HOR4". На Фіг. 11 зображені результати електрофорезу продуктів ПЛР, ампліфікованих із мутантних алель-специфічних маркерів гену fad2A (194 п.н.) та з гена fad3 (внутрішній ПЛР контроль, 57 п.н.) однієї з 6 DH популяцій. М, набір ДНК, 25 п.н.; смуга 1, "LLR1#S007"; смуга 2, "HOR1#S005"; смуга 3-23, DH лінії з гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#S005"; смуга 24, водний контроль. Продукти ПЛР відділяли електрофорезом у 2,5% гелі агарози і забарвлювали бромідом етидію. На Фіг. 12 зображені результати електрофорезу продуктів ПЛР, ампліфікованих і мутантних алель-специфічних маркерів гена fad2C (123 п.н.) та з гена fad3 (внутрішній ПЛР контроль, 57 п.н.) однієї з 6 DH популяцій. М, набір ДНК, 25 п.н.; смуга 1, "LLR1#S007"; смуга 2, "HOR1#S005"; смуга 3-23, DH лінії з гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#S005"; смуга 24, водний контроль. Продукти ПЛР відділяли електрофорезом у 2,5% гелі агарози і забарвлювали бромідом етидію. На Фіг. 13 зображена гістограма, яка показує кореляцію мутантних алель-специфічних маркерів і вмісту олеїнової кислоти у польових та тепличних дослідах. На Фіг. 14 зображено впорядковане розміщення послідовностей FAD2 різних видів Brassica та Arabidopsis thaliana. Далі наведено види, номери депонування та загальноприйняті назви. 7 UA 97642 C2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Рід і вид Brassica тара Brassica rapa Brassica napus Brassica rapa Brassica napus Brassica napus Brassica oleracea Brassica carinata Arabidopsis thaliana Номер депонування послідовності CAG26981 CAD30827 AAS92240 AAC99622 AAT02411 AAF78778 AAF14564 AAD19742 NP_187819 Загальноприйнята назва Суріпка Суріпка Рапс Суріпка Рапс Рапс Капуста Гірчиця абіссинська Гусимець Приклад Матеріал і методи 1. Рослинний матеріал При проведенні цього дослідження для клонування алелей fad2 (стеароїл-СоА-десатураза) застосовували лінії озимого рапсу "LLR1#S007" (дикого типу), "LLR1#PR-2601" (дикого типу), "HOR1#S005" (мутантного типу), "HOR1#B005" (мутантного типу), "HOR1#NPZ-12" (мутантного типу), "HOR2" (мутантного типу), "HOR3" (мутантного типу) та "HOR4" (мутантного типу). Лінії "HOR1#S005", "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12" одержали шляхом схрещення етилметансульфонатної (EMS) мутантної лінії "HOR1" з трьома класичними лініями рапсу (S005, В005 та NPZ-12); вміст олеїнової кислоти у цих трьох мутантних ліній становив приблизно від 80% до 90%. "LLR1#S007" та "LLR1#PR-2601" є лініями рапсу, вміст олеїнової кислоти у яких становить приблизно 60%. "НОR2", "HOR3" та "HOR4" являють собою ще три незалежні EMS мутантні лінії, вміст олеїнової кислоти у яких становить від приблизно 75% до 85%. Шість подвійних гаплоїдних (DH) популяцій одержали шляхом культивування мікроспор рослин-гібридів F1 між (Ковентрі (Coventry) та інші, 1988): (1) лініями рапсу "LLR1#S007" та "HOR1#S005", (2) лініями рапсу "LLR1#PR-2601" та "HOR1#NPZ-12", (3) лініями рапсу "LLR1#S007" та "HOR1#B005", (4) лініями рапсу "LLR1#S007" та "HOR1#NPZ-12", (5) лініями рапсу "LLR1#PR-2601" та "HOR1#B005" та (6) лініями рапсу "LLR1#PR-2601" та "HOR1#S005". Кожна DH популяція містила 64, 32, 115, 72, 63 та 53 лінії відповідно. Повний аналіз жирних кислот насіння ліній DH та їх відповідних батьків здійснювали за допомогою газової хроматографії. Усі 399 DH ліній застосовували для маркерного та статистичного аналізу. Жодної DH популяції не було одержано з мутантними лініями "HOR2", "HOR3" та "HOR4". 2. Екстрагування та кількісне визначення геномної ДНК ДНК як батьківських ліній, так і 399 DH ліній екстрагували з листя вирощених за польових умов рослин віком 2 тижні за допомогою способу на основі СТАВ (бромід цетилтриметиламонію), який являє собою модифікований спосіб Деллапорта (Dellaporta) та інших (1983). Оптичну густину при 260 нм застосовували для кількісного визначення ДНК. До кожної лунки УФ-титраційного мікропланшета додавали 195 мкл надчистої стерильної води, після чого додавали 5 мкл кожного зразка ДНК. Після цього планшет впродовж нетривалого періоду часу збовтували і зчитували за допомогою мікропланшетного спектрофотометра Spectra Max M2 від компанії Molecular Devices. 3. ПЛР ампліфікація У реакціях ПЛР ампліфікації, до яких вдавались для клонування алелей fad2, застосовували 3-4 нг/мкл геномної ДНК, 1,25 мкМ кожного праймера, 2,5 мМ розчин MgCl2, 0,3 мМ розчин кожного dNTP (дезоксинуклеозид-5'-трифосфат), 1ПЛР буфера та 0,12 Од/мкл Taq ДНКполімерази. Ампліфікацію здійснювали у ПЛР системі РТС-225 MJResearch, запрограмованій на 30 циклів по 30 с при температурі 94°С, 30 с при температурі 60°С, 30 с при температурі 72°С із завершенням циклом тривалістю 5 хв при температурі 72°С. Для генотипування 399 DH ліній розробили внутрішній ПЛР маркер для контролювання ефективності ПЛР. Пара праймерів (Послідовність № 10 і Послідовність № 11) була сконструйована на основі гена fad3 для ампліфікації фрагмента у 57 п.н. У реакціях ПЛР ампліфікації, до яких вдавались для генотипування 399 DH ліній, застосовували 3-4 нг/мкл геномної ДНК, 0,625 мкМ кожного праймера (Послідовність № 8, Послідовність № 9, 8 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовність № 10 і Послідовність № 11), 1,5 мМ розчин MgCl2, 0,3 мМ розчин кожного dNTP (дезоксинуклеозид-5'-трифосфат), 1ПЛР буфера та 0,06 Од/мкл Taq ДНК-полімерази. Ампліфікацію здійснювали у ПЛР системі РТС-225 MJResearch, запрограмованій на 30 циклів по 30 с при температурі 94°С, 30 с при температурі 60°С, 10 с при температурі 72°С із завершенням циклом тривалістю 5 хв при температурі 72°С. 4. Клонування алелей fad2 Фрагменти fad2 батьківських ліній "LLR1#S007", "LLR1#PR-2601", "HOR1#S005", "HOR1#B005", "HOR1#NPZ-12", "HOR2", "HOR3" та "HOR4" ампліфікували із застосуванням праймерів, які були сконструйовані за допомогою програми Primer 3 на основі послідовності гена fad2 з GenBank (номер депонування AY577313). Фрагменти fad2, ампліфіковані з кожного з батьків за допомогою праймерів FAD2BnF1 та FAD2BnR1, літували з вектором pGEM -T Easy cloning vector за допомогою набору pGEM-T Easy Vector System kit (компанія Promega Соф., Madison, США) за інструкціями виробника. Ліговані продукти перетворювали на компетентні клітини, які висівали на чашки з агаром і середовищем Луріа (LB), які містили ампіцилін, X-GAL (5-бром-4-хлор-3-індоліл--D-галактозид) та IPTG (ізопропілтіогалактозид), для селекції білих/синіх колоній. Білі колонії у трансформаційних чашках збирали, і ідентифікацію клонованих ПЛР продуктів перевіряли за допомогою ПЛР із застосуванням універсальних прямих і зворотних праймерів М13, які фланкують інсерційний фрагмент. ПЛР виявила інсерційний фрагмент очікуваної величини. Позитивні клони, що містили інсерційний сегмент, секвенували за допомогою Genome Express (компанія Meylan, Франція). 5. Ідентифікація мутацій генів fad2 Як видно на Фіг. 1-5, праймери, сконструйовані за допомогою програми Primer 3 на основі послідовності гена fad2 з GenBank (номер депонування AY577313), застосовували для ампліфікації фрагментів геномної ДНК гена fad2 ліній В. napus "LLR1#S007", "LLR1#PR-2601", "HOR1#S005", "HOR1#B005", "HOR1#NPZ-12", "HOR2", "HOR3" та "HOR4". Пара праймерів FAD2BnF1: AGTGTCTCCTCCCTCCAAAAA (Послідовність № 8) та FAD2BNR1: TCTTCTCACCTTGCCTGTCC (Послідовність № 9) ампліфікувала фрагмент fad2 однакової довжини (1100 п.н.) від кожного із шістьох батьків. Ампліфіковані фрагменти у подальшому клонували та секвенували для дослідження різниць послідовності гена fad2 між п'ятьма батьками. 6. Аналіз послідовностей і аналіз даних Послідовності аналізували і впорядковано розміщували з використанням програми Clustal W (Біоінформатичний центр університету Кіото) та програми Genedoc (Ніколас (Nicholas) та інші, 1997). Зв'язок між маркерами та ознакою високого вмісту олеїнової кислоти визначали шляхом перевірки за критерієм Стьюдента. Результати При проведенні цього дослідження були секвеновані 7 клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601"), 12 клонів "HOR1" (як "HOR1#S005", так і "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12"), 12 клонів "HOR2", 20 клонів "HOR3" та 20 клонів "HOR4". При порівняльному аналізі послідовностей цих клонів із послідовностями fad2 В. rapa та В. oleracea, знайденими у загальнодоступних базах даних, ідентифікували: (1) два гени fad2, що походили з В. rapa (fad2A) та В. oleracea (fad2C), для ліній "HOR1", (2) один ген fad2, що походив з В. rapa (fad2A), для лінії "HOR2", (3) один ген fad2, що походив з В. rapa (fad2A), для лінії "HOR3", та (4) один ген fad2, що походив з В. rapa (fad2A), для лінії "HOR4". Для ліній "HOR1" аналіз послідовностей ідентифікував одну нуклеотидну мутацію у кожному гені fad2. Одна нуклеотидна мутація у гені fad2A, С на Τ, у положенні 752 ампліфікованого фрагмента (тобто положення 775 у непроцесованого гена fad2) відбулась у послідовності гена fad2A усіх клонів "HOR1" (як "HOR1#S005", так і "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12") (Послідовність № 3), але не у клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601") (Послідовність № 1) (дивись Фіг. 1). Одна нуклеотидна мутація у гені fad2C, С на Τ, у положенні 623 ампліфікованого фрагмента (тобто положення 646 у непроцесованого гена fad2) відбулась у послідовності гена fad2C усіх клонів "HOR1" (як "HOR1#S005", так і "HOR1#B005" та "HOR1#NPZ-12") (Послідовність № 4), але не у клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601") (Послідовність № 2) (дивись Фіг. 2). Додатковий аналіз показав, що ці поодинокі нуклеотидні мутації відбулись у кодувальній послідовності як гена fad2A, так і гена fad2C (дивись Фіг. 6-7). Як додатково показано на Фіг. 1-2 та Фіг. 6-7, мутації С на Τ у генів fad2A та fad2C відбулись у першому нуклеотиді кодону, що 9 UA 97642 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спричинює заміну проліну (Р) на серин (S) у амінокислоти 259 та амінокислоти 216, відповідно. Після анотації білків за допомогою ТМНММ Server v.2.0 (прогнозування трансмембранних доменів, екстрацелюлярних та інтрацелюлярних доменів), заміна проліну (Р) на серин (S) у білка FAD2A була локалізована у екстрацелюлярному домені, у той час як заміна проліну (Р) на серин (S) у білка FAD2C була встановлена у трансмембранному домені. Пролін являє собою неполярну амінокислоту, яка має схильність до знаходження у центральній частині білка, у той час як серин являє собою полярну і відносно гідрофобну амінокислоту, яка має схильність до присутності на поверхні білка. Ці різні властивості можуть призвести до структурної модифікації білків FAD2A та FAD2C, що спричинює одержання позбавленої активності дельта-12фосфатидилхоліндесатурази. Для лінії "HOR2" аналіз послідовностей ідентифікував одну нуклеотидну мутацію у гені fad2A. Одна нуклеотидна мутація у гені fad2A, С на Τ, у положенні 804 ампліфікованого фрагмента (тобто положення 827 у непроцесованого гена fad2A) відбулась у послідовності гена fad2A усіх клонів "HOR2" (Послідовність № 5), але не у клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601") (Послідовність № 1) (дивись Фіг. 3). Додатковий аналіз показав, що ця поодинока нуклеотидна мутація відбулась у кодувальній послідовності гена fad2A (дивись Фіг. 8). Як додатково показано на Фіг. 3 та Фіг. 8, мутація С на Τ у гена fad2А відбулась у першому нуклеотиді кодону, що спричинює заміну треоніну (Т) на метіонін (М) у амінокислоти 276. Після анотації білків за допомогою ТМНММ Server v. 2.0 (прогнозування трансмембранних доменів, екстрацелюлярних та інтрацелюлярних доменів), заміна треоніну (Т) на метіонін (М) у білка FAD2A була локалізована у екстрацелюлярному домені. Метіонін (М) являє собою неполярну амінокислоту, яка має схильність до знаходження у центральній частині білка, у той час як треонін (Т) являє собою полярну і відносно гідрофобну амінокислоту, яка має схильність до присутності на поверхні білка. Ці різні властивості можуть призвести до структурної модифікації білка FAD2A що спричинює одержання позбавленої активності дельта-12фосфатидилхоліндесатурази. Для лінії "HOR3" аналіз послідовностей ідентифікував одну нуклеотидну мутацію у гені fad2A. Одна нуклеотидна мутація у гені fad2A, С на Τ, у положенні 323 ампліфікованого фрагмента (тобто положення 346 у непроцесованого гена fad2A) відбулась у послідовності гена fad2A усіх клонів "HOR3" (Послідовність № 6), але не у клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601") (Послідовність № 1) (дивись Фіг. 4). Додатковий аналіз показав, що ця поодинока нуклеотидна мутація відбулась у кодувальній послідовності гена fad2A (дивись Фіг. 9). Як додатково показано на Фіг. 4 та Фіг. 9, мутація С на Τ у гена fad2A відбулась у першому нуклеотиді кодону з одержанням стоп-кодону (TAG), який спричинює ранню термінацію поліпептидного ланцюга під час трансляції. Результатом появи стоп-кодону є включення лише 115 амінокислот до поліпептиду, замість усіх 384 амінокислот непроцесованого поліпептиду. Для лінії "HOR4", аналіз послідовностей ідентифікував одну нуклеотидну мутацію у гені fad2A. Одна нуклеотидна мутація у гені fad2A, G на А, у положенні 246 ампліфікованого фрагмента (тобто положення 269 у непроцесованого гена fad2A) відбулась у послідовності гена fad2A усіх клонів "HOR4" (Послідовність № 7), але не у клонів "LLR1" (як "LLR1#S007", так і "LLR1#PR-2601") (Послідовність № 1) (дивись Фіг. 5). Додатковий аналіз показав,що ця поодинока нуклеотидна мутація відбулась у кодувальній послідовності гена fad2А (дивись Фіг. 10). Як додатково показано на Фіг. 5 та Фіг. 10, мутація G на А у гена fad2A відбулась у першому нуклеотиді кодону з одержанням стоп-кодону (TAG), який спричинює ранню термінацію поліпептидного ланцюга під час трансляції. Результатом появи стоп-кодону є включення лише 89 амінокислот до поліпептиду, замість усіх 384 амінокислот непроцесованого поліпептиду. Для генотипування 6 подвійних гаплоїдних популяцій були розроблені молекулярні тести. Для тестів на домінантність розробили внутрішній ПЛР маркер для контролювання ефективності ПЛР. Пара праймерів (Послідовність № 10 і Послідовність № 11) була сконструйована на основі гена fad3 для ампліфікації фрагмента у 57 п.н. Прямі та зворотні ПЛР праймери (Послідовність № 14 та Послідовність № 15 відповідно) для виявлення мутації С752Т застосовували для генотипування DH ліній гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#S005" (дивись Фіг. 11), гібриду "LLR1#PR-2601" та "HOR1#NPZ-12" (дані не показані), гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#B005" (дані не показані), гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#NPZ-12" (дані не показані), гібриду "LLR1#PR-2601" та "HOR1#B005" (дані не показані) та гібриду "LLR1#PR-2601" та "HOR1#S005" (дані не показані). Прямі та зворотні ПЛР праймери (Послідовність № 12 та Послідовність № 13, відповідно) для виявлення мутації С623Т застосовували для генотипування DH ліній гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#S005" (дивись Фіг. 12), гібриду "LLR1#PR-2601" та "HOR1#NPZ-12" (дані не показані), гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#B005" (дані не показані), гібриду "LLR1#S007" та "HOR1#NPZ-12" (дані не показані), гібриду "LLR1#PR 10 UA 97642 C2 5 2601" та "HOR1#B005" (дані не показані) та гібриду "LLR1#PR-2601" та "HOR1#S005" (дані не показані). Прямі та зворотні ПЛР праймери (Послідовність № 16 та Послідовність № 17, відповідно) для виявлення мутації С804Т застосовували для випробування ліній "HOR2" і дикого типу (дані не показані). На додаток до цього, прямі та зворотні ПЛР праймери застосовували для випробування ліній "HOR3" (Послідовність № 34 та Послідовність № 36), "HOR4" (Послідовність № 35 та Послідовність № 36) і дикого типу. Після генотипування усіх 399 DH ліній було виявлено високий ступінь кореляції між розподілом алелей і високим вмістом С18:1 (дивись Фіг. 13, Таблицю). 10 Таблиця Кореляція мутантних алель-специфічних маркерів і вмісту олеїнової кислоти у польових та тепличних випробуваннях DH ліній різних видів Дикий тип Лише з маркером FAD2 1С "HOR1" Лише з маркером FAD2 2А "HOR1" З маркером FAD2 1С "HOR1"+FAD2 2A "HOR1" 15 20 25 30 35 40 45 Кількість випробуваних ліній Теплиця/Поле 119/133 83/102 66/79 57/67 Середній олеїнової вміст кислоти (%) Теплиця Поле 63,1±5,8 62,6±3,0 66,2±5,5 66,3±3,0 71,5±4,2 71±3,3 77,1±3,1 77,7±2,4 Окрім того, були розроблені ПЛР праймери для надання кодомінантних маркерів для визначення того, чи знаходяться мутації лише на одному (гетерозигота), чи на двох алелях (гомозигота) гена fad2. Для мутації С646 (виявленої у "HOR1") застосовують наведені нижче ПЛР праймери: - прямий праймер 5' АТТ ТСС АСС CCA ACC GCT 3' (Послідовність № 37) - зворотний праймер 5' AGG ССА СТС ССТ GCG 3' (Послідовність № 13) Використовуючи перевагу введення сайту рестрикції BsrBl за допомогою прямого праймера до ампліфікованого фрагмента, що відповідає гену fad2C дикого типу, продукт ПЛР ампліфікації розрізають ферментом BsrBl з одержанням наведеного нижче диференційованого профілю рестрикції: - гомозигота дикого типу: 16 п.н.+108 п.н. - мутована гомозигота: 124 п.н. - гетерозигота: 16 п.н.+108 п.н.+124 п.н. Для мутації С775Т (виявленої у "HOR1") застосовують наведені нижче ПЛР праймери: - прямий праймер 5' ТСТ АСС GCT ACG CTG CTG ТС 3' (Послідовність № 38) - зворотний праймер 5' GTG CGT GTC CGT GAT ATT GT З' (Послідовність № 15) Використовуючи перевагу пригнічення сайту рестрикції MN/1 у мутованому генi fad2А, який містить мутацію С775Т, продукт ПЛР ампліфікації розрізають ферментом MN/l з одержанням наведеного нижче диференційованого профілю рестрикції: - гомозигота дикого типу: 14 п.н.+26 п.н.+41 п.н.+66 п.н.+83 п.н. - мутована гомозигота: 14 п.н.+41 п.н.+83 п.н.+92 п.н. - гетерозигота: 14 п.н.+26 п.н.+41 п.н.+66 п.н.+83 п.н.+92 п.н. Для мутацій С346Т та G269A (виявлених у "HOR3" та "HOR4", відповідно) застосовують наведені нижче ПЛР праймери: - прямий праймер 5'AGT GTC ТСС ТСС СТС САА ААА 3' (Послідовність № 39) - зворотний праймер 5' АТС GAG GCA ACT CCT TGG A 3' (Послідовність № 36) Продукт ПЛР ампліфікації розрізають ферментом ВfаІ з одержанням наведеного нижче диференційованого профілю рестрикції: С346Т - гомозигота дикого типу: 732 п.н. - мутована гомозигота: 410 п.н.+322 п.н. - гетерозигота: 732 п.н.+410 п.н.+322 п.н. G269A - гомозигота дикого типу: 732 п.н. - мутована гомозигота: 244 п.н.+488 п.н. - гетерозигота: 732 п.н.+244 П.Н.+488 п.н. 11 UA 97642 C2 Послідовність № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20' 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 5 10 15 Опис Часткова нуклеотидна послідовність "LLR1" fad2A Часткова нуклеотидна послідовність "LLR1" fad2C Часткова нуклеотидна послідовність "HOR1" fad2A Часткова нуклеотидна послідовність "HOR1" fad2C Часткова нуклеотидна послідовність "HOR2" fad2A Часткова нуклеотидна послідовність "HOR3" fad2A Часткова нуклеотидна послідовність "HOR4" fad2A ПЛР праймер для ампліфікації фрагмента fad2 довжиною 1100 п.н. ПЛР праймер для ампліфікації фрагмента fad2 довжиною 1100 п.н. ПЛР праймер для ампліфікації фрагмента fad3 довжиною 57 п.н. ПЛР праймер для ампліфікації фрагмента fad3 довжиною 57 п.н. Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С646Т ("HOR1") Зворотний ПЛР праймер для виявлення мутації С646Т ("HOR1") Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С775Т ("HOR1") Зворотний ПЛР праймер для виявлення мутації С775Т ("HOR1") Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С827Т ("HOR2") Зворотний ПЛР праймер для виявлення мутації С827Т ("HOR2") Зразкова нуклеотидна послідовність fad2A В. napus дикого типу Зразкова білкова послідовність FAD2A В. napus дикого типу Зразкова нуклеотидна послідовність fad2C В. napus дикого типу Зразкова білкова послідовність FAD2C В. napus дикого типу Консенсусна послідовність мутованого fad2 Консенсусна послідовність мутованого FAD2 Нуклеотидна послідовність G269A мутованого fad2 Білкова послідовність W90СТОП мутованого FAD2 Нуклеотидна послідовність С346Т мутованого fad2 Білкова послідовність Q116CTOП мутованого FAD2 Нуклеотидна послідовність С646Т мутованого fad2 Білкова послідовність P216S мутованого FAD2 Нуклеотидна послідовність С775Т мутованого fad2 Білкова послідовність P259S мутованого FAD2 Нуклеотидна послідовність С827Т мутованого fad2 Білкова послідовність Т276М мутованого FAD2 Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С346Т ("HOR3") Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації G269A ("HOR4") Зворотний ПЛР праймер для виявлення мутації С346Т або G269A ("HOR3/4") Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С646Т (кодомінантний) Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С775Т (кодомінантний) Прямий ПЛР праймер для виявлення мутації С346Т або G269A (кодомінантний) Посилання 1. Bonanome Α., Grundy S.M. Effect of dietary stearic acid on plasma cholesterol and lipoprotein levels. N. Engl. J. Med. 1988 May 12; 318(19): 1244-1248. 2. Liu Q., Singh S., Green A. (2002). High-Oleic and High-Stearic Cottonseed Oils: Nutritionally Improved Cooking Oils Developed Using Gene Silencing. J. Am. Coll. Nutr. 21:205S-211. 3. Debruyne I. Soybean Oil Processing: Quality Criteria and Flavor Reversion. Oil Mill Gazetteer. Volume 110, July 2004. 4. McCallum C/M., Comai L., Greene E.A., and Henikoff S. (2000). Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol 123, 439-442. 5. Herman E.B. (2005). Media and Techniques for Growth, Regeneration and Storage 2002-2005. Volume 9 of Recent Advances in Plant Tissue Culture. Agricell Report. 6. Gallais A. (1997). Theorie de la selection en amelioration des plantes. Editions Masson. 7. Coventry J.; L. Kott and W. Beversdorf: 1988. Manual for microspore culture of Brassica napus. University of Guelph Technical Bulletin, OAC Publication 0489. 12 UA 97642 C2 5 10 8. Dellaporta S.L., Wood J. and Hicks J.B. (1983) A plant DNA minipreparation: version II. Plant Моl. Biol. Rep. 1: 19-21. 9. Nicholas K.B., Nicholas Jr. H.B. & Deerfield II D.W. (1997) GeneDoc:Analysis and Visualization of Genetic Variation, http://www.psc.edu/biomed/genedoc [accessed on 6 April 2005]. 10. Sambrook J. and Russell D.W. (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 11. J.C. Pires, J. Zhao, M.E. Schranz, E.J. Leon, P.A. Quijada L.N. Lukens and T.C. Osborn (2004). Flowering time divergence and genomic rearrangements in resynthesized Brassica polyploids (Brassicaceae). Volume 82 Page 675 Issue 4. Biological Journal of the Linnean Society. 12. Stan Skrypetz, 2005. Le Bulletin bimensuel. Agriculture et Agroalimentaire Canada. Volume 18 Numero 17. 13. Konieczny Α., Ausubel F.M. (1993) A procedure for mapping Arabidopsis· mutations using codominant ecotype-specific PCR-based marker. Plant J. 4:403-410. 13 UA 97642 C2 14 UA 97642 C2 15 UA 97642 C2 16 UA 97642 C2 17 UA 97642 C2 18 UA 97642 C2 19 UA 97642 C2 20 UA 97642 C2 21 UA 97642 C2 22 UA 97642 C2 23 UA 97642 C2 24 UA 97642 C2 25 UA 97642 C2 26 UA 97642 C2 27 UA 97642 C2 28