Спосіб оцінки токсичності водного середовища

Спосіб оцінки токсичності водного середовища, який включає біологічну оцінку токсичності водного середовища, який відрізняється тим, що обчислюють редокс-індекс глутатіону в метаболічно активних тканинах водних тварин на підставі визначення вмісту загального і окисненого глутатіону та класифікують рівень токсичності середовища як малий (адекватна відповідь), середній (оксидативний стрес) або високий (виснаження відновного потенціалу). (19) (21) u201000637 (22) 22.01.2010 (24) 27.09.2010 (46) 27.09.2010, Бюл.№ 18, 2010 р. (72) СТОЛЯР ОКСАНА БОРИСІВНА, ФАЛЬФУШИНСЬКА ГАЛИНА ІВАНІВНА, ГНАТИШИНА ЛЕСЯ ЛЮБОМИРІВНА (73) ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ПЕДАГОГІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ВОЛОДИМИРА ГНАТЮКА 3 розчинення осаду і реєстрацію оптичної густини. Недоліками способу є наступне: - неоднозначність ступеня окиснення білків сироватки крові як показника окисного ураження організму, оскільки рівень окисної модифікації білків залежить не тільки від впливу прооксидантних чинників, але і від співвідношення швидкості експресії та протеолізу білків, а також від стану систем їх транспорту з клітин певних тканин у сироватку. - відсутність гнучких критеріїв оцінки біологічної відповіді. Відомо, що за перевищення адаптивних можливостей організму, значення окремих показників, у тому числі і ступеня окиснення білків сироватки крові риб, можуть відповідати нормі; - використання як індикаторного організму риби, яка не є стаціонарним для певної ділянки водойми організмом, а тому не може бути використана для її характеристики; - процедура відбору крові у риб в токсичному середовищі не завжди є успішною. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу кількісної характеристики біологічної відповіді на забруднення водного середовища на підставі визначення редокс-стану глутатіону в метаболічно активних тканинах водних тварин. Поставлена задача вирішується тим, що на основі визначення вмісту загального та окисненого глутатіону у тканині обчислюють редокс індекс (РІ) глутатіону як відношення вмісту відновленого глутатіону до загального вмісту глутатіону у тканині. Відповідь організму класифікується як норма, стан тривоги (оксидативний стрес), або стан виснаження (окисна деструкція) і, відповідно, токсичність середовища - як мала, середня або висока. Глутатіон ( -глутамілцистеїнілгліцин) має найвищу концентрацію серед метаболітів у більшості клітин. Шляхи перетворення глутатіону в клітині належать до еволюційно найстаріших і універсальних. Глутатіон виконує чисельні важливі функції у клітинах. Він забезпечує відновлений стан тіолів, зокрема SH-груп ферментів, бере участь в знешкодженні вільних радикалів, метаболізмі і детоксикації різноманітних компонентів, що мають електрофільні групи, як органічної природи, так і іонів важких металів, забезпечує транспорт амінокислот через мембрану, є ресурсом цистеїну. Доведено, що він опосередковує дію стресових факторів на експресію стресорних білків. Відновлена форма (GSH) є переважаючою внутрішньоклітинною формою, а вміст окисненої форми (GSSG), в клітинах підтримується в межах менше 3% від загального рівня. Функція глутатіону реалізується через зміну цитоплазматичного редокс-співвідношення кількості GSH/GSSG з 30:1 до 100:1. Загальний вміст глутатіону в клітинах може зазнавати незворотних змін внаслідок кон'югації глутатіону з електрофільними реагентами та виведення з клітин. Збільшення частки GSSG в клітинному пулі глутатіону свідчить про ураження відновних систем клітини. За величиною зменшення РІ можна оцінити стан в біологічній системі як оксидативний стрес (рання відповідь на несприятливі умови) та незворотні депресивні зміни (тривала або високотоксична дія 52992 4 пошкоджуючого чинника). Додаткову інформацію про стан системи можна одержати, порівнюючи загальний вміст глутатіону в двох групах (вищий вміст глутатіону відповідає більшій ефективності системи глутатіону). Для використання способу одержують по 8 екземплярів тварин одного виду (двостулкові молюски, легеневі молюски, коропові риби) з подібними морфологічними показниками (розмір, вік, маса) з природної водойми та визначають вміст GSH та GSSG в їх метаболічне активних тканинах (травна залоза молюска, печінка риби). Для цього виготовляють 10%-ний (маса/об'єм) гомогенат, гомогенізуючи тканину у 5% сульфосаліциловій кислоті з використанням електричного гомогенізатора Поттера (тефлон/скло) і центрифугують протягом 10хв при 10000 g при охолодженні (4°С). Вміст загального глутатіону визначають за допомогою реактиву Елмана після ферментативного відновлення глутатіону НАДФН в присутності глутатіонредуктази (Anderson, 1996), а окисненого глутатіону - після обробки проби вінілпіридином. Редокс індекс глутатіону обчислюють як відношення вмісту відновленого глутатіону до загального вмісту глутатіону. Визначення проводять при температурі 25°С. Порцію супернатанту (37мкл для печінки риб або 200мкл для травної залози молюсків), одержаного після центрифугування, додають до К фосфатного буферу (0,05М, рН 7,4) який містить 200мкМ НАДФН та 1мМ 5,5'-дитіобіс-2-нітробензойної кислоти (ДТНБ). Ферментну реакцію відновлення GSSG ініціюють додаванням глутатіонредуктази (1,9 од.). Кількість утвореного в результаті взаємодії GSH з ДТНБ забарвленого продукту реєструють спектрофотометрично при 412нм кожні 30с протягом 120с. Для визначення вмісту окисненого глутатіону (GSSG), зразок супернатанту обробляють 2-вінілпіридином до кінцевого вмісту 2% за 60хв до аналізу (Griffith, 1980). Стандартні розчини виготовляють з GSH та GSSG (комерційні препарати). Концентрацію глутатіону виражають в мкмоль на г вологої ваги. Редокс-Індекс (РІ) глутатіону обчислюємо за формулою РІ = [GSH]/([загальний глутатіон]), а концентрацію GSH як різницю концентрацій загального та окисненого глутатіону, де [GSH] та [загальний глутатіон]-концентрація GSH та загального глутатіону в тканині. В нормі РІ становить >0,900,95. Кваліфікують біологічну відповідь І, відповідно, загальну токсичність водного середовища як: - "мала токсичність" - РІ становить 0,90 і вище (адекватна відповідь на умови існування); - "середня токсичність" - РІ становить 0,70-0,89 (стан тривоги, оксидативний стрес); - "висока токсичність" - РІ становить менше 0,70 (стан виснаження, пригнічення антиоксидантного захисту). - з двох груп з подібним значенням РІ глутатіону група з вищим значенням вмісту загального глутатіону має переваги у адаптації до умов існування. Реалізація корисної моделі проілюстрована на прикладах оцінки токсичності водного середовища 5 52992 за допомогою визначення РІ GSH двостулкового молюска Anodonta cygnea (Unionidae), легеневого молюска Lymnaea stagnalis (Gastropoda) та риби Carassius carassius (Cyprinidae). Приклад 1. Порівнювали стан РІ глутатіону у травній залозі двостулкового молюска Anodonta cygnea (Unionidae) з природних популяцій на території Поділля: у верхній течії р. Серет у рекреацій 6 ній зоні (с. ІвачІв, I-група), у нижній течії р. Нічлава у зоні інтенсивного аграрного виробництва та нижче м. Борщів, у якому не функціонують водоочисні споруди (В-група) та у ставі-охолоджувачі АЕС на р. Гнилий Рів (басейн р. Горинь) (м. Нетішин, Nгрупа) в травні, липні та вересні. Одержані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Оцінка токсичності водного середовища на підставі визначення редокс-індексу глутатіону у травній залозі двостулкового молюска Anodonta cygnea (Unionidae) Параметр Загальний глутатіон, мкмоль г тканини -1 Відновлений глутатіон, мкмоль г-1 тканини Окиснений глутатіон, мкмоль г-1 тканини Редокс-індекс глутатіону Токсичність середовища Група І В N І В N І В N І В N І В N Весна 0,96±0,08 0,50±0,08a 0,53±0,05a 0,78±0,09 0,21±0,04a 0,32±0,04a 0,19±0,01 0,28±0,02a 0,24±0,04 0,80±0,02 0,45±0,04a 0,57±0,05a Середня Висока Висока Літо 0,60±0,04b 0,31±0,02a,b 0,50±0,02a 0,54±0,04b 0,20±0,02a 0,38±0,02b 0,06±0,02b 0,11±0,01a,b 0,11±0,02a,b 0,90±0,02b 0,64±0,02a,b 0,77±0,03a,b Мала Висока Середня Осінь 0±0,02b 0,18±0,02a,b 0,34±0,02b 0,27±0,02b 0,14±0,01a,b 0,32±0,02a 0,03±0,00b 0,04±0,01b 0,02±0,00a,b 0,90±0,02b 0,79±0,05a,b 0,93±0,01a,b Мала Середня Мала Примітка. а - відмінності порівняно з І-групою вірогідні, b - відмінності в групі порівняно з весною вірогідні, р