Пробіотики для застосування ссавцями жіночої статі у стані вагітності для підвищення імунітету дитини

Реферат: Винахід стосується застосування пробіотиків пробіотиків Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 або Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 або їх комбінації при виробництві композиції для введення ссавцям жіночої статі у стані вагітності для підвищення імунітету дитини після народження. UA 101972 C2 (12) UA 101972 C2 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пробіотики для застосування ссавцями жіночої статі у стані вагітності для підвищення імунітету дитини Галузь винаходу Даний винахід стосується застосування пробіотичних бактерій при виробництві поживної композиції для ссавців жіночої статі у стані вагітності для покращення імунного стану їх новонароджених дітей. Рівень техніки Імунний стан новонародженого є важливим питанням. Такий стан забезпечує захист, наявний при народженні дитини, а також набуття імунологічного захисту протягом перших годин, днів або тижнів життя дитини. Здатність набувати та підтримувати такий захист є принциповим фактором для здоров'я дитини, що зустрічається з новим навколишнім середовищем. У людей такі питання є найважливішим для здоров'я населення. Підтримання доброго стану здоров'я майбутніх матерів під час вагітності є ключовим фактором для сприяння здоров'ю плода під час вагітності і після народження. До відомих загальних факторів здоров'я відносяться режим харчування, прийом мікроелементів, історія їх інфекційних захворювань, а також імунний стан. Наприклад, недостатня кількість певних мінералів, вітамінів і речовин (наприклад, фолієвої кислоти) може негативно впливати на внутрішньоутробний розвиток плоду, а також мати вплив на постнатальний розвиток дитини. Харчування матері відіграє основну роль у майбутньому здоров'ї дітей, і докладається багато зусиль для відстежування і покращення харчового балансу майбутніх матерів. Харчові добавки або просто загальні правила харчування є дуже значущими у цьому відношенні. Крім звичайних правил харчування для вагітних матерів, наразі визнано, що певні специфічні харчові продукти можуть сприяти розростанню специфічної мікрофлори шлунковокишкового тракту вагітної матері. В свою чергу, збалансована мікрофлора має ефект на істотуносія. Застосування пребіотиків, тобто, поживних речовин для покращення мікрофлори кишечника, було описано, наприклад, у WO 02/07533, в частині їх корисних ефектів для здоров'я жінок. Більш того, у WO2007/105945A було заявлено, що згодовування майбутнім матерям пребіотиків, особливо, певного типу неперетравлюваних сахаридів, може покращити мікрофлору та/або імунну систему дитини. При доповненні режиму харчування мікроорганізмами, переважно, живими мікроорганізмами, очевидним є покращення балансу мікрофлори у кишковому тракті людини. Продемонстровано, що регулювання мікрофлори певними живими мікроорганізмами відзначається особливими позитивним фізіологічними ефектами. Наприклад, широко вивчені і дослідженні імунні реакції, стимульовані певними типами пробіотичних бактерій ("Cross talk between probiotics bacteria and the host immune system", The journal of nutrition, Blaise Corthesy et al., supplement, 2007, pages 781S-790S). Як описано в науковій літературі, певні штами мікроорганізмів продемонстрували особливо корисний ефект. Мікроорганізми типу Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus і Lactobacillus caseii є загальновідомими прикладами родин із пробіотичними ефектами. Припускають, що пробіотики, як умовно-патогенні мікроорганізми, впливатимуть на імунні функції істоти-носія або завдяки зміні складу мікрофлори і/або метаболічної активності, або через безпосередню взаємодію із імунною системою, через слизову кишечнику. Внаслідок цієї взаємодії імунні функції будуть активовані, що відображається у вивільненні імунних медіаторів (цитокинів), виробництві антитіл і активації лімфоцитів, а також інших імунних клітин. Завдяки циркуляції крові такі активовані клітини, цитокіни та/або бактеріальні сполуки будуть посилювати імунно-модуляторні функції у різних органах тіла. Відповідно, вважають, що корисний ефект введення пробіотиків на імунний статус матері може вливати на внутрішньоутробний розвиток плоду. Більш того, також відомо, що імунні клітини та інші біоактивні фактори, які походять з кишечнику матері, можуть переходити у грудне молоко по ентеро-молочнозалозним каналам і передаватися новонародженому під час лактації. Таким чином, доцільно розвинути цю тезу і припустити, що введення пробіотиків вагітним матерям може сприяти збагаченню грудного молока імунними факторами, які відіграватимуть значну роль у підтриманні неонатального імунного розвитку. Забезпечення майбутнього здоров'я плоду є добре визнаною потребою. Більш конкретно, найважливішим завданням є забезпечення кращого розвитку та дозрівання імунної системи плоду. Звичайно, окрім медицинських засобів регулювання певних станів здоров'я, особливу увагу приділяють нормальному харчовому балансу майбутніх матерів. Однак, не так багато відомо щодо специфічного покращення імунітету плоду під час вагітності. 1 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Однак, необхідним є додаткова стадія забезпечення майбутнього здоров'я дитини із застосуванням найсучасніших досягнень у харчуванні. Відтак, існує потреба у позитивному впливу на здоров'я дитини за допомогою спеціального раціону харчування майбутніх матерів. Зокрема, існує потреба допомогти у гарантуванні найкращого імунітету дитини, для найкращої підготовки дитини до антигенного впливу протягом першого періоду життя, а також для покращення подальшого дозрівання імунної системи дитини і досконалішого розвитку імунного захисту протягом пізніших періодів дитинства. Існує потреба впливати на розвиток імунної системи плоду на найранніших можливих стадіях під час і протягом всього періоду вагітності, а також на ранніх стадіях життя новонародженого, коли імунна система дозріває в найвищому ступені. Існує потреба у покращенні здатності імунної системи дитини для реагування на антигени в цілому і на імунні захворювання зокрема. Також існує потреба у досягненні таких корисних ефектів за допомогою засобів, які є корисними та позбавлені негативного впливу на майбутніх матерів та/або їх дітей. Суть винаходу В першому аспекті даний винахід розкриває застосування пробіотиків ссавцями жіночої статі у стані вагітності при виробництві композиції для підвищення імунітету їх дітей після народження. В другому аспекті даний винахід стосується застосування ссавцями жіночої статі в стані вагітності специфічних пробіотичних організмів, наприклад, біфідобактерій (Bifidobacterium), лактобацил (Lactobacillus), стрептококів (Streptococcus), ентерококів (Enterococcus) і сахароміцитів (Saccharomyces), для підвищення імунітету їх дітей після народження. В третьому аспекті даний винахід передбачає застосування пробіотиків протягом періоду вагітності та /або протягом періоду лактації дітей. В іншому аспекті винаходу пробіотики вводять майбутній матері в або разом із харчовими продуктами або напоями, і разом з іншими активними інгредієнтами, наприклад, пребіотиками або іншими дієтичними добавками. Винахід також охоплює композицію, застосовувану вищеописаними способами для вищевказаної мети. Короткий опис креслень Фігури 1 та 3 схематично висвітлюють експериментальні процедури досліджень 1 і 2 відповідно. Фігури 2 і 4 зображують результати досліджень, що демонструють підвищення імунітету дитини. Детальний опис винаходу Визначення: У даному описі наступні терміни мають таке значення: "Ссавці жіночої статі у стані вагітності" – це ссавці жіночої статі, в матці яких розвивається принаймні одна запліднена яйцеклітина. Переважно, в даному винаході розглядаються жінки (тобто, матері або майбутні матері). "Пробіотик" означає мікробіальні клітинні препарати або компоненти мікробіальних клітин із корисним ефектом для здоров'я або самопочуття істоти-носія (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10). Пробіотик може бути одним штамом мікроорганізму або сумішшю різноманітних штамів та/або сумішшю різноманітних мікроорганізмів. Термін "пробіотик" в однині може застосовуватися і у випадку, коли необхідно позначити суміш або препарат пробіотиків. "Пребіотик", як правило, означає неперетравлюваний харчовий інгредієнт, що має корисний вплив на істоту-носія шляхом селективного стимулювання зросту та /або активності мікроорганізмів, наявних у кишечнику істоти-носія, і, таким чином, бере участь у покращенні здоров'я істоти-носія. "Дитина" позначає новонароджену дитину або дитину, що має народитися від зазначених ссавців жіночої статі. Зокрема, це визначення включає плід в періоді вагітності. Переважно, в даному винаході розглядають ювенільну фазу/стадію дитинства (тобто, до досягнення дитиною людини віку 12-14 років), ще переважніше, даний винахід стосується імунітету дитини на ранніх стадіях дитинства (тобто, до досягнення дитиною людини віку 2-4 роки). Автори встановили, що введення пробіотиків вагітним істотам жіночої статі може впливати на імунну системи дитини, а саме, може підвищувати імунітет дитини, що уможливлює кращу і більш інтенсивну відповідь імунної системи на вплив антигенів. Регулювання імунної системи дітей може відбуватися на дуже ранніх стадіях їх внутрішньоутробного життя або на ранній стадії після пологів, коли їх імунна система поступово 2 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стає зрілою. Автори засвідчили наявність позитивного ефекту при відсутності явного безпосереднього контакту між кишковою системою дітей і введеною вагітним жінками пробіотичною композицією, тобто, протягом внутрішньо-утробного життя дітей. Крім того, винахідники встановили, що така композиція, яка включає пробіотики, також може мати корисний ефект на імунітет дитини під час періоду лактації. Не бажаючи обмежуватися теорією, було встановлено, що часткова колонізація кишкового тракту істот жіночої статі у стані вагітності пробіотиками стимулює утворення молекулярного сигналу. Вважають, що дитина одержує цей сигнал і реагує на нього. Також вважають, що даний сигнал діє на імунітет дитини. Цей сигнал має позитивний ефект на дозрівання імунної системи дитини. Наслідком цього є краща здатність реагувати на антигени після народження. Також було встановлено, що сигнал може передаватися дитині протягом періоду лактації, зокрема, якщо створені попередні умови для сигналу протягом періоду виношування дитини. Майбутні матері Передбачено застосування композиції згідно даного винаходу і введення зазначеної композиції ссавцям жіночої статі в стані, тобто, особам, які очікують народження дитини. Розглянуте у даному винаході застосування може поширюватися на період від зачаття площу і на весь період вагітності до пологів. Також передбачене застосування у періоді лактації до відняття від грудей. Часткове відняття від грудей до повного припинення лактації також включене у даний винахід. Не виключено, однак, що застосування, розглянуте згідно даного винаходу, також поширюється на період безпосередньо перед зачаттям, що має вплив на стан здоров'я майбутньої матері, і, таким чином, на стан здоров'я дитини. Ссавцями можуть бути вагітні жінки. В такому випадку період вагітності становить приблизно 9 місяців, а період лактації може сильно вар'юватися в залежності від звичок, культури і стану здоров'я жінки. Ссавцями жіночої статі згідно даного винаходу також можуть бути інші ссавці, включаючи коней, домашніх тварин, наприклад, котів і собак. Не виключене і застосування щодо інших ссавців жіночої статі у стані вагітності. Пробіотичні мікроорганізми В даному винаході пробіотичні мікроорганізми можуть включати будь-який пробіотик, обраний з групи, що якої входять біфідобактерії, лактобацили, стрептококи, ентерококи і сахароміцети або їх суміші, переважно обрані з групи, що якої входять Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Enterococcus faecium, Streptococcus sp. і Saccharomyces boulardii або їх суміші. Не виключене застосування згідно даного винаходу і інших мікроорганізмів, за умови, що вони можуть забезпечувати описаний ефект підвищення імунітету. Переважніше, пробіотики обирають з групи, до якої входять Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 (також зветься NCC4007 і LPR), Bifidobacterium lactis CNCM I-3446, що реалізується, серед іншого, компанією Christian Hansen, Данія, під торговою маркою Bb12 (також зветься NCC2818), Bifidobacterium longum ATCC BAA-999 що реалізується Morinaga Milk Industry Co. Ltd., Японія, під торговою маркою BB536, Lactobacillus johnsonii CNCM I-1225 (також зветься NCC533 і La1), Lactobacillus fermentum VRI 003, що реалізується Probiomics (Австралія), під торговою маркою PCC, Bifidobacterium longum CNCM I-2170, Bifidobacterium longum CNCM I2618, Bifidobacterium breve, що реалізується Danisco (Данія) під торговою маркою Bb-03, Bifidobacterium breve, що реалізується Morinaga (Японія) під торговою маркою M-16V, і штам Bifidobacterium breve, що реалізується Institut Rosell (Lallemand) (Канада) під торговою маркою R0070, Lactobacillus paracasei CNCM I-1292, Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, наявний, inter alia, від Valio Oy (Фінляндія) під торговою маркою LGG, Enterococcus faecium SF 68, та їх суміші. Переважним пробіотиком є Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724. Дози пробіотиків Пробіотик може бути наявний в композиції у широкому діапазоні %, за умови, що відповідний застосований пробіотик допомагає досягти бажаного ефекту підвищення імунітету. 3 10 Однак, переважно пробіотик наявний в композиції в кількості, еквівалентній між 10 і 10 КУО/г в сухій вазі (КУО = колонієутворююча одиниця). Це значення поширюється на випадки, коли бактерії є живими, неактивними або загиблими або навіть наявні у вигляді фрагментів – ДНК або клітинного оболонкового матеріалу. Іншими словами, кількість бактерій, які містяться у суміші, виражена як показник здатності такої кількості бактерії до утворення колоній в разі, якщо бактерії є живими, незалежно від того, чи є вони фактично живими, неактивними або загиблими, фрагментованими або симбіозом зазначених двох станів. Переважно пробіотик наявний в 49 кількості, еквівалентній між 10 10 КУО/г композиції в сухій вазі, навіть переважніше в кількості, 3 UA 101972 C2 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8 еквівалентній між 10 і 10 КУО/ г композиції в сухій вазі. Спосіб введення Композицію можливо вводити вагітним істотам жіночої статі різноманітними способами, оскільки вона передбачає контакт між композицією і шлунково-кишечним трактом істот жіночої статі. Переважно композицію вводять як частину харчового продукту, напоїв або добавок до раціону істот жіночої статі. Композицію також можна вводити у складі фармацевтичної композиції. Переважним способом введення є оральний або ентеральний. Більш переважним способом є введення орально, оскільки це є менш травматичним для істот жіночої статі. Однак, у патологічних випадках або при застосуванні ентерального годування композиція може бути введена в ентеральне годування. Введення із іншими сполуками В будь-якому випадку композицію можна вводити окремо (в чистому вигляді або, наприклад, розведену в воді) або у суміші із іншими сполуками (такими, як домішки до раціону, харчові добавки, ліки, носії, ароматизатори, перетравлювані або не перетравлювані інгредієнти). Прикладом типових добавок до раціону є вітаміни і мінерали. В переважному варіанті втілення композицію вводять разом із іншими сполуками, що покращує очікуваний ефект на імунітет дитини. У переважному варіанті втілення винаходу композицію вводять із іншими сполуками, що покращує описаний ефект на імунітет дитини. Такі синергетичні сполуки можуть бути носієм або матрицею, що сприяє надходженню пробіотиків у кишковий тракт істоти жіночої статі, переважно, в активній формі. Такі синергетичні сполуки також можуть впливати на стан здоров'я або метаболізм вагітної істоти жіночої статі, а саме, підвищувати ефект композиції на імунну систему плоду. Такі синергетичні сполуки можуть бути іншими активними сполуками, які синергетично або окремо впливають на імунну відповідь дитини та/або потенціалізують ефект пробіотику. Прикладом таких синергетичних сполук є мальтодекстрин. Одним з ефектів мальтодекстрину є забезпечення носія для пробіотика, покращення його ефекту і запобігання розщепленню. Інші приклади включають відомі пробіотичні сполуки, такі як сполуки вуглеводів, обрані з групи, до якої входять інулін, фруктоолігосахарид (FOS), коротколанцюговий фруктоолігосахарид (коротколанцюговий FOS), галактоолігосахарид (GOS), ксилоолігосахарид (XOS), глангліозид, частково гідролізована гуарова камідь (PHGG), акацієва камідь, камідь соєвих зерен, лакто-ліцій, екстракти ліцію або їх суміш. Можуть бути наявні інші вуглеводи, наприклад, другий вуглевод, який діє синергетично із першим вуглеводом і обраний з групи, що якої входять ксилоолігосахарид (XOS), камідь, акацієва камідь, крохмаль, частково гідролізована гуарова камідь або їх суміш. Вуглевод або вуглеводні можуть бути наявні в добових дозах композиції в кількості від приблизно 1 г до 20 г, або від 1 % до 80 %, або від 20 % до 60 %. Альтернативно, вуглеводи наявні в кількості від 10 % до 80 % композиції в сухій вазі. В будь-якому випадку, однак, добова доза вуглеводів має співпадати із опублікованими вимогами щодо безпеки і чинним законодавством. Стандартним максимальним обсягом для дітей, наприклад, є максимум 6 г/л/день. В одному з варіантів втілення поживна композиція переважно включає джерело білка. Переважним джерелом білка є молочний білок. Молочний білок може бути будь-яким придатним молочним білком, наприклад, тваринним білком (таким як молочний білок, м'ясний або яєчний білок); рослинним білком (таким, як соєвий білок, пшеничний білок, рисовий білок і гороховий білок); сумішшю вільних амінокислот; або їх комбінацією. Особливо переважними є молочні білки, наприклад, казеїн, пшеничні білки і соєві білки. Композиція також може містити джерело вуглеводів та/або джерело жиру. Якщо композиція згідно даного винаходу є поживною композицією і включає джерело жиру, жир переважно забезпечує від приблизно 5 % до приблизно 55 % енергії харчової композиції; наприклад, від приблизно 20 % до приблизно 50 % енергії. Ліпідно-жирове джерело може бути будь-яким прийнятним джерелом жиру або сумішшю жирів. Особливо придатним є рослинний жир; наприклад, соєва олія, пальмова олія, кокосова олія, сафлорова олія, соняшникова олія, кукурудзяна олія, олія каноли, лецитин тощо. Також може бути доданий, за бажанням, тваринний жир, наприклад, молочний жир. До поживної композиції може бути додане додаткове джерело вуглеводів. Переважно, воно забезпечує від приблизно 40 % до приблизно 80 % енергії поживної композиції. Може бути використаний будь-який прийнятний вуглевод, наприклад, цукроза, лактоза, глюкоза, фруктоза, кукурудзяний сироп у твердому вигляді, мальтодекстрин або їх суміш. При необхідності може бути додане харчове волокно. Якщо його додано, переважно воно забезпечує до приблизно 5 % енергії поживної композиції. Харчове волокно може бути волокном будь-якого прийнятного походження, включаючи, наприклад, сою, горох, овес, пектин, 4 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гуарову камідь, акацієву камідь, фруктоолігосахарид або їх суміш. У поживну композицію можуть бути включені прийнятні вітаміни і мінерали у кількості, що відповідає встановленим вимогам. За бажанням у поживну композицію може бути введений один або більше харчовий емульгатор; наприклад, моно- та дигліцеридні ефіри диацетилвинної кислоти, лецитин і його моно- або диглицериди або їх суміші. Аналогічним чином можуть бути включені будь-які придатні солі та/або стабілізатори. У композицію також можуть бути включені ароматизатори. Період введення Період введення починається одночасно із заплідненням або так швидко, наскільки це можливо, після запліднення (тобто, після того, як майбутня матір дізналася про вагітність.). Однак, період введення може починатися і раніше. Наприклад, введення можна розпочати за 1 або 2 місяці до запліднення. Вважають, що в такому випадку стан матір, яку буде запліднено, буде мати вплив на стан здоров'я майбутнього плоду. Період введення може розпочинатися на відносно пізніх стадіях вагітності, переважно, на 3, 5 або 7 місяці вагітності (у жінок) або у відповідні періоди у інших ссавців. Можна розглядати і дуже пізній початок введення композиції, наприклад, приблизно на 8 або 9 місяці (за декілька тижнів до народження). В такому випадку, встановлено, що ефект на імунну систему дитини дуже короткостроковим і швидким, що є сприятливим для підготовки дитини до зустрічі із антигенами після пологів. Період введення може бути безперервним (наприклад до лактації і протягом лактації до відняття від грудей), або небезперервним. Переважно, період введення є тривалим для найкращого пролонгованого дефекту. Однак, встановлено, що періодичний режим введення (наприклад, щоденне введення протягом одного тисня на місяць) може забезпечити утворення "періодичних сигналів підвищення імунітету", що стимулює позитивний вплив на дитину. Тривалість періоду введення може змінюватися. Якщо позитивного ефекту очікують вже від відносно короткого періоду введення (наприклад, при щоденному введенні протягом 1 тижня або 1 місяця), більш тривалий прийом забезпечить підвищений ефект (наприклад, при тривалості введення 3, 5, або 8 місяців у людини і відповідній тривалості у інших ссавців). Переважно, період введення може тривати протягом майже всього періоду вагітності. В одному з варіантів втілення він триває протягом більше ніж 50 %, більше ніж 70 %, або більше ніж 80 % періоду вагітності. Введення також може тривати протягом всього періоду лактації або його частини. Більш переважно, воно тримає протягом всього періоду лактації Тривалість може становити 0 %, 30 % або більше, 50 % або більше або 80 % або більше періоду лактації. В одному з окремих варіантів втілення період введення композиції може тривати протягом періоду лактації або його частини, однак, без введення протягом періоду вагітності; в такому випадку корисний ефект композиції забезпечується при передачі дитини через молоко матері. Більш переважно, період введення триває протягом частини або всього періоду вагітності і і частини або всього періоду лактації. Переважно, введення проводять у вигляді щоденного прийому (один раз або двічі на день), або щотижневого прийому (один раз або двічі на тиждень). В одному з варіантів втілення композицію також вводять безпосередньо дитині, за умови, що матір отримувала композицію під час вагітності. Переважно, композицію вводять безпосередньо дитині протягом лактації або після повного або часткового відняття від грудей, переважно, орально. Звичайно, подвійне введення композиції матері (протягом вагітності) і дитині (безпосередньо) може забезпечити покращений позитивний вплив завдяки синергетичному ефекту. Встановлено, що прийом під час вагітності стимулює попередню підготовку дитини для кращого реагування на безпосереднє введення в більш пізніх періодах. Ефект композиції Введена вагітним ссавцям жіночої статі композиції згідно винаходу стимулює підвищення імунітету дитини. Таке підвищення особливо легко встановити після пологів, однак, воно може розпочатися і протягом періоду вагітності. Зокрема, застосовуваний у даному описі термін "підвищення імунітету" усуває алергічні реакції. Термін "підвищення імунітету" означає підвищення вроджених імунних функцій і сприяння специфічним імунним реакціям на антигени. Вроджені імунні реакції можуть бути клітинними відповідями, фагоцитною активністю, лейкоцитною активністю та/або полі реактивними антитілами. Специфічною імунною реакцією може бути активація клітин та/або специфічні реакції на антитіла. Термін "підвищений імунітет" може включати або може бути визначений як підвищення імунного захисту тіла та/або підвищення здатності тіла реагувати на різноманітні антигенні стимули. Зазначені антигенні стимули можуть бути вірусними та/або бактеріальними та/або паразитарними препаратами та/або їх антигенними похідними, підодиницями клітинно-поверхневих сполук та/або токсинами. В одному з варіантів втілення композиція винаходу підсилює трансмісію імунних компетенції 5 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 від зазначених жінок до зазначених дітей. У такий спосіб композиція може забезпечувати дітям кращі шанси на перенесення стимулів протягом ранніх періодів життя. Очевидно, композиція допомагає дітям краще починати життя та/або одержати кращий захист проти інфекцій. В одному з варіантів втілення такий підвищуючий ефект є здатністю дитини реагувати на антигенний вплив. При народженні імунна система дитини знаходиться одночасно в стані, що дозволяє адекватно реагувати на антигенний вплив та у стані швидкого дозрівання. Піддання впливу антигенів також бере участь у підвищенні дозрівання імунної системи. Після народження всі діти природним чином піддаються впливу патогенних антигенів або антигенів навколишнього природного середовища. Імунна система дитини реагує на такий вплив. В одному з варіантів втілення даного винаходу імунна система дитини більш ефективно реагує на вплив антигенів. В одному з варіантів втілення антигенний вплив можливо виміряти за допомогою дозування антитіл, специфічних до такого антигену. В контексті даного винаходу може бути виміряне кількісне та якісне підвищення специфічних антитіл. В одному з варіантів втілення таке підвищення може бути визначене у сироватці крові та /або слині та/або фекаліях дитини, підданої впливу антигенів. В одному з варіантів втілення відповідь на піддання антигенному впливу передбачає підвищення загальних поліреактивних реакцій, переважно у сироватці крові та /або слині та/або фекаліях дитини. В одному з варіантів втілення реакція на антигенний вплив передбачає збільшення клітинних імунних реакцій в крові дитини, переважно, збільшення кількості та/або збільшення активності лейкоцитів зазначеної дитини (для ілюстрації, див. результати з прикладу 2). Зрозуміло, що тип реакції сильно залежить від виду впливу, хоча деякі антигени можуть стимулювати складну імунну реакцію у вигляді більш ніж одного з вищеописаних ефектів (наприклад, підвищення відповідних антитіл і підвищення поліреактивних антитіл, та/або підвищення клітинних імунних реакцій). Визначення імунної реакції можна здійснити за допомогою звичайних імунологічних досліджень, наприклад, клітинного підрахунку, аналізу антитіл, фагоцитної активності, а також цитотоксичної клітинної активності (активності нейтрофілів та природних клітин-кіллерів), концентрації імунних маркерів, включаючи цитокіни, факторів зросту, а також клітинно-поверхневих імунних маркерів тощо. Підвищення вимірюють по порівнянні із рівнями у відповідних зразках від дітей, які не піддавалися впливу композиції згідно винаходу (= контрольні зразки). Антигенний вплив є особливо релевантним в контексті даного винаходу, і включає, але не обмежується, піддання впливу вірусів, переважно, ротавірусів і аденовірусів, або піддання впливу інфекційних бактерій, переважно, Escherichia coli, Vibrio cholerae, сальмонел, клостридій, шигел, або піддання впливу паразитарних інфекцій, переважно Giardia lamblia, Entamoeba histolytica і Cryptosporidium spp або їх сумішей. Особливо важливим для стану здоров'я немовлят є вияв кращої здатності реагувати на зазначений патогенний вплив. Він може призвести до захисту дитини від цих патогенів, і, зокрема, кращому захисту проти відповідних інфекцій, викликаних такими патогенами. Більш загально, він може сприяти кращому захисту дитини протягом багатьох типів патогенів (= зміцнення імунної системи в цілому). В обсязі даного винаходу може бути розкритий і позитивний ефект на алергію, оскільки вплив на імунну систему може бути краще збалансованою і краще контрольованою реакцією на антигени. Ефект підвищення імунітету дитини може досягти максимуму в періоді лактації, або протягом ювенільної фази / дитинства… Для людей максимального збільшення зазвичай досягають між днем пологів (день 0) і 24 місяцями життя, переважніше, між днем пологів (день 0) і 180 днем життя. Не виключено, що дефект підвищення може тривати протягом періоду юнацтва дитини. Для інших ссавців відповідні періоди мають бути розглянуті. Винахід надалі буде проілюстрований із посиланням на наступні приклади: Приклад 1, дослідження на мишах 1 Матеріали і методи: У всіх експериментах використовували звичайних самиць мішей BALB/c віком шість тижнів (18-20г), придбаних у Charles River (Domaine des Oncins, BP 010969592, L'Arbresle Cedex, Франція). Миші жили у спеціальних вільних від патогенів умовах у виварії в Клінічному медичному університеті Женеви (КМУ-Женева), і для кожної групи дослідження було відібрано від 6 до 8 дітей мишей з кожного поносу. Тварини мали вільний доступ до регулярного звичайного раціону. Вагітні миші одержували порошки пробіотику або плацебо, суспендовані у питній воді. Питну воду змінювали кожного дні. Було порівняно три групи: - Група A контрольна (Мальтодекстрин) - Група B Lactobacillus paracasei CNCM I-2116 (ST11) - Група C Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 (LPR) Всі продукти були одержані із звичайних загальнодоступних джерел. Назви "ST11" і "LPR'є абревіатурами або назвами-замінниками вищевказаних мікроорганізмів. Розбавлена вакцина корі із живими мікроорганізмами (MV-S) була придбана у Aventis 6 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Pasteur (Ліон, Франція) Вимірювання - Визначення антитіл до вірусу корі (ізотопи імуноглобулінів IgG1 і IgG2a) і IgG в загальній сироватці крові було виконане способом твердофазного імуноферментного аналізу ELISA у центрі вакцинології і неонатальної імунології (ЦВНІ) при Медичному центрі університету Женеви (Швейцарія) відповідно до чинних стандартів. Експериментальна процедура: (На фігурі 1 зображено схематичний вигляд процедури): 1. Чотири вагітні миші в кожній групі одержували питну воду із вмістом A, B або C під час вагітності і до відняття від грудей. 2. При віднятті від грудей (через 3 тижні), всі мишенята одержували звичайну воду без будьяких добавок. Матерів умертвили. 3. В три тижні (імунізація немовлят), мишенят (5-8 мишенят з клітки, ; 28 мишенят на групу) 5 імунізували живим розбавленим вірусом корі (5 × 10 CCID50). 4. За мишенятами спостерігали щоденно (у віці від 3 до 8 тижнів), а саме, спостерігали за набранням ваги, фекалії збирали один раз на тиждень (у віці від 3 дo 8 тижнів). 5. У мишенят взяли кров у 3 та 5 тижнів після імунізації для визначення загального імуноглобуліну IgG і спефицічних до корі антитіл IgG1 і IgG2a. 6. Через п'ять тижнів після імунізації всіх мишей умертвили. Для оцінки відмінностей при вакцині від корі були застосовані тести Крускал-Уолліса, а потім тести Манн-Уітні (Уілкоксон). Результати:На фігурі 2 наведено графічну ілюстрацію одержаних результатів. Вплив на зростання новонароджених не встановлений. Не встановлено відмінностей у реакціях на вакцину, що стосувалися б середовища, статі або ваги. Значне підвищення реакцій антитіл після коревої вакцинації спостерігалося у всіх групах, що відображає нормальний процес дозрівання антитіл. Імунні відповіді відрізнятися змішаними реакціями Th1(Т-хелперні клітини 1 типу):Th2 (Т-хелперні клітини 2 типу), як демонструють збалансовані ріврі імуноглобулінів IgG1 та IgG2, що спостерігалися у всіх групах. Введення матерям ST11 не мало статистично значущого ефекту на реакцію мишенят на вакцину корі (в умовах експерименту). Однак, введення вагітним матерям LPR сприяло вищим тітрам імуноглобулінів IgGу порівнянні із контрольними зразками, без зміни загального імунного профілю реакції на вакцину корі. Висновок: Видається, що такі результати вказують, що ефект залежить від штаму пробіотика. Як видно, ST11, здається, має невеликий ефект на імунне дозрівання в кишечнику мишенят і генерування відповіді на вакцину корі. На противагу, введення вагітним матерям LPR сприяло підвищеним периферійним IgG-реакціям на вакцину корі у юних дорослих мишей. Приклад 2, дослідження на мишах 2 Матеріали і методи: У всіх експериментах використовували звичайних самиць мішей BALB/c віком шість тижнів (18-20г), придбаних у Janvier, Франція). Миші жили у спеціальних вільних від патогенів умовах у виварії в дослідницькому центрі Nestlé Клінічному медичному університеті Женеви (КМУ-Женева), і для кожної групи дослідження було відібрано від 10 до 12 дітей мишей з кожного поносу. Тварини мали вільний доступ до регулярного звичайного раціону. Вагітні миші одержували порошки пробіотику або плацебо, суспендовані у питній воді. Питну воду змінювали кожного дні. Було порівняно дві групи: - Група A контрольна (Мальтодекстрин) - Група B Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 (BL) Всі продукти були одержані із звичайних загальнодоступних джерел. Назва "BL" є абревіатурою вищевказаних мікроорганізмів. Анатоксинна вакцина проти правця Tetanol Pur (40 UI) була придбана у Novartis (Швейцарія). Вимірювання - Визначення проліферації T-клітин селезінки у присутності анти-CD3 антитіл виконували відповідно до стандартних процедур. Коротко, спленоцити були інкубовані нанесеним на планшет анти мишачим CD3 (2.5 мкг/мл, інкубовані 2 години при 37 °C, BD Pharmingen, кат. № 553056) на 96-лункових планшетах при 37 °C протягом 72 годин. Проліферація клітин була визначена за допомогою введення [метил-3H]тимідина (Amersham Pharmacia Biosciences), як описано (DeCicco, K. L., Youngdahl, J. D. and Ross, A. C. 2001 Immunology 104, 341-348). Дані представлені у кількості на хвилину, нормалізованій процентним вмістом CD3-позитивних клітин, фактично наявних у селезінці тестованих мишей. Дози сироваткових антитіл імуноглобуліну IgG, специфічних до анатоксинного правця, вимірювалися методом твердофазного імуноферментного аналізу ELISA. Коротко, 96-лункові мікротитрові плашнети були покриті 0.1 мкг цільного антигену TT (Calbiochem, анатоксинна 7 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 протиправцева вакцина від Clostridium tetani, кат. № 582231) у фосфатно-сольовому буфері (PBS). Після здійснення тричі промиття із PBS-0.05 % Tween20, планшети були заблоковані буфером PBS-20 % FCS-0.05 % Tween20 протягом 1 години при 37 °C, а потім зному тричі було здійснене промиття. Серійні розчини сироватки крові мишей у блокуючому буфері були були інкубовані протягом 2 годин при 37 °C. Після промиття тричі, зв'язані TT-специфічні імуноглобуліни IgG були визначені шляхом інкубації антитіл біотин-кон'югованих козячих анти мишачих імуноглобулінів IgG (SouthernBiotech, кат. №. 1034-08) протягом 1 години при 37 °C. Після трьох стадій промиття планшети ELISA інкубували маркованим пероксидазою стрептавідином (KPL, кат. №. 14-30-00) протягом 30 хвилин при 37 °C. Після трьох останніх стадій промиття додали субстрат пероксидази (KPL, кат №. 50-76-00). Колориметричну реакцію блокували сірчаною кислотою, а оптичну густину при 450нм виміряли у спектрофотометрі. Потім були підраховані титри антитіл, як описано (Ma, Y. and Ross, A. C., 2005, Proc Natl Acad Sci. 2005 Sep 20;102(38):13556-61). Експериментальні процедури: (На фігурі 3 зображено схематичний вид процедури): 1. Дві або три вагітні миші в кожній групі одержували питну воду із вмістом плацебо або BL під час вагітності і протягом перших двох тижнів лактації. 2. При віднятті від грудей (через 3 тижні), всі мишенята одержували звичайну воду без будьяких добавок. Матерів умертвили. 3. У три 3 тижні підгрупу мишенят з кожної групи (5-6 мишенят на групу) умертвили для визначення проліферації клітин селезінки. 4. Через 3 тижні (імунізація дітей), решту мишенят (5-6 мишенят на групу) імунізували вакциною TT підшкірно (1/4 дози для людини). 5. Через чотири тижні після першої імунізації мишенятам ввели вторинну дозу вакцини. 6. У мишенят взяли кров через 4 тижні після першої імунізації і через 2 тижні після вторинної імунізації для визначення антитіл анти-TT імуноглобуліну IgG, після чого мишей умертвили. Для оцінки відмінностей у проліферації T-клітин і TT вакцині були застосовані тести МаннУітні (Уілкоксон). Результати: Фігура 4 демонструє, що значне підвищення антигенних відповідей після вакцинації вакциною TT спостерігалися у всіх групах, відображуючи нормальний процес розвитку антитіл. Введення матерям BL під час вагітності і лактації сприяло вищій системній реактивності T-клітин і значному підвищенню титрів IgG у порівнянні із плацебо. Висновки: Два дослідження згідно прикладів 1 і 2 висвітлюють той факт, що можливо сприяти імунному розвитку дитини шляхом перинатального втручання, зокрема, через введення матерям пробіотиків під час вагітності і лактації. Як показує дослідження 1, такий ефект є штамспецифічними, однак, не є специфічними щодо видів мікроорганізмів. Зокрема, видається, що введення вагітним матерям LPR або BL у більшому ступені сприяє імунному дозріванню дитини. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 50 55 1. Застосування пробіотиків Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.3724 або Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 або їх комбінації при виробництві композиції для введення ссавцям жіночої статі у стані вагітності для підвищення імунітету дитини після народження. 2. Застосування за п. 1 для підвищення вроджених імунних функцій дитини та/або сприяння специфічним імунним відповідям на антигени інфекцій. 3. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що покращує передачу імунних реакцій від матері до дитини. 4. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначеними ссавцями жіночої статі є жінки. 5. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначену композицію вводять зазначеним істотам жіночої статі орально, переважно, у вигляді харчових продуктів, напоїв, харчових добавок або фармацевтичних композицій. 6. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що композицію вводять протягом періоду введення, який становить більше 50 % періоду вагітності у зазначених осіб жіночої статі. 7. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначений період введення включає становить 30 % або більше періоду лактації - вигодовування дитини грудьми. 8. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначений період введення становить більше 50 % періоду вагітності і 30 % або більше періоду лактації. 8 UA 101972 C2 5 10 15 20 25 30 35 9. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначена композиція включає додаткові інгредієнти або пребіотики, переважно, обрані серед інуліну, фруктоолігосахариду (FOS), коротколанцюгового фруктоолігосахариду (коротколанцюговий FOS), галактоолігосахариду (GOS), ксилоолігосахариду (XOS), глангліозиду, частково гідролізованої гуарової камеді, акацієвої камеді, камеді соєвих бобів, лактоліцію, екстрактів ліцію або їх суміші. 10. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначене підвищення імунітету включає підвищення здатності дитини реагувати на введення антигенів. 11. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що реакція на введення антигену включає підвищення специфічних антитіл до таких антигенів, переважно, у сироватці крові зазначених дітей та/або слині та/або фекаліях. 12. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначена реакція на антигенний вплив включає підвищення загальних поліреактивних антитіл, переважно у сироватці та/або слині, та/або фекаліях зазначених дітей. 13. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначена реакція на антигенний вплив включає підвищення клітинної імунної відповіді в крові зазначених дітей, переважно, підвищення кількості та/або активності лейкоцитів у зазначених дітей. 14. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначене введення антигену включає введення вірусів, переважно, ротавірусів і аденовірусів, або інфекційних бактерій, переважно, Escherichia coli, Vibrio cholerae, сальмонел, клостридій, шигел, або інфікування паразитами, переважно, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica і Cryptosporidium spp. або їх сумішами. 15. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначена підвищена здатність реагувати на введення антигенів сприяє покращеному захисту зазначених дітей проти інфекцій в ранні періоди життя, переважно, до таких інфекцій відносяться вірусні інфекції, наприклад, ротавірусні інфекції, і аденовірусні інфекції, або бактеріальні інфекції, наприклад, інфекції Escherichia coli, Vibrio cholerae, проти інфікування сальмонелами, клостридіями, шигелами, враження паразитами, такими як Giardia lamblia, Entamoeba histolytica і Cryptosporidium spp. 16. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що підвищення імунітету досягає максимуму під час лактації або під час ювенільної фази зазначеної дитини, переважно між пологами (день 0) і 24 місяцями життя, більш переважною між пологами (день 0) і 180 днем життя. 17. Застосування за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначену композицію додатково вводять дитині під час лактації або після повного або часткового відняття від грудей. 9 UA 101972 C2 10 UA 101972 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11