Спосіб оцінки біобезпеки водного середовища на підставі обчислення інтегральних індексів стресочутливих показників двостулкового молюска

Реферат: Спосіб оцінки біобезпеки водного середовища на підставі обчислення інтегральних індексів стресочутливих показників двостулкового молюска включає визначення якості водного оточення з використанням мінімального набору біомаркерів стресу та токсичності. При цьому у тканинах двостулкових молюсків чоловічої статі визначають показники стресу (супероксиддисмутазна активність, концентрація загального глутатіону, рівень супероксиданіонрадикала у травній залозі) та токсичності (концентрація металотіонеїнів та етоксирезоруфін-Одеетилазна активність у травній залозі та концентрація вітелогенінподібних протеїнів у гонадах). За стандартизованими значеннями показників обраховують інтегральний індекс відповіді біомаркерів та інтегральний індекс стресу та токсичності. За одержаними результатами оцінюють рівень біобезпеки та природу токсичності водного середовища у досліджуваних водоймах за біологічною реакцією організму як "норма", "стрес", "вплив специфічного токсиканту" та "переддепресивний стан". UA 115231 U (12) UA 115231 U UA 115231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області збереження довкілля, а саме до біоіндикації забруднення водойм, і може бути використана для оцінки якості водних екосистем внаслідок їх експлуатації, прогнозу безпеки води для біоти, у тому числі організмів, які знаходяться у вершинах трофічних пірамід і людини, аналізу фізико-хімічного забруднення річок та внесення екологічних оцінок у бізнес-плани інвестиційних проектів. Відомий "Спосіб біоіндикації водного середовища" [Карпезо Ю.І., № 65329UA, 2011], який включає визначення токсичності водного середовища, який відрізняється тим, що для визначення токсичності відбирають з дна водойми проби мікрофітобентосу, досліджують їх, визначають якісний склад та чисельність клітин мікроводоростей, які існують на дні, отримані дані порівнюють з контролем, і наявність відмінностей в сторону зменшення чисельності мікроводоростей чи відсутність їх взагалі свідчить про присутність токсикантів в водному середовищі. Відомий також "Спосіб біоіндикації якості вод" [Ляшенко А.В., Зоріна-Сахарова К.Є., № 101701UA, 2013]. Суть винаходу полягає у адаптації традиційних європейських індексів (ТВІ (Trent Biotic Index)), ВВІ (Belgian Biotic Index) та BMWP (Biological Monitoring Working Party Index) до умов їх застосування в рукавах та затоках дельтових ділянок річок Європи. Для визначення якості вод використовується видова структура макрозообентосу, фітофільної макрофауни та епіфауни твердих субстратів. Розрахунки біотичних індексів проводять як за складом окремих біотичних комплексів, так і за структурою макрофауни безхребетних в цілому. Для аналізу використовуються максимальні з отриманих протягом вегетаційного сезону значення індексів, які нівелюють сезонні зміни у складі комплексів макробезхребетних, агрегованість поселень та похибки у відборі гідробіологічних проб. Проте даний спосіб біоіндикації якості водойм дозволяє зареєструвати лише віддалені наслідки погіршення якості природних вод. Крім цього, показники структури зообентосу водойм виявились малочутливими порівняно з біомолекуляоними маркерами у низці досліджень водойм України [Fetisov et al., 1992; Sylayeva et al, 2012]. Відомий "Спосіб біологічного моніторингу на основі біоіндикації" [Гудімов О.В., № 2357243RU, 2009], який включає відбір проб водних тварин, встановлення їх чисельності, біомаси, видової різноманітності, меж розподілу і реєстрацію функціональних параметрів організму, а також основних гідрологічних і гідрохімічних показників, визначення на їх основі просторових і часових трендів зміни індикаторних біологічних параметрів в градієнті екологічних факторів. Біомоніторинг здійснюється безперервно за допомогою багаторівневої біоіндикації, з використанням декількох рівнів організації біологічних систем і вимірюванням індикаторних параметрів з різною дискретністю. При цьому результати оперативної біоіндикації за фізіологічними і поведінковими реакціями організму в природних умовах характеризують зміни стану середовища в інтервалі від 1 години до 6 місяців, короткостроковій біоіндикації - за параметрами популяцій окремих видів - характеризують діапазон від 0,5 року до 3 років, багаторічної біоіндикації на рівні угруповань оцінюють зміни з інтервалом 3 і більше років, оцінка змін середовища здійснюється шляхом порівняння з фоновими і референтними трендами індикаторних параметрів. При цьому виявлення достовірних відмінностей індикаторних параметрів більш, ніж на 30 % щодо референтних трендів, свідчить про стійкі зміни стану середовища. Більш конкретизовані рекомендації автор пропонує у наступному запатентованому "Способі оперативної біоіндикації" [Гудімов О.В., 2009112433/04RU, 03.04.2009], що включає проведення безперервної реєстрації поведінкових і/або фізіологічних реакцій водних організмів у природних умовах за допомогою вимірювальних приладів в режимі реального часу. Для дослідження пропонується використати аддукцію, амплітуду розкривання стулок мушлі, сумарний час закривання стулок мушлі двостулкових молюсків тощо. Недоліком цього способу є обмеження досліджень реакції організму на забруднення лише на організменному рівні, що не може забезпечити адекватної інформації для ранньої діагностики якості середовища. Відомий "Спосіб оцінки здоров'я морських двостулкових молюсків і стану середовища їх проживання" [Сокольникова Ю.М., RU 2571817]. Винахід належить до екології, охорони навколишнього середовища, імунології та фізіології і може бути використаний для оцінки здоров'я морських двостулкових молюсків, схильних та несхильних до стресу і стану середовища їх проживання. Для реалізації способу у двостулкових молюсків беруть гемолімфу, розділяють її на плазму і гемоцити, визначаючи їх фагоцитарну активність. Додатково як біомаркери визначають гемолітичну активність плазми і концентрацію загального протеїну в ній. Спосіб дозволяє оцінити стан здоров'я морських двостулкових молюсків і середовища їх проживання на основі біоіндикації клітинних і гуморальних факторів гемолімфи молюсків. Недоліком цього способу є відсутність чітких критеріїв та врахування сезонної залежності вибраних показників. 1 UA 115231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відомий також спосіб "Визначення здоров'я екосистем шляхом оцінки множинних біомаркерів у живому організмі, крім людини" (WO/2002/022859), який полягає в узагальненні результатів визначення широкого спектра показників та у застосуванні множинних схем їх використання у лабораторних та природних умовах. Недоліками способу є висока собівартість та необхідність використання різних організмів, відсутність конкретних і універсальних рекомендацій та чітких критеріїв оцінки токсичності водного середовища. Відомий "Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб" [Грубінко В.В. та ін., № 86248UA, 2013] включає оцінку забруднення водного середовища іонами металів. Проводяться визначення ліпідного складу клітин зябер та гепатопанкреасу риб, який модулюється концентрацією іонів цинку та кадмію, що розчинені у водному середовищі. Недоліками цього способу є невідповідність способу умовам реальних водойм, відсутність чітких критеріїв інтерпретації результатів, ранжування біологічної реакції на природу діючого чинника та детального опису формули деклараційного патенту. Відомий "Спосіб біоіндикації забруднення морської води важкими металами" [Корякова М.Д. та ін., 2003123682/13RU, 2003], який полягає у визначенні та порівнянні вмісту металів у мінералізованому сухому залишку піонерних організмів акваторії (двостулкові молюски, ракоподібні, гідроїдні, черви (20 видів загалом)), відібраних у потенційно забрудненій та чистій місцевості. Недоліками цього способу є відсутність кількісних критеріїв, адаптація методу лише до забруднення морської води та недостатнє обґрунтування щодо варіабельності середнього значення вмісту металів залежно від видового набору піонерних організмів. Відомий "Спосіб біоіндикації токсичності водного середовища" [Фальфушинська та ін., № 86249UA, 2013] який дозволяє кількісно оцінити вплив забруднення водойм на організм риб на основі аналізу стану металодепонувальних стресорних протеїнів металотіонеїнів у печінці риб. У відповідності з винаходом спосіб здійснюється шляхом обчислення співвідношення вмісту металотіонеїнів за рівнем тіолових груп у білку та їх металодепонувальною здатністю. Класифікують рівень токсичності середовища як малий (адекватна відповідь), середній (стан тривоги, залучення металотіонеїнів до антиоксидантного захисту) або високий (стан виснаження, втрата здатності зв'язувати метали у нетоксичні комплекси та реагувати на забруднення збільшенням вмісту протеїну). Пропонований спосіб дозволяє кількісно, чутливо та з малими витратами провести біоіндикацію стану водойм та оцінити токсичність речовин у лабораторному дослідженні з використанням риб. Найближчим до пропонованого способу можна вважати "Спосіб оцінки токсичності водного середовища" [Фальфушинська та ін., № 52992UA, 2010], який дозволяє кількісно оцінити вплив забруднення водойм на організм двостулкового та легеневого молюсків і карася на основі визначення редокс-індексу глутатіону в їх метаболічно активних тканинах. У відповідності з винаходом спосіб здійснюється шляхом обчислення співвідношення вмісту відновленого та загального глутатіону у тканині. Класифікують рівень токсичності середовища як малий (адекватна відповідь), середній (оксидативний стрес) або високий (виснаження відновного потенціалу). Проаналізувавши наведені вище способи та технічні рішення, можна дійти висновку, що стандартизованої, придатної до впровадження системи тестів, яка здатна оцінити безпеку водного середовища для біоти та забезпечити ранжування водних об'єктів на певній території в оптимальні терміни та із залученням мінімальної кількості персоналу та обладнання, не існує. Розробники, в основному, пропонують методологічні підходи, орієнтовані на популяційновидовий та/або екосистемний рівень, які не повною мірою відображають ефекти пошкоджуючих речовин на біологічні системи та не є придатними для експрес-діагностики якості середовища. Розробка способів, які використовують клітинні та молекулярні критерії водних організмів, зводиться до визначення окремого показника. Відтак, встановлення чутливих методологічних прийомів, орієнтованих на клітинний та молекулярний рівень організації живого, які відрізняються мінімальними затратами часу, коштів та людських ресурсів, є однією з пріоритетних задач екотоксикології та екологічної біохімії. У світі існує низка практично-орієнтованих міждержавних програм, зокрема MedPol, Biomar, які забезпечують не лише оцінку якості довкілля на підставі аналізу показників біоіндикаторних організмів на різних рівнях біологічної організації від молекулярного до екосистемного, а й картування та ранжування ступеня біологічної безпеки тих чи інших об'єктів для тварин та людини. В Україні аналогічні програми відсутні. Необхідність поєднання методів хімічного та біологічного моніторингу було заявлено в директиві Європейського союзу стратегій моря, як пріоритетний напрямок (MSFD, 2008/56/ЕС) та необхідною умовою достатнього рівня оцінки якості водного оточення. Поряд з відомими забруднювачами прісних водойм, небезпечні кількості яких у воді мають розмірність мкг/л води (купрум, кадмій, меркурій) і відносно легко 2 UA 115231 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фіксуються хімічними методами, у переліку 33-ти пріоритетних хімічних забруднювачів водойм, визначених (Annex II of Directive 2008/105/ЕС; http://ec.europa.eu/environment/water/waterframeworkypriority_substances.htm), містяться побутові та фармацевтичні препарати, які потрапляють у водойми у наномолярних концентраціях, погано піддаються очистці та ідентифікації за допомогою хімічних методів. З огляду на те, що типовою ознакою впливу пошкоджувальних чинників на біоту є комплексний характер хімічних складових, їх слідові концентрації, мінливість складу у часі та поєднання з аномаліями термального чинника (зміни клімату), на зміну традиційним методам оцінки токсичності середовища повинні прийти принципово нові підходи, які визначають у першу чергу здатність організму, адаптованого до певних умов існування, адекватно реагувати на нові несприятливі виклики. Згідно з рекомендаціями [Allen and Moore, 2004, Viarengo et al., 2007, Hays and Aylward, 2008, Amiard-Triquet et al., 2012] набір біомаркерів для оцінки якості води повинен включати: 1) від трьох до шести показників, що забезпечить порівняно низьку собівартість аналізу і з мінімальними витратами часу; 2) показники, для яких відомі стандартизовані протоколи визначення; 3) показники, які охоплюють максимальний діапазон ефектів впливу сполук різних хімічних класів. Згідно з цими вимогами та на підставі диференційного аналізу низки біомаркерів стану молюсків для реалізації способу ми включили до мінімального набору показників шість характеристик, які відповідають цим вимогам та є визначальними для специфічної ідентифікації представників даного виду у певному біотопі [Falfushynska et al., 2010, 2012, 2013, 2014, 2015, Gnatyshyna et al., 2014]. Це маркери стресу та типових забруднювачів (токсичних металів, поліароматичних вуглеводнів та їх хлорпохідних). Відтак, у тканині травної залози тварин визначають маркери оксидативного стресу (супероксиддисмутазну (СОД) активність, що характеризує здатність до знешкодження активних форм кисню та індукується окисним стресом, вміст низькомолекулярного тіолу глутатіону, рівень супероксиданіону (активних форм оксигену)), маркер токсичності металів (вміст металотіонеїну (МТ), етоксирезорифін-Oдеетилазну (ЕРОД) активність, як показник ефективності І фази (мікросомальної) детоксикації ксенобіотиків (біомаркер персистентних поліароматичних вуглеводнів та їх хлорпохідних)), а у гонадах особин чоловічої статі визначають концентрацію фосфоліпопротеїну вітелогеніну, як показник ксеноестрогенного ефекту (біомаркер поліциклічних органічних сполук (бісфенол А, стероїдні гормони). Як біоіндикаторні організми вибрано двостулкові (Bivalve) молюски. Представники цих безхребетних тварин мають низку переваг для біоіндикації: їх використання не потребує дозвільних документів офіційних служб та біоетичних комісій, вони широко розповсюджені, належать до пасивних фільтраторів води у водоймах, що сприяє концентруванню в їх тканинах забруднювачів водного середовища, зокрема іонів металів, поліхлорбіфенілів, поліароматичних вуглеводнів тощо. Спосіб може бути застосований: 1) у режимі пасивного моніторингу з використанням тварин - поселенців даної водойми; 2) шляхом активного моніторингу з використанням екземплярів тварин, переселених у місцевість оцінювання з визначеної референтної водойми. За режиму пасивного біомоніторингу аналізу піддають результати вимірів протягом двох (мінімально) - чотирьох сезонів. У режимі активного моніторингу молюсків поміщають у досліджувану водойму на мінімальний період 14 діб. У кожному випадку для реалізації способу створюють мінімально дві групи по 8 екземплярів молюсків - одну референтну групу (з незайманої водойми) та одну групу з досліджуваної місцевості. За стандартизованими значеннями вимірюваних показників стресу і токсичності у групі 1) будуємо пелюсткову діаграму та обраховуємо інтегральний індекс відповіді біомаркерів (ІВБ), як площу неправильного шестикутника (з використанням формули Герона) за формулою ІВБ=1/2*(SIN(2*3.141592/6))*(S2(COД)*S2(GSH)+S2(GSH)*S2(O2 *)+S2(O2 *)* S2(MT)+S29(MT)*S2(Bтг-ПП)+S2(Bтг-ПП)*S2(EPOД)+S2(EPOД)* S2(COД)) (S2 - стандартизоване значення відповідного біомаркера) та 2) обраховуємо інтегральний індекс стресу та токсичності (ІСТ) як ІСТ=(S2(СОД)+S2(GSH)+S2(MT))/(S2(O2 *)+S2(Bтг-ПП)+S2(ЕРОД)). За одержаними результатами оцінюємо рівень біобезпеки та природу токсичності водного середовища у досліджуваних водоймах та класифікуємо відповідь індикаторного організму як: - "норма" (епізодичне забруднення у межах детоксикаційної здатності організму) варіабельність значень ІВБ та ІСТ у межах 1,0